Genuttrycksmönster för två dominerande tallgräs präriesorter skiljer sig åt som svar på uppvärmning och förändrad nederbörd | vetenskapliga rapporter

Genuttrycksmönster för två dominerande tallgräs präriesorter skiljer sig åt som svar på uppvärmning och förändrad nederbörd | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Ekologi

Abstrakt

För att bättre förstå mekanismerna bakom växtartens svar på klimatförändringar jämförde vi transkriptionella profiler av de samdominerande C4-gräserna, Andropogon gerardii Vitman och Sorghastrum nutans (L.) Nash, som svar på ökade temperaturer och mer varierande nederbördsregimer i en långsiktigt fältexperiment i inhemsk tallgräs prärie. Vi använde mikrotapparundersökning av en nära besläktad modellart ( Zea mays ) för att bedöma korrelationer i bladtemperatur (T- blad ) och bladvattenpotential (LWP) och mängdförändringar på ~ 10 000 transkript i bladvävnad som samlats in från individer av båda arter. Ett större antal transkript visade sig signifikant förändra i mängdnivåer med T- blad och LWP i S. nutans än i A. gerardii . S. nutans var också mer lyhörda för kortsiktig torkåterställning än A. gerardii . Vattenflödesreglerande transkript förknippade med stressundvikande (t.ex. aquaporiner), såväl som de som är involverade i förebyggande och reparation av skador (t.ex. antioxidanter, enzymer, HSP), var unikt mer omfattande som svar på ökande T- blad i S. nutans . De differentiella transkriptomiska svaren från de samdominerande C4-gräserna tyder på att dessa arter kan hantera och svara på temperatur och vattenspänning på molekylnivå på distinkta sätt, med konsekvenser för tallgräs prärie-ekosystemfunktion.

Introduktion

Förutspådda klimatförändringar inkluderar ökade medeltemperaturer och mer varierande nederbördsregimer 1, vilket skulle resultera i ökad vatten- och temperaturstress för många växtsamhällen. Sådana kroniska förändringar i miljöförhållanden förväntas leda till fenotypiska anpassningar på individnivå 2, 3 . Exempelvis har ökad årlig variation i nederbörd visat sig välja större morfologisk och fysiologisk plasticitet, vilket kan leda till evolutionär förändring 4 . Växtfenotypiska svar på förändrade miljöförhållanden uppnås genom reglering av genuttryck på transkriptionella och post-transkriptionella nivåer, vilket resulterar i förändringar i metabolism och fysiologi. Således kan koppling av fenotyp och genuttryck ge en mer känslig indikator på svar på förändrade miljöförhållanden och stress. Vidare kommer utvärdering av funktionella svar från växter på genetisk och biokemisk nivå att öka vår förståelse för underliggande genetiska baser av svar som begränsar tillväxt och överlevnad, vilket kan relateras till konditionsvariation, urval och anpassning 5, 6 . Enskilda svar kan också kaskadera för att påverka samhälls- och ekosystemstruktur och -funktion, särskilt om fokalarten är dominerande i systemet 2, 7 .

Fram till nyligen förflyttades den molekylära basen för växtersvar på förändrade miljöförhållanden och stress i naturliga system till en okänd "svart låda" 8 . Genomiska verktyg kan emellertid belysa molekylära mekanismer och bedöma deras betydelse i ett verkligt sammanhang 8, 9, 10, 11, 12 . Microarray-profilering tillhandahåller ett analytiskt verktyg genom vilket uttryck av tusentals gener kan studeras samtidigt och har använts för att övervaka global genuttryck som svar på abiotiska spänningar i ett antal högre växter 13, 14, 15, 16 . De flesta av dessa studier har emellertid fokuserat på modellarter för vilka cDNA-mikroarrayer är lätt tillgängliga (t.ex. Arabidopsis, majs, Populus , ris och sojabönor) och har infört relativt extrema förhållanden under korta tidsramar och under kontrollerade förhållanden (t.ex. växter odlas i krukor utsatta för torka eller plantor som upplever kortvarig stress). Dessa studier ger insikter om transkriptionella profilförändringar involverade i svar på olika påfrestningar och bidrar till vår förståelse av funktionen hos relaterade gener. Det är emellertid oklart hur fynd från dessa studier gäller för icke-modellväxter i naturliga system. Miljöändringar i naturliga system kan vara mer subtila med stress som ackumuleras över tid (vilket möjliggör anpassning). Växter i dessa system utsätts också för större variation i miljöförhållanden, liksom många andra faktorer (t.ex. konkurrens, växtät). Alla dessa skillnader kan ändra storleken på variation i genuttryck som observerats i mer kontrollerade inställningar 8 . Således, om vi ska förbättra vår mekanistiska förståelse av växtersvar på förändrade miljöförhållanden i samband med klimatförändringar, är ett viktigt steg framåt att genomföra genomiska studier av växtarter som inte är modellera under ekologiskt relevanta fältförhållanden.

Införlivandet av transkriptionsprofilering i fältstudier har hindrats av bristen på tillgängliga genomiska resurser för icke-modellarter 10, även om nya resurser genereras i snabb takt 17 . De flesta mikroarrayer som för närvarande finns för högre växter är för modeller och kommersiellt viktiga arter 8, 17 . Medan nyligen gjorda genotypningsverktyg med hög kapacitet, såsom RAD-seq, försvårar att sekvensera hela genom, kräver dessa tekniker fortfarande betydande tid och / eller resurser (såsom sekvensdjup) för att utveckla för icke-modellarter. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda mikroarrayer utformade för modellarter och tillämpa dem på nära besläktade icke-modellarter (dvs. heterolog eller hybridiserad korsart). Även om brister, såsom förlust av artsspecifika sekvenser och hybridiseringsartifakter, existerar 18, 19, har heterologa hybridiseringar framgångsrikt använts för att undersöka transkriptomerna från icke-modellväxtarter som svar på en rad miljöspänningar 9, 20, 21, 22, 23, 24, inklusive tävling 25, 26 . Studier av icke-modellväxter i naturliga fältinställningar är dock fortfarande ovanliga (men se 9, 10 ).

Här presenterar vi resultat från en fältstudie utformad för att jämförande utvärdera genomiska svar från två infödda C4-gräsarter, Andropogon gerardii Vitman (stor bluestem) och Sorghastrum nutans (L.) Nash (indiskt gräs), till två aspekter av prognostiserad klimatförändring 1 : ökade temperaturer och ökad variation i nederbördsregimer. Tidigare studier rapporterade att A. gerardii svarade på experimentellt förändrade nederbördsregimer genom att reglera uttryck av gener relaterade till fotosyntes, vilket tyder på en produktivitetskostnad för anpassning till torka stress eller minskad prestanda på grund av torka stress 10 . När växter utsattes för både ökade temperaturer och förändrade nederbördsregimer, skiftade A. gerardii uttrycksnivåer av gener som svar på termisk spänning snarare än till vattenstress 9 . I höggräs prärie-ekosystemet dominerar A. gerardii med S. nutans och de två arterna samverkar för att påverka gemenskapens och ekosystemets struktur och funktion 27 och svar på klimatförändringar 28, 29, 30 . Båda arterna finns i hela Central- och Östeuropa, även om S. nutans historiskt sett tenderade att dominera mer mesiska (södra) regioner 31 . Trots nära fylogenetisk besläktning 32, 33, fluktuerar dessa två arter i överflöd och skiljer sig i deras ekofysiologiska svar på förändringar i temperatur och vattentillgänglighet 30, 34, 35, 36, 37 . Exempelvis påverkades netto fotosyntes och stomalt ledningsförmåga hos A. gerardii av temperaturökningar, medan dessa ekofysiologiska svar var närmare kopplade till förändringar i vattentillgänglighet i S. nutans 37 . Ekofysiologi hos S. nutans var också mer känslig för extrema klimatmanipulationer (värmevågor) i fältet 30 . Med andra ord, under samma förhållanden, uppvisade S. nutans en större nedgång i ekofysiologi jämfört med A. gerardii . Således tyder dessa studier på att de två fokusarter som antas vara funktionellt lika ekologiskt faktiskt kan skilja sig åt på viktiga sätt vad gäller deras känslighet för klimatförändringar.

Som ett första steg för att förstå de potentiella molekylära mekanismerna som ligger bakom skillnaderna i känslighet som observerades på ekofysiologisk nivå, analyserade vi transkriptionsprofilerna av individer av dessa samdominerande gräsarter utsatta för både ökade temperaturer och förändrade nederbördsregimer inom naturliga fältplottar. Under en växtsäsong (inklusive en händelse för torråterhämtning i mitten av juli) använde vi heterologa hybridiseringar med cDNA-mikroarrayer utformade för en nära besläktad modellart, Zea mays , för att karakterisera transkriptionella profiler av varje art som svar på experimentellt inducerad temperatur och vatten stress i fältet. Vi förväntade oss att Zea mays skulle ge en lämplig mall på grund av bevarande av gener för stressrespons bland växter 38 . Vi antog att transkriptionella svar skulle vara differentiellt upp- och nedreglerade för olika grupper av gener, såsom de som är involverade i stressrespons 11, 16 och fotosyntes 39, för A. gerardii och S. nutans . Vi förväntade oss att absoluta skillnader i transkript (känslighet) skulle skilja sig som svar på temperatur och vattenspänning under loppet av växtsäsongen, med A. gerardii som är mer känsliga för ökade temperaturer och S. nutans var mer känsliga för ökande vattenstress. Dessa fynd hjälper till att avslöja mekanismer genom vilka dessa två dominerande arter, och i slutändan tallgräs prairiesamhällen, svarar på klimatstress i en naturlig miljö.

Resultat

Variation i T- blad och LWP under växtsäsongen för A. gerardii och S. nutans

A. gerardii och S. nutans skilde sig inte signifikant i svaret på bladets yttemperatur (T- blad ; F 1, 25 = 0, 62, p = 0, 439) eller bladvattenpotential (LWP; F 1, 26 = 1, 74, p = 0, 198) ) till de uppvärmda eller förändrade nederbördbehandlingarna under studiens varaktighet, även om S. nutans tenderade att uppvisa lägre (mer negativ) LWP än A. gerardii under mitten av juli. I allmänhet var T- bladet lägst i början av växtsäsongen, toppade på höjden av torka (18 juli) och förblev sedan mellanliggande under resten av växtsäsongen (fig. 1A, B). Däremot blev LWP mer negativt när växtsäsongen fortsatte (Fig. 1C, D), med LWP lägst i mitten av juli (18 juli). För båda arter var T- blad för enskilda växter i uppvärmda tomter i allmänhet 1 eller 2 ° C högre än växter i ovärmda tomter (Fig. 1, F 1, 6 = 8, 02, p = 0, 030 för A. gerardii ; F 1, 17 = 0, 23, p = 0, 635 för S. nutans ). Men denna skillnad i T- blad minskade när växtsäsongen fortsatte och lufttemperaturerna ökade senare under växtsäsongen. Jämfört med växter exponerade för den omgivande nederbördsbehandlingen (regn omedelbart appliceras), tenderade växter som upplevde den förändrade nederbördsbehandlingen (50% ökning i tid mellan omgivande regnhändelser) mot lägre men inte signifikant olika LWP och högre T- blad (Fig. 1C, D, F 1, 13 = 0, 64, p = 0, 439 för A. gerardii ; F 1, 40 = 0, 49, p = 0, 486 för S. nutans ). Den uppvärmande behandlingen minskade LWP för växter konsekvent jämfört med ovärmda växter under den förändrade utfällningsbehandlingen (Fig. 1C, D). Som en konsekvens förvirrades effekterna av förändrad nederbörd jämfört med uppvärmningsbehandling sannolikt, särskilt när vatten blev begränsande (t.ex. juli- och aug-datum). Under mitten av juli-torkan hade växter lägre LWP (Fig. 1C, D) och uppvisade torka och värmestressrelaterade fenotyper (t.ex. torra bladkanter, rullvalsning / vikning). Applicering av regn den 19 juli på både de omgivande och förändrade behandlingarna resulterade i återhämtning av LWP den 24 juli (torka-återhämtning), men inte till nivåer som observerades i juni (Fig. 1C, D).

Reaktion av bladtemperatur (T- blad ) och bladvattenpotential (LWP) för Andropogon gerardii ( A, C ) och Sorghastrum nutans ( B, D ) på uppvärmnings- och förändrade nederbördbehandlingar under fem provtagningsdatum under 2006. U: ovärmd ; W: värmt; AMB: omgivande nederbörd; ALT: förändrad nederbörd. Ruta tomter visas med medianlinje och övre 75 och nedre 25 percentiler. Felraden är variationerna mellan 5 och 95 procent. Bokstäver indikerar signifikant skillnad mellan T- blad eller LWP bland olika behandlingar för ett individuellt provtagningsdatum (p <0, 05).

Bild i full storlek

Transkriptionsmönster som svar på T- blad, LWP och deras interaktion under växtsäsongen

Regressionsanalys med hög genomströmning visade att överflödet av en delmängd av transkript i bladvävnad av A. gerardii och S. nutans varierade signifikant med variation i T- blad och LWP och interaktionen av T- blad och LWP över samplingsdatum. För att upptäcka de transkripten som svarade separat på variation i T- blad och LWP, identifierade vi först transkript korrelerade med interaktionen mellan T- blad och LWP och hur många av dessa svarade också på samplingsdatum. Överflöd av ett litet antal transkript korrelerades signifikant med interaktionen av T- blad och LWP, med betydligt mer för A. gerardii (311) än S. nutans (54; χ2 = 185, 46, p <0, 0001, Fig. 2A, B ). Bland dessa transkript förändrade 67 transkript i A. gerardii och 11 transkript i S. nutans också överflöd som svar på samplingsdatumet (Fig. 2A, B).

Effekten av kombinationen av variation i bladtemperatur (T- blad ) och bladvattenpotential (LWP; Interaction), provtagningsdatum och variation i T- blad och LWP på transkriptionsfrekvensförändringar för individer av Andropogon gerardii ( A, C ) och Sorghastrum nutans ( B, D ) utsattes för uppvärmningen och förändrade nederbördbehandlingar under 2006. Värdena representerar antalet transkript med betydande förändringsfrekvens (signifikant positiva eller negativa sluttningar, q-värde <0, 05). Antalet transkript med delat förändrat överflöd mellan individuella effekter visas i de överlappande områdena. I samtliga fall var antalet transkript med övergripande förändring signifikant olika mellan de två arterna genom Pearson χ 2- test (p <0, 0001).

Bild i full storlek

Efter redovisning av dessa transkript signifikant korrelerade med interaktionen mellan T- blad och LWP korrelerades ett större antal transkript med variation i T- blad för S. nutans (593) än A. gerardii (257, χ 2 = 127, 60, p <0, 0001, Fig. 2C, D). En liten andel transkriptioner korrelerades med variation i LWP för båda arter (1, 5 mot 0, 1%), med återigen ett större antal för S. nutans (101) än A. gerardii (11, χ 2 = 64, 86, p <0, 0001, Fig. 2C, D). I A. gerardii fanns ingen signifikant transkriptionsnivåförändring korrelerad med både T- blad och LWP, medan överflödet av 2 och 31 transkript förändrades genom samplingsdatum och variation i LWP respektive T- blad . I S. nutans förändrade 31 transkript sina överflöd med både LWP och T- blad, bland vilka överflödet av 10 av dessa transkript också var signifikant korrelerat med provtagningsdatum. Elva och 76 transkript korrelerades signifikant med provtagningsdatum och variation i LWP respektive T- blad .

Skillnader i transkriptionsfrekvens förändras i A. gerardii och S. nutans som svar på variation i T- blad, LWP, deras interaktion och samplingsdatum

( A ) Antal transkript med betydande mängdförändring som svar på variation i bladtemperatur (T- blad ), bladvattenpotential (LWP), deras interaktion (Interaktion) och provtagningsdatum för Andropogon gerardii (svarta staplar) och Sorghastrum nutans (grå staplar) ). I samtliga fall var antalet transkript med ökad eller minskad mängdförändring signifikant olika mellan de två arterna genom Pearson χ 2- test (eller Fishers exakta test) (p <0, 001). ( B ) Distributionen av transkript med signifikanta överflödeförändringar i olika funktionella grupper enligt MapMan-genontologi i A. gerardii och S. nutans som svar på variation i (a, b) bladtemperatur (T- blad ), (c, d) bladvattenpotential (LWP), (e, f) kombinationen av T- blad och LWP (Interaction) och (g, h) provtagningsdatum. Ner = antalet avskrifter med minskat överflöd (negativ lutning). Upp = antalet transkript med ökat överflöd (positiv lutning) som svar på ökande T- blad och minskande LWP.

Bild i full storlek

Full storlek bord

  1. Bladtemperatur

    Med användning av en utvidgning av MapMan-genontologin från Arabidopsis till majs kategoriserades transkript med betydande överflödeförändringar i huvudfunktionella grupper och delades sedan ytterligare in i specifika funktioner. Efter redovisning av statistiska skillnader på grund av samplingsdatum genom multipel regression, antalet transkript i A. gerardii som var korrelerade med variation i T- blad positivt (ökade deras överflöd som svar på ökat T- blad ) kontra negativt (minskade deras överflöd som svar till ökat T- blad ) var liknande (respektive 99 mot 126; fig. 3A). Omvänt var mer än två tredjedelar (383 av 486) av transkripten i S. nutans positivt korrelerade till variation i T- blad (fig. 3A). De flesta av dessa tilldelades MapMan-ontologiceller, DNA, protein, redox, stress och transportgrupper (fig. 3B-b; se bilaga S3, S4). Av transkripten med förändrat överflöd som svar på variation i T- blad, visade sju transkript med funktioner under utveckling, nukleotidmetabolism, proteinsyntes, redox och RNA transkriptionell reglering, förändrat överflöd i både A. gerardii och S. nutans (se bilaga S5) . En märkbar skillnad mellan dessa två arter är att fler transkript från de funktionella grupperna av stress, redox och cell förändrade sitt överflöd i S. nutans jämfört med det i A. gerardii i samband med ökande T- blad (Fig. 3B-a, b; Bord 1). Dessa transkript i S. nutans representerades främst av olika värmechockproteiner (se bilaga S5). I redoxgruppen var majoriteten superoxiddismutas- och askorbatperoxidasgener. Alla dessa transkript korrelerades positivt med variation i T- blad (tabell 1). Major intrinsic protein (MIP) och Tonoplast intrinsic protein (TIP), och p- / v-ATPases utgör huvuddelen av transkripten med förändrat överflöd i transportgruppen för S. nutans , som återigen var positivt korrelerade med T leaf . Alla utskrifter i undergruppen av "MIP" var positivt korrelerade med T- blad i S. nutans , men inte i A. gerardii (tabell 1, se bilaga S5). På samma sätt var i signaleringsgruppen två transkript relaterade till kalcium och två relaterade till G-proteiner i A. gerardii negativt korrelerade med T- blad, medan de flesta transkript relaterade till kalcium, G-protein, receptorkinaser och fosfinositider från S. nutans var positivt korrelerat med T- blad, med undantag för ett transkript (fosfinositider), som var negativt korrelerade med T- blad (tabell 1, se bilaga S5). I fotosyntesgruppen korrelerades endast tre transkript med T- blad i A. gerardii , ett positivt och två negativt, medan tre transkript korrelerades positivt med T- blad i S. nutans (Tabell 1, se bilaga S5).

  2. Bladvattenpotential

    Förändring i överflöd av transkript skilde sig signifikant i korrelation med lägre LWP (dvs. mer negativt) i båda A. gerardii mot S. nutans (fig. 3A). Av de 9 transkripten med betydande förändringar i överflöd i A. gerardii , var 5 negativt korrelerade med LWP (dvs. ökat överflöd som svar på ökande vattenstress, eller lägre LWP; Fig. 3B-c), och dessa var främst i de funktionella grupperna av DNA, lipidmetabolism, protein och stress (se bilaga S3, S6). Däremot var mer än 80% (51 av 59) transkript med förändrat överflöd i S. nutans positivt korrelerade med LWP (dvs minskad mängd som svar på ökande vattenstress, Fig. 3A), med de flesta i de funktionella grupperna av protein och RNA, följt av grupper, såsom cell, utveckling, DNA och hormonmetabolism (Fig. 3B-d, se bilaga S4, S6). Inget transkript hittades förändrat i överflöd hos båda arterna (se bilaga S6). Inga transkript från den funktionella gruppen av fotosyntes visade svar på variation i LWP hos någon av arterna (tabell 1). Två avskrifter från grupperna av stress och transport korrelerades alla negativt med LWP i A. gerardii . Ett transkript från gruppen av signalering korrelerades negativt med LWP i S. nutans (tabell 1, se bilaga S6).

  3. Interaktion mellan T- blad och LWP

    I A. gerardii korrelerades cirka 65% (159 av 244) av transkript positivt med interaktionen mellan T- blad och LWP, medan cirka 88% av transkripten (38 av 43) var negativt korrelerade med interaktionen mellan T- blad och LWP i S. nutans (fig. 3A), och endast ett transkript (Spotid 13430, med 41% sekvenslikhet till ett risprotein, Osr40c1-protein) visade minskad överflöd hos båda arter (se bilaga S7). För A. gerardii korrelerades de flesta transkript från DNA-, protein- och RNA-syntesgrupper positivt med interaktionen av LWP och T- blad (fig. 3B-e, se bilaga S7). Det lilla antalet transkript med förändrat överflöd i S. nutans spriddes mellan olika funktionella grupper (t.ex. cellvägg, DNA, hormonmetabolism, protein och RNA), där de flesta transkript i grupperna av protein och RNA-syntes minskade i överflöd (Fig. 3B-f, se bilaga S7). Inga transkript i den funktionella gruppen av fotosyntes svarade på den kombinerade effekten av att ändra LWP och T- blad i S. nutans , medan ett transkript från A. gerardii var positivt korrelerat med den kombinerade effekten (tabell 1). Transkript från de funktionella grupperna såsom redox, signalering, stress och transport visade liknande reglering med antalet transkript ökade kontra minskat överflöd för S. nutans (1 mot 1) och för A. gerardii (14 mot 9) (tabell 1, se bilaga S7).

  4. Provtagningsdatum

    Fem datum (två juni-datum, två juli-datum och ett augusti-datum) som omfattade större delen av växtsäsongen (början av juni till mitten av augusti) valdes för provtagning. En stor del av variationen i transkriptionsfrekvens berodde på samplingsdatum (Fig. 3A). Bland transkripten med förändrat överflöd för båda arter var antalet transkript med ökad eller minskad mängd liknande, med 501 mot 613 för A. gerardii , 995 mot 736 för S. nutans (fig. 3A). Transkript med förändrat överflöd som svar på provtagningsdatum fördelades i liknande grupper för de två gräsarterna, såsom cell, utveckling, DNA, protein, RNA, transport (fig. 3B-g, h, se bilaga S8). Bland transkripten med förändrat överflöd som svar på provtagningsdatum var 159 transkript vanliga hos A. gerardii och S. nutans , varav de flesta tilldelades grupperna protein, transport, RNA och DNA (fig. 3B-g, h, se bilaga S8).

Reaktion på transkriptets överflöd på kortvarig torkautvinning

Skillnader i transkriptionsfrekvens mellan de två provtagningsdatorna i juli användes för att bedöma kortsiktiga torråterhämtningsresponser för de två gräsarterna eftersom torka påfrestningar i hög grad hade lindrats under det andra provtagningsdatumet av en betydande nederbördshändelse för både den omgivande och förändrade behandlingar. A. gerardii och S. nutans återvinner statusen för bladvatten snabbt efter exponering för vattenunderskott (Fig. 1), därför gav det korta återhämtningsfönstret oss att minimera andra abiotiska och biotiska variabler. För S. nutans ändrades 1 639 transkript (exklusive 1 829 transkript med betydande mängdförändring till samverkan mellan provtagningsdatum och förändrad nederbörd) signifikant i överflöd mellan de två samplingsdatum, med 901 minskade (minskat uttryck på andra datum) och 738 ökade i överflöd. Emellertid ändrades endast 42 avskrifter (exklusive 3 898 utskrifter med betydande överflödesändring till samverkan mellan provtagningsdatum och förändrad nederbörd) betydligt i överflöd mellan torka (18 juli) och återhämtningsdatum (24 juli) för A. gerardii . Endast fem visade minskad överflöd på 24 juli-datumet jämfört med 18 juli-datumet, med tre avskrifter som antecknats (se bilaga S9). Det stora antalet transkript med förändrat överflöd i S. nutans distribuerades i ett brett spektrum av funktionella grupper, t.ex. celler, DNA, protein, RNA, signalering och stressgrupper (Fig. 4A, se bilaga S9). Antalet transkript med ökad eller minskad mängd var lika förutom i grupperna protein och RNA där överflödet av fler transkript ökades (fig. 4A). Fler utskrifter i grupperna av redox, stress och transport minskade i överflöd efter återhämtning från torka i S. nutans (47 mot 20). Dessa inkluderade transkript associerade med askorbatperoxidas, tioredoxin, HSP: er, DNA-J-liknande proteiner och metabolittransportörer (se bilaga S9). Transkript vars överflöd varierade i A. gerardii var bland grupperna såsom cell, protein, RNA och signalering, varav de flesta ökade i överflöd (fig. 4B).

Distributionen av transkript inom huvudfunktionella grupper enligt MapMan-genontologi med signifikant överflödeförändring i bladvävnad hos ( A ) Sorghastrum nutans och ( B ) Andropogon gerardii som svar på återhämtning från en torrperiod i mitten av juli. Positiva siffror anger antalet transkript med ökat överflöd (positiv lutning) och negativa siffror anger antalet transkript med minskat antal (negativ lutning).

Bild i full storlek

Jämförelse av transkriptionsnivåförändringarna under torråterhämtning i A. gerardii och S. nutans med de transkriptioner som var signifikant korrelerade med variation i LWP (säsongslång torka) visade att det inte fanns några transkript som ändrade överflöd på liknande sätt under båda långvariga förändrade jordar fuktighetsförhållanden och kortvarig torråterhämtning i A. gerardii . Emellertid påverkades överflödsnivåerna av 11 transkript av både långvarig torka och kortvarig återhämtning i S. nutans (se bilaga S9), och dessa sprids över ett antal funktionella grupper (se bilaga S9).

Validering av mikroarray-resultat med hjälp av qRT-PCR

Resultaten av mikroarray-experimentet bekräftades genom qRT-PCR av nio differentiellt uttryckta gener för varje art (CB833735, CD651724, CB380843, CB833708, CD568792, DV622645, CD001262, DV621372 för båda arter och DV551311 för A. gerardii ; CD001612 för S. nutans ; se bilaga S2). Konsekventa resultat erhölls i expressionsmönstret (ökat eller minskat i överflöd) av de utvalda klonerna. Även om en viss variation i de relativa mängderna av transkriptionsackumulering observerades mellan de två teknikerna var de två signifikant korrelerade totalt (p = <0, 0001, rho = 0, 481), inom A. gerardii- prover (p = <0, 0001, rho = 0, 559), och inom S. nutans- prover (p = 0, 0003, rho = 0, 418, se bilaga S10).

Diskussion

Som förutsagt fann vi att A. gerardii och S. nutans skilde sig signifikant i korrelationen av transkriptionella svar med säsongslång variation i T- blad och LWP, liksom deras kombinerade interaktion, under fältförhållanden. S. nutans hade ett större antal transkript som förändrades i överflöd övergripande, med majoriteten av transkript korrelerade med datum och variation i T- blad (fig. 2). Däremot visade A. gerardii liknande antal transkript som förändrade överflöd (både positiva och negativa) med variation i T- blad och den kombinerade variationen i T- blad och LWP, med få svar på LWP. Intressant nog hade provtagningsdatum den största effekten på både A. gerardii och S. nutans- transkript. Detta indikerar att båda arterna modifierar sitt genuttryck enligt förändrade abiotiska och biotiska förhållanden under hela växtsäsongen oavsett klimatbehandlingsbehandlingar. Även om detta är svårt att skilja från lövmognad och ontogeni i dessa växter, försökte vi kontrollera för detta genom att välja morfologiskt och utvecklingsmässigt liknande individer (vegetativt, var och en med 3-5 blad) vid varje provdatum inom varje behandling. Bland transkript korrelerade med T- blad- och LWP-interaktion minskade de flesta av dessa i överflöd för S. nutans , medan fler ökades i överflöd för A. gerardii (fig. 3). Under tideråtervinningsperioden i mitten av säsongen visade A. gerardii och S. nutans igen olika svar, under vilka nivåerna av tusentals transkript varierade i S. nutans , jämfört med mindre än 50 transkript med signifikant förändrade nivåer för A. gerardii (Fig. 4, tillägg S9), vilket antyder att S. nutans var mer känslig för torkaförhållanden och svarade mer på lindring från torka än A. gerardii . Upptäckten av differentiella korrelationer av utskriftssvar med T- blad och LWP, både säsongslångt och under en torråtervinningsperiod för mitten av säsongen, överensstämmer med tidigare forskning som visar bevis för differentiell känslighet för transkript svar på temperatur och vatten tillgänglighet i A. gerardii 9 och ekofysiologiska svar för samma individer av A. gerardii och S. nutans samplades samtidigt 37 och i andra experiment 30 .

Vi observerade också olika mönster av upp- och nedreglering, och olika funktionella grupper av transkript hittades förändrade i överflöd i A. gerardii mot S. nutans . Dessutom var det sällan överlappning mellan de två arterna i identiteten för transkript som svarade signifikant (Fig. 3; Bilaga S3, S4). Differentialreglering av flera funktionella grupper observerades mellan dessa två arter som svar på kombinationen av högre T- blad och lägre LWP (de flesta transkriptioner i A. gerardii hade ökat transkriptionsnivåer jämfört med reducerade mängder i S. nutans ), LWP (lägre LWP förknippat med ökat antal transkript endast i S. nutans ), T blad (högre T blad associerat med ökat transkript överflöd endast i S. nutans ) och torka-återhämtningsperioden (ökat transkriptmängd förknippat med ökad markfuktighet i A. gerardii ) . Dessa stora skillnader observerades främst i transkript involverade i olika kategorier av processer, såsom cell, glykolys, protein, redox, RNA, signalering, stress, transport. I motsats till vad vi förväntade oss observerade vi få svar av transkript relaterade till fotosyntes, och när det fanns signifikanta svar var dessa mest relaterade till variation i T- blad snarare än LWP. Andra studier har visat att fotosyntesrelaterade gener kan överrepresenteras som svar på återhämtning av torka i flera växtsystem 40 . Tidigare forskning med A. gerardii fann nedreglering av ett antal fotosyntesrelaterade gener till säsongslång torka 10 . Avsaknaden av respons av fotosyntesrelaterade gener i vår studie kan vara relaterad till den relativt subtila naturen hos de experimentella behandlingarna och bristen på extrem vatten- eller temperaturspänning under studieperioden.

De olika regleringsmönstren, särskilt med avseende på de gener som är involverade i stressrespons, tyder på att de två arterna kan använda olika strategier när de hanterar och / eller svarar på de ökande temperaturerna och vattenspänningen och deras kombinerade effekter i fältet. Även om ingen differentiell reglering av transkript involverade i stressigenkänning, såsom gener i ABA-syntesväg eller transkriptionsfaktorkaskader, hittades för de två arterna, upptäckte vi differentiell reglering av gener involverade i stressundvikande och de som är förknippade med förebyggande och reparation av skador. Exempelvis hittades transkript som kodar sackarossyntas, som är relaterat till osmotisk justering för stressundvikande 41, endast i ökat överflöd i samband med LWP i A. gerardii . Antioxidant-enzymer, såsom glutationreduktas och superoxiddismutas, och HSP: er spelar en viktig roll i stressrespons, med antioxidant-enzymer som vanligtvis är involverade i förebyggandet av skador 42 och HSP som är inblandade i reparation av skador genom att hjälpa till med proteinvikning och stabilisering 43 . I vår studie visade transkript som kodar för antioxidantenszymer och HSP: er en jämn ökning av svaret på ökande T- blad hos S. nutans , men inte A. gerardii . De ökade halterna av dessa två grupper av transkript som svar på ökande T- blad i S. nutans antyder att detta gräs kan uppleva skador förknippade med temperaturstress, medan A. gerardii kanske inte upplever stress eller kan reagera på stress på olika sätt, såsom genom acklimatisering 44 och osmotisk justering.

Transkriptionsfrekvensnivåer av akvaporiner förändrades också signifikant i S. nutans men inte i A. gerardii som svar på variationen i T- blad, där det i allmänhet ökades överflöd med ökningen av T- blad . Växtakaporiner, som fungerar som membranvattenkanaler för att öka vattenpermeabiliteten, är en grupp proteiner som allmänt anses vara involverade i stressundvikande 45 . Aquaporins, mestadels studerade i Arabidopsis, har förknippats med olika abiotiska stressresponser, inklusive vatten, näringsämne, kallt stress och andra biotiska spänningar. Regleringen av akvaporiner i spänningssvar är emellertid inkonsekvent i litteraturen. ABA och vattenstress visade sig öka mängden akvaporintranskript i vissa studier 46, 47, men sänker transkriptnivåerna i andra 47, 48 . Så vitt vi vet saknar studier av reglering av akvaporiner och deras undergrupper och isoformer som svar på uppvärmningen hos växter. Hur som helst, regleringen av aquaporiner i S. nutans men inte i A. gerardii antyder återigen att en av strategierna för S. nutans för att undvika temperaturstress kan vara att öka uttryckningsnivån för aquaporins, medan detta inte var fallet för A. gerardii .

Sammantaget antyder mönstren för transkriptionsfrekvensnivåer förknippade med T- blad och LWP, tillsammans med den ekofysiologiska prestanda hos båda arter 30, 37, att S. nutans är mer känslig och svarar på ökande temperaturer med det ökade transkriptsöverskottet av HSP: er, aquaporiner, superoxiddismutas och askorbatperoxidas. Däremot verkar A. gerardii mindre känslig för variationen i temperatur och vatten tillgänglighet i detta experiment. Ett liknande mönster i transkriptionsfrekvensförändringar observerades för det kortsiktiga torkehämtningsresponset för båda arterna. I S. nutans har ett stort antal transkript från flera funktionella grupper förändrats i överflöd, med liknande antal transkript ökade eller minskade transkriptets överflöd, medan många färre transkript ändrade i överflöd för A. gerardii . Vi kan inte dra slutsatsen vilken art som är mer lyhörd för kortvarig återhämtning från torka eftersom det inte är klart om båda arterna svarade i samma takt. Detta bör verifieras med mer detaljerade tidsförloppssvar från båda arterna på återhämtning från torka.

Växtstressrespons är en temporär process där stressen först erkänns och sedan antas olika strategier för att antingen undvika stressen eller svara på stressen genom att förhindra och / eller reparera skadorna. Jämförelse av förändringar i nivåer av specifika avskrifter under säsongslång vattenspänning och en kortsiktig torråterhämtningsperiod på mitten av säsongen visade att bland de 1 639 utskrifter förändrades i överflöd under torråtervinningsperioden och de 101 transkript som var relaterade till variationen av LWP för S. nutans var endast 11 vanliga mellan de två. På liknande sätt var bara 10% av generna vanliga när snabbt dehydratiserade (~ 6 timmar) kornrötter jämfördes med gradvis dehydratiserade (~ 7 d) kornrötter 49 . Detta beror delvis på olika genuttryckssvar på akut kontra kronisk stress 50, 51, 52 . I vår studie ökade stressen gradvis över tiden och omfattade en stor del av växtsäsongen. Detta kan ha möjliggjort anpassning av växter, vilket kan förklara det lilla antalet avskrifter som reglerats under hela växtsäsongen jämfört med det stora antalet avskrifter som reglerades under en kortvarig torkeåtervinningsperiod. För S. nutans , trots att tusentals avskrifter förändrats avsevärt i överflöd med återhämtning från torka, svarade många färre under den säsongslånga variationen i vattentillgänglighet i samband med förändrade nederbörd och uppvärmningsbehandlingar, och mycket få transkript var vanliga för de två typerna av stress.

I denna studie undersökte vi de transkriptionella profilerna för den samdominerande tallgräs prärien C4-gräsarter, A. gerardii och S. nutans , utsatta för varierande regnregimer och ökade temperaturer under fältförhållanden. Även om vår användning av heterolog hybridisering med cDNA-mikroarrayer från majs (som var den mest tillgängliga tekniken tillgängliga vid tidpunkten för experimentet) har begränsningar som härrör från sekvensdivergensen mellan fokalarten och modellarten 8, 18, 19, använde vi stränga kriterier för att minimera dessa. Först, under kvalitetskontrollprocessen, utesluts fläckar med signal / brusförhållanden på mindre än 10 från ytterligare analys för att minska inkluderingen av korshybridiseringsartifakter 53 . Som ett resultat av denna screening återstod ungefär 70% av transkripten med detektering ovanför bakgrunden för statistisk analys för båda arter (se bilaga S1), vilket antyder att heterolog hybridisering är möjlig för analys av transkriptreglering för dessa två arter utan att förlora generaliteten. För det andra var mikroarray-resultaten från nio transkript från varje art i allmänhet överensstämmande med artsspecifika qRT-PCR-resultat (se bilaga S10), vilket bekräftar uttrycksförändringarna som observerades med de heterologa hybridiseringarna. Dessutom upptäcktes ett antal väsentligt upp- eller nedreglerade gener som är gemensamma för stressrespons eller skada-reparation enligt MapMan-ontologi hos de två arterna som svarar på våra pålagda miljöspänningar. Detekteringen av dessa specifika transkriptförändringar ger förtroende för resultaten från heterologa hybridiseringar. Slutligen sökades cDNA-sekvenserna för majsmikroarray SAM1.2 (18862-sekvenser) som vi använde i detta experiment mot en icke-redundant transkriptdataset med A. gerardii och S. nutans (opublicerad data). Med ett E-värdeavbrott på <1E-10 hade ~ 75% och 73% av sonderna en eller flera träffar på A. gerardii respektive S. nutans transkripterade datauppsättningen. Detta motsvarar ungefär procenten av de hybridiserade särdragen till majs, med 75, 14% respektive 78, 60% för A. gerardii respektive S. nutans . Hybridiseringsdata antyder att det troligtvis finns bevarande av stresvarsgener över dessa tre arter. RNA-seq-tekniker kan ge ytterligare inblick i förändringar av genuttryck, inklusive transkripter bevarade över arter, såväl som artsspecifika transkript. Även om artsspecifika transkript kan ge insikt i unika anpassningar i dessa infödda gräs, är det mindre troligt att den antecknade funktionen för sådana transkript är känd.

Sammanfattningsvis dominerar de två fokalarterna i denna studie, A. gerardii och S. nutans , tillsammans med tallgräs prärieväxtsamhällen. De är nära fylogenetiska släktingar 32, 33 som i allmänhet anses vara ekologiskt och funktionellt ekvivalenta och på liknande sätt anpassade till höga värme- och torkaförhållanden. Men vår studie fann att dessa gräs skiljer sig väsentligt i sina transkriptionella svar på förändrade miljöförhållanden; dessa skillnader inkluderade antalet, mönstret och identiteten hos funktionella grupper av transkript med signifikanta förändringar i överflöd som svar på variation i bladtemperatur och bladvattenpotential. I synnerhet ökade transkript relaterade till stressrespons såväl som andra viktiga funktionsgrupper (cellfunktion, signalering, transport) i överflöd i S. nutans bladvävnad som svar på båda minskande tillgänglighet av vatten (t.ex. LWP under säsongen -lång stress) och ökande temperaturer. Lite överlappning visades mellan de två arterna i de typer av gener som reglerades i korrelation med variation i bladnivåstemperatur och vatteninnehåll. De olika känsligheterna hos A. gerardii och S. nutans för individuella stressfaktorer, vilket är i linje med differentiella känsligheter som observerats på ekofysiologiska nivåer, hela växter och samhällsnivåer (t.ex. 30, 34, 35, 37 ), antyder att dessa två är nära besläktade arter kan använda olika strategier för att hantera och / eller svara på miljöspänningar. De differentiella transkriptomiska svaren från dessa samdominerande arter kan påverka individuell prestanda (fysiologisk och tillväxt) och i slutändan få konsekvenser för strukturen och funktionen för ekologisystemet Tallgrass prairie, eftersom de två arterna bidrar oproportionerligt till ekosystemets funktion och struktur 27, 54 . Eftersom denna studie genomfördes på fältet ger den värdefull insikt om mekanismerna som dessa samdominerande arter använder i en naturlig miljö. Vi misstänker att ökad känslighet av S. nutans kan bidra till maladaptiv plasticitet 55, vilket kan leda till större dominans i samhället av A. gerardii . Det är okänt om urval för torkresistenta genotyper redan hade inträffat i detta fältförsök när individer provtagades, men det är bevis för val av genotyper på lång sikt 56 . Oavsett om selektion inträffade, anser vi att både plastisitet inom genotyper och olika svar genom utvalda genotyper kommer att vara viktigt för att förstå dessa arters svar på gradvis klimatförändring.

Med tanke på att nederbörds- och uppvärmningsbehandlingarna representerar relativt subtila förändringar i temperatur och vattentillgänglighet och att det ofta är svårt att skilja effekterna av temperatur kontra vattenstress, är nästa steg för att förstå hur dessa två gräsarter skiljer sig åt i sin känslighet för klimatförändringar att införa allvarligare temperatur- och vattenspänning vid ett antal behandlingsnivåer 57 och integrera proteomiska och metabolomiska analyser, tillsammans med tillämpningen av nästa generations sekvenseringstekniker (t.ex. RNAseq). Detta kommer att göra det möjligt för oss att förbättra vår mekanistiska förståelse av effekterna av ökande temperatur kontra vattenspänning på svar från de samdominerande gräserna och att avgöra om det finns trösklar i deras svar.

metoder

Webbplatsbeskrivning

Studien genomfördes på Rainfall Manipulation Plots (RaMPs), ett långsiktigt klimatförändringsfältförsök som har upprättats sedan 1998 och ligger vid Konza Prairie Biologiska station i nordöstra Kansas 58 . RaMPs-experimentet består av 12 platsfixerade skyddsrum (14 × 9 m) som ligger över 6 × 6 m inhemska tallgräs prärieplottar, som är indelade i fyra 2 × 2 m tomter, varav två har infraröda värmelampor installerade. The RaMPs shelters allow for the manipulation of growing season precipitation in either an ambient (rainfall immediately applied) or altered pattern (50% increase in time between ambient rainfall events). On average, the altered precipitation treatment reduces volumetric soil moisture by ~15% 58 . Warming treatments (unwarmed, warmed) are nested within the precipitation treatments and are applied year-round to achieve on average a + 2 °C increase in ambient air temperature 58 . Thus, both treatments result in moderate changes in water availability and temperature in the experimental plots.

Focal species and field sampling

We focused on the two co-dominant tallgrass prairie species, A. gerardii and S. nutans , both of which are C 4 grasses that reproduce primarily vegetatively via buds on belowground rhizomes 59, forming dense intermixed stands of tillers (individuals). As clones grow and spread, they sever their root and rhizome connections 60, and as a consequence individual tillers of sufficient distance apart are independent of each other. Because the RaMPs experiment is located in an annually burned area, tillers typically emerge in early-mid April (after burning) and grow vegetatively until mid-July/August when some (but not all) individuals initiate flowering 61 . Individuals typically increase in size vegetatively from mid-Apr to mid- to late-June (unpubl. data). We did not control for plant genotype due to an interest in average species-level response, although this approach can create additional noise in transcriptional response.

We sampled a single tiller of each species within the control (unwarmed) and a randomly selected warmed subplot in paired (based on adjacency) ambient and altered RaMPs. Sampling occurred five times during the growing season in 2006: June 1, June 7, July 18, July 24 and August 22. June 1 was chosen to capture early growing season conditions when water and temperature stress are typically minimal. However, due to less than ideal conditions (lower PAR (photosynthetically active radiation)), June 7 also was chosen to capture early growing season conditions with higher light availability. The two dates in July were chosen specifically to capture a drought and recovery period; the first (July 18) when soil moisture was low and the second (July 24) five days after rainfall events were applied to both the altered and ambient precipitation treatments. Finally, August 22 was chosen to capture late growing season conditions. For each sampling date, morphologically similar vegetative (non-flowering) tillers (3–5 fully expanded leaves) of each species were identified in each of the subplots. At each sampling date, one individual of each species was selected from each replicate plot subjected to the precipitation (n = 2, ambient, altered) and warming (n = 2, control, warmed) treatments, for n = 2 species × 4 treatment combinations × 3 replicates per treatment combination = 24 individuals per five sample periods, n = 120 total. Because timing discrepancies may affect gene expression 12, leaf tissue was collected from individuals located in paired ambient and altered RaMPs within five minutes of each other. The first or second fully expanded leaf was randomly selected for genomic analysis from each individual to ensure leaves had finished developing but were not old enough to be senescing or have reduced cellular activity. The entire leaf was clipped and immediately flash-frozen and stored in liquid nitrogen until brought to the laboratory. Immediately after collection of the first leaf, we measured leaf surface temperature (T leaf ) on the remaining leaf, as part of intensive physiological measurements reported elsewhere (see Nippert et al . 37 ). The whole leaf was then collected for determination of leaf water potential (LWP) using a Scholander-type pressure chamber (PMS Instruments, Inc., Corvallis, OR, USA). LWP reflects the xylem pressure required to continue the flow of water from roots to leaves, where more negative water potentials generally represent plant water stress. We focused on T leaf as an indicator of the warming treatment and temperature stress, as it is highly correlated with canopy temperature 37 and was significantly elevated in response to the warming treatment (Fig. 1A, B). Focusing on LWP as an indicator of the precipitation treatment and water stress was due to its highly correlation with soil water content at 25, 50 and 75 cm (r = 0.64, 0.61 and 0.57, respectively, with p-values < 0.0001), which was measured on a bi-weekly basis with neutron probes located in the warmed and unwarmed subplots within each RaMP. In addition, LWP was significantly reduced with the altered precipitation treatment (Fig. 1C, D). The ranges of both T leaf and LWP captured included levels considered stressful and potentially inhibitory for ecophysiology for the two species 30 .

Mixed-model ANOVAs were implemented in SAS (SAS/STAT Software version 9.1.3, SAS Institute, Cary, NC, USA) to assess the effects of sampling date (five dates during the growing seaon) and the precipitation (ambient, altered) and warming (control, warmed) treatments on T leaf and LWP between the two grass species (Fig. 1). Precipitation was treated as a fixed effect, with warming treated as a random effect nested within precipitation. Sampling date was treated as a random effect.

RNA preparation and microarray hybridization

Leaf tissue samples were stored in an −80 °C freezer for less than one year prior to RNA extraction. Total RNA was extracted from each of the 240 leaf samples (two species) using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 62, and purified with the RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). RNA quantity was measured by a NanoDrop spectrophotometer (Nanodrop products, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). The verification of RNA quality, preparation of cDNA, and subsequent steps leading to hybridization and array scanning were performed by the Keck Biotechnology Resource Facility at Yale University (//keck.med.yale.edu/). We used maize spotted cDNA arrays (SAM 1.2, GEO platform GPL4521) produced by the Center for Plant Genomics at Iowa State University for hybridization. The arrays included 15, 680 maize cDNA clones (14, 118 informative) isolated from maize ear tissue. The sample pairing for microarray hybridization followed Design C of Milliken et al . 63, in which pairs were assigned within a level (ambient vs. altered precipitation) of the whole plot treatment and across levels (unwarmed vs. warmed) of the subplot treatment.

Quality control of heterologous hybridizations

In total, there were hybridizations for 47 leaf samples of A. gerardii and 49 leaf samples of S. nutans . Some samples had to be discarded due to low RNA quality. Array image data were collected using GenePix software (Version 6, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) and normalized using the ratio of medians. Prior to the normalization, features with obvious abnormality and saturated signal were flagged as uninformative and excluded from statistical analysis. Because the signal intensity of some spots was low as a consequence of the heterologous hybridization, stringent criteria concerning signal to noise ratios were applied during quality control of the images. Features with signal to noise ratios (for both channels, 635 nm and 532 nm) less than 10 were excluded from further normalization. After quality control (see Appendix S1 in Supporting Information), there were 10, 607 features in total for further analysis for A. gerardii , while 11, 095 features were included for S. nutans , among which 10, 329 were common for both species. Considering the different hybridization efficiencies (Appendix S1), we focused the following statistical analysis on only the common features of A. gerardii and S. nutans , discarding 278 unique transcripts from A. gerardii and 766 from S. nutans .

Statistical analysis of microarray data

The microarray data were analyzed for each species separately using high-throughput regression 9 to assess how gene expression varied among individual plants as a consequence of altered precipitation and temperatures over the entire growing season. Specifically, multiple regression analysis was used to capture the linear relationship between gene expression levels, as the dependent variable, and T leaf, LWP, together with their interaction, and date (representing the five sampling dates) as the independent variables. The inclusion of date was used to distinguish responses of the transcriptome that are due to changes in temperature or water availability from those due to sampling time. Prior to regression analysis, the microarray data were normalized following Travers et al . 9 .

Regression analysis was conducted for each species separately with the residuals from the normalization analysis. Data was subset so only the common hybridized features (10, 329) represented by all five sampling dates were included in the regression analyses: 10, 309 (99.8% of the common hybridized features) features in total for both species. Statistical significance of either positive (increased transcript abundance associated with higher T leaf or decreased transcript abundance associated with lower LWP) or negative (decreased transcript abundance associated with higher T leaf or increased transcript abundance associated with lower LWP) slopes was tested against the null hypothesis that the slope was zero. Significant differences in the number of transcripts with abundance change in response to T leaf, LWP, their interaction, and sampling date between the two species were tested by Pearson χ 2 test.

To assess genes responding to drought vs. recovery, we subsetted the data focusing on the two sampling dates in July. Specifically, mixed-model ANOVA was used to assess alteration of transcript levels under drought conditions (July 18) vs. drought recovery (July 24). There were 8, 662 and 10, 776 (82% and 97% of hybridized features) transcripts analyzed for A. gerardii and S. nutans respectively, among which 7869 features were common for both species. Similarly, we focused on these common features in the drought-recovery analysis. The normalized expression data (residuals from the normalization analyses above) were used as the dependent variable, with precipitation and warming treatments, sampling date and their interactions as independent variables (fixed effects), and RaMP as random effect.

The normalization analyses, high-throughput regression analyses, mix-model ANOVA for drought recovery evaluation, and Pearson χ 2 test were implemented in SAS (version 9.1.3). For regression analyses and mix-model ANOVA, statistical significance was further evaluated using the q-statistic to control the experiment-wise false discovery rate (FDR) 64 . A q-value of less than 0.05 was chosen to identify significant changes in transcript levels. The transcripts with significant abundance changes were grouped into major functional groups using an extension of MapMan gene ontology 65 to maize using protein sequence identity to Arabidopsis.

Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

We used qRT-PCR to validate the microarray results for the same RNA samples used in the heterologous hybridization (see Appendix S2). Because leaf tissue of A. gerardii and S. nutans was often limited and a relatively large amount of RNA was utilized for the microarray hybridizations, RNA samples were not available for qRT-PCR analysis for all individuals or for all sampling dates. Therefore, we focused on only those sampling dates in which there were adequate samples available for a subset of individuals (June 7 and July 18 for A. gerardii , June 7 and August 22 for S. nutans ). Nine annotated transcripts with significant response to variation in LWP or T leaf according to microarray analysis and which have been shown to be involved in stress response (eg, superoxide dismutase, HSP 90) were selected and cloned (Appendix S2). Expression levels of these transcripts were analyzed for each species with qRT-PCR, with β-tubulin and Elongation factor (EF) 1α as the internal standard for A. gerardii and S. nutans , respectively. The range of the primer amplification efficiency was between 90% and 98%, and correlation coefficiency was between 99.1% and 100.0% as determined by serial dilution of cDNA templates.

ytterligare information

How to cite this article : Smith, MD et al . Gene expression patterns of two dominant tallgrass prairie species differ in response to warming and altered precipitation. Sci. Rep . 6, 25522; doi: 10.1038/srep25522 (2016).

anslutningar

Gene Expression Omnibus

  • GSE35492

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.