Mikrostrukturell visualisering av hög kontrast med naturliga acellulära matriser med hjälp av fasbaserad röntgen-tomografi | vetenskapliga rapporter

Mikrostrukturell visualisering av hög kontrast med naturliga acellulära matriser med hjälp av fasbaserad röntgen-tomografi | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Tillämpad fysik
  • vävnader

Abstrakt

Acellulära ställningar som erhålls genom decellularisering är ett viktigt instrument inom regenerativ medicin både i sig och för att driva utvecklingen av framtida generationens syntetiska ställningar som kan bli tillgängliga utanför hyllan. Inom denna ram är bildbehandling nyckeln till förståelsen av byggnadsställningens inre struktur såväl som deras interaktion med celler och andra organ, inklusive idealiskt efterimplantation. Byggnadsställningar av ett brett spektrum av intrikata organ (matstrupe, lunga, lever och tunntarmen) avbildades med röntgenfasskontrastberäknad tomografi (PC-CT). Bildkvaliteten var tillräckligt hög för att visualisera byggnadsställningens mikroarkitektur och för att upptäcka viktiga anatomiska särdrag, såsom slemhinnans slemhinnor-submukosalseparation, lungalveoler och tarmvilli. Dessa resultat är ett långt eftersökt steg inom området för regenerativ medicin; hittills har histologi och skanningselektronmikroskopi varit guldstandarden för att studera ställningen. De är emellertid båda destruktiva: följaktligen är de inte lämpliga för avbildning av byggnadsställningar före transplantation och har inga utsikter till användning efter transplantation. PC-CT, å andra sidan, är icke-förstörande, 3D och helt kvantitativt. Det är viktigt att vi inte bara visar att hög bildkvalitet uppnås vid två olika synkrotronanläggningar, utan också med kommersiell röntgenutrustning, vilket gör metoden tillgänglig för alla forskningslaboratorier.

Introduktion

Efterfrågan på organtransplantation har snabbt ökat under det senaste decenniet. Samtidigt förhindrar en allvarlig givarbrist och den troliga avvisningen av transplantationsorgan att detta krav uppfylls. Tissue engineering (TE), en växande underdisciplin för regenerativ medicin, erbjuder ett terapeutiskt alternativ. Det syftar till att utveckla lämpliga ersättningar för vävnader och organ från cellfria ställningar, som är befolkade med stamceller från organmottagaren 1 . I allmänhet är utmaningen att generera byggnadsställningar som tillåter och främjar celltillväxt, vilket kräver biokompatibilitet, en lämplig biologisk nedbrytningsprofil och mekaniska egenskaper, komponenter och mikroarkitektur som efterliknar miljön i det organ som ska konstrueras. Byggnadsställningar har traditionellt delats upp i syntetiska material och naturliga acellulära matriser (ACM). Medan syntetiska ställningar har visat avsevärd framgång i både pre-kliniska och kliniska applikationer för enkla organ såsom urinblåsa, urinrör och luftrör 2, 3, 4, hittills hittade de begränsad tillämpning för produktion av mer komplexa modulära organ, såsom levern och lungan. Omvänt har ACM hög potential i produktionen av komplexa byggnadsställningar på grund av deras inneboende förmåga att återskapa den tredimensionella makro- och mikroarkitekturen i varje organ 5 . Som sådan kan förståelse av deras interaktioner med cellerna som används för att återfolka dem utgöra ett viktigt instrument för den framtida utvecklingen av mer komplexa syntetiska ställningar: detta kräver en lämplig icke-förstörande avbildningsmetod, som är huvudämnet för uppsatsen.

ACM: er kommer från djur- eller mänskliga organ som har behandlats för att avlägsna celler och immunogent material. En lämplig decellularisationsprocedur tar bort cellulärt material samtidigt som vävnadsmikroarkitektur, mekaniska egenskaper, extracellular matrix (ECM) och tillhörande tillväxtfaktorer bevaras. ACM: er har emellertid generellt erhållits med hårda kemikalier som tenderar att förstöra ECM, och därmed hindra översättning till klinisk användning. Nuvarande forskning syftar till att utveckla ”skonsamma” dekellulariseringsstrategier som eliminerar cellpopulationen samtidigt som mikroarkitektur och ECM-komponenter bevaras 6 . Detta är särskilt viktigt för organ som är intrikata både i struktur och funktionalitet (t.ex. lunga, lever, njurar och de organ som tillhör mag-tarmkanalen), eftersom bevarande av mikroarkitektur är ett avgörande krav för noggrann celltillväxt och eventuell transplantation. Validering av dekellulariseringsprocessen kräver förståelse för om den ursprungliga vävnadsmikroarkitekturen har bevarats. Även om detta skulle uppnås genom att visualisera byggnadsställningar efter dekellularisering, saknar TE-samhället för närvarande en avbildningsmodalitet som kan producera bilder med tillräckligt hög kontrast och upplösning samtidigt som de inte är förstörande 7 De flesta etablerade avbildningsmetoder kan endast användas i begränsad utsträckning. MicroCT lyckas inte uppnå tillräcklig mjukvävnadskontrast. Magnetic Resonance Imaging (MRI) kämpar för att uppnå den nödvändiga rumsliga upplösningen (helst mikrometer) inom korta skanningsperioder. Dessutom är MRI-skannrar kostsamma och kan vara svåra att komma åt, medan en lämplig avbildningsmodalitet skulle krävas för att hantera en hög provström. Histologi och skanningselektronmikroskopi (SEM) har tillhandahållit användbara bilder av ACM: er 8 och är de mest använda metoderna för att validera decellulariseringsmetoder; emellertid kräver de båda förstörande provberedning. Detta är en stor nackdel med tanke på att ställningar inte kan avbildas före transplantation. Dessutom måste implanterade ställningar slutligen övervakas in vivo , vilket betonar det akuta kravet på icke-förstörande, hög kontrast och högupplösta bilder.

I den här artikeln demonstrerar vi att gränserna för etablerade avbildningsmodaliteter kan övervinnas genom röntgenfaskontrast (PC) computertomografi (CT), en nyligen starkt undersökta radiografisk metod som utnyttjar fasskift snarare än dämpningsskillnader för att generera kontrast 9 . PC-CT har tidigare applicerats på vävnadstekniska prover 10, 11 ; ett brett spektrum av prover har emellertid ännu inte beaktats. Vi presenterar bilder av ACM som härrör från matstrupen, lever, lunga och tunntarmen, eftersom dessa organ för närvarande är av stort intresse för TE-samhället 12, 13, 14, 15 . Misslyckande av dessa organ kräver mestadels transplantation som en definitiv behandling, och på grund av en kritisk givarbrist, förlitar de sig starkt på framstegen inom regenerativ medicin.

Byggnadsställningar härrörde via en ny, "mild" decellulariseringsmetod med namnet detergent enzymatisk behandling (DET) och variationer därav 6, 8, 16 . Tidigare har DNA-kvantifiering, histologi och SEM visat att DET på ett tillförlitligt sätt bevarar ställningens mikroarkitektur. På grund av den höga upplösningen, den starka mjukvävnadskontrasten och den volymetriska naturen visar vi att PC-CT möjliggör samma bedömning utan någon färgning eller destruktiv provberedning. Detta är ett mycket värdefullt resultat för TE-samhället, eftersom a) det möjliggör en enkel bedömning av tillförlitligheten i dekellulariseringsprocessen och b) det tillåter avbildning av byggnadsställningar före transplantation, vilket innebär att metoden i slutändan kan användas för kvalitetskontroll i regenerativ medicin. Dessutom kan den icke-destruktiva naturen och den höga penetrationen av röntgenfasavbildningsmetoder i framtiden möjliggöra uppföljning efter transplantation av transplanterade ställningar in vivo .

Medan de flesta avbildningar utfördes med synkrotronstrålning, är ett viktigt resultat som presenteras i denna artikel demonstrationen att en jämförbar bildkvalitet erhålls med en laboratoriebaserad installation, vilket möjliggör en snabb och utbredd användning av metoden inom TE-samhället. Även om vi här demonstrerar bildkvalitet som är jämförbar med den som erhålls vid synkrotroner med hjälp av ett kantbelysningsbaserat PC-CT-system, kan man förvänta sig liknande bildkvalitet också med ett gitterbaserat system 17, vilket gör de rapporterade resultaten ännu mer allmänna och tillgängliga för en bredare samhälle.

Material och metoder

Provberedning

Alla kirurgiska ingrepp och djuruppfödning genomfördes i enlighet med brittiska inrikesrådets riktlinjer enligt lagen om djur (vetenskapliga förfaranden) 1986 och godkändes av den lokala etiska kommittén (University College London, Storbritannien; projektlicens: 70/2719).

Matstrupe

Vuxna Nya Zeelandskaniner avlivades genom administrering av en överdos av intravenöst Pentobarbital Sodium (Sigma, Storbritannien). Buken steriliserades med 70% etanol och ett snitt i mittlinjen gjordes för att helt exponera buk- och bröstkaviteterna. Matstrupen skördades från livmoderhalscentralen till gastresophageal-korsningen. Esophageal lumen kanylerades och tvättades med fosfatbuffrad saltlösning innehållande 5% antibiotisk antimykotisk lösning (PBS / AA; Sigma, UK). Den perfunderades med kontinuerlig vätsketillförsel med användning av en Masterflex L / S-rullpump med variabel hastighet (Cole-Parmer, UK) vid 1 ml / min. Matstrupen infunderades med detergent-enzymatisk behandling (DET) bestående av avjoniserat vatten (resistivitet 18, 2 MU / cm; dH20) vid 4 ° C under 24 timmar, 4% natriumdeoxikolat (Sigma, UK; SDC) vid rumstemperatur (RT) under 4 timmar och 2000 kU deoxiribonukleas-I (Sigma, Storbritannien; DNase-I) i 1 M natriumklorid (Sigma, Storbritannien; NaCl). Processen upprepades under tre cykler för att säkerställa tillräcklig decellularisering. Efter behandling bevarades konstruktionerna vid 4 ° C i PBS / AA. Proven fixerades i 2, 5% glutaraldehyd (GA) i 0, 1 M fosfatbuffert och lämnades i 24 timmar vid 4 ° C. Efter GA-fixering fixerades proverna i 1% OsO 4 / 0, 1 M fosfatbuffert (pH 7, 4). Efter sköljning med dH20, dehydratiserades prover i en graderad etanol-vatten-serie till 1000% etanol och torkades kritiskt med användning av CO2.

Lunga

Vuxna Sprague-Dawley-råttor, som väger 320–350 g, avlivades genom CO 2 -inhalering och exsanguination. En mittlinje-thorakotomi utfördes, musklerna i huvudet och nacken dissekerades bort från mittlinjen och luftröret delades ovanför krikoidbrosket. Tymusen avlägsnades och lungartären kanylerades via höger förmak, säkrades med suturer, spolades med PBS / AA och de underordnade och överlägsna vena cavae transekterades. Lungen mobiliserades från cricoidbrosket och dissekerades fritt från dess fästen till matstrupen och bröstkaviteten. Luftstrupen kanylerades och spolades med PBS / AA för att tvätta vaskulärt träd och förhindra koagulering. Proverna decellulariserades via DET med intratrakeal insufflering med antingen kontinuerlig eller intermittent inflation. I den kontinuerliga gruppen ("kontinuerlig DET") perfluderades luftstrupen med hjälp av en Masterflex L / S variabel hastighetsvalspump vid 0, 6 ml / min. Lungen perfunderades med dH20 vid 4 ° C under 24 timmar, 4% SDC vid RT under 4 timmar och 2000 kU DNase-I i 1 M NaCl vid RT i 3 timmar. I den intermittenta gruppen ("Intermittent DET") perfluderades luftstrupen med en sprutpump. Genom att simulera den inspirerande cykeln följdes varje insuffulation av sprutpumpen av ett tillbakadragande av vätskan som infunderades. Fyra på varandra följande insufflationer (varar varar 30 sekunder) av varje lösning (dH20, 4% SDC och 2000 kU DNase-I i 1 M NaCl) omfattade en cykel. Nio cykler genomfördes för att säkerställa tillräcklig decellularisering. Efter behandling bevarades konstruktionerna vid 4 ° C i PBS / AA. Proven fixerades och den kritiska punkten torkades på samma sätt som matstrupen (se föregående underavsnitt). Ett icke-decellulariserat kontrollprov ("färskt") lungprov bereddes utöver de decellulariserade.

Lever

Vuxna Sprague-Dawley-råttor, som väger 320–350 g, avlivades genom CO 2 -inhalering och cervikal dislokation. Buken steriliserades med 70% etanol och ett U-format snitt utfördes för att exponera bukhålans kavitet. Abdominal inferior vena cava (IVC) och portalvenen (PV) identifierades och PV kanylerades med en 24 G kanyl (BD, UK), som var säkrad på plats med en 3–0 silkesutur (Ethicon, UK). IVC i buken blockerades med användning av silkesuturer proximal till den högra njurvenen och IVC delades. Membranet användes som en hållpunkt för att frigöra hela levern från den bärande vävnaden. Hela förfarandet genomfördes med särskild försiktighet för att inte skada Glissons kapsel, som omger orgelet. Levern tvättades med PBS / AA före decellularisering. Prover dekellulariserades med intraportal insufflering med användning av antingen DET eller EDTA-DET (etylendiaminetetraättiksyra-detergent enzymatisk behandling). För DET-behandling anslöts levern till en Masterflex L / S-rullpump med variabel hastighet och perfunderades med dH20 under 36 timmar vid 4 ° C. På olika sätt, för EDTA-DET-behandling, anslöts levern till en Masterflex L / S variabel hastighetsrullspump och perfunderades med 2 mM EDTA under 15 minuter och med dH20 under 36 timmar vid 4 ° C. Både DET- och DET-EDTA-levern överfördes sedan vid RT och perfunderades med 4% SDC under 6 timmar följt av perfusion av 2000 kU DNase-I från bovin bukspottkörtel i 1 M NaCl under 3 timmar. Flödeshastigheten hölls vid 4, 5 ml / min för dH20-infusionen och 6, 5 ml / min för SDC- och DNas-steg. Efter slutet av decellulariseringscykeln perfunderades leverställningen med PBS / AA under 30 minuter och lagrades i PBS / AA vid 4 ° C. Proven fixerades och den kritiska punkten torkades på samma sätt som de tidigare beskrivna proverna. Ett icke-decellulariserat kontrollprov ("färskt") leverprov framställdes utöver de decellulariserade.

Tunntarm

Vuxna Sprague-Dawley-råttor, som väger 320–350 g, avlivades genom CO 2 -inhalering och cervikal dislokation. När avlivningen hade avlivats steriliserades buken med 70% etanol, och ett snitt i mittlinjen gjordes för att helt exponera bukhålan. Den överlägsna mesenteriska artären (SMA) kanylerades med en 27 G kanyl (BD, UK) och spolades med PBS för att tvätta vaskulärt träd och förhindra koagulering. Tunntarmen dissekerades fritt och avlägsnades en block från pylorus till ileocecal ventil och tarmlumen kanylerades och tvättades med PBS / AA. Både tarmlumen och det vaskulära trädet perfunderades med kontinuerlig vätsketillförsel med användning av en Masterflex L / S variabel hastighetsvalspump vid 1 ml / min. Tarmen infunderades med dH20 vid 4 ° C under 24 timmar, 4% SDC vid RT under 4 timmar och 2000 kU DNase-I i 1 M NaCl vid RT under 3 timmar. Processen upprepades i upp till fyra cykler. Efter behandling bevarades konstruktionerna vid 4 ° C i PBS / AA. Proven fixerades på samma sätt som beskrivits de tidigare beskrivna proverna; emellertid var de i detta fall inte kritiska torkade. Rörformade tarmställningar, med båda ändarna bundna på ett "korv" -form och en genomsnittlig längd på 2 cm, blötlägges över natten i sterilt 1% penicillin / streptomycin (PS) i PBS.

Avbildningsmetoder

Alla bilder erhölls med röntgenfaskontrast (PC) computertomografi (CT), som har förmågan att ge högkontrast, högupplösta, volumetriska bilder utan behov av destruktiv provberedning. Till skillnad från konventionell CT (eller mikroCT), där kontrast uppstår från dämpningsskillnader i provet, härrör kontrast i PC-CT från fasskiftet som röntgenstrålningar drabbas medan de reser genom ämnet 9 . Denna effekt kan vara upp till tre storlekar större än dämpning 18, vilket förklarar den starkt ökade kontrasten som har observerats med PC-avbildning för ett brett spektrum av biologiska prover 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 .

Synkrotronbaserad PC-CT

Esophagus-, lung- och leverprover avbildades med hjälp av en "förökningsbaserad" PC-CT-installation implementerad vid den biomedicinska strållinjen (ID17) i European Synchrotron Radiation Facility (ESRF; Grenoble, Frankrike). Ett schema över metoden visas i fig 1 (a); den innefattar en (kvasi) parallell synkrotronstråle, ett provrotationssteg och en pixelerad detektor. Den viktigaste skillnaden i en konventionell radiografisk inställning är det förstorade avståndet mellan prov och detektor som, i kombination med en källa med tillräcklig rumslig koherens, gör att interferensfranserna kan utvecklas som en följd av fasskiftningen som röntgenstrålningar lider medan de reser genom provet . Tillämpningen av lämpliga fasåtervinningsmetoder gör det möjligt att omvandla fransarna till fasbaserad områdekontrast 26 .

Image

Bild i full storlek

Avståndet från källa till prov och avstånd till detektor var cirka 150 m respektive 3, 45 m. Källans fulla bredd halva maximala (FWHM) dimensioner var 123 μm horisontellt och 24 μm vertikalt. Strålen monokromatiserades med en fast utgång från Laue / Laue-kisel (1, 1, 1) -kristall till en energi av 26 keV ('E / E' 0, 02%) och filtrerades med användning av 0, 8 mm kol och 3 mm aluminium. Detektorn var FReLoN CCD-kameran 27 kopplad till en 47 μm tjock GGG: Eu på GGG-underlagssintillator, vilket resulterade i en effektiv pixelstorlek på 3, 5 × 3, 5 μm . CT-skanningen involverade förvärv av 2000 lika fördelade projektioner över en 360-graders rotation av provet. Exponeringstiden var 2 s per projektion, och den totala skanningsvaraktigheten var cirka 1, 5 timmar. Foghämtningsalgoritmen "enstaka avstånd" av Paganin et al. 28 applicerades på de enskilda projektionerna för att omvandla faskontrastfranserna till fasbaserad areakontrast, vilket krävde en uppskattning av fasdämpningsförhållandet (ofta benämnt "

Image
-förhållande"). Bilderna rekonstruerades med
Image
-ratioer i intervallet 350–1000 (de exakta värdena per bild anges i bildtexterna för respektive figur som visas nedan); dessa bestämdes utifrån vad som gav den bästa bildkvaliteten. Det bör noteras att Paganins algoritm potentiellt kan leda till ett litet offer i rumslig upplösning, vilket kan övervinnas genom tillämpningen av en mer sofistikerad metod för fashämtning 29 . CT-rekonstruktion utfördes med FBP och i "halvtomografi" -läge eftersom provet något rörde sig ur synfältet under dess rotation 30 . Bilder bearbetades med hjälp av ESRF-programvaran PyHST och analyserades och visades med ImageJ 31 och 3DSlicer.

Tunntarmsprover avbildades med en "analysatorbaserad" PC-CT-installation implementerad vid SYRMEP (SYnchrotron Radiation for Medical Physics) -strålen i Elettra synchrotron (Trieste, Italien). Ett schema över förfarandet visas i fig 1 (b): det innefattar en (kvasi) parallell synkrotronstråle, ett objektrotationssteg, en dubbelkristallanalysator och en pixelerad detektor. Till skillnad från ”förökningsbaserad” PC-CT är ”analysatorbaserad” PC-CT känslig för röntgenrefraktion, som är direkt proportionell mot det första derivatet av fasskiftet. Röntgenrefraktion, dvs mikroradisk eller sub-mikroradisk avvikelse från den ursprungliga utbredningsriktningen, översätts till bildkontrast via kristallanalysatorn: följs lagarna för Bragg-diffraktion, modulerar kristallanalysatorn strålintensiteten som en funktion av dess inkommande vinkel 32 . Följaktligen orsakar kristallen de brytade delarna av strålen att nå detektorn med en ökad eller minskad intensitet, beroende på refraktionsvinkelns riktning och storlek. Detta manifesterar sig som "kantkontrast" i bilderna, dvs som mörka och ljusa fransar på provets konturer och inre funktioner.

Källan-till-provet, provet-till-analysatorn och analysatorn-till-detektoravståndet var ungefär 23 m, 40 cm respektive 50 cm. Kristallanalysatorn skars från två Si (1, 1, 1) -kristaller och avstämdes till den första halva lutningen av dess gungningskurva 33 . Detektorn var en CCD-kamera (Photonic Science Ltd) med fiberoptisk avsmalning kopplad till Gd2O2S-scintillationsoptik, vilket resulterade i en effektiv pixelstorlek av 4, 5 × 4, 5 μm . Källans FWHM-dimensioner var 135 μm horisontellt och 80 μm vertikalt. Strålen monokromatiserades av en monokromator med en dubbelkristall Si (1, 1, 1) till en energi av 17 keV (AE / E 0, 2%). Under CT-skanningen erhölls 1440 lika fördelade projektioner över 360 °. Exponeringstiden var 0, 1 s per projektion, och den totala skanningsvaraktigheten var 55 min. CT-rekonstruktion utfördes med användning av FBP. Eftersom ingen procedur för fashämtning har tillämpats visade CT-bilder dämpning utöver “kantkontrast” på grund av brytning i provet. Dessutom kan en viss förökningsbaserad faskontrast ha varit närvarande i bilderna på grund av en riktningskänslighet hos kristallanalysatorn och det icke-försumbara förökningsavståndet (90 cm) mellan provet och detektorn. Bilder behandlades med PITRE-programvarupaket 34 och analyserades och visades i ImageJ och OsiriX.

Laboratoriebaserad PC-CT

Ett esophagus-prov avbildades också med användning av en "kantbelysning" PC-CT-installation implementerad med ett kommersiellt tillgängligt röntgenrör i strålningsfysiklaboratoriet vid University College London. Även om denna PC-CT-implementering ursprungligen utvecklades vid synkrotroner 35, 36, förlitar den sig inte på strålekoherensen 37, 38 ; följaktligen bryts dess arbetsprincip inte när den implementeras med röntgenrör med relativt stora fokuspunkter. Ett schema över förfarandet visas i fig 1 (c): det innefattar en inkoherent (kon) stråle, ett objektrotationssteg, två öppningsmaskor och en pixelad detektor. Den första öppnade masken, placerad uppströms om provet, delar upp den inkommande strålen i en grupp av enskilda strålar, med ett lateralt mellanstrålaravstånd som är tillräckligt för att hålla dem fysiskt separerade. Den andra öppningsmasken, placerad framför detektorn, skapar okänsliga områden mellan intilliggande pixelkolumner. När den första masken är något feljusterad från den andra, så att hälften av varje stråle faller på en avtäckt del av en pixel och den andra halvan faller på en täckt ("kantbelysning" -tillstånd), uppnås känslighet för brytning utöver dämpning: röntgenstrålar som avviker från deras väg orsakar antingen en ökad eller minskad intensitet på pixeln, beroende på avvikelsesriktningen 37 . En dedikerad fasåtervinningsprocedur, som kräver två inmatningsbilder som erhållits under motsatta kantbelysningsförhållanden, möjliggör en kvantitativ extraktion av brytningskontrasten (dvs. skillnadsfas) kontrast 39

Källan till provet och provet till detektoravstånd var 1, 6 m respektive 0, 4 m. Inställningen har ett Rigaku MicroMax 007 HF röntgenrör med roterande molybdenmål och en fokuspunkt med en horisontell FWHM-dimension på cirka 70 μm . Röret drivs vid 35 kV och 25 mA, vilket motsvarar ett brett spektrum med en medelenergi av cirka 18 keV. Detektorn var Hamamatsu C9732DK-plattan, en CMOS-sensor med passiv pixel med en matris på 2400 × 2400 pixlar och en pixelstorlek på 50 × 50 μ m 2 . Perioderna för den första och andra bländarmasken (Creatv Microtech) var 79 μm respektive 98 μm , och deras slitsöppningar var 23 μm respektive 29 μm breda. Med dessa perioder täcktes varje andra pixelkolonn ("line-hoppa" -konfiguration), vilket minskar effekten av tvärtal mellan pixlarna 40 . Synfältet för bildbehandlingssystemet, definierat av maskernas storlek, var 4, 8 × 4, 8 cm 2 . CT-skanningen involverade att förvärva 720 lika fördelade projektioner över 360 grader. Vid varje rotationsvinkel erhölls två utsprång under motsatta kantbelysningsförhållanden 39 . Vidare förflyttades provet vid varje vinkel tio gånger med 7, 9 μm (en tiondel av perioden i den första öppningsmasken), en projektion erhölls vid varje förskjutning, och dessa utsprången rekombinerades så småningom. Denna procedur, känd som "dithering", används för att öka den rumsliga upplösningen i den slutliga bilden 41, 42, vilket i detta fall gjorde den slutliga upplösningen för de laboratoriebaserade bilderna jämförbara med den för bilder som erhållits vid synkrotroner, där mycket mindre pixelstorlekar användes. Det är beroende av iakttagelsen att vid kantbelysning PC-CT är den rumsliga upplösningen oberoende av pixelstorleken 41, en viktig funktion som redan har utnyttjats för hårda röntgenmikroskopiimplementeringar 43 . Varje projicering förvärvades med en exponeringstid på 1, 2 s. Provets totala exponeringstid var 4, 8 timmar, men hela skanningsförfarandet tog ungefär 19 timmar på grund av att bildinställningen inte hade optimerats för hastighet för denna genomförbarhetsstudie och överdriven tid användes på motorrörelser, läste detektorn -förvärv. I en optimerad installation skulle detta förkortas avsevärt. När det gäller den totala exponeringstiden bör det noteras att för detta prov krävdes en upplösning som var mycket högre än den som dikterats av pixeln, och följaktligen användes 10 ditheringsteg, vilket innebar en faktor 10 i total exponering. Om pixelnivåupplösningen är tillräcklig kan en betydligt reducerad exponeringstid förväntas. Vi vill också lyfta fram att den totala exponeringen skulle kunna minskas med ytterligare en faktor två genom användning av ett nyligen publicerat fashämtningsförfarande som baseras på förvärv av en bild i varje vinkel endast 44 . Efter fashämtning 39 utfördes CT-rekonstruktion med FBP. En specialiserad filterfunktion användes för att redovisa skillnaden i karaktär hos bilder med kantbelysning och konverterade “kantkontrasten” som beror på brytning till fasbaserad areakontrast 45 . En MATLAB-rutin skrevs för att utföra bildbehandlingen. Bilder analyserades och visades med ImageJ och 3DSlicer.

Resultat

Resultaten presenteras och diskuteras individuellt för varje organ (matstrupen, lungan, levern och tunntarmen).

Matstrupe

Kanos-esofagi avlägsnades framgångsrikt efter tre cykler av DET, vilket framgår av histologi och DNA-kvantifiering (data visas inte). Bilder av ett matstrupsställning som erhållits med synkrotronbaserad PC-CT visas i fig 2 (a, b) i form av ett tvärsnitt genom den rekonstruerade volymen respektive en tredimensionell återgivning. Motsvarande bilder förvärvade med laboratoriebaserad PC-CT visas i Fig. 2 (c, d). Alla bilder avslöjade intakt ställningens mikroarkitektur, vilket möjliggör identifiering av alla lager av den ursprungliga vävnaden, nämligen: slemhinna, subslemhinna, muskulär propria (MP) och adventitia. Intakta blodkärl detekterades i submukosa och en tydlig avgränsning sågs mellan de inre cirkulära och yttre längsgående lagren av MP. På grund av stark bildkontrast identifierades och skildes skikten lätt, även om alla består av mjukvävnad med extremt liknande röntgendämpningsegenskaper och skulle kunna skilja sig från konventionell mikroCT. Mucosal-submucosal separation (MSS), en surrogatmarkör för decellulariseringsassocierad skada, kunde detekteras över hela omkretsen för ett långt segment av byggnadsställningen och visas vara minimal. De tredimensionella återgivningarna i fig. 2 (b, d) möjliggör en fullständig volymetrisk analys av MSS, vilket är en fördel jämfört med histologi och SEM. Det bör noteras att bildkvaliteten i de synkrotronbaserade och laboratoriebaserade bilderna är jämförbara. Detta är anmärkningsvärt med tanke på att de förra förvärvades med mycket lysande och sammanhängande synkrotronstrålning, medan de senare förvärvades med ett kommersiellt tillgängligt röntgenrör.

Image

Bilderna visar tvärsnitt av proverna [( a, c )] och tredimensionella vyer [( b, d )]. Alla skalfält representerar 500 μm .

Bild i full storlek

Lunga

Råttelungor avlägsnades framgångsrikt såsom beskrivits tidigare 16 . Tidigare arbete syftade till att fastställa om DET med kontinuerlig eller intermittent inflation skulle bibehålla mikroarkitekturen bäst, och den intermittenta inflationsmetoden visade sig vara överlägsen, vilket framgår av SEM och funktionella analyser. Synkrotronbaserad PC-CT-avbildning av lungproverna stödde detta fynd. Bilderna av en färsk kontrollvävnad, som visas i fig. 3 (a, b) i form av ett tvärsnitt och en tredimensionell återgivning, uppvisar ett centralt placerat bronkovaskulärt bunt och ett perifert tätt packat alveolärt nätverk. Bilderna på ett lungprov som dekellulariserades via kontinuerlig DET [Fig. 3 (c, d)] visar en ACM där bronkovaskulära bunten förstorades med uttunna, komprimerade väggar och tvetydig arkitektur. Detta kan särskilt uppskattas i den tredimensionella återgivningen av ställningen [Fig. 3 (d)]. Förändringarna i det alveolära nätverket uttalades också, antingen visade atekaktiska förändringar, sekundära till komprimering eller utvidgning på grund av brott i det alveolära kapillärmembranet och sammanslagningen av flera alveoler. I jämförelse med detta kunde det observeras att intermittent DET producerade en ACM i vilken både bronkovaskulär bunt och det alveolära nätverket var fullständigt bevarat [Fig. 3 (e, f)].

Image

Bilderna visar tvärsnitt genom proverna [( a, c, e )] och tredimensionella vyer [( b, d, f )]. Alla skalfält representerar 500 μm .

Bild i full storlek

Lever

En tidigare studie (Maghsoudlou et al. , Inlämnad) syftade till att fastställa effektiviteten av DET- och EDTA-DET-protokoll för alstring av ACM från råttlever. Resultatet var att DET ger en mikroarkitektur som är bättre bevarad jämfört med EDTA-DET. Denna observation bekräftas av synkrotronbaserade PC-CT-bilder av leverproven [Fig. 4]. Det färska levernprovet består av en tät vävnadsstruktur som avslöjar hexagonala lobuler och flera grenar i centrala och portalvenerna [Fig. 4 (a, b)]. Huvudkärlen kan ses att på samma sätt bevaras i vävnader som är dekellulariserade med båda EDTA-DET [Fig. 4 (c, d)] och DET [Fig. 4 (e, f)]. Den ökade intensiteten i EDTA-DET-ställningen [Fig. 4 (c)] jämfört med DET-ställningen [Fig. 4 (e)] antyder att EDTA-DET-protokollet producerar en tätare vävnad, vilket var den viktigaste upptäckten i den publicerade studien. Dessutom visade EDTA-DET-ställningen områden med både hyper- och hypointensitet, medan DET-ställningen hade homogena funktioner. Detta resultat kunde inte uppskattas av SEM-analys.

Image

Bilderna visar tvärsnitt genom proverna [( a, c, e )] och tredimensionella vyer [( b, d, f )]. Alla skalfält representerar 500 μm .

Bild i full storlek

Tunntarm

Bilder av tunnvattenscellulär matris som erhållits med synkrotronbaserad PC-CT visas i fig. 5: ett tvärsnitt genom det cylindriska provet och en tredimensionell återgivning av det avbildade avsnittet av organet kan ses i fig. 5 (a, b). För att demonstrera flexibiliteten i PC-CT-metoden för avbildning av decellulariserade ställningar, förvärvades bilder med en annan implementering av PC-CT ("analysator-baserad" i stället för "propagations-baserad" PC-CT 9 ). Vidare konverterades inte "kantkontrasten" som beror på brytning i provet till fasbaserad areakontrast, vilket förklarar varför kontrasten i fig 5 (a) är starkast vid gränssnitten, där den manifesteras som ljus och mörk fransar. Eftersom färgschemat har valts för att skapa intryck av områdekontrast är detta inte så uppenbart i volymåtergivningen. Dessutom modifierades provberedningen något för detta experiment: provet hydratiserades istället för torkad kritisk punkt.

Image

Alla skalfält representerar 500 μm .

Bild i full storlek

Tidigare SEM-avbildning har visat att DET bevarar villi- / kryptmikrostrukturen i tunntarmsprover 6 . PC-CT-bilderna som visas i fig. 5 bekräftar denna observation, i den meningen att närvaron av villi i ställningen tydligt kan uppskattas. Men krypter, dvs de små håligheterna mellan villorna, är inte synliga. Detta beror på otillräcklig rumslig upplösning av den använda detektorn: medan villi i en tunn tunntarmen vanligtvis är av storlekar på tiotals mikrometer, är krypterna så små som några mikrometer, dvs för små för att kunna lösas av detektorpixeln som används I detta fall. För att undersöka PC-CT: s förmåga att lösa tarmkrypter kommer bildbehandlingen av tunntarmen ACM att upprepas med högre upplösningsdetektor som en del av det framtida arbetet.

Diskussion

Ett antal färska och decellulariserade organ (matstrupe, lunga, lever, tunntarmen) som härrör från kaniner och råttor avbildades med synkrotron och laboratorieimplementeringar av PC-CT. Alla bilder var av mycket hög kvalitet, särskilt med avseende på kontrast och detaljsynlighet, till en viss grad att de fynd som tidigare erhållits med histologi och SEM kunde bekräftas 6, 16 . Anatomiska särdrag såsom slemhinnor-submukosalseparation i matstrupsställningen och heterogeniteten hos EDTA-DET-leverställningen kunde identifieras. Infödda ställningar mikroarkitektur var tydligt synlig i alla bilder, vilket möjliggör validering av de decellularization metoder som används. Det faktum att detta har visats för ett brett spektrum av vävnadstyper och för olika implementeringar av PC-CT visar metodens mångsidighet och dess tillförlitlighet inom en mängd TE-områden. Det viktigaste är att det faktum att en bildkvalitet som är jämförbar med synkrotronbaserad PC-CT erhölls i ett standardlaboratorium med användning av enbart konventionell röntgenutrustning indikerar att PC-CT inte bara har förmågan att ersätta histologi och SEM för detta olika applikationer, men också att avbildningen skulle kunna utföras i TE-forskningslaboratorier, vilket möjliggör en hög genomströmning och ett brett upptag.

Den viktigaste skillnaden mellan PC-CT och de guldstandardmetoder som för närvarande används av TE-samhället för att bedöma bevarande av mikrostrukturer i ställningar (SEM och histologi) är att PC-CT är icke-förstörande, vilket gör det till en eftertraktad lösning för avbildning ställningar före transplantation. Detta innebär att PC-CT i slutändan skulle kunna bli ett verktyg för rutinmässig kvalitetskontroll inom regenerativ medicin, såväl som potentiellt kan användas för att övervaka ställningens beteende och funktionalitet in vivo efter transplantation till levande organismer, t.ex. möss. För denna applikation är det viktigt att den levererade strålningsdosen övervakas noggrant och hålls under acceptabla gränser. I detta sammanhang bör det noteras att PC-avbildning har visat sig i flera fall ha lågdosfunktioner som är kompatibla med prekliniska och kliniska standarder 38, 46, 47 .

Slutligen ger PC-CTs inre volymetriska karaktär en exakt förståelse för byggnadsställningens mikroarkitektur i tre dimensioner. Detta krävs för att utveckla den kunskap som är nödvändig för att tillverka syntetiska ställningar som så småningom kan ersätta ACM: er av intrikata organ som de som undersökts i denna studie. Synthetic scaffolds have the advantage that they are man-made, can be produced on a semi-industrial scale and, hence, made widely available to the population.

ytterligare information

How to cite this article : Hagen, CK et al. High contrast microstructural visualization of natural acellular matrices by means of phase-based x-ray tomography. Sci. Rep. 5, 18156; doi: 10.1038/srep18156 (2015).

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.