Genomisk amplifiering och onkogena egenskaper hos gasc1-histondemetylasgenen i bröstcancer | onkogen

Genomisk amplifiering och onkogena egenskaper hos gasc1-histondemetylasgenen i bröstcancer | onkogen

Anonim

Abstrakt

Tidigare ledde kartläggning av 9p23–24-amplikonet i matstrupscancercellinjer oss till den positionella kloning av genamplifierad i skivepitelcancer 1 ( GASC1 ), som kodar ett kärnprotein med en Jumonji C-domän som katalyserar lysin (K) demetylering av histoner. GASC1: s transformerande roller i bröstcancer är dock fortfarande att bestämma. I denna studie identifierade vi GASC1 som en av de amplifierade generna för 9p23–24-regionen i bröstcancer, särskilt i basalliknande undertyper. Nivåerna av GASC1-transkriptionsuttryck var signifikant högre i aggressiva, basalliknande bröstcancer jämfört med icke-basalliknande bröstcancer. Våra in vitro- analyser visade att GASC1 inducerar transformerade fenotyper, inklusive tillväxtfaktoroberoende proliferation, förankringsoberoende tillväxt, förändrad morfogenes i Matrigel och mammosfärbildande förmåga, när de överuttrycks i odödliga, icke-transformerade mammala epiteliala MCF10A-celler. Dessutom reglerar GASC1 demetylasaktivitet uttrycket av gener som är kritiska för självförnyelse av stamceller, inklusive NOTCH1, och kan vara kopplade till stamcellens fenotyper i bröstcancer. Således är GASC1 ett drivande onkogen i 9p23–24-amplikonet i mänsklig bröstcancer och målinriktad hämning av GASC1-histondemetylas i cancer kan ge potentiella nya vägar för terapeutisk utveckling.

Introduktion

Det framgår alltmer att cancerutveckling inte bara beror på genetiska förändringar utan också av epigenetiska förändringar som involverar histonmodifieringar och DNA-metylering. Genetiska och epigenetiska förändringar i cancerceller interagerar direkt och indirekt. I synnerhet kan epigenetiska förändringar vara resultatet av genetiska förändringar som dikterar onormal kromatinreglering. Specifikt kan en genetisk förändring i genen som kodar för ett "epigenetiskt enzym" leda till förändringar inom histonkoden (Esteller, 2007), som är involverad i både tumörgenes och cancerstamcellgenererade hierarkier i flera tumörtyper (Hess, 2004; Krivtsov et al., 2006; Esteller, 2007; Jones and Baylin, 2007; Krivtsov och Armstrong, 2007; Loh et al., 2007).

Genetiska förändringar på kromom 9p har observerats i ett brett spektrum av humana cancer inkluderande lungor, bröst, urinblåsan, matstrupen och andra (Yang et al., 2000, 2001; Savelyeva et al., 2001; Sharpless, 2005; Vinatzer et al. ., 2008). Nyligen genomförda studier med jämförande genomisk hybridisering (CGH) och FISH har avslöjat att amplifiering av DNA vid 9p23–24 ofta förekommer i flera humana tumörer, inklusive cancer i matstrupen och bröst (Knuutila et al., 1998; Savelyeva et al., 1999; Yang et al. al., 2000, 2001; Italiano et al., 2006; Han et al., 2008). Han et al. (2008) visade att förstärkning av 9p21–24 är vanligare i basalliknande, trippelnegativa bröstcancer, som definieras av brist på uttryck av östrogenreceptor, progesteronreceptor och HER-2-oncoprotein (ER–, PR - och HER-2-). Dessutom har samexistens av amplifieringen av 9p23–24 rapporterats i BRCA2- mutationsbärare hos patienter med bröstcancer (Savelyeva et al., 2001). Tidigare ledde kartläggning av 9p23–24-amplikonen i matstrupscellscellinjer oss till den positiva kloningen av genamplifierad i skivepitelcancer 1 ( GASC1 , även känd som JMJD2C / KDM4C ), som anses vara en av de nya onkogenerna i regionen 9p23–24 (Yang et al., 2000).

Nyligen visade flera grupper att GASC1 kodar ett histondemetylas med en Jumonji C-domän som katalyserar lysetyl (K) demetylering av histoner, specifikt histon H3 vid lysin 9 (H3K9) och lysin 36 (H3K36) (Cloos et al., 2006; Whetstine et al., 2006; Klose och Zhang, 2007; Shi och Whetstine, 2007). Lysinrester i histonsvansar kan vara mono-, di- eller trimetylerade. I en sökning efter proteiner och komplex som interagerar med H3K9me3, Cloos et al. (2006) visade att GASC1 demetylerar H3K9me3 / me2-markeringarna både in vitro och in vivo . Dessutom hittades GASC1 associerad med androgenreceptorn, som är nödvändig för transkriptionell aktivering av androgenreceptorresponsiva gener och för spridning av prostatacancerceller (Wissmann et al., 2007).

GASC1 har också visat sig vara involverat i att upprätthålla genuttrycksprogram som är viktiga för självförnyelse och differentiering i embryonala stamceller (ES). 2007, Katoh et al. visade att human GASC1 och mus Gasc1 företrädesvis uttrycks i odifferentierade ES-celler (Katoh och Katoh, 2007). Loh et al. (2007) identifierade Gasc1 som ett Oct4-mål i ES-celler från mus. Nedbrytning av Gasc1 genom små störande RNA i ES-celler inducerade differentiering med en global ökning av H3K9me3, vilket bekräftar att histondemetylasaktiviteten för Gasc1 är kopplad till upprätthållandet av pluripotens. Ännu viktigare visade de att Gasc1 fungerar som en positiv regulator av Nanog, en viktig transkriptionsfaktor för självförnyelse i ES-celler från mus (Loh et al., 2007).

Dessa nya resultat visar att histonlysin-demetylaser såsom GASC1 är kopplade till viktiga biologiska processer såsom gentranskription och underhåll av stamceller. De transformerande rollerna för GASC1-demetylas i bröstcancerceller återstår emellertid fortfarande att fastställas. I denna studie rapporterar vi att 9p23–24-amplikonet, som innehåller GASC1, förstärks och överuttrycks i flera bröstcancercellinjer. Nivåerna av GASC1-transkriptionsuttryck var signifikant högre i aggressiva, basalliknande bröstcancer jämfört med icke-basalliknande bröstcancer. Överuttryck av GASC1 i humana icke-transformerade bröstepitelceller resulterar i fenotypiska förändringar som är kännetecken för neoplastisk transformation, inklusive tillväxtfaktoroberoende spridning och förankringsoberoende tillväxt i mjuk agar. Dessutom kan GASC1-demetylasaktivitet reglera uttrycket av gener som är kritiska för självförnyelse av stamceller, inklusive NOTCH1, och kan vara kopplade till stamcellens fenotyper i bröstcancer.

Resultat

GASC1-genen förstärks i mänsklig bröstcancer

Nyligen genomförde vår grupp CGH-analys med hög upplösning på en panel med bröstcancercellinjer och primära cancerprover (Yang et al., 2006). Här gör vi en detaljerad analys av 9p23–24-amplikonen i SUM149-cellinjen, som utvecklades från en trippelnegativ, aggressiv inflammatorisk bröstcancer. En representativ matris CGH-profil för 9p23–24-regionen i SUM149-celler visas i figur 1a, som visar en förstärkning på 9p23–24 som omfattar ett område på 15 Mb bestående av cirka 35 gener, inklusive GASC1 . Däremot förloras regionen 9p21–22, mellan 21, 5 och 26, 1 Mb, som innehåller p16 / CDKN2A- och p15 / CDKN2B- generna i dessa celler. Vi utförde FISH-analys med användning av en GASC1-specifik sond framställd från BAC-klon RP11-46L22 och bekräftade GASC1- amplifiering i SUM149-celler; 5–7 kopior av BAC-sonden observerades i mellanfaskärnorna i SUM149-celler (figur 1b). Dessutom validerades genomisk förlust av p16 / CDKN2A- lokuset genom genomisk PCR såsom visas i figur 1c.

Image

Genomisk analys av 9p23–24-regionen i bröstcancercellinjer. ( a ) Genomvy av kromosom 9 (vänster panel) och 9p23–24-regionen (höger panel) analyserad på Agilent oligonukleotid-matris (Agilent Technologies) i SUM149 bröstcancercellinje. ( b ) FISK-bild av en GASC1-sond (RP11-46L22) hybridiserade till mellanfaskärnor från SUM149- och HCC1954-celler. ( c ) PCR-analyser av genomiskt DNA erhållet från SUM149-celler och normalt humant DNA med p16- och GAPDH-primerkontroller.

Bild i full storlek

För att få ytterligare stöd för ett potentiellt engagemang av 9p23–24 amplikon i bröstcancer, sökte vi den publicerade databasen för BAC-matris CGH i 51 humana bröstcancercellinjer (Neve et al., 2006). Förstärkningen av regionen 9p23–24 har hittats i 6 av 51 cellinjer, inklusive HCC38, HCC70, HCC1954, HCC2157, MDA-MB-436 och SUM149 (kompletterande tabell S1). Fyra av dessa cellinjer, HCC38, HCC70, MDA-MB-436 och SUM149, tillhör den trippelnegativa bröstcancertypen. FISK-analys med användning av en GASC1- specifik sond bekräftade GASC1-amplifiering i HCC1954-celler. I HCC1954-cellinjen observerades 10–14 kopior av BAC-sonden i mellanfaskärnor (figur 1b). Array CGH-data avslöjade också den genomiska förlusten 9p21–22 i HCC1954, HCC70 och MDA-MB-436-celler (kompletterande tabell S1). Genamplifiering vid 9p23–24 inträffar därför ofta i en bakgrund av p16 / CDKN2A- locusförlust. Dessutom rapporterades 9p23–24 amplifiering inklusive GASC1- genen nyligen i en annan bröstcancercellinje, Colo 824 (Savelyeva et al., 1999). Således, liknar matstrupen cancer, förstärks GASC1-genen i en undergrupp av bröstcancer.

GASC1 är överuttryckt på RNA och proteinnivåer i bröstcancer med 9p23–24-amplikon

För att börja undersöka konsekvenserna av GASC1 -genamplifiering på expression i SUM149 bröstcancerceller undersöktes genuttrycksprofiler erhållna med användning av Affymetrix U133A-mikroarrayer i jämförelse med liknande studier som utfördes med den odödliga, icke-transformerade bröstepitelcellslinjen MCF10A. Resultaten visade att GASC1 är överuttryckt i SUM149-celler jämfört med MCF10A-celler. För att verifiera resultaten av genuppsättningen utförde vi semikvantitativ RT – PCR-analys för att mäta GASC1-mRNA-uttryck i sex bröstcancercellinjer med eller utan 9p23–24 amplifiering jämfört med MCF10A-celler. Resultaten visade två till femfaldiga ökningar i GASC1 mRNA i SUM149, HCC1954, HCC70 och Colo 824-celler (figur 2a). Vidare analyserades GASC1-proteinnivåer med western blot i SUM149, HCC1954, HCC70 och Colo 824-celler, som har amplikonen 9p23–24, och i MCF10A och SUM-52, som inte har amplitmen 9p23–24. GASC1-proteinnivåerna ökades i SUM149, HCC1954, HCC70 och Colo 824-celler (figur 2b). Således är GASC1 överuttryckt vid mRNA- och proteinnivåerna i en undergrupp av bröstcancer med genamplifiering.

Image

Överuttryck av GASC1 vid RNA och proteinnivåer i bröstcancercellerna. ( a ) GASC1-mRNA-uttryck mättes genom semikvantitativ realtids-PCR i sex bröstcancercellinjer med eller utan 9p23–24 amplifiering jämfört med MCF10A-celler. För MCF10A-cellerna sattes baslinjen till 1. ( b ) GASC1-proteinnivåer analyserades med Western blot i fem bröstcancercellinjer och MCF10A-linje. ( c ) Uttrycksnivåer av GASC1 erhållna från genuttrycksdatasättet i basalliknande och icke basalliknande bröstcancer (Kreike et al., 2007). Barer indikerar medianer; P- värden för Kruskal – Wallis-testet tillhandahålls.

Bild i full storlek

För att bestämma om GASC1 är uppreglerat i primära bröstcancerprover jämfört med normala bröstvävnader, sökte vi först den webbaserade metaanalysen av data för uttrycksuppsättningen i ONCOMINE. I denna analys uppreglerades GASC1 i mänskliga bröstcancervävnader jämfört med motsvarande normala vävnader i två nyligen genomförda studier (kompletterande figur S1). Vidare var GASC1 mRNA-uttryck signifikant högre i ER-tumörer jämfört med ER + tumörer i fem studier (kompletterande figur S2). Nyligen har Han et al. (2008) visade att amplifiering av regionen 9p21–24 som inkluderar GASC1 är mest vanlig i basalliknande, trippelnativ bröstcancer. Dessutom hör fem av sex bröstcancercellinjer (HCC38, HCC70, HCC2157, MDA-MB-436 och SUM149) med 9p23–24 amplifiering till basalliknande subtyp av bröstcancer (Neve et al., 2006). Vi har dock fortfarande ingen tydlig bild av uttrycksnivån för GASC1 i olika undertyper av primär bröstcancer. För att undersöka om GASC1-mRNA-uttrycksnivåer är förknippade med basalliknande bröstcancer, analyserade vi ett datasystem för bröstcancergenuttryck, som innehåller 97 trippelnegativa tumörer och 102 invasiva bröstcancer som inte valdes baserat på deras trippelnegativa status ( Kreike et al., 2007). På basis av deras genuttrycksprofil klusterade alla 97 tre-negativa tumörer samman som basalliknande tumörer. Dessutom, bland de 102 oselekterade invasiva bröstkarcinom, klusterade också 19 tumörer med basalliknande tumörer (Kreike et al., 2007). Figur 2c visar expressionsnivån för GASC1 i dessa 116 basalliknande tumörer jämfört med de 83 icke basalliknande tumörerna. Vi fann att nivåerna av GASC1-transkriptionsuttryck var signifikant högre i basalliknande tumörer jämfört med icke basala-liknande tumörer (Kruskal – Wallis-test, P <0, 001). Ytterligare analys av GASC1-uttryck i fem subtyper av bröstcancer visade att det fanns en statistiskt signifikant skillnad mellan basalliknande tumörer och subtyperna Luminal A ( P = 0, 007), ERBB2-positiv ( P = 0, 003) och normal ( P = 0, 02) ); men det var ingen signifikant skillnad jämfört med luminal B ( P = 0, 73) (kompletterande figur S3). Våra resultat visade att amplifiering och överuttryck av GASC1 är vanligare i basal-liknande bröstcancer.

GASC1 har transformerande egenskaper in vitro

Med tanke på att GASC1 är förstärkt och överuttryckt i flera humana cancerceller behandlade vi frågan om GASC1 har transformerande egenskaper. För detta ändamål använde vi uttryckskonstruktionen pLenti6 / V5-GASC1 för att etablera MCF10A-GASC1-cellinjen från föräldrar MCF10A-celler. Överuttryck av GASC1 mRNA och protein i denna cellinje bekräftades med semikvantitativ RT – PCR och western blot (figurerna 3a och b). GASC1-överuttryckande celler och deras respektive föräldracellinjer analyserades sedan för förändringar i tillväxthastigheter, tillväxtfaktoroberoende proliferation, förankringsoberoende tillväxt och tredimensionell morfogenesanalyser.

Image

Stabilt överuttrycker GASC1 i MCF10A-celler med pLenti6 / V5-GASC1-konstruktionen (MCF10A-GASC1). Överuttryck av GASC1 mRNA och protein i denna cellinje bekräftades med ( a ) semi-kvantitativ RT – PCR och ( b ) western blot-analyser. ( c ) In vitro- tillväxthastighet för MCF10A-cellerna som stabilt överuttrycker GASC1 relativt MCF10A-kontrollceller i insulinbrist media. Celler ympades i 35 mm odlingsbrunnar och odlades i frånvaro av insulinliknande tillväxtfaktorer.

Bild i full storlek

Först testade vi MCF10A-GASC1-celler för deras förmåga att växa i frånvaro av insulinliknande tillväxtfaktor. Vår grupp odlar rutinmässigt MCF10A-celler i serumfria, tillväxtfaktor-kompletterade media och vi har tidigare visat att flera olika onkogener kan inducera insulinoberoende tillväxt i denna modell (Ignatoski et al., 2000; Woods Ignatoski et al., 2003; Moffa et al., 2004). Även om vektorkontroll-MCF10A-celler kräver insulin för kontinuerlig tillväxt i serumfritt medium, växte MCF-10-GASC1-celler kontinuerligt i frånvaro av insulin i många passager och odlas nu rutinmässigt i detta medium (figur 3c).

Därefter använde vi en mjuk agartransformationsanalys som mäter huruvida celler kan genomgå förankringsoberoende tillväxt, vilket är en av de mest konsekventa indikatorerna på onkogen transformation. Efter 3 veckor växte MCF10A-GASC1-celler till robusta kolonier i mjuk agar, en egenskap som inte observerades i de föräldriga MCF10A-cellerna eller i MCF10A-celler innehållande kontrollvektorn (figur 4a). Detta resultat validerades dessutom i en annan MCF10A-GASC1-cellklon (kompletterande figur S4). För att ytterligare undersöka effekterna av GASC1-aktivitet i ett sammanhang som mer liknar in vivo- mammarkitektur, bedömde vi konsekvenserna av GASC1-överuttryck på tredimensionell morfogenes i Matrigel. Även om MCF10A-celler bildade polariserade, tillväxt-arresterade acinarstrukturer med ihåliga lumen liknande den körtelformade arkitekturen in vivo , bildade MCF10A-GASC1-celler onormala acini vid en hög frekvens som var grovt oorganiserad och innehöll fyllda lumen. Dessa resultat indikerar att GASC1-överuttryck stör epitelcellarkitektur, vilket ofta förekommer under de tidiga stadierna av cancerbildning (figur 4b).

Image

( a ) Antal och representativa bilder av MCF10A-GASC1 och mjuka agarkolonier för kontrollceller. Celler odlades under 3-4 veckor i mjuk agar och färgades med det vitala färgämnet p-jodonitrotetrazoliumviolett. ( b ) Effekter av GASC1 på mammär acinar morfogenes. MCF10A-GASC1 och kontrollceller odlades på en bädd av Matrigel såsom beskrivits i material och metoder. Övre raden: representativa ljusa fältbilder av acini tagna på dag 10. Nedre raden: representativa bilder av strukturer med färgning för aktin med falloidin konjugerat till Alexa Fluor-568 (röd) och DAPI som en markör för kärnor (blå).

Bild i full storlek

Nyligen befanns GASC1 vara en epigenetisk modifierare av de centrala självförnyelsestyrarna, OCT4 och NANOG, genom H3K9-märken i ES-celler (Loh et al., 2007). För att bestämma om överuttryck av GASC1-genen kunde inducera fenotyper av cancerstamceller utförde vi mammosfärbildningsanalyser i MCF10A-celler och MCF10A-GASC1-celler. Som visas i figur 5a har MCF10A-GASC1-celler 3-5 gånger högre kapacitet att generera mammosfärer än MCF10A-kontrollceller efter 10–12 dagar i mammosfärkulturerna. När cellerna från mammosfärer ompläterades under normala odlingsförhållanden, vidhöll livskraftiga celler i mammosfärerna till odlingsskålen och prolifererades vilket resulterade i ett stort antal proliferativa kolonier härledda från MCF10A-GASC1-celler jämfört med föräldrar MCF10A-celler (figur 5a). Detta resultat antyder att GASC1-aktivitet kan vara kopplad till stamcellens fenotyper i bröstcancer. Således inducerar GASC1-överuttryck tillväxtfaktoroberoende spridning, förankringsoberoende tillväxt, förändrad morfogenes i tredimensionella kulturer och inducerar bildandet av mammosfärer, ett kännetecken för cancerstamceller. Därför fungerar GASC1 som en transformerande gen som liknar andra kända bröstcancer-onkogener när den överuttrycks i MCF10A-celler (Ignatoski et al., 1999; Moffa et al., 2004).

Image

( a ) Mammosfärbildningsanalys av MCF10A-GASC1 och MCF10A kontrollceller. Den övre panelen visar representativa bilder av mammosfärer bildade från MCF10A-GASC1-celler och MCF10A-kontrollceller på dag 12. Den nedre panelen visar livskraftiga celler i mammosfärerna vidhäftade till odlingsskålen efter återplantering av mammosfärkulturen i fästplattan. ( b ) shRNA-medierad knockdown av GASC1 hämmar kolonibildning i bröstcancerceller med GASC1-amplifiering. Den vänstra raden visade TurboGFP-fluorescensen av pGIPZ-shRNA i HCC1954-celler efter 2 veckor. ( c ) Knockdown av GASC1 med pLKO GASC1 shRNA hämmar celltillväxt i linjerna HCC1954 och Colo 824. HCC1954 och Colo 824-celler för GASC1-knockdown med pLKO-shRNA och icke-filtrerande kontrollvektorer ympades vid 3 x 105 celler / brunn i sex-brunnars plattor. Efter 10 dagar bestämdes cellantalet med användning av en Coulter-räknare.

Bild i full storlek

Knockdown av GASC1 hämmar cellproliferation i bröstcancerceller

För att mer direkt utvärdera bidraget av endogent GASC1-överuttryck på transformationen av bröstcancerceller och för att upprätta ett bevis för begreppet riktad behandling, undersökte vi den biologiska effekten av GASC1-hämning på spridningen av bröstcancerceller med GASC1-amplifiering och kontroll MCF10A-celler. Vi använde ett Expression Arrest GIPZ lentiviralt shRNAmir-system från OpenBiosystems (Huntsville, AL, USA) (//www.openbiosystems.com/) för att stabilt slå ner GASC1-uttrycket. I denna pGIPZ-vektor är TurboGFP och shRNA del av ett enda transkript som tillåter den visuella markeringen av de shRNA-uttryckande cellerna. HCC1954 och Colo 824-celler med hög nivå GASC1-genamplifiering infekterades med lentivirus-supernatanterna för knockdown av GASC1. Nonsilencing shRNA lentiviral kontroll, i samma titer som GASC1 shRNA, användes parallellt som negativ kontroll shRNA. Fyrtioåtta timmar efter infektion selekterades celler med komplett tillväxtmedium innehållande puromycin. Poolade cellkloner övervakades med avseende på TurboGFP-uttryck genom fluorencensmikroskopi och GASC1-mRNA-expressionsnivåer mättes genom semikvantitativ RT – PCR. Semikantitativa RT – PCR-experiment visade att GASC1-shRNA-cellklonerna visade nedreglering av GASC1-uttryck till 30–50% av nivån som sågs i de nonsilencing-infekterade cellklonerna. Därefter utvärderades konsekvenserna av minskat GASC1-uttryck på kolonibildningen. Figur 5b visar att GASC1-nedslagning dramatiskt bromsade celltillväxten och inhiberade kolonibildningen av HCC1954 och Colo 824-celler. Den dramatiska hämningen av HCC1954 och Colo 824-celltillväxt genom knockdown av GASC1 reproducerades med ett pLKO GASC1-shRNA (figur 5c). Nedstoppningen av GASC1 hämmade celltillväxt av SUM149 med ~ 50% och hade endast en liten effekt på celltillväxten av MCF10A-celler (data visas inte). Tillsammans med analysen av GASC1-överuttryckande celler överensstämmer dessa resultat med en transformerande funktion för GASC1 när den överuttrycks i mänsklig bröstcancer.

NOTCH1 är en ny målgen för GASC1

Expressionsprofileringsexperiment med Illumina-uttryck-pärlspetsen utfördes för att identifiera GASC1-målgenkandidater i MCF10A-GASC1-celler i förhållande till MCF10A-kontrollceller. Analys av gener förändrade genom överuttryck av GASC1 i MCF10A-GASC1-celler gav 425 uppreglerade gener och 478 nedreglerade gener med minst en tvåfaldig förändring relativt kontroll. Transkriptionell reglering av en delmängd av dessa gener kan vara resultatet av GASC1-demetylasaktiviteten. De 20 bästa generna upp- och nedreglerade av GASC1 visas i kompletterande tabell S2 och omfattande analys av GASC1 målgener kommer att publiceras separat. En intressant gen som uppreglerades i MCF10A-GASC1-celler är NOTCH1, som visade fem gånger ökad mRNA-nivå i MCF10A-GASC1-celler jämfört med MCF10A-kontrollen. Som visas i figurerna 6a och b bekräftade semikvantitativa RT – PCR och western blot att NOTCH1 är uppreglerad av GASC1 i MCF10A-GASC1-celler. Dessutom är NOTCH1 mRNA-expressionsnivån ∼ 10 gånger högre i MCF10A-GASC1 mammosfärceller än i MCF10A-kontrollceller (figur 6a). Uppreglering av NOTCH1-uttryck med GASC1 verifierades dessutom i HEK293-GASC1 och SUM102-GASC1-celler (kompletterande figur S5). Vidare validerades regleringen av NOTCH1- genen med GASC1 ytterligare i GASC1 som överuttryckte Colo 824 bröstcancerceller med användning av GASC1-knockdown. Knockdown av GASC1 i bröstcancer Colo 824-celler och MCF10A-celler inhiberade NOTCH1-uttrycket (figur 6c). Effekten var mer anmärkningsvärd i Colo 824-celler, som har NOTCH1-uttryck på hög nivå, där knockdown av GASC1 nedreglerade NOTCH1 med ∼ 80%. Vi använde ChIP-sekvensering för att karakterisera genombredda förhållanden mellan H3K9me1 och H3K9m3 i GASC1-amplifierade bröstcancerceller och kontrollera MCF10A-celler. Den preliminära analysen visade en anrikning av DNA-sekvensassocierade H3K9m1-aktiverade markeringar i det genomiska området NOTCH1 i GASC1-amplifierade celler jämfört med MCF10A. I de GASC1-amplifierade cellerna var dessutom antalet H3K9m1-markeringar dramatiskt större än antalet H3K9m3-repressiva märken (kompletterande figur S6). Vidare etablerade vi en GASC1-mutation lentiviral expressionskonstruktion med den katalytiska dometylasdomänen borttagen. Både vildtyp och GASC1 av mutanttyp överfördes till MCF10A-celler. NOTCH1-uttrycket inducerades av vildtyp, men inte mutanttyp GASC1 i MCF10A-celler (kompletterande figur S7). Även om den exakta mekanismen bör undersökas ytterligare, antyder dessa resultat att NOTCH1 är ett mål för histondemethyalse GASC1.

Image

( a ) NOTCH1-expressionsnivå i MCF10A-GASC1 och kontrollceller mättes med halvkvantitativa RT – PCR i normalkultur och mammosfär (Mamm.) -kulturbetingelser. Baslinjen för MCF10A-kontrollcellerna sattes till 1. ( b ) NOTCH1 i MCF10A och MCF10A-GASC1-celler analyserades med western blot. ( c ) NOTCH1-expressionsnivå mättes genom semikvantitativ RT – PCR i GASC1-knockdown MCF10A och Colo 824-celler. Baslinjen för MCF10A-cellerna med icke-filtrerande shRNA-kontroll inställdes på 1.

Bild i full storlek

Diskussion

Tidigare kromosom-CGH- och BAC-array-CGH-analyser visade att 9p23–24-amplifiering sker i olika tumörtyper. Pierga et al. fann att vinst på 9p22–24 var vanligare i ER-negativ bröstcancer, och Han et al. visade att vinsten 9p21–24 var vanligare i basalliknande, trippelnativ bröstcancer (Han et al., 2008; Pierga et al., 2007). År 2000 publicerade vi den första uppsatsen om kloning av GASC1- genen från amplikon 9p23–24 i cellstrupper i matstrupscancer (Yang et al., 2000). I denna studie identifierade vi GASC1 som en av målgenerna för amplikon 9p23–24 i en undergrupp av bröstcancer. Vidare har vi tillhandahållit tydliga bevis som visar att GASC1 fungerar som en transformerande gen som liknar andra kända bröstcancer-onkogener när genen förstärks och överuttrycks. Dessa fynd pekar på en viktig roll av GASC1 i bröstcancerutveckling och progression.

GASC1-protein demetylerar tri- och dimetylerade H3K9- och H3K36-märken (Cloos et al., 2006; Whetstine et al., 2006; Klose och Zhang, 2007; Shi och Whetstine, 2007). Demetylering av H3K9 aktiverar transkription och förlust av H3K9 metyltransferasaktivitet är sannolikt förknippat med många typer av tumörer. H3K9-metyltransferas RIZ1 identifierades ursprungligen genom dess interaktion med pRB (Steele-Perkins et al., 2001). RIZ1-uttryck och aktivitet reduceras i många humana cancerformer genom genomisk deletion, framväxling och missense-mutationer samt promotormetylering (Poetsch et al., 2002; Geli et al., 2005; Lal et al., 2006). RIZ1 - / - möss har en hög förekomst av diffust stort B-celllymfom och ett brett spektrum av ovanliga tumörer (Steele-Perkins et al., 2001). En annan H3K9-metyltransferas SUV39H1 är främst associerad med pericentriskt heterokromatin och knockout-möss för SUV39H1 är benägna att utveckla B-celllymfom (Peters et al., 2001). GASC1 kodar ett H3K9-demetylas och amplifieras och överuttrycks i hjärn-, bröst-, matstrups- och prostatacancer (Yang et al., 2000, 2006; Cloos et al., 2006; Klose et al., 2006; Whetstine et al., 2006; Wissmann et al., 2007; Northcott et al., 2009).

Till skillnad från H3K9 är H3K36 involverad i transkriptionell aktivering. Trimetylmärken vid H3K36 är faktiskt högre hos aktiva gener (Bannister et al., 2005). H3K36-metyleringsmärken är också associerade med cancer. NSD1 är H3K36-metyltransferas som smälter samman med NUP98 (Wang et al., 2007). Wang et al. (2007) visade att H3K36-metylering avreglerades på grund av en translokation som resulterade i ett NUP98 – NSD1-fusionsprotein vid human akut myelooid leukemi. Det faktum att GASC1-protein både kan katalysera demetyleringen av H3K9 och H3K36 antyder flera roller för detta enzym. Expression och / eller aktivitet av GASC1 måste regleras tätt i normala celler. Således kan avreglering av histondemetylas GASC1 resultera i felreglering av gener, vilket bidrar till tumörgenes.

Stamcellhypotesen för cancer antyder att en delmängd tumörceller med stamcellliknande egenskaper främst är ansvarig för tillväxt, progression och återfall av cancer. Förändringar i histonmetylering och demetylering är sannolikt kritiska steg i neoplastisk progression genom att störa det normala stam- eller progenitor-cellprogrammet. MLL- genen, som omorganiseras och aktiveras vid leukemi, kodar ett H3K4-metyltransferas (Hess, 2004). Krivtsov et al. (2006) visade att MLL-AF9-fusionsproteinet inducerar avvikande uttryck av en specifik uppsättning stamcellgener i myeloida stamceller. Detta resulterar i ökad självförnyelsepotential och omvandlar dessa celler till cancerstamceller som kan initiera, upprätthålla och föröka leukemin (Krivtsov et al., 2006). NANOG är en av de kritiska transkriptionsfaktorerna för upprätthållande av pluripotens och självförnyelseskapacitet hos stamceller in vivo och in vitro , och uttrycks vanligtvis endast i pluripotenta celler och inte i differentierade celler. Nyligen Loh et al. (2007) identifierade Nanog som en Gasc1-målgen och bekräftade rekryteringen av Gasc1 till Nanog-promotorn i ES-celler från mus. Efter att ha visat att överuttryck av GASC1 förbättrar bildandet av mammosfären undersökte vi uttrycket av NANOG i sfäroider. Sfärbildande celler härledda från MCF10A-GASC1-celler överuttryckte dramatiskt NANOG jämfört med sfärbildande celler från MCF10A-kontrollceller (kompletterande figur S8). Vidare är Gasc1 ett bona fide-mål för den viktiga stamcellstranskriptionsfaktorn, Oct4, i ES-musceller (Loh et al., 2007). Ben-Porath et al. (2008) visade att aktiveringsmålen för NANOG och OCT4 oftare överuttrycks i dåligt differentierade tumörer än i väl differentierade tumörer. I bröstcancer är denna ES-liknande signatur förknippad med högkvalitativa ER-negativa tumörer, ofta den basalliknande subtypen som oftare har GASC1-amplifiering (Han et al., 2008). Eftersom GASC1 är målet för OCT4, såväl som en nyckelregulator för NANOG, kan förändring av GASC1 förbättra och / eller störa den autoregulatoriska kretsen för stamcellstranskriptionsfaktorer i humana cancerceller.

Det är nu känt att signalvägen för NOTCH påverkar beslut om cellens öde hos däggdjur, såsom celldifferentiering, överlevnad / apoptos och cellcykel i både fysiologiska och patologiska sammanhang, särskilt i samband med stamcellsbeteende (Politi et al., 2004; Farnie och Clarke, 2007). NOTCH1 och NOTCH4 är involverade i normal utveckling av bröstkörtlar, och muterade former av dessa gener är förknippade med utvecklingen av mus mammor tumörer (Politi et al., 2004). Överuttryck av aktiverade NOTCH1 och NOTCH3 i transgena möss blockerar utvecklingen av bröstkörtlarna och inducerar mus-tumörerna hos mus (Hu et al., 2006). Dontu et al. (2004) visade att induktion av NOTCH-signalering främjar självförnyelse av normala humana mammala stamceller. Dessutom finns det ett betydande bevis på att NOTCH-vägen är relevant för överlevnaden av stamceller från bröstcancer (Farnie och Clarke, 2007; Sansone et al., 2007; Rizzo et al., 2008). I denna studie fann vi att NOTCH1 var ett kandidatmål för GASC1. Våra preliminära ChIP-sekvensbestämningsanalyser fann att H3K9me1 aktiva markeringar var mer mycket anrikade på NOTCH1 genomiska loci i GASC1-amplifierade celler jämfört med kontrollceller. Således kan den histonmodifierande aktiviteten hos GASC1 reglera uttrycket av NOTCH1 och NANOG genom H3K9 och H3K36-märken i humana bröstcancerceller.

Sammanfattningsvis indikerar våra data att GASC1 är en drivande onkogen i amplikonen 9p23–24 i mänsklig bröstcancer. Vår studie tillsammans med tidigare publicerade data antyder att GASC1 är en viktig transkriptionsreglerare som är involverad i uttrycket av avgörande faktorer för självförnyelse av stamceller, såsom NANOG och NOTCH1. Deregulering av GASC1-histondemetylasaktivitet kan resultera i cellulär transformation och stamcellfenotyper genom förändring av den epigenetiska histonkoden i humant cancer. Således kan målinriktad hämning av GASC1-histondemetylas i cancer ge potentiella nya vägar för terapeutisk utveckling.

Intressekonflikt

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur

  2. 2.

    Kompletterande tabell

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)