Högupplöst 3D-avbildning av levande celler med suboptiska våglängdsfononer | vetenskapliga rapporter

Högupplöst 3D-avbildning av levande celler med suboptiska våglängdsfononer | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Akustik
  • Avbildning och avkänning

Abstrakt

Etikettfri avbildning av levande celler under den optiska diffraktionsgränsen utgör stora utmaningar för optisk mikroskopi. Biologiskt relevant strukturell information förblir under Rayleigh-gränsen och utanför konventionella mikroskop. Superupplösningstekniker baseras vanligtvis på det icke-linjära och stokastiska svaret på fluorescerande etiketter som kan vara toxiska och påverka cellfunktionen. I det här dokumentet presenterar vi för första gången avbildning av levande celler med hjälp av suboptiska våglängdsfononer. Den axiella avbildningsupplösningen för vårt system bestäms av den akustiska våglängden ( λ a = λ sonden / 2 n ) och inte på NA: s optik, vilket möjliggör sub-optisk våglängds akustisk sektionering av prover med flygningstiden. Den tvärgående upplösningen är för närvarande begränsad till den optiska fläckstorleken. Kontrastmekanismen bestäms signifikant av de mekaniska egenskaperna hos cellerna och kräver inget ytterligare kontrastmedel, färg eller etikett för att avbilda cellstrukturen. Möjligheten att bryta den optiska diffraktionsgränsen för levande celler i bilden lovar akustiskt att få en ny serie av bildtekniker att bära för att besvara exigenta frågor inom cellbiologi och biomedicin.

Introduktion

Optisk mikroskopi är kanske den mest kraftfulla tekniken som används inom biovetenskapen för att studera cellbiologi och är fortfarande ett extremt aktivt globalt forskningsområde som fortsätter att driva framstegen inom biomedicin. Avbildning av levande celler är avgörande för att studera struktur, funktion och dynamiskt beteende - ofta ett svårt problem på grund av skala, bräcklighet och svag optisk kontrast hos levande celler. Tekniker såsom differentiell interferens, faskontrast 1, epifluorescens 2 (2D), konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM 3 ) och multiphotonavbildning 4 används ofta på grund av deras kompatibilitet med levande celler. Levande celler är emellertid mottagliga för fotodamage från höga fotonenergier vid korta våglängder. Detta begränsar intervallet med våglängder som kan användas för den synliga delen av spektrumet och begränsar slutligen upplösningen. Superupplösningstekniker som STED 5 och STORM 6 kan överträffa Rayleigh-upplösningsgränsen men kräver höga fotondoser och lysröretiketter som kan vara skadliga för levande preparat 7 . Studien av dynamiska interna processer som involverar suboptiska strukturer (<500 nm) blir allt viktigare, och det finns ett begränsat val av etikettfria superupplösningsmetoder som kan hantera levande beredningar.

Bilder av enskilda biologiska celler som använder mekanisk kontrast är av stort intresse eftersom de kan ge komplementär information till den som erhålls med konventionell optisk mikroskopi. Nuvarande metoder för mekanisk avbildning vid optiska upplösningar eller högre är inte kompatibla med biologiska prover, speciellt levande prover. Dessa kräver ofta hårda förhållanden eller direkta mekaniska interaktioner med provet, som kanske inte är förstörande eller kvantitativt. Mekanisk avbildning utförs för närvarande med hjälp av tekniker såsom skanning av akustisk mikroskopi (SAM), atomkraftsmikroskopi (AFM), fotoakustisk mikroskopi (PAM) och Brillouin mikroskopi.

SAM 8, 9- tekniker är vanligtvis baserade på piezoelektriska omvandlare där dämpningen av ljudet i odlingsmedium begränsar utbredningsavståndet och därmed upplösningen till under det hos ett optiskt mikroskop 10 . AFM 11, 12 kan lösa suboptiska funktioner med en skarp nanoprock för att testa ytans höjd och stelhet. Även om en kraftfull och mångsidigt tillämpad metod på andra områden, är AFM svårt i levande celler och är i sig känslig endast nära beredningens yta utan att orsaka skada. PAM 13 förlitar sig på absorptionen av provet för att producera en akustisk våg för avbildning. Här är kontrastmekanismen huvudsakligen optisk absorption och upplösningen förblir optisk. För etikettfri avbildning av enstaka celler är optisk absorption inte enhetlig och olika delar av cellen kräver olika pumpvåglängder. Detta betyder inte bara flera laserkällor utan giftiga våglängder i UV-delen av spektrumet 14 . För att undvika dessa kan externa kontrastmedel också användas vid en enkel våglängdsoperation 15 . Fria bilder med hög upplösning har erhållits med användning av PAM, men detta är ännu inte livskraftigt för levande celler 16 . Brillouin-mikroskopi 17, 18 mäter frekvensförskjutningen (Brillouin-frekvensen) för fotoner som är spridda av fononer för att erhålla ett mått på ljudhastigheten. Detta är samma grundläggande mekanism för att erhålla en mätning som presenteras här, men spontan Brillouin-spridning är en ineffektiv process (en av varje ~ 10 10–10 12 fotoner bidrar till signalen 19 ) eftersom den förlitar sig på termiskt genererade fononer i provet och därmed kräver höga optiska flöden för att erhålla tillräckligt med SNR som är oförenliga med levande celler, dessutom är metoden i sig optiskt begränsad i upplösning eftersom de termiska fononerna är inkoherenta.

Telefoner för cellavbildning

Fononer kan genereras genom absorption av korta ljuspulser av metallfilmer 20 och detekteras med flera metoder inklusive; den opto-elastiska effekten, strålavböjning, interferometri eller Brillouin-svängningar 21 . Telefoner har använts i stor utsträckning för att studera hårda fasta material, men har nyligen applicerats på biologiska prover 22, 23, 24 . Telefongenererings- / detekteringsmetoderna är baserade på optiska pump-sondtekniker 25 . Här genereras fononerna (vanligtvis termoelastiskt) med en kort laserpuls och undersöks sedan med en andra försenad laserpuls. Att svepa tidsfördröjningen underlättar temporär rekonstruktion av vågformen. Denna metod möjliggör observation av mycket högfrekventa fononer, upp till THz-regionen 26 . Historiskt sett är anskaffningshastigheten för denna metod långsam på grund av den tid som krävs för att mekaniskt svepa tidsfördröjningen. På senare tid har utvecklingen av ASOPS-lasersystem 27 möjliggjort en betydande ökning av anskaffningshastigheten (se metoder).

När provet är genomskinligt, som i fallet med biologiska celler, observeras signaler typiskt kända som Brillouin-svängningar. Dessa signaler uppstår eftersom det finns störningar mellan ljudspridda och direkt överförda eller reflekterade strålar (se fig. 1 (a)). Den relativa fasen hos de interfererande strålarna förändras när fononfältet rör sig bort från generationsfilmen och alstrar en temporär oscillation av temporalitet (se fig. 1 (b)). Frekvensen för denna akustiska signal är Brillouin-frekvensen, fB = 2 nν / λ- sond , (normal incidens) där n är brytningsindex, v ljudets hastighet och λ- sond den optiska sondens våglängd. Genom att alstra koherenta fononer med samma riktning och frekvens undviks den spontana generationens slumpmässiga natur att öka spridningseffektiviteten med flera storleksordningar. För ett material med ett känt brytningsindex är enkla kvantitativa mätningar av ljudets hastighet möjliga. Denna funktion har stor potential och den har producerat rapporter i både fononiska 28 och Brillouin mikroskopi 29 fält.

I ( a ) används en ljuspuls (pump) för att termoelastiskt generera ett koherent fononfält i metallfilmen. Fononfältet (visat vid två positioner i tid, t 1 och t2, med tunna horisontella staplar) undersöks av en andra ljusstråle (sond). Störningen av både direkta och spridda sondstrålar inducerar en svängning i den detekterade sondens ljusintensitet. Frekvensen för denna oscillation fB är en funktion av ljudets hastighet. När fononfältet rör sig från ett material med ljudhastigheten v 1 till ett annat material med hastigheten på ljudet v 2, ändras den detekterade frekvensen i enlighet med det som visas i ( b ). Eftersom fononvåglängden är kortare än den optiska, är det möjligt att sektionera den optiska volymen genom efterbehandling utan behov av ytterligare anskaffning, mekanisk positionering eller fokusändring.

Bild i full storlek

Det temporära läget för fononerna är relaterat till deras rumsliga placering genom ljudets hastighet ( z = vt ) såsom visas i fig 1 (b). Varje cykel i den temporära signalen motsvarar en akustisk våglängd och därmed kan Brillouin-frekvensen längs den axiella riktningen bestämmas med akustisk upplösning snarare än den optiska upplösningen som används för att undersöka fältet. Eftersom den akustiska våglängden Xa = λ- sonden / 2 n är kortare än den optiska, finns det möjlighet att axiellt sektionera den uppmätta optiska volymen. Detta kan leda till upplösning av objekt som är mindre än det optiska fokusdjupet med förvärv av en enda mätning och utan behov av höga NA-objektiv. Medan den axiella upplösningen kan överstiga den optiska, är det genererade fononfältet begränsat i dess sidoutsträckning till det för generationspumpens våglängdpunkt som sätter sidoupplösningen till den som ges av pumpstrålens våglängd.

Med tanke på potentialen för kvantitativa mätningar med hög upplösning av en mekanisk egenskap såsom ljudets hastighet har Brillouins oscillationer utforskats som ett cellkarakteriseringsverktyg 22 . Enpunkts fononiska mätningar av vegetala 30 och dehydratiserade 31 celler har publicerats med användning av olika provförfrågningsregimer. Avbildning av fasta 24, 32 och dehydratiserade 23 prover har också rapporterats, men de underliggande teknologierna är oförenliga med levande exemplar. Brillouinscillation använder korta våglängdsfononer och långa våglängdsfotoner för att undersöka provet. Ljudets hastighet är vanligtvis 10 gånger lägre än ljusets hastighet. Därför, för samma våglängd, är frekvensen och energin som bärs av en fonon också 10 gånger lägre jämfört med den för en foton, vilket eliminerar den energiska skadan som görs med korta våglängdsfotoner. Trots denna fördel har de skador som orsakats av fotoner, värme och långsamma uppsamlingshastigheter (på grund av låg SNR) fram till nu gjort fononisk livecellavbildning omöjlig.

Detta dokument presenterar utvecklingen och tillämpningen av en alternativ fononavbildningsmodalitet, som övervinner några av begränsningarna i tidigare fononiska metoder för att för första gången visa kompatibiliteten mellan fononavbildning med levande celler. Dessutom kan denna metod i princip genom att arbeta i GHz-regimet generera koherenta fononfält vid suboptiska våglängder. Sådana våglängder kan användas för att extrahera information i axiell riktning under den optiska Rayleigh-gränsen. Denna potential undersöks och den axiella upplösningen som kan uppnås med denna metod analyseras.

Resultat

Vår lösning på de nuvarande barriärerna för livscelle-fononavbildning innefattar en serie experimentella designval för att minimera exponeringen av provet för skadliga foton- eller termiska doser. Den använder en ny belysningsgeometri, ny givarkonstruktion och värmeledande underlag för att skydda och hantera ljus- och termisk exponering. Ett förenklat schema av vårt system presenteras i fig. 2. Den optiska pumpen (390 nm, ~ 0, 5 mW) och den optiska sonden (~ 780 nm, 1 mW) strålar närmar sig provet genom substratet, som väljs för minimal optisk exponering och optimal termisk spridning. En optoakustisk givare tillverkad ovanpå underlaget består av en optisk kavitet bestående av tre lager. Hålrummet är exakt utformat för att starkt absorbera pumpljuset (för fonongenerering) samtidigt som det möjliggör hög överföring av sondstrålen (för fonondetektering). Designparametrarna för denna nya givare är avstämda för att producera såväl mekaniska som optiska resonanser i de önskade prestandabandena. Denna konfiguration erbjuder sålunda flera viktiga fördelar jämfört med andra fonondetekteringsmetoder: avsevärt reducerad exponering av provet för både pump- och sondstrålar, ökning av signalamplituden genom mekanisk resonans inom givaren och förbättrad termisk hantering genom användning av en hög-termisk konduktivitet substrat (safir). Dessa fördelar visar sig som kraftigt förbättrad signal-brusförhållande (SNR) och minimerad termisk störning av provet. Ökad SNR kan säljas för anskaffningshastighet, vilket i vår pump-sond ASOPS-konfiguration kan anskaffa cirka 5000 spår per sekund som är medelvärden för att erhålla SNR på ~ 40–70, beroende på ingångseffekt, substratmaterial och givarkarakteristik 24, 33 . Denna SNR är tillräcklig för att föreställa provet vid varje punkt i x-, y-dimensionerna och från de förvärvade spåren extraheras axiell information.

( a ) Experimentell installation. Två pulserade lasrar i ASOPS pump-sondkonfiguration kombineras av en objektivlins (0, 55 NA) och fokuseras i givarsubstratgränssnittet där sondstrålen fångas av ett andra mål (0, 42 NA) och detekteras i en fotodiode. Systemet är byggt runt ett mikroskop för att möjliggöra komplementär optisk avbildning. Ett fluorescensdetekteringsarrangemang gör det möjligt att bedöma tillståndet för en cell. ( b ) Transduktor och provarrangemang. Pumpstrålen absorberas medan sondstrålen överförs av givaren (med måtten Au = 20 nm, ITO = 140 nm och Au = 20 nm) för att möjliggöra detektering samtidigt som cellen skyddas från optisk exponering. Underlaget är safir för att förhindra temperaturökning.

Bild i full storlek

Sektionering och upplösning

Att lösa Brillouin-frekvensen i tid ger möjlighet att dela den optiska volymen med akustisk upplösning. Varje cykel för den detekterade signalen motsvarar rumsligt en akustisk våglängd, som typiskt är kortare än den optiska våglängden. Genom att beräkna Brillouin-frekvensen för ett litet antal cykler kan den optiska volymen sektioneras. Ur en teoretisk synvinkel är minst en cykel nödvändig för att mäta frekvensen för en sinusformad funktion. Men i praktiken är detta svårt att uppnå. I detta avsnitt analyseras den axiella upplösningen som kan uppnås genom att bearbeta Brillouinsignalerna med den korta tiden Fourier transforms (STFT) 34, 35- metoden baserat på modellering och experimentella mål med en kant.

Baserat på en teoretisk termoelastisk modell 36 (se kompletterande information) simulerades generationen, spridningen av ljudet och dess interaktion med ljus (vid λ- sonden ) för en dimensionell rymd (z). Simuleringen betraktade ett eller två objekt nedsänkta i ett medium (se fig. 3 (a)) där bredden ( Ow ) och separationen av objekten (O- gap ) varierades för att observera det optiska svaret. Signalens flygtid kan konverteras till axiell position z. Den resulterande temporära variationen av den simulerade ljusintensiteten efterbehandlades sedan för sektionering. Baserat på STFT-metoden beräknades fB mot tiden (se fig. 3 (b)). I denna metod varade varje fönster i några cykler av Brillouin-signalen och varje cykel hos signalen motsvarar rumsligt en akustisk våglängd aa = λ- sond / 2 n . Bredden på varje sektion i rumsliga enheter ges av S w = λ a N λ där N λ är behandlingsfönstret bredd och väljs för att matcha ett heltal antal cykler större eller lika än en (se fig 3 (b)) .

( a ) Schematisk över den simulerade geometri. ( b ) Simulering av ett kantsvar för att representera snittning. ( c ) Simulerat svar från ett enda objekt med olika storlekar för N λ = 2. ( d ) Simulerat svar med två nära föremål på olika kant till kantavstånd med N λ = 2. Upplösning i båda fallen är hälften av mätfönstret S w / 2.

Bild i full storlek

Figur 3 visar en simulering av optisk sektionering med användning av fononer. Figur 3 (a) visar modellens geometri. Pumpens våglängd ( λ pump = 390 nm) absorberas i en metallfilm. Det genererade ljudet sprider sig sedan i z-riktningen och inducerar Brillouin-svängningar för sondens våglängd ( λ- sond = 780 nm). Figur 3 (c) visar svaret på ett enda objekt nedsänkt i medium. Det simulerade objektet består av lager av pseudomaterial med något olika mekaniska men identiska optiska egenskaper. I fig 3 (c) och 3 (d) representerar de prickade linjerna det ideala svaret som förväntas från objektet och de heldragna linjerna visar svaret uppmätt från simuleringarna. Bredden på sektionen S w och en halv del av sektionen S w / 2 (för N λ = 2) visas som gula respektive orange områden. När objektet blir mindre ändras svaret tills objektets uppmätta Brillouin-frekvens inte når det förväntade frekvensvärdet beräknat utifrån de kända objektegenskaperna. Detta beror på att den första kanten inte är helt upplöst innan objektets andra kant anländer. Men objektet är fortfarande synligt. Här ska vi godtyckligt definiera ett upplöst objekt med denna metod är att en vars uppmätta frekvens är inom 5% av det förväntade värdet. Från denna definition observerades att bredden på ett upplösbart objekt typiskt är ungefär hälften av bredden på fönstret Sw (se fig. 3 (c)). När det gäller två föremål separerade med ett mellanrum (se fig. 3 (d)) är det minsta upplösta spalten också hälften av sektionsbredden (eftersom kantresponsen förblir densamma). När objektet blir mindre än detta reduceras den uppmätta frekvensskiftningen - vilket motsvarar en förlust av kontrast vid optisk avbildning. Om den kvantitativa mätningen av frekvensen inte är av intresse och allt som är viktigt är kontrast, tillåter avkoppling av upplösningskravet observationer av objekt på en fjärdedel av mätfönstret (analogt med Sparrow-kriterier i optik 37 )

Det extraherade fB i fig. 3c, d visar artefakter i form av krusningar, dessa uppstår av två huvudskäl. När sektionsfönstret, som är fixerat i storlek, övergår från ett objekt till det andra, är dess storlek inte längre ett komplett antal cykler som producerar falska fasövergångar. För att minska denna effekt fönstras tidspåret (vanligtvis av ett Hann-fönster) för att jämna ut kanterna. Att tillämpa denna process på en enda cykel introducerar betydande snedvridningar (vilket begränsar N ^ > 1). Dessa effekter minskar när N λ ökar.

Ett upplösningsmål för att experimentellt demonstrera z-upplösningen för denna metod är svårt att tillverka och karakterisera exakt, men svaret på en kant kan bekräfta observationerna från modellen. Figur 4 visar det experimentella svaret på en kant gjord av polystyren och vatten. Experimentella och simulerade (monterade) variationer i intensitet visas i fig. 4 (a). I fig. 4 (b – d) behandlas både simulerade och experimentella signaler av STFT med användning av N ^ = 2, 4 respektive 6. Det experimentella svaret på kanten följer väl simuleringarna som bekräftar att kanten är upplöst inom halva bredden på sektionen. I fig. 4 (b) är krusningarna i det simulerade spåret (artefakter) mindre än variationerna orsakade av brus. För N λ = 4 och 6 är krusningarna inte längre synliga (se Fig. 4 (c, d)).

( a ) Experimentella och simulerade (monterade) spår med en skarp kant av polystyren-vattenövergång. ( b ) Kantrespons med N λ = 2. ( c ) Kantrespons med N λ = 4. ( d ) Kantrespons med N λ = 6. I alla N λ- fall är upplösningen hälften av sektionens bredd.

Bild i full storlek

Den axiella upplösning erhållen med användning av metoden som presenteras här har observerats vara ungefär hälften av bredden för varje sektion S w / 2. Ett fast antal akustiska cykler N λ används i STFT-processen där ett minimum av N = 2 har observerats som genomförbart. Storleken på varje sektion ges av S w = N λ λ a som ger ett enkelt uttryck för upplösning:

där λ- sonden är den optiska sondvåglängden och n brytningsindex. Frekvensupplösningen, som styr den minsta detekterbara variationen i fB är direkt proportionell mot N λ och omvänt proportionell mot den axiella upplösningen. Vilket innebär att man i en praktisk situation måste handla mellan frekvens och axiella upplösningar; högfrekvensupplösning tillåter detektering av breda föremål med svag frekvenskontrast medan hög axiell upplösning av tunnare föremål kräver starkare frekvenskontrast för att vara livskraftig. Denna handel kan observeras i fig. 4 där det kortare fönstret visar större påverkan från buller än de längre.

I praktiken avbildar celler, den tunnaste möjliga sektionen ( N λ = 2) ger upplösningen lika med en a a ~ 280 nm vid 780 nm. På grund av närvaron av brus är emellertid antalet akustiska cykler N ^ som används för snittfönstren vid cellavbildning typiskt fyra till sex vilket reducerar den axiella upplösningen. För N ^ = 4 eller 6 är upplösningen 560 och 840 nm, som endast kan matchas med konfokal mikroskopi med mycket hög NA-objektiv (~ 1, 7), medan en 0, 42 NA-objektiv används i detta arbete.

Telefonisk cellavbildning

Celler kan förväntas visa mekanisk kontrast mellan styva, inriktade strukturer såsom kärnan eller sarkomerer jämfört med cytoplasma. När det gäller den här avbildningsmodaliteten, detekteras ljudet med Brillouin-spridning där styva strukturer avslöjar sig med en högre ljudhastighet (och därför högre fB ) än mjuka strukturer. Figur 5 visar ett exempel på vårt tillvägagångssätt tillämpat på en fixerad fettcell odlad på vår givare med ett glasunderlag. Den akustiska våglängden är i detta fall ungefär 280 nm om ett brytningsindex på 1, 36 antas 38 . En ljusfältbild av det skannade området visas i fig. 5 (a). Brillouin-frekvenskartan som visas i fig. 5 (b) erhölls genom beräkning av Fourier-transformen över den totala temporära utsträckningen av den förvärvade signalen. Fettdropparna visar tydlig kontrast jämfört med resten av cellen. Denna kontrast förväntas eftersom fett har olika mekaniska egenskaper än resten av cellen. Genom att anta ett brytningsindex är det möjligt att konvertera den temporära axeln till en rymdaxel (z). Genom att göra detta och att sektionera rumsvis mätningen av Brillouin-frekvensen med N ^ = 4 erhölls tre kritiskt samplade z-sektioner med en upplösning av 560 nm. Sådana sektioner visas i fig. 5 (c – e). Därifrån är det tydligt att se att fettdroppen märkt med en svart cirkel visas i det andra avsnittet och försvinner i det tredje. Detta visar att föremålet är ~ 560 nm i höjd och dess läge är nära mitten av den andra sektionen (~ 1 μm ) eftersom det är liten påverkan från det på de andra sektionerna.

( a ) Optisk bild tagen med ett konventionellt ljusfältmikroskop som visar en fettcell. Fettdroppar är tydligt synliga. ( b ) Brillouin-frekvenskartan över det område som visas i ( a ). Denna karta erhölls med användning av den totala temporära utsträckningen av de detekterade signalerna. ( c - e ) Underavsnitt av den uppmätta volymen. Det centrala läget för fönstren i z-riktningen är 0, 6, 1 respektive 1, 4 μm mot figurerna ( c - e) . Fettdroppen märkt med en cirkel visas och försvinner inom den uppmätta volymen. ( f ) Typiskt tidspår observerat från cellcytoplasma visat som en stjärna i ( a ). ( g ) Fouriertransformering av tidspåret presenterat i ( f ) som visar Brillouin-frekvensstoppen.

Bild i full storlek

Live cellavbildning

Imaging av levande celler med lasergenererade fononer kräver att provet överlever exponering för systemets ljus och värme och avbildningstiden måste vara så kort som möjligt för att förhindra rörelseartefakt och fånga dynamiska processer. Skadetröskeln för celler orsakade av nära-infraröda (NIR) laserpulser rapporterades vara säkra för effektdensiteter på 1, 7 × 10 14 W / m 2 som skannade en under-mikron plats under över 35 minuter 39 . I våra mätningar är effekttätheten ungefär 8, 5 × 10 12 W / m 2 som skannar en plats på en mikron under ~ 38 minuter, vilket är jämförbart med vad som har rapporterats som säkert. Det är välkänt att UV-ljus är särskilt skadligt för celler, men skadetrösklar för enstaka celler som använder korta 390 nm-pulser har inte rapporterats i litteraturen och är anekdotiskt låga och ska undvikas om det är möjligt. Med vårt schema får provet en typisk reduktion av sondens (5x) och pumpens (15x) strålintensitet för samma ingångseffekt jämfört med tidigare rapporterade fonondetekteringsmetoder 22, 32 . Medan strålbeläggningar således minimeras av givaren och mätgeometri, förblir termisk exponering ett problem när man använder glas som substrat på grund av den låga värmeledningsförmågan hos substratet. Numeriska modeller (se tilläggsinformation) visar att temperaturen i jämnt tillstånd stiger vid gränssnittet mellan cell / substrat och ligger runt 25 ° C över rumstemperatur (20 ° C) när ett glasunderlag används. Detta beror på absorption av laserpulståg och dålig värmeledning. Sådana temperaturer kan vara dödliga för celler, särskilt om värme ackumuleras över det stora antal mätningar som krävs för att bygga bilder med fononer. Safir, som har ~ 30 gånger värmeledningsförmågan hos glas, användes som ett underlag med levande celler för att minimera gränsytemperaturen stiger till ~ 7 ° C över rumstemperatur. Att hantera den termiska belastningen under bildbehandling begränsar temperaturökningen till det fysiologiska tolerabla intervallet, vilket möjliggör förvärv av tusentals mätningar utan att äventyra cellens livskraft.

Figur 6 visar ett exempel på levande cellavbildning (3T3 musfibroblaster) med användning av ett safirunderlag och 280 nm våglängdsfononer. Det finns god visuell överenskommelse mellan de optiska (fig. 6 (a)) och ultraljudsbilderna (fig. 6 (b)). Den genomsnittliga effekten som applicerades på givaren var 0, 4 och 1 mW för pump- och sondstrålar, varav cellen får ~ 0, 04 respektive 0, 3 mW. Våra metoder bestrålar således provet med mycket mindre optisk effekt än vad som krävs i andra fononiska (~ 7, 5 mW pump och 2, 2 mW sond 32 ) och Brillouin mikroskopi (2–5 mW 17, 18 ). För att bekräfta kompatibilitet med levande celler bedömdes cellernas tillstånd dynamiskt genom närvaron av propidiumjodid (PI) i badmediet. PI fluorescerar starkt i rött när det är bundet till DNA, från vilket det utesluts av cellmembranet i levande celler. Fortsatt uteslutning av PI under experimenten visade att cellerna förblev levande hela och efter avbildningsprocessen hade avslutats. Tillsats av tvättmedel till lösningen efter experiment dödade cellerna och bekräftade närvaron och funktionen av PI (se kompletterande information). Detta visar att den termiska belastningen är en dominerande skadlig faktor och att egenskaperna hos vår strategi har gett tillräckligt skydd mot termisk och fotonskada.

( a ) Optisk bild av det skannade området. ( b ) Brillouin-skift uppmätt från ( a ) provtagning varje 1 μm , med ~ 1, 5 s per punkt och totalt 38 minuter total anskaffningstid. ( c ) Avsnitt erhållet vid d = 1 μm . ( d ) Avsnitt erhållet vid d = ~ 1, 8 μm . När ljudet förökas upplöses tunn filopodia (markerad med vit cirkel, kvadrat) axiellt när sektionen rör sig djupare in i cellen.

Bild i full storlek

Sektionering av levande celler var också möjligt. Genom att välja N ^ = 6 för 840 nm upplösning, erhålls kontrast längs z-axeln (se fig. 6 (c, d)). Filopodialfunktioner visas vara tunnare än den axiella sektionen (fig. 6 cirkel, kvadratisk), och morfologin och omfattningen ser således förändras när sektionen flyttas genom cellen.

Tidigare rapporter om cellavbildning med fonon har historiskt utförts i behandlade celler (fixerade och / eller dehydratiserade). Användningen av detergent för att döda cellerna efter experimentet gav ytterligare möjlighet att bedöma den mekaniska kontrasten av celler vars membran delipideras av detergenten. Figur 7 visar celler som medvetet dödades med användning av tvättmedel som ändrade deras utseende inte bara optiskt utan även mekaniskt (se fig. 6 för jämförelse). Högre frekvenser observeras i de döda cellerna jämfört med de levande. Dessa högre frekvenser uppstår möjligen för att när cellen kollapsar på grund av upplösningen av dess lipidmembran, är allt styvt strukturellt material packat tätt ihop.

( a ) Brightfield-bild av 3T3 fibroblastceller. ( b ) Karta över Brillouin-skiftet erhållet från cellen som presenteras i ( a ). Cellens utseende är avsevärt annorlunda än de levande cellerna som visas i fig 6, deras intervall av akustiska frekvenser är också betydligt större.

Bild i full storlek

Diskussion

Detta papper har introducerat etikettfri högupplösta avbildning av levande celler med fononer. Denna teknik har förmågan att axiellt lösa strukturer baserade på mekanisk kontrast i sig för provet med bättre än optisk upplösning. Genom att implementera en optimerad givarkonstruktion för att skydda provet från termisk och fotonskada, visar vi vidare att metoden är kompatibel med levande cellavbildning. Denna teknik erbjuder ett etikettfritt alternativ för levande cellavbildning och mekanisk karakterisering.

Kontrasten i bilderna beror på provets optiska och mekaniska egenskaper. För de typer av celler som presenteras i detta dokument är förändringen i den uppmätta Brillouin-frekvensen inom en cell huvudsakligen relaterad till förändringar i den akustiska hastigheten eftersom den erforderliga förändringen i brytningsindex för att orsaka den observerade frekvensskiftet skulle vara många gånger större än den som observerats tidigare 40 . Om man kombinerar den aktuella tekniken med en optisk metod för lokalt mätning av brytningsindex skulle det möjliggöra att hastigheten återhämtas direkt, detta är möjligt eftersom instrumentets alla optiska natur tillåter kombination med andra avbildningsmodaliteter.

Det är intressant att notera att kontrasten som ses i levande cellbilder är lägre än för fasta celler 24. Det finns ett antal potentiella skäl för denna observation. För det första kan fixeringsprocessen för tvärbindning av interna strukturer med polymerer göra att de fasta cellerna verkar styvare och därmed snabbare än deras levande motdelar. För det andra är det möjligt att vissa finare strukturer i levande celler rör sig (till exempel filopodia), men eftersom en enda punkt förvärvas på 1-2 sekunder är det osannolikt att detta skulle ha stor inverkan på den uppmätta kontrasten. Det skulle emellertid ha en inverkan på den rumsliga korrelationen av fina särdrag i den slutliga bilden eftersom tiden som tar mellan angränsande punkter kan vara betydande och det är möjligt att rörelsen av dessa funktioner kan införa artefakter. En betydande ökning av bildhastigheten kan uppnås genom att parallellt spela in signaler, detta har uppnåtts för icke-ASOPS-pumpsondmätningar 41, ett modifierat schema kan tillämpas här. Med snabbare bildförvärvningshastigheter kan bilder av dynamiska celler eller processer erhållas.

I princip är den högsta axiella upplösningen med användning av den fononiska avbildningstekniken som presenteras här X- sond / 2 n , vilket är ~ 280 nm i celler vid X- sond = 780 nm. Detta är betydligt mindre än de optiska sektionsförmågorna för det optiska systemet som används för att utföra mätningarna, (som med ett NA på 0, 42 har ett fokusdjup på ungefär 8 mikron) och är högre än det som kan uppnås med ett typiskt oljedämpande konfokalsystem. I praktiken är den axiella upplösningen för närvarande begränsad av brus till 560 nm och 840 nm för de fasta respektive levande cellerna.

In contrast to most other sectioning techniques time resolving the acoustic signal allows the sectioning information to be acquired in one go, there is no need to re-scan the sample for each section required. The sections are recovered in post processing and the cell therefore only receives one dose of light to obtain all the information in the 3D volume. This gives flexibility in the processing as a high SNR image of the average velocity can be recovered if the entire signal is used or separate sections can be recovered to show more detail. The time to acquire the signal is the same regardless, which is ~1–2 seconds per point, which typically yields 5–10 voxels per point if the data is sectioned.

The lateral resolution is currently limited by the size of the optical spots used to generate and detect the ultrasound. It is possible to make the size of the acoustic spots smaller than the optical spots in a number of ways, for example, by engineering the spatial properties of the thin film substrate or by using nanoparticles to generate sound waves with sub optical resolution in all directions, but this requires further research. There is much scope to take advantage of the broad bandwidth available from laser-generated phonons (>100 GHz, with λ ~ 15 nm) in the search for a very high resolution imaging tools.

metoder

Experimentuppställning

The asynchronous optical sampling (ASOPS 27 ) pump probe system (see Fig. 2) controls two 150 femtosecond pulsed lasers with repetition rates of ~100 MHz and allows the delay between the lasers to be set and swept electronically without the need for a mechanical delay line 21, 22 . In our system, the delay repetition rate between the probe and the pump is 10 kHz which means that a measurement (of the complete 10 ns delay sweep) is taken every 100 μ s.

As seen in Fig. 2, both beams ( λ probe = 780 nm, λ pump = 390 nm ) are combined and focused together through a 50x (NA = 0.55) long working distance objective. Adjustable mirrors allows coaligning of the pump spot to the probe spot. The probe beam is detected after being collected by an objective lens (20x, NA = 0.42) and focused to a photodiode. The sample is scanned by moving electromechanical stages with a minimum step motion of 100 nm. Typically 10000 averages are taken per point which takes ~2 s to acquire limited by data acquisition element. The system uses typical average powers of 1 mW (0.3 mW at cell) in the probe and 0.5 mW (0.05 mW at cell) in the pump corresponding to pulse energies of 10 pJ and 5 pJ and peak powers of ~60 W and ~30 W respectively.

Optical imaging is performed with two cameras: one CCD is used for brightfield imaging (using the 50x objective lens) and the other (emCCD) for fluorescence (using the 20x objective lens). A spectrally-distinct LED source (530+/−25 nm) provides brightfield illumination of the sample as well as excitation for red-emitting fluorescence dyes. Epifluorescence was detected via a TRITC cube (Ex: 535/15, DCX: 565, Em: 615/35 nm).

Cell methods

3T3 fibroblast cells were cultured on the EtOH-sterilised transducers for 24 hrs in standard culture medium. Living cells were kept in Hanks balanced salt solution (HBSS) buffered with 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, 25 mM) to maintain physiological pH (7.4) under ambient conditions during the experiments. Media was pumped at 0.05 μ Ls −1 using a syringe pump into a chamber (chamilde CF-T25 produced by Live Cell Instruments, Seoul) comprising a transducer substrate and a closing coverslip. Constant flow of media allowed specimens to remain alive for several hours at room temperature (21 °C).

A fluorescence assay was used to confirm cell viability (Fig. 6). Propidium iodide (PI, abs: 510–560 nm, em: 600–650 nm) binds to DNA in the nuclei of dead cells, and is non-fluorescent when excluded from entering living cells by the intact cell membrane. PI was added as a 1 mM EtOH stock to a concentration of 1 μ M in bathing medium. A fluorescence picture of the targeted region of cells was obtained before starting the ultrasonic imaging and another following the ultrasound imaging experiment (see supplementary Fig. 1). Finally, all cells were deliberately killed using a detergent (Triton X-100 in phosphate buffered saline (PBS) solution, Sigma-Aldrich). Cells which survived the ultrasound imaging experiments continued to exclude PI from their nuclei throughout and following the experiment, confirming that the cells remained viable (see supplementary information).

Signal processing

Raw signals are composed of several parts: coincidence peak, thermal response and signals of interest - which were extracted by established signal processing 24, 33 . A fast Fourier transform (FFT) is then performed on the resultant trace to measure the Brillouin frequency. Signal to noise ratio (SNR) was evaluated in the frequency domain by measuring the peak amplitude of the acoustic signal with the standard deviation of the noise background in the absence of signal (pump off) and in the same band.

Because the acoustic waves are propagating axially through the sample, different moments in time represent different locations in space. Axial sectioning information was therefore obtained by resolving the Brillouin frequency in time. This was possible using the short time Fourier transform method (STFT) where a small time window (length: two acoustic cycles or more) is shifted in time. In this way, it is possible to section the optical volume. The resolution of this process was estimated by modelling and experimental measurements of an edge response revealing the axial resolution is approximately half of one measuring window when the window lasts for two cycles or more.

ytterligare information

How to cite this article : Pérez-Cota, F. et al . High resolution 3D imaging of living cells with sub-optical wavelength phonons. Sci. Rep. 6, 39326; doi: 10.1038/srep39326 (2016).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.