Borttagning av leverkärl1 predisponerar för diabetes och steatos via glukos-6-fosfatas och perilipin-5 uppreglering | laboratorieundersökning

Borttagning av leverkärl1 predisponerar för diabetes och steatos via glukos-6-fosfatas och perilipin-5 uppreglering | laboratorieundersökning

Anonim

ämnen

  • Cellbiologi
  • Endokrinologi

Abstrakt

Notch-signalvägar har nyligen varit inblandade i patogenesen av metaboliska sjukdomar. Emellertid förblir rollen för hepatisk Notch-signalering i glukos- och lipidmetabolismen oklar och behöver ytterligare undersökning eftersom det kan vara ett kandidatterapeutiskt mål vid metabola sjukdomar som icke-alkoholisk steatohepatit (NASH) och icke-alkoholisk fettsjukdom (NAFLD). Vi använde hepatocyt-specifika Notch1 knockout (KO) -möss och leverbiopsier från NASH- och NAFLD-patienter för att analysera Notch1: s roll i glukos- och lipidmetabolism. Hepatocyt-specifika Notch1 KO-möss matades med en fettrik diet (HFD) eller en vanlig diet (RD). Vi bedömde metabola fenotyp, glukos- och insulintoleranstester och leverhistologi. Hepatiskt mRNA-uttryck profilerades av Affymetrix Mouse Gen-arrayer och validerades genom kvantitativ omvänd transkription PCR (qPCR). Akt fosforylering visualiserades genom immunblotting. Genuttryck analyserades i leverbiopsier från NASH, NAFLD och kontrollpatienter med qPCR. Vi fann att Notch1 KO-möss hade förhöjd fastande glukos. Genuttrycksanalys visade en uppreglering av glukos-6-fosfatas, involverat i det sista steget av glukoneogenes och glukosfrisättning från glykogenolys, och perilipin-5, en regulator för ackumulering av leverlipid. När de matades med en HFD KO-möss utvecklades öppen diabetes och leverstatos. Akt fosforylerades starkt i KO-djur och Foxo1-målgenuttrycket förändrades. Följaktligen observerades en minskning av Notch1 och en ökning av glukos-6-fosfatas och perilipin-5-expression i leverbiopsier från NAFLD / NASH jämfört med kontroller. Notch1 är en regulator för glukos i lever och lipidhomeostas. Nedsatt leverfunktion av Notch1-uttryck kan vara involverad i patogenesen hos human NAFLD / NASH.

Huvudsaklig

Levern är ett viktigt organ för reglering av energihomeostas hos däggdjur. Under fastaförhållanden säkerställer glykogenolys och glukoneogenes energiöverflöd genom frisättning av glukos i cirkulationen. Långvarig fasta initierar lipolys inklusive p- oxidation av fettsyror i lever-mitokondrier. 1 I matat tillstånd aktiveras glykogensyntes och lipogenes konsekvent för att lagra överskott av energi. 2, 3 Alla dessa processer styrs av hormonella, neuronala och näringsfaktorer. Insulinsvägen har en viktig roll i regleringen av glukosabsorption och upptag, glukosproduktion, glykogenlagring och lipid / proteinsyntes. 4 Icke-alkoholisk fet leversjukdom (NAFLD) och icke-alkoholisk steatohepatit (NASH) kännetecknas av hyperinsulinemi orsakad av störningar i regleringsmekanismerna för energihomeostas i det kroniska tillståndet av överutrition. 5 De olika kaskaderna av deregulerade signalhändelser som leder till olämplig energilagring i levern förblir ofullständigt förstås. Nyligen ifrågasätts den kanoniska modellen som antar att fosforylering av PKB / Akt krävs för reglering av glukosproduktion i lever. Faktum är att med användning av en Akt1 / Akt2 / Foxo1 triple knockout (KO) musmodell gav Lu et al 6 bevis på att glukosproduktion i lever regleras oberoende av den Akt-beroende fosforylering av Foxo1, medan en enda KO av antingen Akt1 eller Akt2 resulterade i insulin resistens orsakad av en konstitutiv aktivering av Foxo1-beroende genuttryck. Med tanke på dessa fynd behövs en ny utvärdering av det nuvarande konceptet med glukosmetabolism i lever och antyder att ytterligare signalvägar kan behövas.

Notch-vägen är en intercellulär signaleringskaskad som har en viktig roll i cellproliferation, differentiering och ödesbestämning. Således är denna väg väsentlig för utveckling och förnyelse av vuxna vävnader. 7 Notch1–4 är membranbundna receptorer som aktiveras genom cell-till-cell-interaktion genom deras membranbundna ligander (Jagged 1, -2, Delta-liknande ligand (Dll) -1, -3, -4). Deras aktivering resulterar i proteolytisk klyvning och translokation av den intracellulära domänen Notch till kärnan där den modulerar transkription av målgener. 8 Radering av Notch1 under embryogenesen är dödlig. 9 Haploinsufficiens hos Jagged 1 orsakar Alagille syndrom. 10 Avreglering av signalering av hack har också rapporterats vid hepatokarscinogenes. 11, 12 Nya verk föreslår en roll för Notch-signalvägar i regleringen av metaboliska processer. Förändringar i metabolism inklusive kroppsvikt, energimetabolism, blodlipidkomposition och uttryck av relaterade gener har observerats i en modell av möss som inte är tillräckliga för Notch-liganden Dll-1. 13 Förhöjd expression av Notch1 har observerats i tunntarmen hos diabetiska möss. 14 Dessutom har Notch-aktivering och Notch-hämning rapporterats utlösa hepatisk steatos respektive för att minska fetma hos möss som matats med HFD. 15, 16 Vidare har regulering av lipidmetabolismen tillskrivits F-box och WD repeterande domäninnehållande 7, en molekyl som riktar sig till och försämrar Notch. 17 Slutligen har Notch1 rapporterats reglera Foxo1-medierad insulinkänslighet. 18 I leverbiopsier från NAFLD / NASH-patienter är uttrycket av Notch-målgener HES1 / HEY1 förhöjda och korrelerade med insulinresistens och NAFLD-aktivitetsresultat. 19 Dessa resultat tyder på ett bidrag från Notch-signalering i moduleringen av glukos- och lipidmetabolism i levern och eventuellt NAFLD / NASH.

MATERIAL OCH METODER

Djur, induktion av borttagning av notch1, genotypning och sydlig blot

Hepatocyt-specifika Notch1 KO-möss genererades såsom beskrivits tidigare. 20 Kortfattat korsades Notch1lox / lox-möss med AlbCre +/−-möss på en C57Bl / 6-bakgrund (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) och uttryckte Cre-rekombinas under den hepatocyt-specifika albuminpromotorn. Enkel transgen AlbCre +/− mus användes som kontroll. Nyfödda möss genotypades och effektiviteten av Notch1-borttagning verifierades genom Southern blot-analys med användning av en Notch1-specifik sond som beskrivits tidigare. 21

Möss hölls i djurfaciliteten vid avdelningen för biomedicin vid universitetssjukhuset Basel, i en specifik patogenfri miljö på ett 12 timmars ljus och 12 timmars mörkt schema. Mat och dricksvatten tillhandahölls ad libitum . Experiment godkändes av veterinärkontoret i Basel. Endast vuxna (8 veckor gamla) hanmöss inkluderades i studien på grund av den högre förekomsten av NALFD hos män jämfört med den hos kvinnor.

patienter

Leverbiopsier från NAFLD, NASH och (insulinkänsliga) kontrollpatienter erhölls i polikliniken vid avdelningen för gastroenterologi och hepatologi, University Hospital Basel, Basel Schweiz. Användningen av biopsimaterial för detta projekt godkändes av etikkommittén i Kantons Basel och Baselland, Schweiz. En del av biopsimaterialet som inte behövdes för rutinmässig histopatologi användes för forskningsändamål efter att ha erhållit skriftligt informerat samtycke. Patientens egenskaper sammanfattas i kompletterande tabell 1. NAFLD- och NASH-patienter klassificerades baserat på histologi och NAFLD-aktivitetspoäng.

Matningsprotokoll med hög fetthalt

AlbCre Notch1 KO och AlbCre +/− (kontroll) -möss matades med en fettrik diet (HFD) innehållande 60% kalorier från fett (Laboratorio dottori piccioni srl, Gessate, Italien) eller med en vanlig diet (RD) innehållande 10% kalorier från fett (Provimi Kliba Ag, Kaiseraugst, Schweiz). Diätets sammansättning rapporteras i kompletterande tabell 3. Tio möss användes för var och en av de fyra matningsgrupperna. Kroppsvikt bedömdes varje vecka och fastande glukosnivå mättes varannan vecka. Glukos- och insulintoleranstester utfördes efter 12 veckors utfodring. Möss återhämtade sig i 2 dagar och fastades över natten innan levern avlägsnades. Vävnader knäpptes omedelbart fryst i flytande kväve och förvarades vid -80 ° C för vidare analys.

Histologisk bedömning av vävnader i lever och bukspottkörtel

Lever- och bukspottkörtelvävnader fixerades i 4% formaldehyd och bearbetades för standardhistologisk bedömning med H&E och Preussisk blåfärgning. En blindad utvärdering av leverhistologi utfördes av en erfaren hepatopatolog.

Fastande glukos, insulin och HOMA-IR

Djur fastades över natten och blodsockernivån mättes med användning av Ascensia Contour-blodsockerövervakningssystem (Bayer AG Health Care, Zürich, Schweiz). Insulin mättes från 5 mikroliter serum med användning av Mercodia Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA (Mercodia, Uppsala, Sverige). HOMA-IR beräknades baserat på formeln: fastande glukos (mmol / l) x fastande insulin (mIU / l) /22, 5. 22

Test av glukos och insulintolerans

För glukostoleranstest fastades möss över en natt och en glukoslösning injicerades intraperitonealt med 2 g / kg kroppsvikt. Glukosinnehållet mättes före och 15, 30, 45, 60, 90 och 180 min efter glukosinjektion med användning av Ascensia Contour-blodglukosövervakningssystem. För insulintoleransprov fastades möss under 4 timmar och en insulinlösning injicerades intraperitonealt med 0, 8 IE / kg kroppsvikt. Glukosnivån mättes före och 15, 30, 45, 60 och 90 minuter efter insulininjektionen.

Microarray-analys

MRNA-uttryck i lever profilerades i tre möss per grupp. I korthet extraherades RNA från snäppfrysta leverprover med Qiazol (Qiagen) och renades på RNeasy Mini Column Kit (Qiagen). Omvänd transkription, andra-strängssyntes och in vitro- transkription utfördes enligt tillverkarens instruktioner (Ambion). Prover hybridiserades över natten till Affymetrix Mouse Gene ST 1.0-matriser (Affymetrix). Microarray-analys genomfördes med Bioconductor-paket med statistisk R-miljö (//www.R-project.org/). Normalisering, bakgrundskorrigering och sammanfattning av nivån för transkriptkluster utfördes med användning av RMA-algoritmimplementering av oligopaket. 23, 24 Gener identifierades som differentiellt uttryckta om de visade en genomsnittlig vikförändring över 2 med motsvarande falsk upptäcktsfrekvens under 0, 1.

Kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion

Ett mikrogram totalt RNA transkriberades omvänt och kvantitativ PCR utfördes med användning av SYBR Green Polymerase Chain Reaction Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Intron-spännande primrar designades för varje målgen och köpades på Microsynth (Balgach, Schweiz). Alla reaktioner kördes i duplikat med användning av ett snabbt reaktionssystem för polymeraskedjan i realtid 7500 (Applied Biosystems). Uttrycksnivåerna för transkripten normaliserades till Rpl19 eller GAPDH med användning av ΔCt-metoden. Primersekvenser rapporteras i kompletterande tabell 4.

immunoblotting

Vävnader lyserades i helcellslisbuffert innehållande 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0, 1% Triton X-100, 10 mM PMSF och 1 mM natriumortovanadat. Lysat rensades genom centrifugering och proteinkoncentrationer kvantifierades av Bradford (Bio-Rad Protein Assay; Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Schweiz). Proteiner upplöstes med SDS-PAGE, överfördes till nitrocellulosamembran och undersöktes med specifika antikroppar. pS473-Akt (1: 1000) och aktin (1: 1000) antikroppar var från Cell Signaling (BioConcept, Allschwil, Schweiz) respektive Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Buchs SG, Schweiz). Densitometri-analys av proteinband utfördes med ImageJ-programvaran (NIH Image).

Statistisk analys

Musdata uttrycks som medelvärde ± sem och mänskliga data visas som median. Jämförelser utfördes med studentens t- test eller Mann – Whitney U- test med hjälp av programvaran GraphPad Prism 4.0. * P <0, 05, ** P <0, 01 och *** P <0, 001.

RESULTAT

HFD-utfodring inducerar Overt Diabetes i AlbCre Notch1 KO-möss

Vi fann att AlbCre Notch1 KO-djur har en högre kroppsvikt än kontrollmöss, vilket tyder på att störning av Notch1-signalering försämrar kroppsviktshostostasen (figur 1a). Levern och förhållandet lever / kroppsvikt förblev oförändrade i kontroll och KO-möss matades antingen med RD eller HFD (figurerna Ib och c). Intressant nog observerade vi ingen skillnad i hastigheten på kroppsviktökning mellan KO och kontrolldjur som matades med varken RD eller HFD (kompletterande figur S1A). Vidare mätte vi inte en ökad mängd matintag i KO-mössen jämfört med kontrolldjur trots deras initiala högre kroppsvikt (kompletterande figur S1B), vilket tyder på att leverspecifik Notch1 KO inte orsakar ökade energibehov.

Hepatocyt-specifika Notch1 knockout (KO) -möss har förhöjt fastande glukosnivåer och är insulinresistenta. Metabolisk fenotyp av 8 veckor gamla AlbCre Notch1 KO-möss (han) och AlbCre-möss användes som kontroller. Djuren ( n = 10 för varje grupp) matades med vanlig diet (RD) eller diet med hög fetthalt (HFD). ( a ) kroppsvikt, ( b ) levervikt, ( c ) förhållande av lever / kroppsvikt, ( d ) fastande glukos (mmol / l), ( e ) fastande insulin (mU / l) och ( f ) HOMA- IR (homeostatisk modellbedömning Insulinresistens). Data uttrycks som medelvärde ± sem

Bild i full storlek

Efter att ha matat djuren med antingen RD eller HFD i 12 veckor, mätte vi en signifikant viktökning i AlbCre Notch1 KO jämfört med kontrollmöss (figur 1a). Intressant nog märkte vi att KO-möss matade med RD eller HFD hade signifikant högre fastande glukosnivåer jämfört med kontrollmöss (figur 1d).

Dessutom visar vi att den fastande glukosnivån uppmätt efter 12 veckors utfodring med HFD nådde en patologisk nivå (7, 50 ± 0, 59 mmol / l) i KO-mössen (figur 1d). Dessa data antyder en förändring i regleringen av glukosmetabolism i lever hos KO-djuren. Vi analyserade sedan de fasta insulinnivåerna och fann att insulinnivån ökades i grupperna som matades med HFD. Den genomsnittliga insulinnivån var signifikant högre i KO jämfört med kontrollmöss (figur 1e). Vi observerade ingen skillnad i HOMA-IR mellan KO och kontrollmöss matade med RD. Emellertid höjdes HOMA-IR signifikant i KO jämfört med kontrollmöss matade med HFD (figur 1f), vilket tyder på en nyckelpåverkan av HFD. Sammantaget antyder dessa observationer en predisposition av den hepatocyt-specifika KO-modulering av lever glukosmetabolism mot utvecklingen av en insulinresistent, diabetisk fenotyp som svar på HFD.

Därefter analyserade vi mössens kapacitet att bryta ner glukos genom att utföra ett glukostoleranstest på djur som matats med RD eller HFD i 12 veckor. Som förväntat visar vi signifikant högre blodplasmaglukosinnehåll i Notch1 KO-möss matade med HFD jämfört med de andra grupperna, vilket antyder att dessa djur har nedsatt glukostolerans (figur 2a). Vi testade sedan insulinkänsligheten hos Notch1 KO-möss genom att utföra ett insulintoleranstest. Vi fann att KO-djur som matades med HFD var insulinresistenta jämfört med mössen från de andra grupperna (figur 2b). Dessa data bekräftar avreglering av glukoshomeostas och antyder en förändring av insulinverkan.

Hepatocyt-specifika Notch1-knockout (KO) -möss utvecklar en diabetisk fenotyp som svar på fettriktad diet (HFD) under en 12-veckors period. ( a ) Glukostoleranstest utfördes i 20 veckor gamla hepatocyt-specifika Notch1 KO och kontrollmöss efter 12 veckors utfodring med HFD eller vanlig diet (RD). Möss svaldes under 14 timmar och 2 g / kg glukos injicerades intraperitonealt ( n = 10 för varje grupp). Serumglukosnivåer mättes före, 15, 30, 45, 60, 90, 120 och 180 min efter glukosadministrering. ( b ) Insulintoleranstest utfördes inom samma grupp av djur. Möss svalnade under 4 timmar och 0, 8 mU / kg insulin injicerades intraperitonealt. Serumglukosnivåer mättes före, 15, 30, 45, 60, 90, 120 och 180 min efter insulininjektion.

Bild i full storlek

Glukos-6-fosfatas och Perilipin-5 uppregleras i Notch1 KO-möss

För att studera om frånvaron av Notch1 i hepatocyterna kan förändra uttrycket av gener som kan gynna glukoneogenes, jämförde vi leveruttrycket mellan Notch1 KO och kontrollmöss matade med RD genom att utföra transkriptomanalys. Intressant nog, bland de gener som har förändrats differentiellt, mätte vi en uppreglering av lever glukos-6-fosfatas (G6PC), ett viktigt enzym för de sista stegen av glukoneogenes och glukosfrisättning från glykogenolys, och perilipin-5 (PLIN5), en lipid droppassocierat protein känt för att reglera lever triglyceridansamling, i Notch1 KO möss (figur 3a). Dessa resultat validerades sedan genom kvantitativ omvänd transkription PCR (RT-PCR) i en större uppsättning av möss (figur 3b).

Hepatocyt-specifika Notch1-knockout (KO) -möss har förhöjt uttryck av glukos-6-fosfatas och perilipin-5 och utvecklar lever-steatos. ( a ) Microarray-analys genomfördes i 3 av 10 möss per grupp för vanlig diet (RD). Värmekartan visar expressionsmönstren för differentiellt uttryckta gener (vikningsändring ≥2, falsk upptäcktshastighet <0, 1) mellan Notch1 KO-möss och kontrolldjur som matades med en vanlig diet under 20 veckor. ( b ) Microarray-resultat validerades med kvantitativ PCR ( n = 6 per grupp). Data visas som medelvärde ± sem ( c ) Histologi för levern (hematoxylin och eosin (H&E) färgning). Visade är representativa bilder. ( d ) Microarray-resultat som visar det ökade uttrycket av tre gener involverade i lipidansamling. Uppgifterna kommer från tre möss per grupp som matas med fettsnål diet (HFD). Resultaten visas som medelvärde ± sem ( e ) 3-hydroxi-3-metylglutaryl-koenzym En reduktas (HmgCoAR) uttrycksnivå mättes med kvantitativ PCR i möss matade med RD ( n = 6 per grupp)

Bild i full storlek

HFD inducerar ökat uttryck av lipidmetabolismreglerade gener och leversteatos hos Notch1 KO-möss

Eftersom PLIN5 vanligtvis är överuttryckt på feta djur och är en viktig regulator för lipolys, utförde vi histologianalys av leversektioner från kontroll och Notch1 KO-möss matade med RD eller HFD. Vi observerade betydande leverstatos hos 6 av 10 Notch1 KO-möss på HFD (figur 3c och kompletterande tabell S2). Endast mindre inflammation i en av 10 Notch1 KO-möss matade med HFD kunde detekteras (tilläggstabell S2). Järnfärgning var negativ hos alla djur. Bukspottkörtelvävnader verkade histologiskt normala utan holmförlust i slumpmässigt tilldelade möss från olika matningsgrupper (data visas inte). Våra transkriptomanalysdata avslöjade ett förhöjt uttryck av Fas , 3-hydroxi-3-metylglutaryl-koenzym A-reduktas ( HmgCoAR ) och sköldkörtelhormonresponsivt ( Thrsp ), tre gener involverade i reglering av lipidmetabolism, i Notch1 KO-möss matade med HFD jämfört med kontrollmöss (figur 3d). Vi validerade sedan våra resultat med kvantitativ PCR och visade att endast HmgCoAR är signifikant uppreglerad i Notch1 KO-möss jämfört med kontrolldjur (figur 3e).

Hepatic Akt fosforyleras i Notch1 KO-möss

Det är väl etablerat att Akt negativt modulerar den insulinmedierade transkriptionella aktiviteten hos Foxo1 vilket leder till en minskning av glukoneogena gener. 6 Eftersom vi har uppmätt ett ökat uttryck av G6PC i Notch1 KO-djur som matats med RD, analyserade vi därför fosforyleringsstatusen för lever i Akt och i kontroll och Notch1 KO-möss som matats med RD eller HFD. Överraskande mätte vi en högre storleksordning av Akt-fosforylering i levern hos Notch1 KO-möss matade med RD jämfört med kontrollmöss (figur 4a och b). Ingen skillnad observerades mellan Notch1 KO och kontrollgruppen när de matades med HFD. Vi analyserade sedan mRNA-uttrycket av två Akt-Foxo1 målgener, insig2 och VLDLR , i Notch1 KO och kontrollmöss. Vi förväntade oss hitta en minskning av insig2 och en ökning av VLDLR- uttryck i NOTCH1 KO-möss som korrelerade med Akt-fosforylering. Men vi fann att insig2- och VLDLR- expressionsnivåer ökade och minskade, respektive (figur 4c), vilket tyder på att i vår hepatocyt-specifika Notch1 KO-mus, är den defekta moduleringen av hepatiska glukosnivåer oberoende av den klassiska Akt-Foxo1-signaleringskaskaden.

Akt fosforyleras i hepatocyt-specifika Notch1 knockout (KO) -möss och Foxo1-beroende målgener uttrycks differentiellt. ( a och b ) Fosforylerat och aktin analyserades genom western blotting och signalintensiteten för banden kvantifierades ( n = 10 per grupp). Resultaten uttrycks som medelvärde ± sem ( c ) Insig2 och Vldlr-uttryck utvärderades genom mikroarray-analys hos möss matade med regelbunden diet (RD) ( n = 3 per grupp). Resultaten visas som medelvärde ± sem

Bild i full storlek

Notch1-uttrycket reduceras och G6PC / PLIN5 uppregleras i leverbiopsier från NAFLD / NASH-patienter

Därefter kvantifierade vi mRNA-uttrycket hos NOTCH1, HES1, HEY1, G6PC och PLIN5 i leverbiopsier från NAFLD / NASH-patienter och jämfördes med normala leverprover. I linje med våra musdata visade vi att Notch1-uttrycksnivån är signifikant sänkt hos NAFLD- och NASH-patienter jämfört med kontrollprover (figur 5). Vi är medvetna om att reduktionen av NOTCH1-uttryck endast mättes på mRNA-nivån och en kvantifiering av NOTCH1-proteinmängderna skulle vara mer informativ. Emellertid finns inga tillförlitliga antikroppar mot NOTCH1 för närvarande tillgängliga. Vi fann också att Notch1-målgenerna Hes1- och Hey1-nivåer reduceras i NAFLD- och NASH-patienter jämfört med kontrollprover. Slutligen rapporterade vi att G6PC- och PLIN5-transkriptuttryck var högre i NAFLD- och NASH-grupper jämfört med kontrollgruppen.

NOTCH1 i lever reduceras och glukos-6-fosfatas (G6PC) och perilipin-5 (PLIN5) uppregleras vid icke-alkoholisk fet fettsjukdom / icke-alkoholisk steatohepatit (NAFLD / NASH) jämfört med kontrollpatienter. Uttrycksnivåerna för NOTCH1, G6PC, PLIN5, HES1 och HEY1 mättes med kvantitativ PCR i NASH ( n = 17), NAFLD ( n = 13) och kontroll ( n = 8) patienter. Resultaten visas som lådor.

Bild i full storlek

DISKUSSION

I det aktuella arbetet identifierade vi hepatocyt-specifika Notch1 KO-möss som en musmodell med en förhöjd expressionsnivå av G6PC och PLIN5 förutsätter utvecklingen av leverstatos. Vi visar faktiskt att Notch1 KO-möss illustrerar en fenotyp som är mottaglig för HFD-inducerad insulinresistens, diabetes och leverstatos inom 12 veckor. Även om mekanismen som associerar Notch1-borttagning i hepatocyter till transkriptionell reglering av dessa gener förblir oklar, antyder våra data att det är oberoende av insulinmedierad Akt-fosforylering.

För närvarande har endast få komponenter i Notch-kaskaden studerats i ett annat metaboliskt sammanhang. Komplexiteten hos fenotypiska förändringar i Dll-1 haploinsufficienta möss indikerar en involvering av Notch-signalering i många fler biologiska processer än tidigare känt. I själva verket leder Dll-1 haploinsufficiens hos möss till minskad kroppsvikt, matförbrukning och metaboliserad energi. En minskning av triglycerid- och kolesterolnivåerna i levern såväl som gener som är involverade i kolesterolsyntes såsom Idi1 och Hmgcs1 har också observerats. 13 Tillsammans med våra data föreslår det en reglerande roll för Notch-signalering i kolesterol- och lipidbiosyntes, energilagring och reglering av kroppsvikt. Kombinerande möjligheter för ligandreceptorbindning och deras olika intra- och extracellulära regleringsmekanismer krävs för att justera kontextspecifika distinkta Notch-reglerade genuttrycksmönster som under utveckling. Vi antar att liknande specifika ligandreceptorinteraktioner och vävnadsspecifika regleringsmekanismer kan förklara de observerade skillnaderna på fenotyperna till Dll-1 haploinsufficient och Notch1 KO möss.

Pajvani et al. 18 har rapporterat en direkt bindning av RBPJ- K på G6PC-promotorn som modulerar glukoneogenes på ett Foxo1-beroende sätt. I deras studie resulterade inte haploinsufficiens hos Notch1 ensam i fenotypiska förändringar. Emellertid ledde haploinsufficiens hos både Notch1 och Foxo1 till signifikant högre insulinkänslighet jämfört med kontrollmöss. Den hepatocytspecifika Notch1 KO-modellen som användes i det aktuella arbetet visar tydliga fenotypiska förändringar inklusive hyperglykemi, hyperinsulinemi, kroppsviktökning och steatos när de matas med HFD. Således tillhandahåller den celltypspecifika KO bevis för en primär hepatocyt-specifik molekylär förändring på grund av Notch1-deletion, vilket sannolikt inducerar uppreglering av glukos i lever och lipidproduktion som ett ursprung för de observerade systemiska fenotypiska förändringarna. Även om de data som presenteras i denna studie verkar kontroversiella för resultaten rapporterade av Pajvani et al , 18 finns det olika möjliga mekanismer som kan förklara skillnaden och som ger ny kunskap till komplexiteten hos Notch-signalering på glukos- och lipidmetabolism i lever. Först har Notch1-haploinsufficiensmodellen som används av Pajvani en minskning av Notch1-uttrycket i alla vävnader, medan Notch1-radering är hepatocytspecifik i vår modell. Konceptet att leverfria icke-parenkymala celler kan vara effekterna av metaboliskt syndrom och insulinresistens har diskuterats tidigare. 25 Dessa icke-parenkymala celler verkar faktiskt inte bara åskådare utan kan reagera aktivt som svar på förändringar i deras miljö. Således kan en förändring av Notch-signalering i hepatocyter följaktligen utlösa en kompensationsmekanism i icke-parenkymala celler som leder till en förhöjd glukos- och lipidproduktion. I själva verket visade a- glatt muskelaktinfärgning av leversektioner från kontroll- och KO-möss en reduktion av aktiverad lever-stellerad cell (HSC) -fenotyp i hepatocyt-specifika Notch1 KO-djur, vilket tyder på en övergång till fettlagring av fenotyp av HSC: er (kompletterande figur S2 ). En mer djupgående analys av Notch-signalering i parenkymala och icke-parenkymala celler i samband med insulinresistens och steatos krävs för att klargöra detta. För det andra är modellen som används av Pajvani en kombinerad haploinsufficiens hos Foxo1 och Notch1. Det är välkänt att Foxo-familjemedlemmar är viktiga effekter av insulinmedierad lever glukosproduktion. 26 Därför kan frånvaron av Foxo1 i deras modell leda till en minskning av glukoneogenesen. För det tredje har Valenti et al 19 rapporterat att de kanoniska Notch-målen, HEY1 och HES1, är uppreglerade hos NAFLD-patienter, vilket antyder en roll för Notch-signalering i insulinresistens och steatos. I våra NASH- och NAFLD-kohorter reduceras HES1 och HEY1 uttrycksnivåer jämfört med kontrollgruppen. I våra hepatocyt-specifika KO-möss uttrycks inte Hey1 / Hes1 differentiellt (data visas inte). Våra data antyder en icke-kanonisk Notch-signalmedierad G6PC- och PLIN5-uppreglering. Ytterligare analys av celltypspecifikt uttryck av Notch-receptorer och ligander behövs för att klargöra den underliggande mekanismen.

Den kanoniska modellen för glukosreglering i leveren där Akt krävs för att modulera Foxo1 transkriptionell aktivitet har diskuterats. 6 Det har faktiskt rapporterats att regleringen av glukosproduktion i lever i Akt1 / Akt2 / Foxo1 trippel KO-möss var jämförbar med kontrolldjur, vilket tyder på att denna process är oberoende av Akt-Foxo1-signalering. I vår modell med hepatocyt-specifik Notch1 KO, mätte vi en högre storleksordning av Akt-aktivering i KO-mössen jämfört med kontrolldjuren (figurerna 4a och b), vilket resulterade i en förändring av Foxo1-målgenens uttryck (figur 4c), förmodligen på grund av till Foxo1 kärnkraftsuteslutning och nedbrytning. Därför förväntades en reduktion av G6PC-expression i Notch1 KO-djur. Överraskande mätte vi ett ökat uttryck av G6PC i KO-möss (figur 3b). Dessa data antyder att G6PC-uttryck i hepatocyt-specifika Notch1 KO-möss är oberoende av Akt-Foxo1-signalering.

Insulinresistens förutsätter hepatisk steatos orsakad av en ökning av lipolys i fettvävnader och ökat flöde av fria fettsyror till levern. 27 Insulinresistens är generellt associerat med uttrycket av lipidaktiverad transkriptionsfaktor PPAR α , vilket transkriptionellt ökar PLIN5-uttrycket. Det är väl dokumenterat att PLIN5 bidrar till lipidansamling genom att förändra lipiddroppsmetabolismen genom hämning av triglyceridnedbrytning och / eller reducera fettsyraoxidation. 28 I vår musmodell av hepatocyt-specifik Notch1-brist mättes insulinresistens och leverreglering av lever PLIN5 och kan bidra till den observerade lipiddråpsansamlingen.

Sammanfattningsvis bekräftar våra data den föreslagna rollen för Notch-signalering i ämnesomsättningen. Vi tillhandahåller nya bevis för den Notch1-beroende regleringen av glukos- och lipidproduktion i lever och föreslår därmed Notch1 som en ny viktig aktör i patofysiologin hos NAFLD / NASH. Även om den fulla molekylära mekanismen förblir oklar antyder data en mer komplex regleringsmekanism som involverar distinkta Notch-ligander och receptorer på parenkymala och icke-parenkymala celler i levern. En detaljerad analys av celltypspecifik ligandbindning av Notch1 såväl som Notch1 / RBPJ-transkriptionell reglering av gener som är involverade i levermetabolism behövs för att utvärdera de potentiella framtida läkemedelsmålen för behandling av insulinresistens och leverstatos.

Kompletterande information

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell 1

  2. 2.

    Kompletterande tabell 2

  3. 3.

    Kompletterande tabell 4

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande tabell 3

  2. 2.

    Kompletterande figurlegender

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen för laboratorieundersökningar (//www.laboratoryinvestigation.org)