Genetisk undersökning av foxo3a kräver särskild uppmärksamhet på grund av sekvenshomologi med foxo3b | europeisk tidskrift för mänsklig genetik

Genetisk undersökning av foxo3a kräver särskild uppmärksamhet på grund av sekvenshomologi med foxo3b | europeisk tidskrift för mänsklig genetik

Anonim

ämnen

  • Genetisk variation
  • Transkriptionsfaktorer

Abstrakt

Vår studie visar att den genetiska undersökningen av gaffelhuvud O3A-genen ( FOXO3A ), en validerad mänsklig livslängdsgen, hindras starkt av det faktum att dess exoniska regioner har 99% sekvenshomologi med FOXO3B- pseudogenen. Om det inte beaktas kan denna höga grad av homologi orsaka allvarliga genotypnings- eller sekvensfel. Här presenterar vi en experimentell uppsättning som möjliggör tillförlitlig datagenerering för de mycket homologa regionerna och som kan användas för utvärdering av analysspecificitet. Med hjälp av denna design visade vi exemplifierande FOXO3A- specifika resultat för två enkel-nukleotid-polymorfismer (SNP) (rs4945816 och rs4946936) som är signifikant förknippade med livslängd i vårt centenarian-kontrollprov ( P vardera = 0, 0008). Eftersom båda SNP: er är belägna i den 3 'otranslaterade regionen av FOXO3A , kan de vara av funktionell relevans för livslängdsfenotypen. Vår experimentella uppsättning kan användas för tillförlitlig och reproducerbar datagenerering för ytterligare sekvensering och genotypningsstudier av FOXO3A i syfte att upptäcka nya SNP: er av funktionell relevans.

Introduktion

Gaffelhuvud O3A-genen ( FOXO3A ) är en nyckelregulator för insulinreceptorn / insulinliknande tillväxtfaktor-I signalvägen och deltar i moduleringen av livslängd i Caenorhabditis elegans och Drosophila . 1, 2, 3, 4, 5 Hos människor har genetisk variation i FOXO3A visat sig konsekvent i olika populationer vara associerad med överlevnad till ålderdom. 6, 7, 8, 9, 10, 11 De underliggande molekylära mekanismerna måste emellertid fortfarande klargöras eftersom de flesta av de livslängdsassocierade enkel-nukleotidpolymorfismerna (SNP: er) som analyseras finns i introniska regioner. 6, 7, 8, 9, 10, 11 För att identifiera de orsakande allelvarianter som modulerar genfunktionalitet behövs därför studier som undersöker den fullständiga genetiska variationen av FOXO3A genom djupgående utjämning av exoner, exon-intron gränser och promotor.

Innan sådana undersökningar påbörjas måste det beaktas att en pseudogen, kallad FOXO3B , ligger på kromosom 17p11. FOXO3B är 99% identisk med FOXO3A över en sträckning på ungefär 7, 1 kb exonisk sekvens. Pseudogenen innefattar alla de tre exonerna av FOXO3A NM_001455 och saknar de två intronerna (figur 1). 12 Eftersom exon 2 och 3 av FOXO3A är jämförelsevis stora (1, 4 kb respektive 4, 9 kb) ger FOXO3A- specifika intronregioner inte tillräckliga grundmål för analysen av dessa två exoner. Till exempel, för att generera högkvalitativa läsningar med Sanger-sekvensering, bör PCR-amplikoner inte överstiga 600 baser. Eftersom exon 2 och 3 var och en är större än 1400 baser, måste deras sekvenseringsprimrar emellertid placeras inom de exoniska regionerna, trots deras starka homologi med FOXO3B. Icke desto mindre kan det för vissa sekvenserings- eller genotypningsanalyser vara möjligt att placera primrar särskilt på FOXO3A / FOXO3B sekvensskillnader (som endast innefattar 1% av de kritiska regionerna) (Kompletterande figur S1). För den genetiska undersökningen av den fullständiga exoniska regionen (7, 1 kb) skulle emellertid en konventionell primerdesign, med användning av de homologa exoniska regionerna för primerplacering, sannolikt resultera i ospecifik genotyp eller blandad FOXO3A / FOXO3B- sekvenseringsamplikoner. Tyvärr kan inte resultatet förutsägas pålitligt av till exempel i PC- silikotest före det faktiska våtlaboratoriumsexperimentet.

Illustration av FOXO3A-genmodellen som visar de två isoformerna NM_201559 (fyra exoner) och NM_001455 (tre exoner) på kromosom 6. Exonerna indikeras med rutor och presenteras i jämförelse med FOXO3B- pseudogenen på kromosom 17. FOXO3B är 99% identisk med FOXO3A över ungefär 7, 1 kb relaterad sekvens innefattande alla de tre exonerna av FOXO3A NM_001455 medan de saknar de två intronerna emellan. De fysiska positionerna (i kilobaser) av utskrifterna hänvisar till UCSC Genome Browser på Human March Assembly 2006.

Bild i full storlek

Här presenterar vi en experimentell uppsättning som gör det möjligt för FOXO3A- specifik genetisk undersökning av exoniska regioner utan FOXO3B 'kontaminering': med genereringen av långsiktiga produkter som spänner över 8000 baser, kan exon 2 och 3 förstärkas i en FOXO3A - specifikt sätt med användning av de icke-homologa introniska regionerna för primerplacering. Genotypning och sekvenseringsexperiment beskrivs exemplifierande för exon 3: först förstärktes exon 3 genom PCR med lång räckvidd med FOXO3A-specifik primerplacering i de närliggande unika introniska regionerna (kompletterande tabell S3) för att säkerställa målinriktad amplifiering av FOXO3A exoniska regionen (dvs. (saknar FOXO3B- sekvens). Därefter användes de långväga amplikonerna som mallar för genotyping och sekvenseringsreaktioner. Vi testade lämpligheten för denna experimentella uppsättning för två SNP: er belägna i exon 3 av FOXO3A , nämligen rs4945816 och rs4946936. Dessa två SNP: er valdes eftersom de är de enda i FOXO3A exoniska regionen som listas på dbSNP-sidan som vanliga SNP: er i CEU-prover (//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/).

Resultat och diskussion

Sekvensomvandlingstest: skillnader i FOXO3A- specificitet

Genotypning med Sequenom-teknik (Sequenom, Hamburg, Tyskland) utfördes för båda SNP: er på 23 individer som utnyttjade tre olika mallar för jämförelse: FOXO3A långsiktiga produkter av exon 3 (5.523 kb), FOXO3B långväga produkter (8.540 kb) och genomiskt DNA (gDNA). Tabell 1 visar exemplifierande data erhållna för nio individer. Uppgifter om de återstående 14 individerna ges i tilläggstabellen S1. Sekvens-PCR-primrar för båda SNP: erna placerades på FOXO3A / FOXO3B- sekvensskillnader (kompletterande figur SI). Trots denna speciella primerplacering visar jämförelse av genotypningsresultat för SNP rs4945816 som erhållits från de tre olika mallen att de till synes heterozygota genotyperna härrörande från gDNA-mallen (prover 1, 3, 4, 5 och 8) beror på ospecifik typ och representerar blandningar av genotyper av FOXO3A och FOXO3B (tabell 1a, kompletterande tabell S1a). Fiktiv heterozygositet blir uppenbar endast om FOXO3A- och FOXO3B- genotyper skiljer sig från varandra, som det var fallet för proverna 1, 3, 4, 5 och 8 (tabell 1a). Å andra sidan demonstrerade den andra SNP-analysen (rs4946936) FOXO3A- specificitet genom att presentera samma genotypningsresultat för FOXO3A- långsiktiga produkten och gDNA-mallen, som båda skilde sig från FOXO3B (tabell 1a). Skillnaderna i FOXO3A- specificitet för de två Sequenom-analyserna indikerar tydligt att FOXO3A- analysspecificitet inte kan förutsägas pålitligt före det faktiska våtlaboratoriumsexperimentet. Endast jämförelsen av våra genotypningsresultat för gDNA-mallen med de härledda från FOXO3A- och FOXO3B- långsiktiga produkter demonstrerade att analysen för rs4946936 var FOXO3A- specifik, medan analysen för rs4945816 inte var (tabell 1 och kompletterande tabell S1). Följaktligen, för att erhålla FOXO3A- specifika resultat för rs4945816 och rs4946936 med de tillämpade Sequenom-analyserna, skulle typ av rs4945816 behöva utföras på FOXO3A långsiktiga produkter, medan rs4946936 skulle kunna undersökas på gDNA.

Full storlek bord

FOXO3A- specifik sekvensering

Vi visade vidare att vår experimentella uppsättning också är lämplig för FOXO3A- specifik sekvensering av de problematiska homologa exoniska regionerna. För detta ändamål sekvenserade vi exon 3 av FOXO3A hos samma 23 individer som använde FOXO3A långsiktiga produkter som mål för sekvensering av primrar istället för gDNA. Den efterföljande SNP som krävde rs4945816 och rs4946936 gav samma FOXO3A- specifika genotyper (tabell Ib, kompletterande tabell S1b) som tidigare (tabell 1a, kompletterande tabell S1a).

FOXO3A- specifik genotypning

För storskaliga fallskontrollföreningsstudier kan det vara för tid- och pengekrävande att producera FOXO3A- specifika långsiktiga PCR-produkter för tusentals prover för att få FOXO3A- specifika genotypningsresultat. För att undvika behovet av sådana produkter kan vår studiedesign också användas för att testa kommersiellt tillgängliga analyser (t.ex. TaqMan; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) för primerspecificitet: Först skrivs analyserna av intresse i ett litet antal prover med gDNA-, FOXO3A- och FOXO3B- mallarna. Genotyperna härledda från de tre olika mallen jämförs sedan för att utvärdera analysspecificitet. Därefter, om analyserna testade på gDNA visar samma genotyper som de från FOXO3A långsiktiga produkter, kan de anpassade analyserna också användas för genotypning av större prover med gDNA som mall. Vi använde denna uppsättning för att utvärdera FOXO3A- specificitet för en anpassad TaqMan-analys (rs4945816; hCV27392797) och en egenutformad TaqMan-analys (rs4946936; rs4946936_SDA). Båda TaqMan-analyserna demonstrerade FOXO3A- specificitet genom att ge samma genotypningsresultat som erhållits från FOXO3A långsiktigt produkt (tabell 1c, kompletterande tabell S1c). Eftersom dessa två analyser visade sig generera tillförlitliga genotyper från normalt gDNA, bestämde vi oss för att undersöka dem därefter i vårt hela studieprov som omfattade 747 centenarians och 1102 kontroller. Båda SNP: erna visade en mycket signifikant associering med livslängden i en allelbaserad fallkontrollanalys (rs4945816, P = 0, 0008; rs4946936, P = 0, 0008).

I silico utredning av funktionell relevans

Eftersom båda SNP: erna är belägna i den 3 'otranslaterade regionen av FOXO3A, kan de vara av funktionell relevans. Tillämpning av olika prediktionsverktyg för i silico- analys testade vi de två SNP: er rs4945816 och rs4946936 för potentiellt funktionell betydelse. Det fanns inga funktionella eller strukturella effekter, mikroRNA-bindande ställen eller skarvplatser förutspåddes (kompletterande tabell S2). Endast de verktyg som analyserade skarvningsregleringselement (SRE) upptäckte skillnader mellan referens- och muterade sekvenser. Dessa resultat måste emellertid ses med försiktighet eftersom SRE är kända för att vara mindre bevarade, och följaktligen är det osannolikt att denna typ av verktyg kommer att ge robusta och exakta resultat. 13 De två SNP: er rs4945816 och rs4946936 har undersökts exempelvis för att testa vår uppsättning. Framtida studier som syftar till att identifiera nya SNP: er av funktionell relevans i FOXO3A exoniska regionen bör beakta de aspekter som presenteras här.

Slutsats

Sammantaget visar våra resultat tydligt att, för pålitlig genetisk undersökning av FOXO3A exoniska regioner, är en speciell studiedesign obligatorisk redovisning för FOXO3B- sekvenshomologin. Detta fynd är av speciell betydelse eftersom vissa studier redan har använt ospecifika primers för amplifiering av FOXO3A exoniska regioner. Till exempel använde Mikse et al 14 olika grunduppsättningar för att bestämma FOXO3A- deletioner i tumörceller med qPCR. När vi testade dessa par med UCSC i silico Test-PCR (//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start) visade utgången ytterligare bindning till FOXO3B för två av dem (se kompletterande material och metoder) ).

FOXO3A / FOXO3B- homologin på 99% påverkar inte de tidigare FOXO3A- livslängdsassocieringsresultaten, eftersom de flesta av de associerade och validerade SNP: erna har nämnts ovan i FOXO3A- specifika introniska regioner. Icke desto mindre måste pseudogenen beaktas i framtida genetiska studier av FOXO3A . Vidare kan den presenterade strategin också tillämpas på andra genpar eller pseudogener med hög sekvenshomologier som gör designen av PCR-primrar eller pålitliga genotypningsanalyser svåra, till exempel cytokrom P450-generna CYP2D6, CYP2D7, CYP2D8 eller RH-blodgruppsgenerna ( RH ). 15, 16

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen European Journal of Human Genetics (//www.nature.com/ejhg)