Proantocyanidintillskott för druvmassa minskar adipocytstorleken och ökar antalet adipocyt hos feta råttor | internationell journal för övervikt

Proantocyanidintillskott för druvmassa minskar adipocytstorleken och ökar antalet adipocyt hos feta råttor | internationell journal för övervikt

Anonim

ämnen

  • Fettmetabolism
  • Fetma

Abstrakt

mål:

Vit fettvävnad (WAT) expanderar genom hypertrofi (ökad adipocytstorlek) och / eller hyperplasi (ökat adipocytantal). Hypertrofi har associerats med insulinresistens och dyslipidemi oberoende av kroppssammansättning och fettfördelning. Däremot skyddar hyperplasi mot metaboliska förändringar. Proantocyanidiner, som är de vanligaste flavonoiderna i den mänskliga dieten, förbättrar metaboliska störningar förknippade med dietinducerad fetma utan att minska kroppsvikt eller fett. Syftet med denna studie var att bestämma om proantocyanidin-extrakt (drupefrön) för druvor kan modulera WAT-expanderbarheten. Eftersom GSPE också innehåller gallinsyra, studerade vi också gallinsyraförmåga att ombygga WAT.

Design:

Hanråttor från Wistar matades med en standard chow-diet ( n = 6) eller en cafeteria-diet (CAF) under 11 veckor. Efter 8 veckor kompletterades de CAF-matade djuren med 25 mg GSPE / kg kroppsvikt ( n = 6), 7 mg gallsyra / kg kroppsvikt ( n = 6) eller bäraren ( n = 6) under 3 veckor. Histologiska analyser utfördes i retroperitoneal (rWAT) och inguinal (iWAT) WAT för att bestämma adipocytstorlek och antal. Specifika markörer för adipogenes och WAT-funktionalitet analyserades i rWAT med användning av kvantitativ RT-PCR.

Resultat:

GSPE eller gallinsyratillskott minskade inte viktökning eller omvänd och fett. GSPE minskade emellertid adipocytstorleken signifikant i rWAT och måttligt i iWAT och tredubblade adipocytantalet i rWAT. Gallinsyra minskade något adipocytstorlek i rWAT och iWAT och fördubblade adipocytantalet i båda WATs. I enlighet med denna adipogena aktivitet tenderade Pref-1 och PPARy att vara överuttryckta i rWAT hos råttor kompletterade med GSPE. Dessutom ökade GSPE-tillskott Plin1- och Fabp4-uttrycket och återställde adiponektinuttryck fullständigt, vilket indikerar en bättre funktionalitet för visceralt WAT.

Slutsatser:

GSPE-tillskott har antihypertrofisk och hyperplasisk aktivitet hos råttor med etablerad fetma, främst i visceral WAT som inducerar en hälsosam utvidgning av WAT för att matcha överskottsenergin från kafeteriet.

Introduktion

Fetma är en riskfaktor för många metaboliska sjukdomar, såsom dyslipidemi, hypertoni, typ 2-diabetes och hjärt-kärlsjukdomar. 1 Det har antagits att prevalensen av metabola sjukdomar ökar med vattnet av fettvävnad (WAT). Vissa feta individer uppvisar emellertid inte metaboliska förändringar och kallas metaboliskt friska feta. 2 Därför har nya teorier som kopplar över fetma och metaboliska sjukdomar föreslagits. En teori antyder att metaboliska störningar uppträder när lagringskapaciteten för WAT överskrids, och därmed genererar dysfunktionell fettvävnad. 3 Detta fenomen kallas till och med WAT-misslyckande av vissa författare. 4 Således kan utvidgningen av WAT för att matcha överskottsenergin ge metaboliska fördelar trots att individer blir mer överviktiga.

WAT-expansion sker genom hypertrofi (ökning i adipocytstorlek genom lipidansamling i adipocyter) och / eller hyperplasi (ökning i adipocytantal genom differentiering före adipocyt, det vill säga adipogenes). Flera studier har visat att adipocytstorlek är en oberoende prediktor för metabola sjukdomar, och adipocythypertrofi har associerats med insulinresistens 5 och dyslipidemi 6 oberoende av kroppssammansättning och fettfördelning. I själva verket har hypertrofiska adipocyter större kapacitet att locka inflammatoriska celler 7 och är mer lipolytiska och resistenta mot insulinverkan än små adipocyter. 8 Adipocyternas förmåga att lagra och mobilisera lipider störs dessutom i dysfunktionellt WAT. I detta avseende har ett reducerat uttryck av peroxisomproliferatoraktiverad receptor y (PPARy) och fettsyrasyntas (FASN) observerats hos feta människor med insulinresistens. 4 Det antas således att hyperplasi skyddar mot metabola förändringar, medan adipocythypertrofi resulterar i metabola dysfunktioner. Följaktligen är adipogenes en nyckelfaktor för att bevara lämplig utvidgbarhet av WAT, och flera studier har visat att feta individer uppvisar lägre adipogen potential. 4

Hypoxia är också förknippat med nedsatt WAT-funktionalitet; följaktligen kräver WAT-expansion en angiogenes. Vaskulära endotelväxtfaktorer (VEGF: er) främjar angiogenes, och uttrycket av VEGF-A i WAT är högre hos feta personer med låg insulinresistens än hos de med insulinresistens. 4 Möss som överuttrycker VEGF-A i WAT har dessutom ett ökat antal och storlek på blodkärl och skyddas följaktligen mot hypoxi och insulinresistens inducerad av en fettrik diet. 9

Proantocyanidiner, som är flavonoider som är mycket rikliga i den mänskliga dieten, har definierats som friska bioaktiva föreningar. 10 Flera studier har rapporterat många gynnsamma effekter av druvfröproantocyanidin-extrakt (GSPE) på olika fetma-associerade sjukdomar, såsom insulinresistens, 11 dyslipidemi, 12 hypertoni, 13 inflammation 14 och leptinresistens. 15 Intressant nog har dessa positiva effekter av GSPE observerats utan betydande minskningar av kroppsvikt och fett. Således var syftet med denna studie att bestämma om GSPE kan förbättra expanderbarheten i retroperitoneal (rWAT) och inguinala (iWAT) fettvävnader i fall av fetma och därmed undvika metaboliska sjukdomar associerade med fettsnål fettsinducerad fetma. Förutom proantocyanidiner innehåller GSPE också gallinsyra. Således utvidgades syftet med detta arbete ytterligare för att undersöka gallinsyrans bidrag till GSPE: s kapacitet att ombygga WAT.

Material och metoder

Proanthocyanidin-extrakt och gallinsyra för druvfrö

GSPE tillhandahöll vänligt av Les Dérives Résiniques et Terpéniques (Dax, Frankrike). GSPE-kompositionen kännetecknades tidigare av Margalef et al 16 och beskrivs i tilläggstabell 1. Gallinsyra (98, 5% renhet) köptes från Sigma-Aldrich (G7384, Madrid, Spanien).

Djurförsök

Undersökningen genomfördes i enlighet med de etiska standarderna och Helsingforsdeklarationen och godkändes av Etiköversynskommittén för djurförsök av Universitat Rovira i Virgili (referensnummer 7959 av Generalitat de Catalunya).

Fem veckor gamla Wistar-råttor av hanköp köptes från Charles River Laboratories (Barcelona, ​​Spanien) och hölls i djurskvarter vid 22 ° C med en ljus / mörk period på 12 timmar (ljus från 0800 till 2000 timmar). Djur hölls under en vecka och matades med chowdiet för anpassning. Djuren delades sedan upp i fyra grupper slumpmässigt: standardgruppen (STD, n = 6) matades en standard chow-diet (STD Panlab A04, Panlab, Barcelona, ​​Spanien) och kranvatten ad libitum , och alla andra grupper matades en cafeteridiet (CAF) bestående av korv, bacon, kex med paté, ost, ensaïmada (sötad bakelse), morötter och sötad mjölk (20% sackaros w / v) utöver den vanliga chowdieten. Sammansättningen för cafeteria-dieten var 14% protein, 35% fett och 51% kolhydrater. Denna mycket smakliga diet kan inducera frivillig hyperfagi. CAF tillhandahölls nyligen till djuren dagligen, och djur kunde välja och äta ad libitum . Efter 8 veckor delades CAF-matade djur upp i tre nya grupper: GSPE-grupp (GSPE, n = 6), som fick en komplettering av CAF-diet med en oral dos av 25 mg GSPE / kg kroppsvikt i sötad mjölk; gallinsyragrupp (gallinsyra, n = 6), som fick en oral dos av 7 mg gallsyra / kg kroppsvikt i sötad mjölk; och CAF-gruppen, som endast fick sötad mjölk. Alla grupper fick föreningarna eller vehikeln under resten av experimentet. Efter 3 veckor fastades råttorna i 3 timmar efter den orala dosen och dödades sedan genom levande halshuggning. Totalt blod uppsamlades med användning av heparin (DeltaLab, Barcelona, ​​Spanien) som antikoagulant. Plasma erhölls genom centrifugering (1500 g , 15 min, 4 ° C), och alla fettvävnadsdepåer skars ut och frystes omedelbart i flytande kväve. Både plasma och vävnader lagrades vid -80 ° C tills vidare användning.

Adipositetsindexet beräknades för varje djur som summan av de mesenteriska, retroperitoneala och epididymala WAT-depotvikterna uttryckta som en procentandel av den totala kroppsvikten.

Kvantifiering av plasmaparametrar

Plasmanivåerna av insulin, adiponectin och leptin mättes med användning av en immunometrisk sandwich-enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) med användning av en råtta / mus-insulin ELISA-kit (EZRMI-13K), råtta leptin ELISA-kit (EZRL-83K) och råtta-adiponectin ELISA kit (EZRADP-62K) köpt från Millipore Ibérica (Madrid, Spanien). Plasmaprover utspäddes och immunoanalyser utfördes i duplikat enligt tillverkarens protokoll. Plasmatriglycerider (TG), totalt kolesterol (TC), HDL-kolesterol (HDL-C) och glukos mättes med enzymatiska kolorimetriska satser efter tillverkarens protokoll (QCA, Barcelona, ​​Spanien). Plasma-NEFA: er analyserades med det enzymatiska kolorimetriska HR NEFA-serien (Wako, CA, USA).

Fettvävnadsmorfologi

Små bitar av frysta rWAT och iWAT (−80 ° C) skickades till ELDINE Patologia (Tarragona, Spanien), där de tinades och fixerades i 4% utspädd formaldehyd. Efter 24 timmars fixering genomgick vävnader successiv dehydrering (Alkohol / etanol 70, 96 och 100%; plus xylol / dimetylbensen) och paraffininfiltrering och nedsänkning vid 52 ° C (Citadel 2000. HistoStar, Thermo Scientific, Madrid, Spanien). Paraffinblocken skars därefter i på varandra följande 2-mik tjocka sektioner (Microm HM 355S. Thermo Scientific). Sektionerna avsattes på objektglas (JP Selecta Paraffin Bath) och utsattes för automatiserad hematoxylin-eosinfärgning (Varistain Gemini. Shandom. Thermo). 17 bilder av fettpartierna förvärvades med hjälp av AxioVision Zeiss Imaging-programvara (Carl Zeiss Iberia, SL, Madrid, Spanien). Slutligen lagrades bilderna som tagits med förstoringen × 20 och analyserades med Adiposoft-programvaran (CIMA, University of Navarra, Spanien) för att kvantifiera adipocytantal och områden. Fem fält per prov och tre prover från varje grupp (STD, CAF, GSPE och gallinsyra) mättes. Området beräknades utifrån medelvärdet av cellområdet i alla uppmätta fält. Det totala cellantalet i fettdepåerna rWAT och iWAT beräknades utifrån fettcellvolymen.

Fettcellvolym erhölls för varje fångat fält med användning av formeln

18 (där d är medeldiametern för 100 uppmätta celler i fältet, och σ är standardavvikelsen för diametern). Därefter applicerades fettcelldensitet (0, 92 g / ml) för att bestämma fettcellens vikt. Slutligen bestämdes det totala fettcellantalet i hela rWAT- och iWAT-depot för varje djur genom att dela den totala fettdepotvikten med medelcellvikt för alla fångade fält.

RNA-extraktion och mRNA-kvantifiering genom realtids qRT-PCR

Totalt RNA isolerades från det frysta rWAT och iWAT med användning av trizolreagens (Ambion, MA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Kvaliteten på totalt RNA kontrollerades med användning av en NanoDrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

Relativa mRNA-nivåer av Perilipin 1 (Plin1), fettsyrabindande protein 4 (Fabp4), Peroxisome proliferator-aktiverad receptor gamma (Ppary), fettsyrasyntas (Fasn), familjemedlem Wnt 10 Beta (Wnt10P), Kollagen typ VI alfa 2 kedja (Col6A2), vaskulär endotelväxtfaktor A (Vegfa), Leptin, Kopplingsprotein 1 (Ucpl), Interleukin 6 (IL-6), tumornekrosfaktor alfa (TNFa), Adiponectin (Adipoq), Pre-adipocytfaktor-1 (Pref-1) och Adhesion G-proteinkopplad receptor El (Adgre1) analyserades med realtids-PCR i rWAT med användning av cyklofilin (Ppia) som den endogena kontrollen.

Totalt RNA transkriberades omvänd med TaqMan Reverse Transcription Reagents-kit (Applied Biosystems, MA, USA) enligt tillverkarens protokoll. Genuttryck utvärderades med Bio-Rad CFX96 Realtid PCR-system (Bio-Rad Laboratories, Barcelona, ​​Spanien) med användning av SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Barcelona, ​​Spanien) och genspecifika SYBR-primrar designade för varje gen med FastPCR-programvaran (kompletterande tabell 2). Resultaten normaliserades till PPIA. Amplifiering utfördes enligt temperaturstegen på 95 ° C under 30 s följt av 40 cykler vid 95 ° C under 5 s och 60 ° C under 5 s. Vikningsändringen i mRNA-nivån beräknades i log 2-skalan med ekvationen 2 ΔΔCt (där ΔCt = Ct mRNA - Ct Ppia och ΔΔCt = ΔCt-behandlade prover - ΔCt obehandlade kontroller).

Statistisk analys

Resultaten rapporteras som medelvärde ± sem av sex djur per grupp för mRNA-nivåer och som medelvärde ± sem av tre djur per grupp för histologi Adiposoft-analys. Gruppmedel jämfördes med användning av envägsanalys av varians (ANOVA) med IBM SPSS statistik 20.0 mjukvara (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA). Jämförelserna ansågs vara signifikanta vid P0, 05.

Resultat

GSPE eller gallinsyratillskott minskade inte kroppsvikt och fett men förbättrade hyperglykemi och dyslipidemi hos maträtningar som matats med dieter

GSPE- eller gallinsyratillskott under 3 veckor minskade inte kroppsvikt eller vändte den subkutana och viscerala fettkudden som inducerades av cafeteriedieten (tabell 1). GSPE- och gallinsyratillskott var emellertid effektiva för att modulera plasmanivån för hormoner och metaboliter relaterade till glukos och lipidhomeostas (tabell 2). Specifikt minskade GSPE och gallinsyra plasma-TG, TC och icke-HDL-C-nivåer med mer än 20%. Detta resulterade i en mer än 20% reduktion av det aterogena indexet TC / HDL-C i djuren kompletterade med GSPE. Dessutom reducerade GSPE och gallinsyra plasmaglukosnivåerna med 11 respektive 21% och insulinnivåerna med 27 respektive 23%. Således förbättrade GSPE eller gallinsyratillskott insulinresistensindexen HOMA-IR, QUICKI och R-QUICKI. Adiponektin- och leptinnivåerna påverkades emellertid inte av GSPE eller gallinsyraadministration.

Full storlek bord

Full storlek bord

Sammantaget indikerar dessa resultat att tillskott av GSPE och gallinsyra förbättrade hyperglykemi och dyslipidemi inducerad av cafeteridieten utan att påverka kroppsvikt och fettmassans ackretion. Eftersom dysfunktionella fettvävnader kan vara avgörande för metabolisk försämring förknippade med fetma, undersökte vi därefter om tillskott av GSPE eller gallinsyra kan modulera adipocytmorfologi och WAT-expansion i fetma.

GSPE eller gallinsyratillskott minskade adipocytstorlek och ökade adipocytantal

Det finns metaboliska och funktionella skillnader mellan WAT-depåerna. Således studerades adipocytmorfologi i rWAT- och iWAT-fettdepåer som representerar visceralt respektive subkutant WAT (figur 1 och 2). Vi utvärderade hyperplasi i visceral och subkutan WAT genom extrapolering av det totala antalet adipocyter från storleken på adipocyter (via histologi) och vikten av fettkudden i rWAT och iWAT. Figurerna la och 2a visar en representativ histologisk bild av rWAT och iWAT för varje grupp av råttor.

Effekt av GSPE eller gallinsyratillskott på adipocytstorlek och antal i rWAT. Råttor matades med en standard chow-diet (STD-grupp) eller cafeteria-diet (CAF) under 11 veckor. Efter 8 veckor kompletterades CAF-matade djur med 25 mg GSPE / kg kroppsvikt (GSPE-grupp), 7 mg gallsyra / kg kroppsvikt (GA-grupp) eller bäraren (CAF-grupp) under 3 veckor. Prover av rWAT färgades med hematoxylin och eosin. Representativa ljusmikroskopibilder ( a ) från varje grupp användes för att mäta adipocytarea ( b ). Adipocytvolym ( c ) och frekvensen för adipocytstorlek ( d ) beräknades från adipocytarea. Totalt adipocytantal ( e ) extrapolerades från storleken på adipocyter och vikten av rWAT. Värdena är medelvärdet ± sem av fem fält per djur från tre djur i varje grupp. Olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader mellan grupper vid P 0.05 med enkelriktad ANOVA.

Bild i full storlek

Effekt av GSPE eller gallinsyratillskott på adipocytstorlek och antal i iWAT. Råttor matades med en standard chow-diet (STD-grupp) eller cafeteria-diet (CAF) under 11 veckor. Efter 8 veckor kompletterades CAF-matade djur med 25 mg GSPE / kg kroppsvikt (GSPE-grupp), 7 mg gallsyra / kg kroppsvikt (GA-grupp) eller bäraren (CAF-grupp) under 3 veckor. Prover av iWAT färgades med hematoxylin och eosin. Representativa ljusmikroskopibilder ( a ) från varje grupp användes för att mäta adipocytarea ( b ). Adipocytvolym ( c ) och frekvensen för adipocytstorlek ( d ) beräknades från adipocytarea. Totalt adipocytantal ( e ) extrapolerades från storleken på adipocyter och vikten av iWAT. Värdena är medelvärdet ± sem av fem fält per djur från tre djur i varje grupp. Olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader mellan grupper vid P 0.05 med enkelriktad ANOVA.

Bild i full storlek

Matning av råttor i cafeteria-dieten under 11 veckor ökade signifikant adipocytytan och volymen i både rWAT (figurerna 1b och c) och iWAT (figurerna 2b och c) i förhållande till de mager kontrolldjur, vilket resulterade i en förhöjd frekvens av adipocyter på högre än 3800 μm 2, främst i rWAT (figur 1d och 2d). Däremot fördubblades cafeteria-diet nästan adipocytantalet i iWAT ensam, även om denna ökning inte var statistiskt signifikant (figur 1e och 2e). Dessa värden indikerar att cafeteria-diet inducerade visceral och subkutan fettuttag främst genom hypertrofi.

GSPE-tillskott under de senaste 3 veckorna, när övervikt redan hade fastställts, omvänt totalt adipocythypertrofi av rWAT inducerat av enbart cafeteriedieten (figur 1b och c). Således normaliserades adipocytområdet på grund av en ökad frekvens av adipocyter till lägre än 3800 um 2 (figur 1d). Dessutom tredubblade GSPE-kompletteringen adipocytnumren i rWAT-depot (figur 1e). Däremot tenderade GSPE-tillskott att minska adipocytytan och volymen i iWAT utan någon signifikant effekt på adipocytantalet (figurerna 2b – e).

Effekterna av gallinsyratillskott på adipocytmorfologi var inte lika tydliga som effekterna av GSPE-tillskott. Råttor som matats med cafeteria, kompletterat med gallinsyra under de senaste 3 veckorna, visade en liten minskning av adipocytområdet och volymen (ungefär 15–20%) jämfört med de hos råttor som matats med cafeteria-diet enbart i både rWAT (figur 1b – d) och iWAT (Figurerna 2b – d). Dessutom fördubblade gallinsyratillskott adipocytantalet i både rWAT och iWAT. Denna ökning var dock endast signifikant i iWAT jämfört med magra råttor (figur 1e och 2e).

Sammantaget indikerar dessa resultat att tillskottet av GSPE eller gallinsyra kunde modulera visceralt och subkutant WAT, reducera hypertrofi och öka hyperplasi. RWAT var emellertid mer känslig än iWAT för GSPE, medan iWAT var mer känslig än rWAT för gallsyra.

För att bestämma huruvida dessa morfologiska förändringar i WAT-expansion inducerad genom GSPE eller gallinsyratillskott kan vara relaterade till förbättringen av dyslipidemi och hyperglykemi, beräknade vi sambandet mellan volym och antal adipocyter med plasma-metaboliska parametrar (tilläggstabell 3). Intressant nog korrelerade iWAT-adipocytvolymen negativt med QUICKI-indexet och positivt med TG och TC / HDL-C-förhållandet. Dessutom korrelerade adipocytnumret i iWAT negativt med HDL-C och HDL-C / icke-HDL-C-förhållandet. Däremot hittades ingen signifikant korrelation mellan adipocytantal och storlek i rWAT.

Mekanismer genom vilka GSPE eller gallinsyratillskott kan renovera visceral fettvävnad

De stora modifieringarna av adipocytstorlek och antal i rWAT inducerade genom GSPE-tillskott, och i mindre utsträckning genom gallinsyratillskott, fick oss att undersöka några av de processer som är involverade i fettombyggnad av dessa föreningar. Dessa processer inkluderar adipogenes (pre-adipocytdifferentiering), extracellulär matris och vaskularisering. Dessutom är visceralt WAT, i motsats till subkutant WAT, närmare associerat med fetma-relaterade metaboliska störningar. 19

Uttrycket av pre-adipocytfaktor-1 (Pref-1), en pre-adipocytmarkör, ökades i rWAT hos råttor kompletterade med GSPE eller gallinsyra, även om skillnaderna inte var signifikanta på grund av den höga variationen i uttryck mellan råttor av samma grupp (figur 3a). Dessutom tenderade uttrycket av PPARy, som betraktas som huvudregleraren för adipogenes, att vara uppreglerat genom GSPE-tillskott men inte med det av gallsyra (figur 3b). Däremot påverkades Wnt-signalvägen, som hämmar adipogenes, inte av GSPE eller gallinsyratillskott (figur 3c). Dessa observationer indikerar att GSPE ökade antalet pre-adipocyter och gynnade deras differentiering till mogna adipocyter.

Effekt av GSPE eller gallinsyratillskott på uttrycket av gener relaterade till fettombyggnad i rWAT. Råttor matades med en standard chow-diet (STD-grupp) eller cafeteria-diet (CAF) under 11 veckor. Efter 8 veckor kompletterades CAF-matade djur med 25 mg GSPE / kg kroppsvikt (GSPE-grupp), 7 mg gallsyra / kg kroppsvikt (GA-grupp) eller bäraren (CAF-grupp) under 3 veckor. ( a ) Pre-adipocyt faktor-1 (Pref-1) mRNA-nivåer. ( b ) Peroxisomproliferatoraktiverad receptor gamma (Ppary) mRNA-nivåer. ( c ) Wnt-familjemedlem 10 Beta (Wnt10p) mRNA-nivåer. ( d ) MRNA-nivåer av kollagen typ VI alfa-2-kedja (Col6A2). ( e ) MVNA-nivåer av vaskulär endotel tillväxtfaktor A (Vegfa). ( f ) Koppla bort mRNA-nivåer av protein 1 (Ucpl). Värdena är medelvärdet ± sem av sex djur per grupp. Statistiska analyser utfördes med hjälp av envägs ANOVA. Olika bokstäver ( a - c ) indikerar signifikanta skillnader mellan grupper som beaktar P .050.05.

Bild i full storlek

GSPE eller gallinsyratillskott påverkade inte den extracellulära matrisen, mätt med uttrycket av Collagen 6A2-genen (figur 3d). Däremot ökade GSPE, men inte gallonsyra, uttrycket för den vaskulära endotelväxtfaktorn A (VEGF-A) (figur 3e), vilket antyder ökad angiogenes i rWAT hos råttor kompletterade med GSPE.

Vidare undersökte vi också om GSPE eller gallinsyratillskott kunde modulera ödet för pre-adipocyter till den beige fenotypen genom att analysera UCP1-uttryck (figur 3f). På grund av den höga variationen i UCP1-uttryck mellan råttor i samma grupp observerades emellertid inga signifikanta skillnader.

Även om studien fokuserades på rWAT, analyserades PPARy- och UCP1-uttrycket också i iWAT (kompletterande figur 1). Enligt den mindre känsligheten av iWAT för dessa föreningar observerades inga statistiska skillnader i dessa genuttryck i iWAT.

GSPE-komplettering förbättrade visceral fettfunktion

Fetthypertrofi är förknippat med dysfunktion i fettvävnad. Således undersökte vi kapaciteten för tillskott av GSPE eller gallinsyra för att förbättra flera markörer för fettvävnadsfunktionalitet, med fokus på rWAT.

En reducerad kapacitet att lagra och mobilisera lipider är associerad med WAT-dysfunktion. Således analyserade vi uttrycket av Fasn, Plin1 och Fabp4 i rWAT (figur 4a – c). Intressant nog ökade GSPE-komplettering uttrycket av Plin1 och Fabp4, vilket indikerade en ökad kapacitet för visceralt fett att lagra och mobilisera triglycerider. Däremot modifierade inte gallinsyratillskott dessa processer.

Effekt av GSPE eller gallinsyratillskott på uttrycket av gener relaterade till WAT-funktionalitet i det retroperitoneala fettdepotet. Råttor matades med en standard chow-diet (STD-grupp) eller cafeteria-diet (CAF) under 11 veckor. Efter 8 veckor kompletterades CAF-matade djur med 25 mg GSPE / kg kroppsvikt (GSPE-grupp), 7 mg gallsyra / kg kroppsvikt (GA-grupp) eller bäraren (CAF-grupp) under 3 veckor. ( a ) fettsyrasyntas (Fasn) mRNA-nivåer. ( b ) Perilipin 1 (Plin1) mRNA-nivåer. ( c ) fettsyrabindande protein 4 (Fabp4) mRNA-nivåer. ( d ) Adiponectin (Adipoq) mRNA-nivåer. ( e ) Leptin-mRNA-nivåer. ( f ) Interleukin 6 (IL-6) mRNA-nivåer. ( g ) Tumornekrosfaktor alfa (TNF-a) mRNA-nivåer. ( h ) makrofagytemarkörgenen vidhäftning G-proteinkopplad receptor El (Adgre1) mRNA-nivåer. Värdena är medelvärdet ± sem av sex djur per grupp. Statistiska analyser utfördes med hjälp av envägs ANOVA. Olika bokstäver indikerar signifikanta skillnader mellan grupper som beaktar P0, 05.

Bild i full storlek

Dessutom återställde GSPE-komplettering fullständigt adiponektinuttryck och delvis återställd leptinuttryck (figur 4d och e). Således normaliserade GSPE visceral funktionalitet relativt adipokinsekretion. Men gallinsyratillskott återställde endast delvis både leptin- och adiponektinuttryck.

Inflammation och makrofaginfiltration är egenskaper hos dysfunktionell fettvävnad. Matning av råttor med en cafeteria-diet ökade emellertid inte IL-6- eller TNFa-uttrycket hos dessa djur (figurerna 4f och g), och GSPE-tillägg förändrade inte uttrycket för dessa markörer ytterligare. Ändå är det viktigt att notera att gallinsyra förvärrade inflammation, eftersom dess tillskott ökade IL-6-uttrycket i rWAT signifikant. Uttrycket av Adgre1 (figur 4h), en makrofagmarkör, indikerade att dietbehandlingar inte inducerade immuncellinfiltrering.

Sammantaget indikerar dessa resultat tydligt att GSPE-komplettering förbättrade visceral adipocytfunktionalitet. Däremot var gallinsyratillskott inte lika effektivt som GSPE och till och med förvärrade inflammationsmarkörer i rWAT.

Diskussion

Tidigare studier har visat att GSPE förbättrar hyperglykemi, dyslipidemi och till och med störningen av central leptinsignalering inducerad av en cafeteridiet utan att påverka kroppsvikt eller fettindex. 11, 12, 15 Nedsatt utvidgning av WAT anses vara orsakande av metaboliska störningar associerade med fetma. I denna studie undersökte vi därför om de positiva effekterna av GSPE kunde förknippas med förbättrad WAT-expanderbarhet.

Hyperplasi och hypertrofi kan bidra till utvidgningen av WAT i fetma. I vår modell av fetma med cafeteria dietmatade råttor expanderade rWAT med hypertrofi, medan iWAT expanderade genom en kombination av hypertrofi och hyperplasi. Studier av gnagare som matas med en fettrik diet tyder på att hyperplasi främst är relevant vid utvidgning av subkutan WAT, medan andra visar att hyperplasi endast är signifikant vid utvidgning av visceral WAT. 21 Denna skillnad har tillskrivits den metod som används för att mäta WAT-hyperplasi. 22

Det är viktigt att tillskottet av cafeteridiet med GSPE under 3 veckor, när fetma var märkbart, förändrade djupt mönstret för den CAF-inducerade rWAT-expansionen genom att normalisera adipocytstorlek och öka antalet adipocyter. För att matcha överskottsenergi inducerade GSPE alltså en sundare expansion av rWAT än cafeteridieten ensam. Detta kan avslutas eftersom GSPE-komplettering tydligt ökade kapaciteten att lagra och mobilisera TG och återställa adiponectin och leptinuttryck i rWAT. Däremot, i iWAT, modifierade GSPE-tillägg adipocytantal och storlek i mycket lägre utsträckning än i rWAT. Dessa resultat belyser att visceralt fett var mer känsligt än subkutant fett för GSPE.

Gallinsyra, en icke-proanthocyanidin-komponent i GSPE, är känd för att ha gynnsamma effekter på det metaboliska syndromet 23 och att modulera 3T3-L1 adipocytdifferentiering. 24 Således resonerade vi att gallinsyra också kunde delta i moduleringen av WAT-morfologi inducerad av GSPE. För att testa detta kompletterades en grupp råttor med 10 gånger mängden gallsyra närvarande i 25 mg GSPE. Gallinsyratillskott påverkade adipocytantalet mer än det påverkade adipocytstorleken, vilket tyder på att den antihypertrofiska aktiviteten hos GSPE främst kan tillskrivas proantocyanidiner, medan gallinsyra och proantocyanidiner skulle kunna bidra till den hyperplasiska aktiviteten hos GSPE.

Andra författare har fokuserat på förmågan hos rena polyfenoler och polyfenolrika extrakt för att modulera adipocythypertrofi, men inte hyperplasi, i gnagarmodeller av dietinducerad fetma. Till exempel reducerar polyfenolrikt druvmassa, 25 resveratrol 26 eller piceatannol 27 tillskott epididymal adipocytstorlek. I överensstämmelse med våra resultat minskar dessutom långvarig tillskott av resveratrol adipocytstorleken i visceral, men inte subkutan, WAT hos rhesus-apor som matas med en fettsnål diet med högt socker. 28 Resveratrol kapacitet att minska adipocytstorleken har också bekräftats i subkutan WAT i buken hos friska människor. 29 I alla dessa djurstudier administrerades polyfenoler emellertid från början av kosten, vilket indikerade att dessa polyfenoler förhindrade utvecklingen av hypertrofi i samband med fetma. I motsats till detta, i vår studie administrerades GSPE endast när fetma kunde märkas, vilket visade att GSPE hade tydliga antihypertrofiska och hyperplasiska aktiviteter.

Visceral WAT är närmare besläktad än subkutan WAT till metaboliska störningar associerade med fetma. 19 Genom att främst rikta in sig på rWAT-expanderbarhet kan GSPE således ha en hög potential att undvika metaboliska störningar. Den antihypertrofiska effekten av GSPE på visceralt fett kan återställa glukos och lipidhomeostas eftersom hypertrofiska adipocyter är förknippade med insulinresistens 5 och med en ökad risk för metaboliskt syndrom. 30 Dessutom kan den hyperplasiska effekten av GSPE också öka insulinkänsligheten eftersom tiazolidindionläkemedel leder till insulinkänslighet genom att öka adipogenen. 31 Detta antyder att det kan vara fördelaktigt att ha fler adipocyter. Noterbart var denna modifiering av adipocytantal och storlek inducerad av GSPE i rWAT samtidigt med överuttrycket av VEGF, en faktor som inducerar angiogenes och ökar WAT adipose vasculature, 32 vilket indikerar att GSPE-tillskott ökade syretillförseln till adipocyter och därmed förbättrade rWAT-funktionaliteten. I enlighet med dessa resultat indikerar mätningar av plasmaparametrar också en förbättring av dyslipidemi och hyperglykemi med GSPE, även om korrelationen som hittades mellan adipocytantal och storlek i rWAT och dessa plasmaparametrar inte var signifikant. Däremot korrelerade iWAT-adipocytvolymen positivt med TG och TC / HDL-C-förhållandet, och iWAT-adipocytantal korrelerade negativt med HDL-C och HDL-C / icke-HDL-C-förhållandet. Därför kan måttliga förändringar i iWAT-expanderbarhet inducerad av GSPE och gallinsyra vara relevanta för den förbättrade lipid- och glukoshomeostasen genom komplettering med dessa dietföreningar.

Intressant nog var effekten av GSPE på att öka adipocytantalet och minska adipocytstorleken mycket snabb, det vill säga inom 3 veckor efter GSPE-tillskott. Although the life span of adipocytes in rodents is not well defined, this speed of action of GSPE is in agreement with the results of some studies investigating epididymal fat that indicate a very rapid adipogenesis after cold exposure. 21

Until now, the mechanisms that control adipogenesis have been studied mainly in vitro , and little information is known under in vivo conditions. Some studies have identified adipocyte precursors in the WAT stromal-vascular fraction that are able to differentiate into mature adipocytes. 22 In the present study, the rWAT of rats supplemented with GSPE showed a tendency to increase the expression of Pref-1, which is a pre-adipocyte marker, 33 suggesting that GSPE supplementation increased the number of adipocyte precursors in visceral WAT. Although Pref-1 has been considered an adipogenic inhibitor, 34 the concomitant overexpression of PPARγ, the master regulator of adipogenesis, indicated that adipogenesis was active in the rWAT of rats supplemented with GSPE.

The adipogenic activity of GSPE observed in this study contradicts previous in vitro studies using 3T3-L1 cells, which postulated proanthocyanidins and GSPE as anti-adipogenic agents. 35 Although in vitro and in vivo conditions are not equivalent, several factors can account for these contradictory results. One important factor could be the specific molecules that reach adipocytes under each condition, that is, parental proanthocyanidins or their metabolites. Under in vivo conditions, proanthocyanidins are actively metabolized by the intestine, the liver and the microbiota, generating a large set of metabolites, such as phenyl-valerolactones. 36, 37, 38 Thus, the adipocytes in vivo are in contact with proanthocyanidin metabolites and not with parental proanthocyanidins. In contrast, in the in vitro studies, the pre-adipocytes were cultured directly with GSPE, that is, with parental proanthocyanidin. An additional factor that could explain this disparity is the presence of mature adipocytes under in vivo conditions. These mature adipocytes secrete adipogenic signals that can affect adipocyte formation either positively or negatively 39, 40, 41 and even control adipocyte size. 42 Thus, GSPE could increase adipogenesis in vivo by modulating some of these factors in mature adipocytes without directly affecting the differentiation of pre-adipocytes, which is the process observed under in vitro conditions.

In this experiment, GSPE was administered at 25 mg of GSPE/kg of body weight. This dose, using a translation of animal to human doses 43 and estimating the daily intake for a 70-kg human, corresponds to an intake of 284 mg of GSPE/day. This GSPE intake can be achieved in humans with a polyphenol-rich diet. For example, in Spanish adults, the mean dietary flavonoid intake was 313.26 mg/day, with proanthocyanidins comprising 60.1%. 44 Although experimental data obtained in rats cannot be directly translatable to humans, the fact that proanthocyanidins reverse adipocyte hypertrophy suggests that the inclusion of proanthocyanidin-rich foods in the diets of obese humans could be a good strategy for improving their metabolic alterations.

To summarize, GSPE supplementation has anti-hypertrophic and adipogenic activities in rats with established obesity, mainly in visceral WAT. Because hypertrophy is associated with insulin resistance and metabolic syndrome, GSPE supplementation induced a healthier expansion of WAT to match the surplus energy provided by the cafeteria diet. Moreover, GSPE supplementation improved visceral WAT functionality, increasing the capacity of visceral WAT to store and to mobilize TGs and restoring the expression of adiponectin.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande tabell 1

  2. 2.

    Kompletterande tabell 2

  3. 3.

    Kompletterande tabell 3

  4. 4.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på webbplatsen International Journal of Obesity (//www.nature.com/ijo)