Genomomfattande DNA-metyleringsanalys hos patienter med tvångssyndrom | vetenskapliga rapporter

Genomomfattande DNA-metyleringsanalys hos patienter med tvångssyndrom | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • DNA-metylering
  • Tvångssyndrom

Abstrakt

Litteraturer har föreslagit att inte bara genetiska utan också miljöfaktorer interaktivt stod för känsligheten för tvångssyndrom (OCD). DNA-metylering kan reglera expression av gener som den ärftliga epigenetiska modifieringen. Undersökningen för genomomfattande DNA-metylering utfördes på blodprover från 65 patienter med OCD, liksom 96 friska kontrollpersoner. DNA-metyleringen undersöktes på över 485 000 CpG-ställen med användning av Illumina Infinium Human Methylation450 BeadChip. Som ett resultat visade sig 8 417 prober motsvarande 2 190 unika gener vara differentiellt metylerade mellan OCD och friska kontrollpersoner. Av dessa gener var 4 013 loci på CpG-öar och 2 478 var i promotorregioner. Dessa inkluderade BCYRN1, BCOR, FGF13, HLA-DRB1, ARX , etc., som tidigare har rapporterats vara associerade med OCD. Banvägsanalyser indikerade att reglering av aktincytoskelet, celladhesionsmolekyler (CAM), aktinbindning, transkriptionsregulatoraktivitet och andra vägar kan vara ytterligare associerade med risken för OCD. Oövervakad klusteranalys av de 3 000 mest variabla proberna avslöjade två distinkta grupper med signifikant fler personer med OCD i kluster ett jämfört med kontroller (67, 74% av fallen mot 27, 13% av kontrollerna, Chi-square = 26, 011, df = 1, P = 3, 41 E-07). Dessa resultat antydde starkt att differentiell DNA-metylering kan spela en viktig roll i etiologin för OCD.

Introduktion

Trots den obsessiva-kompulsiva störningen (OCD), som en kronisk neuropsykiatrisk störning, drabbar 2% av världsbefolkningen 1, 2, hittills har det inte funnits några exakta biomarkörer som hjälper klinikern att identifiera denna störning. Det har rapporterats att betydande interaktioner med social, genetisk och arbetsfunktion kan spela viktiga roller i patogenesen av OCD. Familjestudier visade att OCD-risken fyra till tiofaldigt ökade risken bland patienternas första grads släktingar, jämfört med friska kontroller. Kopplingsstudier har identifierat kromosomer 3q, 9p, 10p, 15q, 4q och 19q som kopplingsregioner för OCD. Associeringsstudierna har också rapporterat att DLGAP1, BTBD3, SLC64A, 5HT2A, DRD4 , etc., som tilltalande känslighetsgener för OCD. Å andra sidan har miljöförsäkringsfaktorer, som vitamin B12, flotat, homocystein och andra, också rapporterats spela viktiga roller i patogenesen av OCD 3 . Dessutom kan trauma hos barn, särskilt känslomässigt missbruk och försummelse, också öka risken för humörstörningar 4 .

Även om individernas genomstruktur i sig har fixerats hela livslängden har den epigenetiska mekanismen verifierats för att vara inblandad i regleringen av genuttryck. Hillemacher et al . rapporterade att det fanns signifikant hypermetylering av dopamintransportör ( DAT ) promotor hos personer med alkoholberoende som utvärderades för tvångssyndrom 5 . Därför lägger vi fram en hypotes om att onormal metylering kan spela en viktig roll i patogenesen av OCD. Men till vår vetskap har det hittills inte rapporterats någon genomfattande metyleringsanalys av OCD.

I den aktuella studien implementerade vi en genom-bred DNA-metyleringsstudie av OCD i den kinesiska Han-populationen. Enligt differentiellt metylerade loci kan resultat av framtida epigenetisk utforskning ge stora löften om biomarkörer och behandling för OCD, med tanke på att epigenetiska processer kan vändas.

Resultat

Differentialmetylering

65 patienter med OCD och 96 friska kontrollpersoner visade inga signifikanta skillnader i termer av deras demografiska data, såsom ålder och kön (tabell 1).

Full storlek bord

Mellan två grupper identifierades totalt 8 417 sonder som differentiellt metylerade (fig. 1 och tabell 2). Cirka 72, 62% av proberna (n = 6 116) metylerades differentiellt i OCD-grupp, jämfört med friska kontrollpersoner. De 8 417 proberna motsvarade 2 190 unika gener. Bland de signifikanta proberna var 2 478 loci i en promotorassocierad region av 388 gener (omgivande transkriptionsstartplatsen), 4 013 loci belägna i CpG-öar med 937 gener. Bland dessa loci var 1 622 båda promotorassocierade och lokaliserade på CpG-öar (tabell 2). Dessutom förstärkte de flerdimensionella skalningsdiagrammen på justerade ß- värden ytterligare skillnaden i sondens intensitet för metyleringsnivå mellan OCD-patienter och friska kontrollpersoner (fig. 2).

Kromosomal distribution av DNA-metylering avläst av Illumina IHumanMethylation450 sonder. X-axeln representerar positionen för sonder över 22 autosomala kromosomer. Y-axeln är avläst antal som kartläggs i varje kromosom.

Bild i full storlek

Full storlek bord

X- och Y-axeln representerade de genomsnittliga p- värdena hos kontrollpersoner respektive hos OCD-patienter. De blå prickarna är de signifikanta proberna som uppfyllde följande två kriterier: diffscore ≥20 ( P <0, 01), liksom delta- p- värde ≥ 0, 05.

Bild i full storlek

Som förväntat inträffade förändrad DNA-metylering mestadels på CpG-öarna (28, 39% ojusterad, 33, 12% justerad; 4 013/8 417). Andelen sonder i CpG-öar som återfinns på olika sätt metylerade i de justerade resultaten är signifikant högre än den totala andelen prober som finns i CpG-öar i matrisen som helhet (totalt 31, 13%; P = 1, 26 E-05). Vidare inträffade en hög andel av avvikande DNA-metylering i promotorassocierade regioner (12, 83% ojusterade, 17, 82% justerade; 2 478 / 8, 417). Andelen i de ojusterade resultaten var signifikant mindre än andelen promotorregioner som finns på matriserna som helhet (totalt 21, 34%; P = 6, 08E-04).

En genlista genererades baserat på gener som tidigare visat sig vara associerade med OCD från genetiska och / eller DNA-metyleringsstudier, som inkluderade hjärncytoplasmatisk RNA 1 ( BCYRN1 ), BRO-c ( BCOR ), fibroblasttillväxtfaktor 13 ( FGF13 ), aristaless relaterade homeobox ( ARX ), efrin B1 ( EFNB1 ); hämmare av kappa lätt polypeptidgenförstärkare i B-celler, kinas gamma ( IKBKG ); translokas av inre mitokondriell membran 17 homolog B (jäst) ( TIMM17B ); polyglutaminbindande protein 1 ( PQBP1 ); glukos-6-fosfatdehydrogenas ( G6PD ); Rho GTPase-aktiverande protein 6 ( ARHGAP6 ); kloridspänningsgrindad kanal 5 ( CLCN5 ), och så vidare. Dessa gener identifierades som differentiellt metylerade efter justering (tabell 3). I den aktuella studien inkluderade några andra gener med mer än 3 signifikant differentierad metylerad loci inklusive 5-hydroxytryptamin (serotonin) receptor 2C ( 5HT2C ), dopaminreceptor D5 ( DRD5 ), BTB (POZ) domän som innehåller 3 ( BTBD3 ), som också har har tidigare rapporterats vara förknippade med risken för OCD 3, 4, 5, 6 . Stewart et al . 7 rapporterade en SNP rs6131295 nära BTBD3- gen associerad med OCD med genombredande betydelse ( P = 3, 84E-08). Vidare visade rs6131295 en cis-eQTL-effekt på BTBD3 i det främre cortexet ( P = 0, 028), ett område som upprepade gånger har varit inblandat i OCD. I den aktuella studien fann vi att BTBD3- genen också visade hypomehtylering hos OCD-patienter jämfört med friska kontrollpersoner. Våra resultat, liksom tidigare publicerade känsliga gener av OCD, antydde tillsammans att det kan finnas mycket mer genetiska eller epigenetiska avvikelser i OCD.

Full storlek bord

Klusteranalys

Vi gjorde klusteranalys för de översta signifikanta proberna för differentiell metylering, som visade signifikant metylering med diffscore ≥ 20, delta p > 0, 1, P <0, 01. Justering av ålder och kön, β- värden avslöjade två distinkta kluster, den ena innehöll huvudsakligen OCD-patienter (67, 74%), den andra innehöll huvudsakligen kontroller (72, 87%; Kompletterande figur 2). Kluster 1 hade signifikant fler patienter med OCD jämfört med friska kontrollpersoner (Chi-kvadrat = 26, 011; df = 1; P = 3, 41E-07). Vi tolkade resultaten från dessa tre analyser i samband med att vi bekräftade att minst 12 av de 65 patienterna tydligt kan skiljas från kontrollerna.

För vägbaneanalyser hittade vi flera vägar som involverar differentiellt metylerade gener associerade med OCD, såsom reglering av aktincytoskelet (KEGG hsa04810), celladhesionsmolekyler (CAM, KEGG hsa04514), aktinbindning (GO: 0003779), transkriptionsregleringsaktivitet (GO : 00016563) etc. (tabell 4).

Full storlek bord

Diskussion

I den aktuella studien rapporterade vi den differentiella DNA-metyleringen i OCD och använde en genomomfattande metyleringsuppsättning med mycket omfattande täckning av de potentiella metyleringsplatserna i det mänskliga genomet. Så vitt vi vet är detta den första rapporten om genombrett förening av differentiellt metylerad gen av OCD mellan de med OCD och kontrollpersoner i den kinesiska Han-populationen. Efter justering för ålder befanns 8 417 sonder motsvarande 2 190 unika gener vara differentiellt metylerade. Vid jämförelse av differentiellt metylerad genlista med tidigare studier med användning av perifera blodprover fann vi en hög konkordansgrad, särskilt för gener som tidigare visat sig vara associerade med OCD.

En av generna som vi identifierade var hjärnans cytoplasmatiska RNA 1 ( BCYRN1 ), BCL-6 co-repressor ( BCOR ), som har förändrat DNA-metylering i den aktuella studien liksom andra metyleringsstudier. BCYRN1 kodar ett neuralt litet icke-budbärare-RNA, är en medlem av familjen av ispedd repetitivt DNA, som har rapporterats spela en roll i Alzheimers sjukdomar och cancer 8 . BCOR har rapporterats reglera mesenkymala stamcellsfunktioner med epigenetiska mekanismer 9 . Andra gener som har befunnits vara differentiellt metylerade i nuvarande den perifera leukocytvävnadsstudien inkluderar FGF13, ARX, HLA-DRB1, etc., som också har rapporterats vara deltagare i annan sjukdom associerad med epigenetik 10, 11, 12, 13 . Dessutom bör funktionell betydelse av gener som visar sig vara differentiellt metylerad också testas genom genuttryck.

I den aktuella studien använde vi genomgenomfattande perifert blodleukocyt-DNA-metyleringsmikro-strålar, såväl som utan övervakning av de största signifikanta proberna för differentiell metylering avslöjade två distinkta grupper efter justering för ålder kön och metylering PC. Kluster 1 omfattade 67, 74% patienter med OCD och 27, 13% kontroller, medan kluster 2 omfattade 32, 26% patienter med OCD och 72, 87% kontroller.

Klusteranalys avslöjade också två undergrupper inom OCD. Kanske dessa två undergrupper har specifika symptomprofiler behöver ytterligare undersökning i prover med en omfattande klinisk historia. För OCD rapporterade flera litteraturer att genetiska och miljömässiga riskfaktorer kan bidra till sjukdomens mottaglighet. Emellertid har sällan litteratur rapporterat specifika metyleringsavvikelser som bidrar till risken eller sjukdomen. Efter justering för potentiella förvirrande faktorer (ålder, kön, metyleringsdatorer, provtagningspoäng 1 för Peking och 2 för Guangzhou), befanns BROC, BCYRN1, HLA-DRB1, ARX , etc. differentieras metylerat mellan OCD-patienter och hälsosam kontroll ämnen. Intressant nog var det gener som vi tidigare har funnit vara associerade med OCD. Ciesielski et al . rapporterade att ett lokus nära transkriptionsstartplatsen för leptinreceptorn (cg21655790) visade minskade metyleringsnivåer hos spädbarn till mödrar med prenatal psykiatrisk sjukdom (depression, ångest, OCD eller panik) 6 . Stewart et al . rapporterade den första genombredda associeringsstudien (GWAS) för OCD med multietniska prover, som inkluderade DLGAP1, BTBD3 associerad med OCD i ( P <10 −6 ) 7 . I den aktuella studien hittade vi också 3 differentiella metylerade platser på BTBD3 och 2 platser på DLGAP2 , vilket föreslog att de två generna kan spela en viktig roll i patogenesen av OCD. Men de potentiella konsekvenserna bör undersökas ytterligare i framtiden.

Sabunciyan et al . Rapporterade också den första genombredda DNA-metyleringsscanningen vid störning av depression (MDD), och de fann att de största DNA-metyleringsskillnaderna var i PRIMA1, med 12–15% ökad DNA-metylering i MDD ( P = 0.0002– 0, 0003) 14 . I den aktuella studien fann vi att flera gener visade metyleringsavvikelser i OCD. Türksoy rapporterade att vikten av vitamin B12, folat och homocystein i kolöverföringsmetabolismen (metylering), vilket var nödvändigt för produktion av serotonin såväl som för andra monoamin-neurotransmittorer och katekolaminer 3 .

Våra data indikerar att studier av epigenetiska förändringar i OCD ger ett löfte om den framtida utvecklingen av diagnostiska och prognostiska biomarkörer för OCD, såväl som terapeutiska alternativ som riktar orsakande epigenetiska förändringar. Vi vill identifiera avvikande DNA-metyleringsprofiler i blodvävnader och att avgöra om resultaten kan översättas tillbaka till en diagnostiskt genomförbar vävnader som blod eller saliv. Att identifiera när DNA-metyleringsförändringar inträffar kommer också att vara viktigt för att förstå ursprunget till OCD. Litteraturer antydde att förändrad DNA-metylering kan inträffa under de kritiska utvecklingsperioderna mellan graviditet och födelse 15 . Om gen-miljömässiga riskfaktorer som påverkar DNA-metyleringsstatus kunde identifieras, kan förekomsten av OCD eventuellt minskas genom att rikta in sig på miljöutlösarna. Genom att sätta ihop alla pusselbitarna för patogenes av OCD, bör det undersökas ytterligare hur gen-miljöinteraktioner påverkar epigenetisk framsteg. Under dessa år har det gjorts många studier om effekterna av genetiska polymorfismer på mRNA-uttryck i OCD, men få undersökningar som indikerar hur polymorfismer påverkar genuttryck genom DNA-metylering. Att undersöka effekterna av polymorfismer - miljöinteraktioner på epigenetik kommer ytterligare att gynna vår förståelse av patofysiologin för OCD. Att identifiera enzymer som förmedlar DNA-demetylering i cellinjer som potentiella mål för terapeutisk intervention kommer också att vara en spännande möjlighet, som kan inneha nyckeln till att vända den psykiatriska sjukdomen 16 .

Föreliggande studie är en mycket preliminär undersökning av metylering i OCD, delvis på grund av en mycket liten provstorlek och registrerade ämnen från separata två sjukhus, som kan ge selektionsförskjutning. Å andra sidan har vi över uteslutit vissa fall med andra fysiska sjukdomar, vilket kan begränsa provstorleken något. I framtiden kommer vi att förstora provstorleken och också verifiera våra preliminära resultat i ett oberoende prov. En annan begränsning av den aktuella studien var att patienter inte var fria från anti-OCD-medicinering och antipsykotisk medicinering kan påverka DNA-metylering 17 . I framtiden rekryterar vi läkemedelsnaiva patienter med OCD med mycket lämpliga kriterier och undersöker förhållandet mellan metylering och terapeutiska effekter av anti-OCD-mediciner.

metoder

Metoderna genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.

Etik uttalande

Denna studie godkändes av Medical Research Ethics Committee vid Institute of Mental Health, Sjätte sjukhuset, Peking University och Guangzhou Psychiatry Hospital. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagare.

ämnen

Sextiofem OCD-patienter och 96 friska kontrollpersoner registrerades från Sjätte sjukhuset, Pekings universitet respektive Guangzhou Psychiatry Hospital. Konsensusdiagnoserna gjordes av minst två erfarna psykiatriker, enligt kriterierna för primär OCD från Diagnostic and Statistical Manual of Mental Health (DSM-IV) 18 . Alla fall, kontroller eller deras föräldrar födda i norra Kina. Uteslutningskriterier inkluderade antingen allvarliga kroniska fysiska sjukdomar, såsom cancer, diabetes, astma, cancer och hjärtsjukdomar, epilepsi eller annan primär psykiatrisk störning, enligt DSM-IV-kriterierna, komorbid diagnos av schizofreni, bipolär störning, alkoholmissbruk och andra neurologiska störningar.

Svårighetsgraden av OCD bedömdes med Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale (Y-BOCS) 19 . Medelåldern vid början av OCD var 22, 1 ± 8, 5 år och medelvaraktigheten för OCD var 32, 4 ± 10, 1 månader i fallgruppen. De friska kontrollpersonerna och relaterade uppgifter kom från databasen från Key Laboratory of Mental Health vid Ministeriet för hälsa (Sjätte sjukhuset), Peking University. De är alla norra kinesiska. För att kontrollera det grundläggande elementet i fallkontrolldesignen registrerade vi bara kontrollen som matchades till varje enskilt fall efter ålder (± 5 år) och kön för ytterligare analys. De friska kontrollpersonerna utesluts också om de mötte diagnos eller med historia av OCD eller andra psykiatriska störningar enligt DSM-IV eller fysiska sjukdomar. Frekvensmatchningsmetoderna för ålder och kön användes mellan 65 OCD-fall och 96 friska kontrollgrupper ( p > 0, 05, tabell 1).

Illumina Infinium HumanMethylation450 Beadchip

Genomiska DNA-prover extraherades med QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) och lagrades vid -80 ° C. Kvalitetskontroll av proverna utfördes med Nanodrop Spectrophotometer (Nanodrop, Wilmington, DE, USA) och upplösning på en 0, 8% agarosgel. Prover konverterades bisulfit med Zymo EZ DNA-metyleringskit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). GenomeStudio ChIP Sequencing Module v2011.1 (Illumina, San Diego, CA, USA) med metyleringsmodul 1.9.0-mjukvara med standardinställningarna Illumina och Illumina HumanMethylation450-manifestfiler användes i metyleringsanalys 20, 21 . Analyserna av Infinium-plattformen inkluderar mer än 485 000 CpG-platser, som omfattar 99% av RefSeq-generna. Beadchipen täcker 96% av CpG-öar, stränder (inom 2 kb från CpG-öar) och hyllor (> 2 kb från CpG-öar), liksom. Det kan också täcka platser utanför CpG-öar, DNas-överkänsliga platser, liksom de inbyggda miRNA-promotorregionerna. Alla Illumina-kvalitetskontroller inkluderade följande kontroller: provoberoende, provberoende, färgning, förlängning, borttagning av mål, hybridisering, bisulfitkonvertering I och II, specificitet, icke-polymorfisk och negativ kontroll 22 .

Databehandling

Illumina GenomestudioV2011-programmet (Illumina Ltd.) användes för att analysera BeadArray-data för att tilldela platsspecifikt DNA-metylerings- P- värden till varje CpG-ställe. Beadchips underkastades fluorescerande märkta nukleotider i två olika färger, var och en motsvarande cytosin (metylerad, M) eller uracil (ometylerad, U) identitet av den bisulfit-omvandlade nukleotiden på ett specifikt CpG-ställe. Andelen metylering ( P ) beräknades som: P = Max (M, 0) / [Max (M, 0) + Max (U, 0) + 100]. Metyleringsstatusen för varje sond beräknades som ett p- värde (varierade från 0 ~ 1), vilket representerar låga till höga nivåer av metylering 21, 22 . Efter ytterligare filtrering av överlappningar lämnade 386, 135 sonder till slutanalys. P > 0, 05 indikerade att datapunkterna inte signifikant skilde sig från bakgrundsmätningar.

Differentialmetyleringsdetektion

För att bedöma skillnader i metylering mellan fall- och kontrollgrupper omvandlades de ursprungliga 386, 135 p- värdena till M- värden via logit-transformationen 23 . Differentiellt metylerade prober detekterades med användning av Limma-paketet med Bioconductor (version 3.2) 23, 24, 25 . Använde ettprov Kolmogorov-Smirnov-testet för att undersöka fördelningstestet av p- metyleringsvärdet, vi fann att z- värdet av KS- testet var 0, 493, vilket antydde att fördelningen var normal (Gaussisk distribution). Därför använde vi den linjära regressionsanalysen för att ytterligare upptäcka differentiellt metylerade sönder av p- värdet mellan två grupper, med justerade potentiella förvirrande samvariationer (ålder, kön, metylerings-PC: er, provtagningspoäng 1 för Peking och 2 för Guangzhou). Metoderna Bonferroni, Benjamini-Hochberg och falsk upptäcktsfrekvens (FDR) användes för att justera P- värdena 26 . Prober ansågs vara differentiellt metylerade om justerade P <0, 05. Motsvarande gener kommenterades härrörande från genanteckningarna associerade med proberna.

Oövervakad klusteranalys

Vi valde topp 3 000 mest betydande olika metylerade sönder för ytterligare klusteranalyser med användning av den rekursivt fördelade blandningsmodellen (RPMM) 27, 28 . För att justera för ålder anpassades en linjär modell till M- värdena (logit-transformerade ß- värden) med Limma-paketet och R-programvaran. För att visualisera avståndet mellan proverna och för att ytterligare förstärka klusteringen utfördes multidimensionell skalning med ett euklidiskt avstånd (kompletterande figur 2).

Pathway-analys

Vi valde de differentiellt metylerade generna med (Freq ≥ 2) för funktionell och vägbaserad annotation. Sökvägsdata extraherades från två typiska och offentliga sökvägsdatabaser, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (//www.kegg.jp/kegg/pathway.html), samt Gene Ontology (GO) (www.geneontology .org) (tabell 4).

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Yue, W. et al . Genomfattande DNA-metyleringsanalys hos patienter med tvångssyndrom. Sci. Rep. 6, 31333; doi: 10.1038 / srep31333 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.