Hög glukosuppreglering av bace1-medierad aP-produktion genom rosberoende hif-la och lxrα / abca1-reglerad lipidflottomorganisation i sk-n-mc-celler | vetenskapliga rapporter

Hög glukosuppreglering av bace1-medierad aP-produktion genom rosberoende hif-la och lxrα / abca1-reglerad lipidflottomorganisation i sk-n-mc-celler | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Molekylär neurovetenskap
  • Näringssignalering

Abstrakt

Det finns en ansamling av bevis som indikerar att risken för Alzheimers sjukdom är förknippad med diabetes mellitus, en indikator på höga glukoskoncentrationer i blodplasma. Denna studie undersökte effekten av hög glukos på BACE1-uttryck och amyloidogenes in vivo , och vi presenterar detaljer om mekanismen associerad med dessa effekter. Våra resultat, med ZLC- och ZDF-råttmodeller, visade att ZDF-råttor har höga nivåer av amyloid-beta (Ap), fosforylerad tau, BACE1 och APP-C99. In vitro- resultat med mus hippocampal neuron och SK-N-MC, hög glukosstimulerad A-sekretion och apoptos på ett dosberoende sätt. Dessutom ökade högt glukosuttryck av BACE1 och APP-C99, som omvändes av en ROS-rensare. I själva verket ökade höga glukoser intracellulära ROS-nivåer och HIF-la-uttryck, associerade med reglering av BACE1 och lever X-receptor a (LXRa). Dessutom var högglukosinducerad ATP-bindande kassetttransportör A1 (ABCA1) nedreglering, associerad med LXR-inducerad lipidflottreorganisation och BACE1-lokalisering på lipidflotten. Dessutom visades tystnad av BACE1-expression att reglera Ap-utsöndring och apoptos av SK-N-MC. Sammanfattningsvis uppreglerar högt glukosuttryck och aktivitet av BACE1 genom HIF-la och LXRa / ABCA1-reglerad lipidflottreorganisation, vilket leder till AP-produktion och apoptos av SK-N-MC.

Introduktion

Flera epidemiologiska och biologiska beviskällor stöder en koppling mellan diabetes mellitus (DM) och Alzheimers sjukdom (AD) 1, 2, 3, 4 . Dessutom finns det bevis som visar en koppling mellan förändring av glukosmetabolism och ackumulering av amyloidprekursorer i hjärnan hos diabetespatienter 5, 6 . Även om de molekylära och patofysiologiska mekanismerna som utlöser förekomsten av AD fortfarande inte är fullständigt beskrivna, har vissa studier föreslagit att ackumulering och avsättning av amyloid-beta (Ap), som är resultatet av otillräcklig bearbetning av amyloid-prekursorprotein (APP), kan bidra till patogenesen av AD 7, 8 . Även om flera studier antyder att DM kan vara en kofaktor för AD-förekomst, är dess närvaro otillräcklig för att producera AD-förekomst 9, 10 ; emellertid har nyligen genomförda studier rapporterat att en hög glukosmiljö kan förvärra AD-patogenes via APP-ackumulering, Ap-produktion och plackbildning 11, 12, 13 . Dessa fynd tyder på att undersökning av glukosens roll i AP-produktion och APP-bearbetning krävs för att utveckla strategier för att förebygga AD-förekomst och behandling av AD hos patienter som har hög blodglukosprofil. Beta-plats APP-klyvande enzym 1 (BACE1) är ett viktigt APP-behandlingsenzym associerat med membranbundet C-terminal fragment C99 (APP-C99) och AP-produktion. Flera studier har rapporterat att BACE1-reglering är involverad i AD-patogenes inklusive Ap-deposition och Ap-associerat minnesnedsättning 14, 15, 16 . Dessutom har BACE1-hämmare betraktats som en potent terapeutisk kandidat för AD-behandling 17 . Det finns emellertid få rapporter som beskriver effekten av glukos på BACE1-uttrycket. Chen RF et al . rapporterade att berövande av syre och glukos inducerar ackumulering av BACE1 18 . En detaljerad beskrivning av mekanismen genom vilken hög glukos reglerar BACE1 kan ge en ny ledtråd för att kontrollera AD-förekomst hos DM-patienter.

Flera rapporter har föreslagit att DM- och hyperglykemi-förändrad kolesterolmetabolism kan spela en avgörande roll i neurologiska och metabola dysfunktioner 19, 20 . Lever-X-receptorerna (LXR: er) inklusive LXRa och LXRp är viktiga transkriptionsfaktorer som strikt reglerar intracellulära kolesterolnivåer via reglering av transkriptionell aktivitet hos gener involverade i kolesteroltransport och utflöde. På senare tid har det rapporterats att membranlipidkomposition har en viktig roll i AD-patogenes 21 ; varvid lokala ökningar av membrankolesterol påverkar APP-behandling, vilket resulterar i stimulering av AP-produktion 22 . Kolesterol är en kritisk komponent i lipidflotten, ett specialiserat membranmikrodomän som är involverat i proteinhandel, signaltransduktion, neurotransmission och ligand-receptor interaktion 23 . Vidare har det rapporterats att BACE1 är beläget i lipidflotten, och en förändring i lipidflotten-kolesterol kan påverka BACE1-aktivitet och resultera i förändringar i AP-produktion, vilket antydde att lipidflotten modifiering genom hyperglykemi kan vara en potentiell utlösare av AD-patogenes 24 . Förhållandena mellan hyperglykemi-inducerad intracellulär kolesterolansamling och AP-produktion och de relaterade signalvägarna förblir emellertid oklara.

ZDF-råtta, härrörande från mutation av leptingenen i ZF-stammen, har en hög nivå av blodglukos och används allmänt som en modell för att studera humant DM och dess komplikationer 25 . Dessutom har mushippocampalneuron och SK-N-MC celler använts i stor utsträckning som en in vitro neuronal cellmodell för att undersöka neuronal patogenes av 26, 27, 28, 29 AD. Upplysning av kritiska molekyler som påverkar förekomsten av AD under diabetiska förhållanden är viktigt för att utveckla en förståelse av AD-patogenes och kan vara till hjälp vid utveckling av nya strategier för behandling och förebyggande av AD. I den aktuella studien undersökte vi effekten av hög glukos på BACE1-uttryck och relaterade mekanismer med användning av in vivo och in vitro , Zucker Diabetic Fatty (ZDF) -råttor respektive SK-N-MC humana neuroblastomceller.

Material och metoder

material

Celler från SK-N-MC-humant neuroblastom, MEF-embryonalt fibroblast från mus och CACO-2 humant kolonkarcinom tillhandahölls av Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Fetalt bovint serum (FBS) och serumersättning (SR) för odling köptes från Hyclone (Logan, UT, USA) respektive Gibco (Grand Island, NY, USA). P-Tau (Ser 396 ), Tau, presenilin-1, p-aktin, lamin A / C, JNK, p-JNK (Thr 183 / Tyr 185 ), p-tubulin, caveolin-1, flotillin-2, p -GSK3P (Ser 9 ), GSK3P och caspase-9 antikroppar köptes från Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). A, BACE-1, APP, HIF-la, LXR, retinoid X-receptor (RXR) och ATP-bindande kassetttransportör Al (ABCA1) erhölls från Abcam (Cambridge, MA, USA). Caspase-3-antikropp köptes från Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Hästradisperoxidas (HRP) -konjugerad kanin-antimus och get-anti-kanin-sekundära antikroppar köptes från Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). Specificiteten för AP-antikropp validerades med användning av gammasekretasinhibitor L-685, 458 (Sup Fig. 3). N-acetylcystein (NAC), D-glukos, L-glukos, PD98059, SP600125, TO901317, metyl-p-cyklodextrin (MCDD), filipin III, fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerat koleratoxinundersökningsenhet B (CTB) och propid jodid (PI) erhölls från Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Små interfererande RNA: er (siRNA: er) för bace-1 och icke-målriktning köptes från Dharmacon (Lafayette, CO, USA). hif-la siRNA köptes från GenePharma (GenePharma, Shanghai, Kina). Alexa fluor 488- och 568-konjugerade sekundära antikroppar förvärvades från Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Alla reagens som användes i denna studie var av kommersiellt tillgängliga former av högsta kvalitet.

Celler

SK-N-MC, MEF och CACO-2-celler odlades med 10% FBS, 1% antibiotisk-antimykotisk lösning innehållande penicillin, streptomycin och fungizon, och högt glukos Dulbecos viktiga medium (DMEM; Gibco). Cellerna odlades på 6-brunnars plattor eller i 60 mm skålar i en inkubator hölls vid 37 ° C med 5% CO2. Celler inkuberades under 72 timmar och tvättades sedan med fosfatbuffrad lösning (PBS). Därefter ändrades mediet till DMEM-kompletterat odlingsmedium med låg glukos med 1% SR och 1% antibiotisk-antimykotisk lösning. Efter synkronisering under 24 timmar tvättades cellerna två gånger med PBS och placerades i SR-kompletterat DMEM med låg glukos med reagens.

Experimentella djur

Zero-råttor av manlig och kvinnlig heterozygotyp ( Lepr fa / + ) erhölls från Genetic Models (Genetic Models Inc., Indianapolis, IN, USA) och parades till varandra för att erhålla homozygota ZDF lean control (ZLC) och ZDF-råttor. Manliga homozygota ZDF- och ZLC-råttor användes i denna studie. Råttor hölls i en vanlig djurfacilitet och hölls vid ett rumstemperaturområde 20–25 ° C och 60% fuktighet med en 12 timmars ljus / mörk cykel. Purina 5008-diet (Purina Korea, Seoul, Korea), som rekommenderats av genetiska modeller, tillhandahölls alla råttor. Alla procedurer som involverade råttor följde de nationella riktlinjerna för hälsa för human behandling av djur; protokollen godkändes dessutom av Institutet för djurvård och användning av Seoul National University (SNU-140219–1). Råttor avlivades vid 16 veckors ålder. Hjärnvävnader extraherades och fixerades med 4% paraformaldehyd i 0, 1 M PBS under 24 timmar. Fasta hjärnvävnader lagrades efter infusion med 90% sackaros för kryoprotektion och inbäddades sedan i OCT-förening (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA). Vävnadsprover kryosektionerade koronalt vid 10 mikrometer tjockt med hjälp av en kryostat (CM1520; Leica, Wetzlar, Tyskland) och genomgick Western blotting och immunohistokemisk (IHC) färgning.

Mus-primär hippocampal neuronkultur

Mushippocampus isolerades från 17 dagar musembryonhjärnan. Efter dissociation av hippocampusvävnad med 0, 05% trypsinlösning, pläterades 2 × 105 hippocampalceller på poly D-lysinbelagd 35 mm skål, och neurobasalpläteringsmedium (Neurobasal media innehållande B27-tillägg [1 ml / 50 ml], 0, 5 mM glutamin, 25 mikrometer glutamat, 1 mM HEPES, 10% hästserum) tillsättes till skålen. Celler inkuberades under 24 timmar. Neuronala celler odlades med neurobasalt matningsmedium (neurobasalt medium innehållande B27-tillägg [1 ml / 50 ml], 0, 5 mM glutamin, 1 mM HEPES, 10% hästserum) under 12 dagar. Alla förfaranden som involverar primär hippocampal kultur följde de nationella institut för hälsa riktlinjer för human behandling av djur; dessutom godkändes protokollen av Institutet för djurvård och användning av Seoul National University (SNU-151116-1).

Western blot-analys

Efter behandlingen uppsamlades cellerna med användning av en cellskrapa. Celler tvättades två gånger med kall PBS före lysering med RIPA-buffert (Thermo Fisher) och en proteinas- och fosfatasinhibitorcocktail (Thermo Fisher). Efter inkubering i lysbuffert under 30 minuter på is centrifugerades lysat under 30 minuter vid 15 000 rpm vid 4 ° C, och supernatanten uppsamlades. Bestämning av proteinkoncentration i prover utfördes med användning av en bicinchoninsyra (BCA) -analyssats (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteinprover (10 μg) laddades i 8–15% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel (SDS-PAGE) för elektrofores och överfördes till ett polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran. Efter proteinöverföring tvättades det proteinöverförda membranet med tris-buffrad saltlösning innehållande 0, 1% Tween-20 (TBST) -lösning {150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7, 6) och 0, 1% Tween-20}. Därefter blockerades membranet med 5% skummjölk (Gibco) och 5% bovint serumalbumin (Thermo Fisher) i TBST-lösning. Membranet tvättades sedan tre gånger var 10 min och inkuberades med primär antikropp (1: 1 000 utspädning) över natt vid 4 ° C. Efter inkubering med primär antikropp tvättades membranet och inkuberades i följd med pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad sekundär antikropp (1: 10.000 utspädning) under 4 timmar vid 4 ° C. Western blot-bandet detekterades med användning av en förbättrad kemiluminescenslösning (Bio-Rad). Densitometrisk analys för kvantifiering utfördes med användning av ImageJ-programvara (utvecklad av Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; //rsb.info.nih.go.kr/ij/). Fullständiga geler och fläckar av nyckeldata ingår i den kompletterande informationen (Sup. Fig. 1 och 2),

Extraktion av mRNA och omvänd transkriptions-polymeraskedjereaktion

SK-N-MC-cellerna extraherades med användning av ett kommersiellt RNA-extraktionssats (TaKaRa Biomedicals, Otsu, Japan). Extraherat RNA (1 μg) omvänd transkriberades med ett omvänd transkriptionsförblandningssats (iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea) för att producera cDNA. CDNA amplifierades med användning av framåtriktade och omvända primrar av lxr-a , lxr-p och p-aktin .

Realtidspolymeraskedjereaktion

MRNA-expressionsnivåerna för generna lxr-a , lxr-p , abca1 , abcg1 och p-aktin mättes med användning av ett realtids-termiskt cykelsystem Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, NSW, Australien) med en Quanti NOVA SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) tillsammans med cDNA (1 μg) och mRNA-primrar. De mRNA-primersekvenser som användes i denna studie beskrivs i tilläggstabell 1. Identiteten och specificiteten för polymeraskedjereaktionens (PCR) -produkter bekräftades genom att utföra smältkurvanalys. Normalisering av genuttrycksnivåerna utfördes med användning av p-aktingenen som en kontroll.

Immunohistokemisk färgning

Fixade hjärnvävnadsprover deparaffiniserades med xylen och olika koncentrationer av etanol (100, 90, 70 och 50%). För inaktivering av endogent peroxidas inkuberades deparaffiniserade vävnader med 3% väteperoxid i metanol under 10 minuter och tvättades sedan med PBS två gånger. Därefter utfördes antigenutvinning av vävnadsprover genom inkubering av vävnader med förvärmd (100 ° C) citratbuffert {100 mM, 0, 05% Tween 20, pH 6, 0 i destillerat vatten (DW)} under 20 minuter. Därefter tvättades prover och permeabiliserades genom inkubation med 0, 5% triton X100 i PBS. Prover blockerades sedan med 5% normalt getserum (Sigma Aldrich) i PBS under 30 minuter. Vävnadsglas inkuberades med primära antikroppar (1: 100-utspädning) över natt vid 4 ° C. Efter tvättning tre gånger med PBS inkuberades vävnadsglas med Alexa fluor 488 och konjugerade sekundära antikroppar (1: 100-utspädning) och PI under 2 timmar vid 4 ° C. Immunfärgade prover visualiserades med användning av konfokal mikroskopi (Fluoview 3000; Olympus, Tokyo, Japan). Alla skalstänger är 200 μm. Förstoringen av bilderna är × 100 och × 200.

Intracellulär reaktiv syresmätning

Detektion av intracellulära reaktiva syrespecies (ROS) utfördes med användning av CM-H2 DCF-DA-färgning (DCF-DA, Life Technologies). Cellerna lossades med 0, 25% trypsin och 0, 5 mM EDTA, räknades sedan med användning av en Petroff-Hausser-räknekammare. Därefter erhölls 5 x 105 celler och suspenderades i 10 um DCF-DA i PBS och inkuberades vid 25 ° C under 1 timme i mörkret. Efter inkubation tvättades cellerna två gånger med PBS och laddades i en 96-brunnars svart platta. Mätning av intracellulär ROS utfördes med användning av en luminometer (Victor3, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA).

Liten störande RNA-transfektion

Det hif-la- specifika siRNA eller icke-målriktade siRNA som en negativ kontroll transfekterades till SK-N-MC-celler under 24 timmar med Turbofect-transfektionsreagens (Thermo Fisher) före behandling enligt tillverkarens handbok. Koncentrationen av transfekterade siRNA var 20 nM. Alla siRNA-sekvenser som användes i denna studie beskrivs i tilläggstabell 2.

Kromatinimmunutfällning

Chromatin immunoprecipitation (CHIP) -analys utfördes med användning av ett EZ-ChIP-Chromatin Immunoprecipitation Kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Prover innehållande proteinkromatinkomplex inkuberades med antikroppar specifika för HIF-la, IgG och PolIII över natt vid 4 ° C. Normalt IgG och PolIII användes som negativa respektive positiva kontroller. Immunutfällt komplex eluerades med elueringsbuffert (1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 och 10 mM EDTA). Eluater inkuberades med 5 M NaCl under 4 timmar vid 65 ° C och inkuberades sedan med RNas A under 30 minuter vid 37 ° C. Därefter inkuberades prover med 0, 5 M EDTA, 1 M Tris-HCl och proteinas K under 2 timmar vid 45 ° C. Prov-DNA extraherades med tillförd kolonn och amplifierades genom PCR med användning av en konstruerad primer (kompletterande tabell 3). En procent av kromatin-extraktet användes som inmatning. Kvantifiering av bindning av protein till promotorn utfördes med användning av PCR i realtid.

Sackarosdensitetsgradientfraktionering

Efter behandling tvättades cellerna med kall PBS och skrapades i 1 ml lysbuffert (500 mM, Na2C03, 10 mM EDTA, pH 11 i DW). Proteinas- och fosfatasinhibitorcocktailen sattes till lysaterna. Därefter homogeniserades lysat med användning av en sonikator (Branson Sonicator 250, Branson Ultrasonic Corp., Danbur, CT, USA) och inkuberades under 30 minuter på is. Efter proteinkvantifiering genom att utföra en BCA-analys justerades samma mängd protein för att bilda 2 ml 45% sackaros i MES-buffrad lösning [MBS: 25 mM MES (pH 6, 5), 0, 15 M NaCl] och placerades i en ultracentrifug rör (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). För att bilda en 5–35% diskontinuerlig sackarosgradient, sattes 4 ml 35% sackaros och 4 ml 5% sackaros innehållande MBS i följd till ultracentrifugröret. Provinnehållande ultracentrifugrör centrifugerades vid 40 000 rpm under 20 timmar i en SW41-rotor (Beckman Coulter). Fraktionerade prover samlades och analyserades genom att utföra western blotting.

Beredning av kärnfraktion

Samlade celler suspenderades i kärnfraktionslysbuffert {137 mM NaCl, 8, 1 mM Na2HP04, 2, 7 mM KCl, 1, 5 mM KH2PO4, 2, 5 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 0, 1 mM PMSF och 10 mg / ml leupeptin (pH 7, 5)}. Celler suspenderades genom pipettering och inkuberades i 10 minuter på is. Lysater centrifugerades vid 3 000 varv per minut under 5 minuter vid 4 ° C. För att erhålla det icke-nukleära fraktionsprovet uppsamlades lysatsupernatant. Den återstående kärnpelleten lyserades med RIPA-lysbuffert under 20 minuter på is och centrifugerades sedan vid 15 000 rpm under 30 minuter vid 4 ° C. Provsupernatant, innefattande kärnkraftsfraktionen, uppsamlades.

immunocytokemi

Celler placerade på en konfokalskål (Thermo Fisher) fixerades genom inkubering med 80% aceton i PBS under 10 minuter och tvättades sedan tre gånger med PBS. Därefter blockerades cellerna med 5% FBS i PBS för att hämma icke-specifik bindning av proteiner. De blockerade cellerna inkuberades med primär antikropp (1: 100-utspädning) följt av tvättning med PBS och inkuberades sedan med Alexa fluor-sekundär antikropp, FITC-konjugerad CTB och PI under 2 timmar vid 4 ° C. Bilder erhölls med användning av en Fluoview 300 konfokalmikroskopi (Olympus). Fluorescensintensitet av protein analyserades med användning av Image J-programvaran (utvecklad av Wayne Rasband, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA; //rsb.info.nih.gov/ij/). Vi beräknar den korrigerade totala cellfluorescensen (CTCF, Image J arbitary unit). Ekvationen som används för att bestämma CTCF är: CTCF = Integrerad densitet - (Area of ​​vald cell × Medel fluorescens för bakgrundsavläsningar).

Trypan-blå uteslutningscellviabilitet

Efter behandling uppsamlades cellkonditionerat medium. Celler tvättades med kall PBS och inkuberades sedan och suspenderades med en 0, 05% trypsin (Gibco) och 0, 5 mM EDTA-lösning (Sigma Aldrich). Suspenderade celler tillsattes sedan till det uppsamlade mediet tillsammans med cellsuspensionslösningen. Sojaböntrypsininhibitor (0, 05 mg / ml) tillsattes till cellsuspensionslösningen för att stoppa trypsinaktiviteten. Prover centrifugerades vid 3000 rpm under 5 minuter vid 4 ° C. Därefter avlägsnades supernatanten och den återstående cellpelleten suspenderades med PBS och trypanblått (0, 4%, Sigma Aldrich) för att färga de döda cellerna. Färgade och ostänkta celler räknades med användning av en Petroff-Hausser-räknekammare (Hausser Scientific, Horsham, PA, USA). Ekvationen som användes för att bestämma cellviabilitet var cellviabilitet = [{1 - (antal trypanblåfärgade celler / antal totala celler)} × 100].

Annexin V / PI fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys

Annexin V- och PI-färgning för att utvärdera apoptos av SK-N-MC-celler utfördes med användning av ett Annexin V / PI-apoptosdetekteringssats (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA) enligt tillverkarens manual. I korthet uppsamlades SK-N-MC-odlingsmedium efter cellbehandling. SK-N-MC-cellerna lossades och suspenderades med 0, 25% trypsin och en 0, 5 mM EDTA-lösning. Därefter tillsattes det uppsamlade mediet till cellsuspensionen. Upphängda celler räknades med användning av en Petroff-Hausser-räknekammare (Hausser Scientific). Celler (1 x 105) återsuspenderades sedan i bindningsbuffert som levererades med apoptosdetekteringssatsen och immunfärgades med 5 ul FITC-Annexin V och 5 ul PI under 15 minuter i mörkret vid rumstemperatur. Apoptosanalys utfördes med användning av flödescytometri (Beckman Coulter). Cell (3 × 105 ) som hade liknande nivåer av sidospridningsvärde och cellvolym mättes och analyserades med användning av CXP-programvara (Beckman Coulter).

Total kolesterolmätning

Den totala cellulära kolesterolnivån bestämdes med användning av ett kommersiellt kolesterolmätningssats (BioVision, Mountain View, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet samlades 1 x 106 celler, lyserades med en blandning av kloroform, isopropanol och NP-40 för att extrahera cellulära lipider. De extraherade cellulära lipiderna torkades och den torkade pelleten suspenderades i kolesterolbufferten levererad med kolesterolmätningssatsen. Därefter tillsattes den enzymblandning som levererades med kolesterolmätningssatsen till proverna, som sedan inkuberades under 1 timme vid 37 ° C. Det kolorimetriska protokollet för detektion antogs och mätningar gjordes vid 570 nm med användning av en mikroplattläsare (Bio-Rad).

Filipin III-färgning för kolesterolmätning

Celler fixerades med 3% färsk paraformaldehyd under 1 timme vid rumstemperatur. Celler tvättades två gånger med PBS och inkuberades med 1 ml 1, 5 mg glycin i PBS-lösning under 10 minuter vid rumstemperatur för att stoppa paraformaldehyd. Celler inkuberades med filipin III (Sigma Aldrich) arbetslösning (0, 05 mg / ml i PBS / 10% FBS) under 2 timmar vid rumstemperatur. Konfokal bild förvärvades med hjälp av konfokal mikroskopi (340–380 nm excitation).

immunoprecipitation

För att detektera utsöndrad Ap i mediet uppsamlades SK-N-MC-konditionerat medium efter behandling. Proteinas- och fosfatasinhibitorcocktailen (Thermo Fisher) sattes till mediumprovet. För att producera den A-specifika antikroppen konjugerad med agarospärla utförde vi immobilisering genom att använda ett kommersiellt samimmunutfällningssats (Thermo Fisher) enligt tillverkarens instruktioner. Mediumprov inkuberades med en primär antikropp specifik för A-konjugerade agarospärlor under 6 timmar vid 4 ° C. Agarospärlor spundades ned genom centrifugering vid 1000 rpm under 1 min och uppsamlades sedan. Samlade pärlor tvättades sex gånger med tvättbuffert. Protein förvärvades genom inkubering i elueringsbuffert som levererades med sam-immunutfällningssatsen. Protein i mediet bestämdes med användning av en BCA-proteinkvantifieringsanalys. Samma mängd protein laddades i 12% SDS-PAGE för elektrofores och överfördes till ett PVDF-membran. Proteinöverförda membran inkuberades med den A-specifika antikroppen. Efter inkubering med HRP-konjugerad sekundär antikropp detekterades blotting med användning av en ECL-lösning (Bio-Rad).

Statistisk analys

Alla experimentella data presenteras som ett genomsnitt ± standardfel. Skillnader mellan grupperna testades med användning av ANOVA. Jämförelser av behandlingsgrupper med kontrollgrupper utfördes genom användning av Bonferroni Dunn-test. Ett testresultat med ett p- värde <0, 05 ansågs vara signifikant.

Resultat

Effekt av hög glukos på AP-sekretion och neuronal celldöd in vivo och in vitro

För att bestämma effekten av hög glukos på Ap-uttryck in vivo utförde vi immunhistokemisk färgning av hippocampalregionen ( Cornu Ammonis ; CA1-CA3) i hjärnvävnader med ZLC-kontrollmodeller och ZDF-diabetiska råtta. Proteinuttryck av Ap och fosforylerad tau var tydligare i ZDF-hjärnvävnad än i ZLC-hjärnvävnad (Fig. 1a). Bland de immunohistokemiska resultaten var antalet AP och fosforylerade tau-positiva celler större i ZDF-hjärnvävnad än i ZLC-hjärnvävnad (Fig. 1b). För att undersöka effekten av hög glukos in vitro , behandlades SK-N-MC-celler med olika koncentrationer av D-glukos (5–25 mM) under 24 timmar. Genom att utföra immunutfällning av Ap i mediet observerade vi att den höga glukosdosen (D-glukos; 25 mM) stimulerade A-sekretion. 20 mM L-glukosbehandling påverkade emellertid inte A-sekretion (Fig. 1c). Såsom visas i fig. Ld ökade fluorescensintensiteten hos p-tau vid serin 396-återstoden till 206% med 25 mM D-glukos, inte 25 mM L-glukosbehandling. Dessutom kontrollerade vi tau-fosforylering och tillhörande kinaser för att bestämma effekten av ökad A-sekretion till följd av hög glukosbehandling. Våra resultat visade att D-glukosbehandling inducerade fosforylering av GSK-3p och AKT, ett huvudsakligt kinas som involverade i tau fosforylering 30, 31, 32, 33, 34 (Sup. Fig. 4a, b). Vidare undersökte vi effekten av D-glukos på apoptos av SK-N-MC-celler. Resultaten från testpanelsblått-uteslutningen visade att D-glukos, inte L-glukos, minskade SK-N-MC-cellens livskraft på ett dosberoende sätt (Fig. 1e). I överensstämmelse med detta resultat visade vår annexin V / PI FACS-analys att hög glukos ökade annexin V-positiva eller PI-positiva SK-N-MC-celler på ett dosberoende sätt (Fig. 1f). Därefter bedömde vi uttryck av BACE1, Presenilin-1 (PSEN1) och APP-C99 för att undersöka effekten av hög glukos på AP-utsöndring på regleringen av enzymuttryck in vivo och in vitro . Våra Western blot-analysresultat visade att BACE1- och APP-C99-uttryck var större i ZDF-råttor än i ZLC-råttor (Fig. 2a). De immunohistokemiska resultaten visade att antalet BACE1- och APP-C99-positiva celler var signifikant högre i ZDF än i ZLC-råttmodeller (fig. 2b). Det fanns emellertid inga signifikanta skillnader i PSEN1-expressionsnivåer eller PSEN1-positiva cellantal i hjärnvävnaderna i ZLC- och ZDF-råttmodeller (Sup. Fig. 5a, b). I våra resultat med hippocampal neuron från mus inducerades uttryck av BACE1 och APP-C99 genom D-glukosbehandling (Fig. 2c). I överensstämmelse med resultaten in vivo ökade hög glukos bace1- mRNA-expressionsnivån (fig. 2d). Och både BACE1- och APP-C99-uttryck ökades med D-glukos, men L-glukosbehandling (Fig. 2e). Dessutom inducerade D-glukos fosforylering av AKT och GSK-3p, avfosforylerat genom BACE1 siRNA-transfektion (Sup. Fig. 4b). AKT-inaktivering genom förbehandling av wortmannin reducerade GSK-3p och tau-fosforylering (Sup. Fig. 4c). Dessutom fann vi att vi behandlade D-glukos till olika cellinjer inklusive SK-N-MC, MEF och CACO-2. I vårt resultat ökade 25 mM D-glukosbehandling BACE1-uttrycket i SK-N-MC, men är ineffektivt i MEF och CACO-2 (Sup. Fig. 6). På grundval av våra vivo- och vitro-data föreslår vi att en hög glukosnivå stimulerar BACE1-uttryck och aktivering, vilket sedan leder till AP-produktion i nervceller.

Image

( a ) Ap-, fosforylerad tau- och p-aktinproteinuttryck av ZLC- och ZDF-hjärnvävnader detekterades genom western blotting. ( b ) Objektglasprover för immunohistokemi immunofärgades med specifika Ap- och p-tau (Ser 396 ) -antikroppar och PI. Bilder som visas i resultatet är representativa. Alla skalstänger, 200 μm (förstoring av lågt och högeffektfält, × 100 och × 200). ( c ) Utsöndrad Ap från SK-N-MC i medium detekterades genom immunutfällningsanalys. Immunutfällt Ap analyserades genom western blotting. ( d ) Celler immunfärgades med p-tau (Ser 396 ) och PI. Skalstänger, 50 μm (förstoring, × 800). Fluorescensintensiteten för p-tau analyserades med användning av Image J-programvaran (utvecklad av Wayne Rasband, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA; //rsb.info.nih.gov/ij/). Resultaten är representativa för fem oberoende experiment. Data presenteras som ett genomsnitt ± SE för sex oberoende experiment. * p <0, 05 mot 5 mM D-glukosbehandling. ( e ) Cellviabilitet mättes med trypanblå uteslutningsanalys. Data presenteras som ett genomsnitt ± SE för tre oberoende experiment med duplexskålar. ( f ) Viabla celler detekterades med användning av annexin V / PI-analys. Data presenteras som ett genomsnitt ± SE för två oberoende duplexrätter. Varje Western blot-resultat som visas är representativa bilder av tre oberoende experiment. * p <0, 05 mot 5 mM D-glukosbehandling. All Western blot-data beskärdes och förvärvades under samma experimentella förhållanden.

Bild i full storlek

Image

( a ) BACE1 och APP-C99 uttryck av ZLC och ZDF hjärnvävnader detekterades genom western blotting. Varje data som visas i resultatet är representativa bilder av fem oberoende experiment. ( b ) Vävnadsprover för immunohistokemi bestämdes med immunförsvar med BACE1 och APP-C99-antikroppar. Bilder som visas i resultatet är representativa. Alla skalstänger, 200 μm (förstoring av lågt och högeffektfält, × 100 och × 200). ( c ) Hippocampal neuron från mus inkuberades med 25 mM D-glukos under 24 timmar BACE1, APP-C99 och p-aktinuttryck av mushippocampal neuron detekterades genom western blotting. Varje data som visas i resultatet är en representativ bild av fem oberoende experiment. ( d ) Totalt mRNA extraherat från SK-N-MC omvänd transkriberades och därefter förstärktes bace1- och p-aktin- mRNA-uttryck genom PCR. MRNA-uttrycket av bace1 analyserades med kvantitativ realtids-PCR. MRNA-expressionsnivån normaliserades med p-aktin- mRNA-expressionsnivå. Data presenteras som ett genomsnitt ± SE för tre oberoende duplexrätter. ( e ) bace1 och non-targeting (NT) siRNA transfekterades till cellen under 12 timmar före D-och L-glukosbehandling under 24 timmar BACE1, APP-C99 och p-aktinuttryck detekterades genom western blotting. Varje Western blot-bild är representativ för tre oberoende experiment. Data presenteras som ett genomsnitt ± SE * p <0, 05 mot 5 mM D-glukosbehandling. All Western blot-data beskärdes och förvärvades under samma experimentella förhållanden.

Bild i full storlek

Involvering av högt glukosinducerat HIF-la-uttryck i BACE1-uttrycket

Dessutom undersökte vi rollen för intracellulär ROS-generering i BACE1-expression av SK-N-MC-celler. DCF-DA-färgningsanalysresultaten visade att den intracellulära ROS-nivån var 198% av 5 mM D-glukosnivån i den 25 mM höga glukosbehandlingsgruppen (fig. 3a). Dessutom minskade ROS-scavenger-NAC-förbehandling de 25 mM D-glukosinducerade BACE1- och APP-C99-proteinuttrycken (Fig. 3b). Såsom visas i fig. 3c, d, ökade behandling med hög glukos HIF-la-expression i musens hippocampalneuron och SK-N-MC, medan uppreglering av HIF-la-uttryck minskades genom NAC-förbehandling (fig. 3e). Dessutom stimulerade hög glukosbehandling kärntranslokation av HIF-la (Fig. 3f, g). Our CHIP results showed that the high glucose treatment stimulated binding of HIF-1α to the hypoxia responsive element (HRE) of the bace1 gene promoter, while silencing of HIF-1α protein expression inhibited high glucose-induced BACE1 expression (Fig. 3h–j). These results indicate that high glucose directly regulates BACE1 expression via HIF-1α.

Image

( a ) DCF-DA–sensitive SK-N-MC cells were visualized by confocal microscopy. Scale bars, 50 μm (magnification, ×600). Intracellular ROS generation was quantified by using luminometer. Data are presented as a mean ± SE of two independent sixth dishes. ( b ) BACE1, APP-C99 and β-actin expressions were detected by western blotting. ( c ) Mouse hippocampal neuron was incubated with 25 mM D-glucose for 24 h HIF-1α and β-actin expressions of mouse hippocampal neuron were detected by western blotting. Each data shown in the result is representative image of five independent experiments. ( d, e ) NAC (5 mM) was pretreated to cells, and then HIF-1α and β-actin expressions of SK-N-MC were detected by western blotting. ( f ) Non-nuclear protein and nuclear expressions were normalized by β-tubulin and lamin A/C repectively. ( g ) Cells were immunostained with HIF-1α and PI. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( h ) DNA was immunoprecipitated with RNA polymerase, IgG and HIF-1α antibodies. The immunoprecipitation and input samples were amplified with primers of gapdh and bace1 gene promoters. ( i ) Quantatative data was analyzed by real time PCR of two independent experiments of triple dishes. ( j ) SK-N-MC cells were transfected by siRNAs for 24 h prior to D-glucose treatment. HIF-1α, APP-C99, BACE1 and β-actin were detected by western blotting. Each western blot image shown is representative of three independent experiments. Data are presented as a mean ± SE * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Bild i full storlek

Role of high glucose-mediated ROS generation in LXR-mediated ABCA1 expression and cholesterol accumulation

To examine the effect of D-glucose on LXR in SK-N-MC cells, we determined the effect of high glucose on mRNA expressions of lxrα and lxrβ in SK-N-MC cells. Both lxrα and lxrβ mRNAs were expressed in SK-N-MC cells; however, their mRNA expression levels were not changed by high glucose treatment (Sup. Fig. 7a, b). We treated with various concentrations of D-glucose (5–50 mM) for 24 h and examined subsequent LXRα and LXRβ protein expressions. High glucose decreased LXRα expression in a dose-dependent manner, but LXRβ expression was not affected by the D-glucose treatment (Fig. 4a). Moreover, high glucose reduced nuclear translocation as well as fluorescence intensity of LXRα (Fig. 4b, c). In addition, based on western blot and immunocytochemistry analyses D-glucose increased RXRα expression in a dose-dependent manner (Sup. Fig. 7c, d). Western blot results from ZLC and ZDF rats showed that LXRα protein expression was lower in ZDF rats than in ZLC rats (Fig. 4d). Immunohistochemical results showed that the number of LXRα-positive cells was lower in ZDF rats than in ZLC rats, but the number of RXR-positive cells was higher in ZDF rats than in ZLC rats (Fig. 4e and Sup. Fig. 7e). Consistent with these results, LXRα expression in mouse hippocampal neuron was reduced by high glucose treatment (Fig. 4f). As shown in Fig. 4g, a decrease in LXRα expression by high glucose treatment was reversed by pretreatment with ROS scavenger NAC. In addition, D-glucose stimulated JNK phosphorylation at the Thr 183 and Tyr 185 residues in a dose-dependent manner (Fig. 4h). High glucose-reduced LXRα expression was reversed by pretreatment with JNK inhibitor SP600125, but not with ERK inhibitor PD98059 (Fig. 4i and Sup. Fig. 8a). Furthermore, we performed immunoprecipitation to investigate the effect of high glucose on LXRα/RXRα heterodimer formation, and the results indicated that high glucose disrupted LXRα/RXRα heterodimer formation (Sup Fig. 8b). Those results suggest that high glucose-induced ROS generation contributes to a decrease in LXRα expression through the JNK pathway, and is followed by inhibition of LXRα nuclear translocation and LXRα/RXRα heterodimer formation. Next, we investigated the role of LXRα in intracellular cholesterol regulation. Our results from cholesterol measurement assaying and filipin III staining showed the intracellular cholesterol level in 25 mM D-glucose-treated SK-N-MC cells increased to 223% of that in 5 mM D-glucose-treated cells (Fig. 5a, b). The high glucose treatment reduced abca1 mRNA expression, but not the abcg1 mRNA expression; moreover, the abca1 mRNA expression was reversed by LXR agonist TO901317 pretreatment (Fig. 5c and Sup. Fig. 9). In addition, D-glucose decreased ABCA1 protein expression in a dose-dependent manner (Fig. 5d). Furthermore, the fluorescence intensity of ABCA1 was decreased by the high glucose treatment (Fig. 5e). By using the CHIP assay, we confirmed high glucose-induced binding of LXR to the LXR element (LXE) region of the abca1 promoter was blocked by TO901317 pretreatment (Fig. 5f, g, and Sup. Fig. 11).

Image

( a ) LXRα, LXRβ and β-actin were detected by western blotting. ( b ) Cells were immunostained with LXRα and PI. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( c ) LXRα, lamin a/c and β-tubulin in the non-nuclear and nuclear fractions were detected by western blotting. Non-nuclear protein and nuclear expressions were normalized by β-tubulin and lamin A/C repectively. ( d ) LXRα and β-actin protein expressions of the ZLC and ZDF brain tissues were detected by western blotting. ( e ) Immunohistochemistry with ZLC and ZDF tissues were performed with LXRα-specific antibody and PI. All scale bars, 200 μm (magnification of low and high power field, ×100 and ×200). ( f ) Mouse hippocampal neuron was incubated with 25 mM D-glucose for 24 h LXRα and β-actin expressions of mouse hippocampal neuron were detected by western blotting. Each data shown in the result is representative image of five independent experiments. ( g ) SK-N-MC was incubated with NAC (5 mM) for 30 min before D-glucose treatment. LXRα and β-actin expressions were analyzed by western blotting. ( h ) Phosphorylated JNK, JNK and β-actin expression were detected by western blotting. ( i ) SK-N-MC was incubated with SP600125 (1 μM) for 30 min before D-glucose treatment. LXRα expression was detected by western blotting. Each western blot image is representative of three independent experiments. Data are presented as a mean ± SE * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Bild i full storlek

Image

( a ) Total cholesterol level is measured by using cholesterol detection kit described in Materials & Methods. Data are presented as a mean ± SE of three independent experiments of duplex dishes. ( b ) Intracellular cholesterol was stained with fillipinIII, and visulalized by confocal microscopy. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( c ) TO901317 (1 μM) pretreated to SK-N-MC prior to D-glucose treatment. Total mRNA expressions of abca11 and β-actin were analyzed by quantitative real-time PCR. The mRNA expression level was normalized by β-actin mRNA expression level. Data are presented as a mean ± SE of three independent duplex dishes. ( d ) ABCA1 and β-actin expressions were detected by western blotting. ( e ) Cells were immunostained with ABCA1 and PI. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( f ) DNA was immunoprecipitated with RNA polymerase, IgG and LXRα antibodies. The immunoprecipitation and input samples were amplified with primers of gapdh and abca1 gene promoters. ( g ) CHIP data was quantified by real time PCR of two independent experiments of triple dishes. Each western blot image is representative of three independent experiments. Data are presented as a mean ± SE * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Bild i full storlek

Role of localization of BACE1 on the lipid raft in amyloidogenesis and apoptosis of SK-N-MC

To clarify the effect of high glucose on BACE1 localization, we performed sucrose gradient fractionation and immunocytochemical staining. As shown in Fig. 6a, high glucose stimulated translocation of BACE1 from the non-lipid raft part (fractions #7–#12) to the lipid raft part (fractions #4–#6). BACE1 expression in the lipid raft part (fractions #4-#6) was significantly increased by high glucose treatment (Fig. 6b). In addition, high glucose stimulated BACE1 and APP-C99 localizations in the lipid raft after being disrupted by TO901317 pretreatment (Fig. 6c). In addition, lipid raft disruption by MβCD pretreatment inhibited Aβ secretion (Fig. 6d). To confirm the effect of high glucose-induced BACE1 expression on amyloidogenesis and cell viability, we transfected bace1 siRNA into SK-N-MC cells. As shown in Fig. 6e, high glucose-induced Aβ secretion was reduced by knockdown of BACE1 expression. In addition, we determined the expressions of apoptosis markers caspase-9 and 3 to examine the role of high glucose-induced BACE1 expression in apoptosis of SK-N-MC cells. Our results showed that silencing of BACE1 expression inhibited expressions of cleaved caspase-9 and 3 (Fig. 6f). We confirmed that high glucose-induced apoptosis of SK-N-MC cells was decreased by inhibition of BACE1 expression by performing trypan blue exclusion assays and annexin V/PI FACS analyses (Fig. 6g, h). Based on these results, our findings indicate that high glucose-induced BACE1 localization and expression on the lipid raft is important for Aβ secretion and apoptosis of SK-N-MC cells.

Image

( a ) SK-N-MC was incubated with TO901317 (1 μM) for 30 min prior to D-glucose treatment. Sucrose gradient-fractionized samples were blotted with BACE1, caveolin-1, flotillin-2 and β-actin-specific antibodies. ( b ) The same volumes of lipid raft fraction (#4–6) were loaded to SDS-PAGE gel, blotted with BACE1 and caveolin-1-specific antibodies. ( c ) Cells were stained with APP-C99, BACE1 and CTB, visualized by confocal microscopy. Scale bars, 50 μm (magnification, ×800). ( d, e ) Cells were incubated with MβCD and transfected with bace1 and NT siRNAs prior to D-glucose treatment. Secreted Aβ in medium was analyzed by immunoprecipitation assay. ( f ) The bace1 and NT siRNAs-transfected SK-N-MC samples were blotted with BACE1, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 and β-actin-specific antibodies. ( g ) Cell viability was measured by trypan blue exclusion assay. Data are presented as a mean ± SE of three independent experiments with duplex dishes. ( h ) Viable cells were detected by using annexin V/PI analysis. Data are presented as a mean ± SE of two independent duplex dishes. Each western blot image is representative of three independent experiments. * p < 0.05 versus 5 mM of D-glucose treatment, # p < 0.05 versus 25 mM of D-glucose treatment. All western blot data were cropped and acquired under same experimental conditions.

Bild i full storlek

Diskussion

In the present study, we have shown that high glucose-induced BACE1 expression and the reorganization of the lipid raft through cholesterol accumulation stimulate Aβ production (Fig. 7). Our results show that the brain of ZDF rats exposed to high glucose exhibits increases in Aβ deposition and tau phosphorylation levels, which suggest the existence of a connection between two main pathophysiological features of AD; that is, Aβ production/secretion and tau phosphorylation. Thus, we investigated how a high glucose level affects APP processing in neuronal cell with mouse hippocampal neuron and SK-N-MC. Consistent with the ZDF rat model results, high glucose (D-glucose; 25 mM), but not high L-glucose (20 mM), stimulated Aβ production and tau phosphorylation, which suggests that the in vitro experimental model using SK-N-MC cells reflects an in vivo diabetic condition. A low D-glucose level (5 mM) was used as a control, and reflects the normal plasma glucose concentration of non-diabetic individuals. According to previous study, fasting blood glucose level in lean subjects maintains a narrow range of approximately 4.8 ± 0.1 mmol/L, whereas type 2 diabetes patients present a high fasting plasma glucose level of 11.1 ± 0.9 mmol/L 35 . In addition, our results showed that high glucose-induced Aβ production, tau phosphorylation, and apoptosis are mainly dependent on alteration of glucose metabolism rather than on an osmotic effect. Consistent with our findings, previous investigators have reported that the hyperglycemic condition in DM is closely linked to diabetic neuropathy and apoptosis 36, 37 . Moreover, we presented that high glucose induced SK-N-MC apoptosis in a dose dependent manner. In the previous reports, it is suggested that high glucose treatment or hyperglycemic condition induces ROS and BACE1-mediated Aβ production, critical to high glucose-induced neuronal cell apoptosis 38, 39, 40, 41 .

Image

High glucose stimulates ROS production, leads to increase of HIF-1α for nuclear translocation and phosphorylation of JNK. Translocated HIF-1α is bound to HRE promoter region of bace1 gene, subsequently increases BACE1 expression. Phosphorylated JNK stimulates decrease in LXRα expression, reduced binding LXRα to the LXE promoter region of abca1 gene, leads to reduction of ABCA1 expression and intracellular cholesterol accumulation which may be involved in high glucose-induced lipid raft reorganization. In addition, high glucose-lipid raft modification induces BACE1 expression on the lipid raft, stimulates to Aβ secretion in SK-N-MC.

Bild i full storlek

In this study, we found that ZDF rats exhibited higher levels of APP-C99 and BACE1 expressions than those in ZLC rats, and that high glucose treatment stimulated APP-C99 and BACE1 expressions in mouse hippocampal neuron and SK-N-MC. These results indicate that a high glucose level itself is a risk factor for AD through the regulation of BACE1. As shown in Sup. Fig. 4a–c, our observation suggest the possibility that high glucose-induced BACE1 expression regulates AKT phosphorylation, involved in GSK-3β phosphorylation at Ser 9 and tau phosphorylation at Ser 396 . It has been reported that phosphorylation of AKT and GSK3β might be associated with tau phosphorylation at Ser 396, and the GSK-3β phosphorylation at Ser 9 is a downstream target of AKT activation 42, 43, 44 . Although the phosphorylation of GSK-3β at Ser 9 has an inhibitory role in GSK3β activity, there have been several reports suggesting induction of oxidative stress and inactivation of PP2A increase GSK-3β phsphorylation at Ser 9 and activity via another alterative pathway such as a calpain activation, which is important for tau phosphorylation in AD brain 31, 45, 46, 47, 48, 49, 50 . In addition, our results indicate that high glucose-induced BACE1 expression is mainly regulated by ROS generation and HIF-1α expression. Oxidative stress, resulting from hyperglycemia-induced ROS generation under diabetic conditions, has been associated with various neurodegenerative diseases including AD 51 . Thus, deciphering the underlying molecular mechanisms involved in the effect of high glucose-induced oxidative stress on AD pathogenesis is necessary for elucidating the linkage between DM and AD. It has been reported that the alteration of glucose metabolism is tied to the activation of the transcription factor HIF-1α, mediated by an increase in ROS generation 51, 52 . Interestingly, both a previous report and our data presented in Sup. Fig. 10 suggest that a functional HRE is present in the bace1 promoter 53 . In addition, another investigation reported that upregulated HIF-1α increased mRNA and protein expression of BACE1, but that hif-1α knock-out mouse exhibit a decrease in BACE1 expression in the hippocampus, suggesting a link between HIF-1α and Aβ processing under diabetic conditions 54 . Consistent with those results, our data showed that ZDF rats exhibit a high level of BACE1 expression, and that a high glucose condition stimulates the binding of HIF-1α to the bace1 gene promoter, and subsequently increases the bace1 promoter transcription level. These findings suggest that a high glucose condition stimulates Aβ production through HIF-1α-dependent direct expression of BACE1, and high glucose-induced oxidative stress has a critical role in the pathogenesis of AD.

Based on our study results, we suggest that high glucose decreases ABCA1 expression through JNK-reduced LXRα expression and binding to the abca1 gene promoter. Although the role of ROS in LXR expression or activation has not been completely described, several researchers have reported that JNK, which can be activated by ROS, regulates LXR activation 55, 56 . In addition, LXR phosphorylation by JNK stimulates the export of liver rich transcription factors, including LXR, which has a nuclear export signal-containing DNA-binding domain from the nucleus and inactivates LXR for degradation in the cytoplasm 57, 58, 59, 60 . These findings suggest the possibility that ROS-induced JNK phosphorylation resulting from high glucose levels stimulates export of inactivated LXR from the nucleus, leading to degradation, and is responsible for high glucose-reduced LXRα expression. Moreover, we found that high glucose reduced LXRα only, not LXRβ, even though high glucose did not affect mRNA expressions of either LXRα or LXRβ. A previous investigation demonstrated that LXRα and LXRβ have similar protein structures, but their nuclear localization is differently controlled 61, suggesting that differently regulated nuclear localization of LXRs could contribute to high glucose-reduced LXRα expression. Furthermore, our results showed that formation of a LXRα/RXRα heterodimer and binding of LXRα to LXE of the abca1 promoter were reduced by high glucose, even though high glucose increased RXRα expression. It has been well documented that activated LXR stimulates formation of a heterodimer with RXR and controls transcriptional activity of the abca1 gene 62, 63 . Indeed, Repa et al . reported pharmacological activation of LXR with an LXR agonist can induce ABCA1 expression via LXR/RXR heterodimer formation 64 . These findings indicate that high glucose-inhibited formation of the LXRα/RXRα heterodimer can control ABCA1 expression. However, additional investigation into the role of increased RXRα by high glucose in AD pathogenesis is needed.

The present study has shown that high glucose can increase the intracellular cholesterol level, and that action is associated with LXR/ABCA1-mediated lipid raft reorganization. Although there are reports that reverse cholesterol transport (RCT) by LXR is involved in the pathological condition in AD, with the exception of atherosclerosis in mice, the role of RCT in AD pathogenesis under diabetic condition has not been fully described 65 . Regardless, previous reports and the results of the present study suggest that high glucose-induced LXR-mediated cholesterol accumulation is closely related to progression in AD. In addition, our results showing that high glucose increases expression of BACE1, located in the lipid raft, suggests the possible role of cholesterol and lipid raft on APP processing by BACE1. As cholesterol serves as a structural part between sphingolipid hydrocarbon chains in the lipid raft, alteration of the cholesterol content of cells can result in lipid raft reorganization. In fact, several previous investigations have demonstrated that altered free cholesterol and plasma membrane cholesterol have an influence on lipid raft structure and functions 66, 67, 68, suggesting that the alteration of intracellular cholesterol level could be an important regulator of lipid raft reorganization. In the present study, high glucose stimulated changes in cholesterol in the lipid bilayer and affected APP processing through regulation of lipid raft reorganization, which elicits BACE1 activity and thus stimulates Aβ production and apoptosis of SK-N-MC cells. Consistent with these results, there is mounting evidence that cholesterol has a critical role in the regulation of BACE1 activity and the cleavage of APP. In addition, it has been reported that an increase in dietary cholesterol uptake stimulates amyloid plaque formation, while the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA–reductive (HMG-CoA–reductase) inhibitor relieves the neurological symptoms of AD 69 . These previous and current findings suggest that regulation of high glucose-induced lipid raft reorganization plays an important role in Aβ production via regulation of BACE1 activity, and such regulation has potential as a novel therapeutic approach to controlling BACE1 expression and activation thereby leading to neuronal cell death.

Taken together, our observations with ZLC/ZDF rat brain, mouse hippocampal neuron and SK-N-MC cell line suggest the possible role of high glucose in Aβ production as a risk factor associated with AD occurrence in diabetic patients. Furthermore, the high glucose-induced increase in HIF-1α and decrease in LXRα-mediated cholesterol accumulation appear to act as intermediate regulators linking DM and AD. Therefore, those affected pathways could be used in the development of therapeutic strategies and identification of selective targets for prevention of AD occurrence in DM patients. In conclusion, high glucose stimulates BACE1 through HIF-1α expression and LXRα/ABCA1-mediated localization in the lipid raft, actions that are important for high glucose-induced Aβ production and neuronal cell apoptosis.

ytterligare information

How to cite this article : Lee, HJ et al . High glucose upregulates BACE1-mediated Aβ production through ROS-dependent HIF-1α and LXRα/ABCA1-regulated lipid raft reorganization in SK-N-MC cells. Sci. Rep . 6, 36746; doi: 10.1038/srep36746 (2016).

Förlagets anmärkning : Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.