Globin mrna reduktion för helblods transkriptomsekvensering | vetenskapliga rapporter

Globin mrna reduktion för helblods transkriptomsekvensering | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Genexpression
  • RNA-sekvensering

Abstrakt

Transkriptomanalysen av helblods-RNA genom sekvensering lovar identifiering och spårning av biomarkörer; emellertid hämmar det höga globin-mRNA (gmRNA) -innehållet i erytrocyter helblods- och buffy-skiktanalyser. Vi introducerar en ny gmRNA-låsningsanalys (GlobinLock, GL) som ett robust och enkelt gmRNA-reduktionsverktyg för att bevara RNA-kvalitet, spara tid och kostnader. GL består av ett par gmRNA-specifika oligonukleotider i RNA initial denatureringsbuffert som är effektiv omedelbart efter RNA-denaturering och lägger till bara tio minuters inkubation till hela cDNA-syntesförfarandet jämfört med RNA-analys utan blod. Vi visar att GL är fullt effektivt inte bara för mänskliga prover utan också för mus och råtta, och hittills ofullständigt studerade ko, hund och sebrafisk.

Introduktion

Som en typ av flytande biopsi används blod allmänt i klinisk forskning på grund av att det är enkelt att ta prov, dess transport av biomolekyler från hela kroppen och dess snabba dynamik. Blod bär proteiner, metaboliter och celler, och celler som erytrocyter, leukocyter och blodplättar kan tillhandahålla genomiskt DNA, mikroRNA och mRNA som biomarkörer för ett antal tillämpningar 1, 2, 3 . Att använda helblods-RNA (wbRNA) för uttrycksprofilering med RNA-sekvensering (RNA-sekvens) innebär utmaningar som en låg andel leukocyter (4–11 × 10 6 / l) och en hög prevalens av erytrocyter (4-5 × 10 9 / l), vilket resulterar i en signifikant mängd globin-mRNA (gmRNA) från erytrocyter. Som ett resultat berikas wbRNA-poolen med gmRNA i den utsträckning att 50–80% av wbRNA-sekvensen läser karta till gmRNA 4, 5 . Denna höga prevalens av gmRNA komplicerar transkriptomstudier av wbRNA, eftersom den massiva omvandlingen av gmRNA-molekyler till globin cDNA (gcDNA) kapar en betydande del av cDNA-synteskraften och samtidigt lämnar biologiskt relevanta molekyler oupptäckbara. De tillgängliga gmRNA-reduktionsmetoderna för RNA-seq, inklusive GLOBINclear TM (ThermoFisher) och Globin-Zero TM (Illumina), hjälper till att övervinna denna begränsning men lägger också till fler praktiska steg och därmed komprometterar kvaliteten på RNA (granskad i tilläggsfiguren) 1).

Hos vuxna människor är starkt uttryckta gmRNA alfa 1 och 2 ( HBA, nedan α) och beta ( HBB , ß) gmRNA ovanligt stabila för att säkerställa kontinuerligt uttryck av hemoglobinprotein i differentierade erytrocyter 6 . Den cellulära stabiliteten hos gmRNA förklaras delvis av en sluten slingstruktur, en egenskap delad av nästan alla eukaryota mRNA. Specifikt innehåller gmRNA en cis-verkande sekvens, C-rikt element i dess 3 'otranslaterade region och en 5 ′ m 7 Gppp-lockstruktur, som är kritiska för stabiliteten för denna långlivade mRNA 7, 8 .

För att minska mängden gmRNA i genuttrycksbaserade studier utvärderade vi systematiskt ett antal gmRNA-specifika oligonukleotider (GlobinLock, GL) som förhindrar eller åtminstone signifikant minskar grundningen av gcDNA-syntes. Vår GL-strategi minskar de negativa effekterna av gmRNA-närvaro i expressionsstudier och eliminerar behovet av ytterligare pipettering. För vuxen människa med dominerande gmRNA a och p används ett enda par specifika oligonukleotider i RNA-denatureringsbuffert. GL är effektiv omedelbart efter RNA-denaturering genom att binda till gmRNA-molekyler vid 3'-ställe och specifikt blockera bindningsstället för oligo-T-primer. Den GL-medierade gmRNA-reduktionsproceduren lägger endast tio minuters inkubation till cDNA-syntesförfarandet.

Resultat och diskussion

Vi observerade att oligonukleotidhybridisering med gmRNA maskerar bindningsstället för den förankrade oligo-T-primern (T30 VN, oligonukleotider visas i kompletterande tabell 1), undertryckande gcDNA-syntes. Den förankrade oligo-T-primern har degenererat nukleotid (er) vid 3'-änden för att bestämma cDNA-priming vid enstaka position per transkript 9, 10 . Icke-förankrade oligo-T-primrar glödar slumpmässigt längs 150-250 poly-A-nukleotidsvans av mRNA 11, vilket producerar flera cDNA-molekyler från en enda mall medierad genom strängersättningsaktivitet för omvänt transkriptas (RT).

För att upptäcka den mest effektiva och specifika GL testades flera oligonukleotidvarianter som är komplementära till human globin a och p. Två typer av GL-oligonukleotider utformades: en linjär GL som maskerar 3'-änden av gmRNA och en cirkulär GL som maskerar gmRNA 3 'med ett ytterligare bindningsställe vid 5'-änden för att lägga till specificitet och för att störa öppningen av gmRNA-sekundär strukturera. Den naturliga formen av gmRNA, där 3'- och 5'-ändarna är i nära närhet (kompletterande figurer 2 och 3) möjliggjorde den hypotetiska bildningen av ett cirkulärt gmRNA med ett cirkulärt GL-komplex före cDNA-syntesen (fig. La).

( a ) Schematisk globin-mRNA med möjliga maskerande oligonukleotider och förankrad oligo-T-primer. Alla oligosekvenser och modifieringar visas i tilläggstabell 1. ( b ) Fem GL-tillstånd och GL-negativa kontroller jämfördes för att mäta globin a-reduktionsfällförändring med qPCR. Mallutspädningar (10 ×) användes i denna relativa qPCR-konstruktion och därför mäts reduktionseffekten upp till tio exakt enligt befintlig utspädningsfaktor men vikningsändringsvärden över tio är utanför det rapporterade kvantifieringsområdet. ( c ) 3'-DNA lång GL-koncentrationseffekt på humant globin a och p mätt med qPCR.

Bild i full storlek

GL: erna utvärderades först med kvantitativ PCR (qPCR), mätande avkastningsförändringen för a cDNA. HBA har förutspått sekundär struktur vid gmRNA 3'-änden med två oberoende algoritmer (kompletterande figur 2 och 3). Därför konkurrerar den förutsagda a-självbindningen med GL, vilket indikerar att känsligt testsystem bör användas för att fastställa effektiv och stringent hybridisering och oligonukleotidbetingelser för omfattande gmRNA-låsning. För att undersöka stabila bindnings- och blockeringsegenskaper för GL-oligonukleotider testade vi låsta nukleinsyra 12 (LNA) och zip-nukleinsyra 13- modifieringar (ZNA) utöver icke-modifierade DNA-oligonukleotider. I en parallell jämförelse tillhandahöll ZNA-modifierad GL den högsta gcDNA-reduktionsvikningsförändringen (8, 3 ± 1, 1) och var mer effektiv än 3'-LNA och 3'-DNA-långa oligonukleotider (fig. Ib). När den förutspådda sekundära strukturen av a maskerar gmRNA 3'-änden för GL-hybridisering, är blockeringen starkt beroende av GL-koncentration, vilket ger den högsta vikningsförändringen på 5 μM-nivån (Fig. 1c). Högre GL-koncentrationer testades inte på grund av den möjliga risken för hämning av omedelbar nedströms cDNA-syntes i samma reaktionsrör.

Trots den mikromolära koncentrationen av GL, verifierades specificiteten i gcDNA-reduktion genom tillsats av artificiella spike-in-molekyler vid 1, 50 och 100 ng inmatat wbRNA. Spike-in är en förformulerad uppsättning av 92 polyadenylerade artificiella mRNA-liknande molekyler i olika koncentrationer för att möjliggöra uppdatering av expressionsdata-normalisering. I GL-specificitetstest hade GL-oligonukleotider inga bindningsställen på spike-in-molekyler, vilket möjliggjorde utvärdering av GL: s specificitet. Som ett resultat hittade vi inga skillnader i spik-in-detektion ( P ≥ 0, 107, n = 3, Studentens t- test, kompletterande tabell 2) vid olika wbRNA-koncentrationer i närvaro av GL, vilket indikerar att endast upp till 10 ytterligare PCR-cykler krävdes för att analysera 1 ng wbRNA istället för 100 för att kompensera för det lägre insatsmaterialet (Fig. 2a). Utan RNA-seq-bevis är det teoretiska wbRNA-ingångskravet för GL> 10 gånger mindre än för GLOBINclear TM- eller Globin-Zero TM- satser, vilket granskades i tilläggsfigur Fig. 1. Utöver specificitet utvärderades GL-effektiviteten vid 1–100 ng wbRNA-intervall med qPCR. Som ett resultat ökade förändringen av a- och ß-reduktionsvikten något med användning av högre mängd input-RNA i detta testsystem (Fig. 2b).

( a ) QPCR-cykeltröskelvärden presenteras för att indikera antalet erforderliga PCR-cykler om mindre än 100 ng helblod-RNA är GL-behandlat. ( b ) Effekten av förändring av GL-vikningsändring mättes med qPCR för tre RNA-ingångar av helblod: 1, 50 och 100 ng. ( c ) Spridningsdiagram för att mäta GL-specificiteten baserat på en ERCC 92 mRNA spike-in-blandning över fem olika GL-oligonukleotider jämfört med en GL-negativ kontroll. ( d ) GL T n- svans betydelse för maskering. Olika GL-oligonukleotider med variabla längder av T-svansar analyserades och reduktionseffekten av globin a jämfördes med det GL-negativa experimentet med användning av qPCR.

Bild i full storlek

Specificiteten hos GL mättes också med RNA-sekv där olika GL-tillstånd jämfördes med GL-negativa prover. För alla GL-oligos indikerade spike-in-experimentet höga korrelationer. Fortfarande i 3'-LNA (R = 0, 998) och 3'-DNA lång GL (R = 0, 997) sågs högre specificitet än med användning av 3'-DNA kort GL (R = 0, 974) och 3'-ZNA (R = 0, 875) (Fig. 2c).

Närvaron av GL-oligo-T-svansen är avgörande för effektiv maskering av gmRNA. Minsta längden på T-svansen verifierades genom experiment där gradvis kortare oligonukleotider jämfördes. GL med T 15 användes som en kontroll och jämfördes med T4, T2 och TO GL oligonukleotider. Ett minimum av 4 T-nukleotider krävdes för att möjliggöra ett stabilt maskeringskomplex före T30 VN-hybridisering (fig. 2d). Det har visats att en gång initierad kan gcDNA-syntes endast hämmas av peptid-nukleinsyraoligonukleotider 14 (PNA), eftersom alla andra nedströms hybridiserade DNA- eller LNA-molekyler avlägsnas genom strängförskjutningsaktiviteten hos RT 15 .

Den globala GL-effekten för sju wbRNA och en negativ kontroll över alla förhållanden analyserades med användning av en modifierad enkelcellsmärkt omvänd transkription RNA-seq metod 9, 16 (STRT). STRT använder oligo-T-priming liknande avancerade SMART-Seq-protokoll 17, G & T-seq 18 och CEL-seq 19- protokoll. WbRNA utspäddes till 30 ng / ul, och 2 ul behandlades under 10 min vid 60 ° C i närvaro av GL i GL-K + buffert före cDNA-syntes. Närvaron av K + -kation är väsentlig för stringent GL-hybridisering och är ofarlig för RT-reaktion nedströms i samma reaktionsrör. Alkaliskt pH garanterar stabiliteten hos mRNA även efter den korta denatureringen och blockeringen. Det är anmärkningsvärt att kort denaturering vid 95 ° C är väsentlig för GL-medierad låsningsreaktion beroende på närvaron av K +, vilket förmodligen höjer glödgningstemperaturen för mål-gmRNA-molekyler. Endast konstant GL-hybridiseringstid och temperatur (10 minuter vid 60 ° C) testades med RNA-seq-experiment i denna rapport. Baserat på karaktären av gmRNA och våra empiriska data om högt GL-koncentrationsberoende verkar GL-hybridisering äga rum strax efter gmRNA-denaturering och innan gmRNA bildar sin naturliga slutna struktur. Därför är kortare låsningsinkubationstider skäl att testa med RNA-seq.

Alla olika GL-oligonukleotidreaktioner sammanställdes i ett 48-plex RNA-sekvensbibliotek. Biblioteket sekvenserades på en Illumina HiSeq2000-körfält, vilket erhöll 0, 9–4, 1 M-kvalificerade läsningar per prov enligt typen av GL-oligo (kompletterande tabell 3). Läskartläggningsgraden till referens var 88–92%. Vår tillämpade STRT RNA-seq metod 9 bestämmer 5'-startplatsen för poly-A-transkript, vilket indikerar möjlig RNA-nedbrytning. Därför var mRNA 5′-fångstgraden (RNA-integritet) i GL-experiment 80–85% för alla förhållanden, vilket visar att andelen av de kartlagda och intakta transkripten inte minskade efter GL-behandling (kompletterande tabell 3).

RNA-seq utan GL-behandling avslöjade en 63, 6% total prevalens av globintranskript, varvid a och ß bidrog med 21, 4% respektive 42, 2% (Fig. 3a). I likhet med våra iakttagelser beskrivs också förvånansvärt hög variation i globinnivåer mellan studerade prover i tidigare rapport 4, där globinprevalensen skilde sig mellan 52–76% över sex prover. Denna skillnad representerar troligen det variabla erytrocytantalet i de ursprungliga blodproven; informationen som inte fanns tillgänglig för våra deltagare. ß cDNA-syntes minskades med ~ 90 × (från 42, 2% till 0, 5%) med LNA-modifierade GL-oligos, och a reducerades med ~ 4, 5 × (21, 4% till 4, 7%) med 3'-LNA eller 3'-DNA lång GL. Emellertid reducerades prevalensen av a och ß med> 10 × (63, 6% till 5, 2%) i en kombination där 3'-LNA och 3'-DNA långa eller endast 3'-LNA GL användes för p respektive a . Den blygsamma reduktionseffekten av a (4, 5 ×) förklaras av sekundär struktur av gmRNA. Jämfört med ß-mRNA, i vilket de sista 26–28 bp vid 3 ′-änden förutsägs vara fria från självmontering, vilket möjliggör effektiv GL-hybridisering, har α mRNA en tät självbindande struktur, vilket gör GL-bindning mer konkurrenskraftig (Tilläggsfigurerna 2 och 3).

( a ) Mänsklig globin a- och ß-mRNA-reduktionsfald förändring baserat på normaliserad prevalens över alla gener detekterade i RNA-sekvens, med eller utan GL (röd). ( b ) Venn-diagram som visar det totala antalet gener detekterade med eller utan GL-behandling, där GL-behandling avslöjade 1 178 unika gener jämfört med kontrollen. ( c ) RNA-transkriptom-normaliserat läsantal med helblod jämfört fem olika GL: er med en GL-negativ kontroll.

Bild i full storlek

Analyserande humana wbRNA-prover detekterades totalt 9 758 gener. Utan GL-behandling detekterades 488 gener unikt (fig. 3b). Dessa gener visade normaliserade medelläsvärden vid en frekvens av 1 × 10 −5, vilket indikerar det slumpmässiga och knappa utseendet hos generna (kompletterande tabell 4). De 10 bästa transkripten analyserades med BLASTN vid deras 3'-ändar, men inga signifikanta likheter med GL-sekvenser detekterades. En något högre gendetekteringsgrad i GL-behandling jämfört med det GL-negativa provet förväntades 4, 5 . Det normaliserade läsantalet (~ 1 × 10 −5 ) avslöjade att detekteringen av ytterligare 1 178 gener (fig. 3b) var slumpmässigt baserat på det låga läsantalet per transkript. Generen detekterade, liksom deras normaliserade prevalens och 95% konfidensintervall, visas i kompletterande tabell 5.

En normaliserad läsräkningssjämförelse av de fem olika GL-oligonukleotidema med de GL-negativa kontroll-RNA-proverna avslöjade en R> 0, 915-korrelation (fig. 3c), vilket indikerar korrelationen mellan resten av de tusentals transkripten efter borttagning av a och β från analysen. .

Den höga prevalensen av globin-mRNA i blodprover är en teknisk begränsning för expressionsanalys i alla djurarter. Därför designade vi 3'-DNA lång typ av GL-skivor för ko, hund, råtta, mus och sebrafisk. Zebrafisk ger bara 10–20 μl blod, vilket gör mängden blod till en begränsande faktor för wbRNA-studier. Effektiviteten hos GL i alla arter testades med qPCR, vilket kvantifierade utbytet av gcDNA. En> 5-faldig reduktion detekterades hos alla arter utom för ko α, hund α och sebrafisk ß (kompletterande figur 4). Sanger-sekvensering av hund och sebrafisk vid den ultimata 3'-änden av gmRNA antydde förekomsten av ett möjligt ytterligare motiv (AGCCT, kompletterande tabell 6) i hunden a1. Samtidigt detekterades ingen hund a2. Denna upptäckt kan förklaras av 84% GC-innehållet i de sista 50 bp i gmRNA-regionen som potentiellt skulle kunna undertrycka samtidigt al- och a2-amplifiering före kloning. Tre av tio oberoende kloner identifierade en möjlig TAAAAGC-radering av motiv i sebrafisk-p. Vi föreslår att högkvalitativ re-sekvensering av globin-mRNA, särskilt högst 3 ′ nedströmsregion, kan behövas för GL-analysdesign i många modellorganismer.

Sammanfattningsvis presenterar vi här en enkel och kostnadseffektiv metod för att övervinna globin mRNA orsakad begränsning i biomarkörsforskning när helblods RNA-prover används. Presenterade data erhållna med qPCR och RNA-seq bevisar den GL-positiva reduktionseffekten med vuxna humana helblods RNA-prover och indikerar dess potential för arter som mus, råtta, ko, hund och sebrafisk.

metoder

Etiska uttalanden

Studieprotokollet för humana prover godkändes av forskningsetiska kommittén vid University of Tartu (221 / M-31). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla analyserade personer. Alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och förordningar.

Alla metoder med djurblodprover utfördes i enlighet med Europeiska gemenskapsdirektivets (86/609 / EEG) riktlinjer och förordningar. De använda experimentprotokollen godkändes av djurkliniken från Estlands universitet för livsvetenskaper (Estonian Veterinary and Food Board (KL1203)), Animal Ethics Committee of State Provincial Office of Southern Finland (ESAVI / 6054 / 04.10.03 / 2012) och Stockholm North Experimental Animal Committee (N128 / 15).

RNA-sekundärstrukturprognos

Human RefSeq HBA1 (a), HBA2 (a) och HBB (p) mRNA-sekvenser med ytterligare A5- nukleotider vid 3 ′ för att härma poly-A-strängen användes för att förutsäga sekundära strukturer. Två strukturprognosprogramvarupaket, mfold v3.6 20 och Wien RNA Websuite 21, användes (kompletterande figurer 2 och 3).

GlobinLock design

GL-molekylen är en enkelsträngad DNA (Sigma Aldrich), LNA (Exiqon) eller ZNA (Metabion) oligonukleotid med 3 ′ modifiering för att blockera möjlig 3'-förlängning under enzymatiska reaktioner. Alla oligonukleotider visas i kompletterande tabell 1. Baserat på gmRNA-sekvensen designades två typer av GL-molekyler. Det cirkulära GL (3'-5'-DNA, fig la) har två komplementära sekvenser till gmRNA. 5'-änden av cirkulär GL binder till mRNA 5'-änden och täcker 22 bp a och 30 bp p. Den cirkulära GL3'-änden binder till gmRNA 3'-änden till 28 bp av a och 31 bp av P för att uppnå liknande Tm över alla de specifika regionerna. Den cirkulära GL har en 15 bp poly-T-svans för att binda och flankera 5'-änden av mRNA-poly-A. Poly-T, tillsammans med den GL-specifika uppströmsregionen, bildar kärnan i GL-oligo som flankerar bindningsstället för den förankrade oligo-T-primern (T 30 VN) före RT. En icke-specifik linker med en variabel längd (55 bp av a och 44 bp av p) används för att ansluta GL-oligo 5'- och 3'-specifika regioner och för att bilda ett cirkulärt komplex mellan GL och gmRNA. Den linjära GL (3'-ZNA / LNA / DNA kort och lång GL) utformades för att endast maskera T30 VN-grundningsstället. De linjära GL-oligorna innehåller upp till 30 bp vid 3'-änden som är specifika för gmRNA 3'-proteinkodande änden och en <15 bp poly-T-sträcka komplementär till mRNA-poly-A-svansen. Den 3 'änden av linjär GL blockeras av fosfat för att förhindra enzymatisk förlängning. Det linjära GL binder endast vid 3'-stället för gmRNA och bildar inget cirkulärt komplex av GL och gmRNA.

Blodprovtagning och RNA-extraktion

Blodprover från människor ( n = 7), kor ( n = 3), hundar ( n = 2), råttor ( n = 3) och möss ( n = 6) samlades in i PAXgene Blood RNA-rör (PreAnalytiX). WbRNA från sebrafisk (10-20 μl) uppsamlades och extraherades omedelbart med TRIzol-metoden. För andra arter än mus och sebrafisk samlades 2, 5 ml blod. För musprover samlades blodprover från flera djur för att erhålla den erforderliga (2, 5 ml) volymen. Alla PAXgene-prover inkuberades under 24 timmar vid rumstemperatur före extraktion av PAXgene Blood RNA Kit, enligt tillverkarens instruktioner. RNA-koncentrationer och RNA-integritetsnumret (RIN) mättes med en Agilent 2100 Bioanalyzer Total RNA Nano-kit (Agilent Technologies) eller Qubit Fluorometer (Thermo Fisher Scientific).

GlobinLock-effektivitet genom kvantitativ PCR (qPCR)

RT utfördes på alla RNA-prover för efterföljande kvantifiering med qPCR. Under cDNA-syntesen tillsattes olika GL-molekyler för olika arter eller modifieringar (kompletterande tabell 1) till reaktionsblandningen för att hämma RT för a- och ßgmRNA-molekyler. En annan reaktionsblandning innehöll nukleasfritt vatten istället för GL och tjänade som en negativ kontroll och en jämförelse för att bestämma den oligonukleotidmaskerande effekten i qPCR. Globin-mRNA-maskeringsreaktioner genomfördes sedan med användning av GL-K + -buffert innehållande 1 ul 50% PEG-6000 (Sigma Aldrich), 1, 5 ul 3, 2 M betain (Sigma), 0, 4 ul 25 mM dNTP-blandning (Thermo), 0, 375 ul 2 M KCl (Sigma), 0, 05 ul 1 M Tris-HCl (Sigma, pH 8, 0) och 0, 05 ul 10% Triton X-100 (Sigma) per blockerande reaktion. För a- och p-globinblockering tillsattes 0, 12 ul av varje specifik 3'-DNA-lång GL-oligonukleotid (100 umM) till varje reaktion, och en lika stor mängd nukleasfritt vatten användes för negativa kontroller. Nukleasfritt vatten tillsattes för att erhålla en slutlig volym av 4 ul.

Två mikroliter wbRNA (20 ng / ul) tillsattes till 4 ul GL-K + buffert och hölls på is tills denaturering. GmRNA-maskeringen och cDNA-syntesreaktionerna utfördes i 0, 2 ml rör med användning av vanliga termocykler. Reaktionsbetingelserna var som följer: 95 ° C under 30 sekunder för initial denaturering, 60 ° C under 10 minuter för GL oligo-hybridisering och ett 42 ° C håll för påfyllning av 5 ul RT-blandning. 5 mikroliter RT-blandningen innehöll 2 ul nukleasfritt vatten, 0, 04 ul 100 μM T 30 VN, 1, 6 μl 3, 2 M betain, 0, 5 μl 1 M Tris-HCl (pH 8, 0), 0, 075 μl 1 M MgCl 2 (Sigma), 0, 5 μl av 100 mM DTT (Sigma), 0, 18 μl RiboLock RNase Inhibitor (Thermo) och 0, 13 μl RevertAid Premium Transcriptase (Thermo). Koncentrationerna beräknades för den slutliga RT-volymen på 10 | il, inklusive GL-K + -bufferten. Cykelparametrar fortsatte vid 42 ° C under 60 minuter för RT-reaktionen och 85 ° C under 5 minuter för RT-inaktivering. Kvantitativ PCR utfördes med hjälp av HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus (ROX) (Solis BioDyne) med ett 7500 Fast Realtime PCR-instrument (Applied Biosystems) enligt tillverkarens instruktioner; 200 nM-primrar och 1 ul mall användes i en reaktionsvolym på 20 pl. Primrarna designades med användning av programvaran 22 för Primer3 v4.0.0. Genereringen av specifika produkter säkerställdes genom att utföra en smältkurvanalys av proverna under realtids PCR-programmet. Vi utförde också konventionell PCR för alla globinprimrar och analyserade produkterna med 2% TAE-buffrad agarosgelelektrofores. Alla prover kördes också med 10 x utspätt cDNA för att möjliggöra kvantifiering. De termiska cykelförhållandena var följande: 95 ° C under 15 minuter för aktivering och sedan 30 cykler av 95 ° C under 15 s, 62 ° C under 20 s, 72 ° C under 30 s (i slutet av vilken fluorescensen var mätt). QPCR-data analyserades med användning av Applied Biosystems 7500 Software v2.0.5.

GlobinLock-effekt av RNA-seq

Den modifierade STRT-metoden användes. Humana wbRNA-prover utspäddes med RNas-DNas-fritt vatten till en koncentration av 30 ng / ul, och 2 | il sattes till 4 ul GL-K + buffert. Bufferten innehöll 1 M betain, 2 mM dNTP-blandning, 10 mM Tris (pH 8, 0), 150 mM KCl, 0, 2% Triton X-100, 2 mikrometer ekvimolära streckkodade 48-plex mallomkopplande oligonukleotider och 5 uM GL a och P oligonukleotider (Tilläggstabell 1). De humana wbRNA-proverna ( n = 7) placerades i reaktionsplattan med 48 plex och varje brunn märktes för sekvensering med en individuell streckkod. Efter blandning av GL-K + och RNA på is denaturerades RNA under 30 s vid 95 ° C och inkuberades under 10 minuter vid 60 ° C för GL-maskering och fortsatte under 60 minuter vid 42 ° C. Strax efter 60 ° C-inkubationen kyldes blocket till 42 ° C, och 5 ul RT-blandning tillsattes för att initiera cDNA-syntes. RT-blandningen innehöll 1 M betain, 50 mM Tris (pH 8, 0), 5 mM DTT, 7, 5 mM MgCl2, RiboLock (0, 7 U / mL), 400 nM T 30 VN och RevertAid Premium omvänt transkriptas (7 U / ul). Koncentrationerna beräknades för slutlig RT i en volym av 10 ul, inklusive GL-K + -bufferten. Två mikroliter ERCC Mix 1 (Ambion), en spädningsutspädning på 1: 500 med nukleasfritt vatten, användes per hela 48-plexbibliotek. Efter en 60-minuters RT-reaktion vid 42 ° C och en 5 min inaktivering av RT vid 85 ° C poolades innehållet i alla 48 reaktionsbrunnar (~ 500 ul) i ett 2, 0 ml rör. Dynabeads MyOne C1 Streptavidin (Invitrogen, 100 pl) pärlor tvättades två gånger och användes för att fånga de bildade cDNA-molekylerna (och fria primrar) enligt instruktionerna. Efter tre omgångar med EB-buffert (10 mM Tris, pH 8, 0) och en omgång tvätt av vatten, suspenderades de DNA-anrikade pärlorna i 75 ul vatten och inkuberades vid 75 ° C i 3 minuter för att frisätta biotin från streptavidinpärlorna. Supernatanten användes som en mall för ytterligare full cDNA-amplifiering såsom beskrivits tidigare 16 . Den renade cDNA-poolen förstärktes först med användning av 14 cykler av PCR följt av 15 ytterligare cykler för att introducera de kompletta uppsättningarna av adaptrar för Illumina-sekvensering. Biblioteken valdes i storlek (200–400 bp) med användning av det sekventiella AMPure XP-pärlvalsprotokollet som beskrivits tidigare 16 .

RNA-seq dataanalys

Förprocessering av RNA-sekviga råsekvenser, inriktning och kvantifiering utfördes med användning av STRTprep-ledningen 16 (//github.com/shka/STRTprep). Rörledningen rapporterar endast unikt kartlagda läsningar. De två loci- HBA1 och HBA2 är mycket likartade och ledde till obearbetbara läsningar. Därför maskerades HBA2- lokuset och det uppströms 500 bp (chr16: 222346-223709 på hg19 referensgenom) före inriktning, vilket resulterade i kartläggning av både HBA1- och HBA2- läsningar vid HBA1 . Filial v3dev (åtagande 698fa8c

.

) användes som standardprocedur med PCR-biasreduktion baserat på den unika molekylära identifieraren (UMI) och gren v3devNoUMI (commit e0d6721

.

) var en speciell procedur som hoppar över reduktionssteget. Siffrorna genererades med R-version 3.2.2.

GlobinLock-design för andra arter och Sanger-sekvensering

Förutom människor designades GL-oligon för att maskera gmRNA från ko, hund, råtta, mus och sebrafisk. För dessa arter användes qPCR-baserad kvantifiering och linjära GL-oligonukleotider applicerades. GL-konstruktionen följde principen att den specifika delen har en Tm ~ 70 ° C plus ytterligare 15 bp poly-T-svans för att stabilisera komplexet under T 30 VN-priming och cDNA-syntes. Den qPCR-baserade GL-effektiviteten detekterades såsom beskrivits ovan. På grund av oförmågan att detektera GL-effekten med a från ko och hund och β av sebrafisk (kompletterande figur 4) amplifierades gmRNA 3'-ändarna från cDNA, klonades till en vektor och Sanger sekvensbestämdes för att bekräfta sekvensen av de studerade avskrifterna. I korthet amplifierades transkripten med användning av primrar som anges i tilläggstabell 1 och HotStarTaq DNA-polymeras (Qiagen) enligt tillverkarens instruktioner. Produkterna förstärktes med användning av ett PCR-program enligt följande: 95 ° C under 5 minuter och 30 cykler av 95 ° C under 30 s, 60 ° C under 30 s, 72 ° C under 30 s och slutlig förlängning 72 ° C under 5 minuter . PCR-produkter klonades in i en pCRII-dual promotor TOPO-vektor med användning av TOPO TA-kloningssatsen (Invitrogen) och sekvenser verifierades genom Sanger-sekvensering (Eurofins Genomics). De fullständiga Sanger-sekvenserna finns tillgängliga i tilläggstabell 7.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Krjutškov, K. et al . Globin-mRNA-reduktion för helblods transkriptomsekvensering. Sci. Rep. 6, 31584; doi: 10.1038 / srep31584 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

CSV-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell 1

  2. 2.

    Kompletterande tabell 3

  3. 3.

    Kompletterande tabell 4

  4. 4.

    Kompletterande tabell 5

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell 6

  2. 2.

    Kompletterande tabell 7

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.