Gata3 undertrycker metastas och modulerar tumörens mikromiljö genom att reglera uttrycket microrna-29b | naturcellbiologi

Gata3 undertrycker metastas och modulerar tumörens mikromiljö genom att reglera uttrycket microrna-29b | naturcellbiologi

Anonim

ämnen

  • Bröstcancer
  • Cancermikromiljö
  • Metastas
  • miRNA

Abstrakt

Trots framstegen i vår förståelse av bröstcancer har patienter med metastaserad sjukdom dåliga prognoser. GATA3 är en transkriptionsfaktor som specificerar och upprätthåller luminal epitelcells öde hos mammär, och dess uttryck går förlorad vid bröstcancer, vilket korrelerar med en sämre prognos hos mänskliga patienter. Här visar vi att GATA3 främjar differentiering, undertrycker metastas och förändrar tumörens mikromiljö i bröstcancer genom att inducera mikroRNA-29b ( miR-29b ) uttryck. Följaktligen berikas miR-29b i luminala bröstcancer och förlust av miR-29b, även i GATA3-uttryckande celler, ökar metastasen och främjar en mesenkymal fenotyp. Mekaniskt hämmar miR-29b metastas genom att inrikta sig på ett nätverk av pro-metastatiska regulatorer som är involverade i angiogenes, kollagenombyggnad och proteolys, inklusive VEGFA , ANGPTL4 , PDGF , LOX och MMP9 , och inriktar ITGA6 , ITGB1 och TGFB , varigenom indirekt påverkar differentiering och epitel. formbarhet. Upptäckten att en GATA3-miR-29b-axel reglerar tumörens mikromiljö och hämmar metastas öppnar möjligheter för terapeutisk ingripande i bröstcancer.

Huvudsaklig

Ett av de klassiska kännetecknen för cancer är tumörcells förmåga att invadera och metastasera 1 . Metastas är en flerstegsprocess som inkluderar extracellulär matrixombyggnad, rekrytering av blodkärl, tumörcells inträde och utgång från cirkulation och överlevnad vid ett avlägset organ 2 . Tumörens mikromiljö erkänns alltmer som en viktig bidragare till malign progression och metastas 3, 4 . Förutom att ombyggnad av mikromiljön för att underlätta metastas, aktiverar cancerceller också embryonala morfogenesregulatorer för att genomgå epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) och stänga av differentieringsprogram 5, vilket tillåter cancerceller att få rörlighet, ändra cellvidhäftning och få stam -liknande egenskaper 6 .

Till skillnad från EMT är differentiering associerad med mindre aggressiva tumörer och bättre prognos. GATA3 är en transkriptionsfaktor som specificerar och upprätthåller luminal epitelcelldifferentiering i bröstkörteln 7, 8, 9 . Förlust av GATA3 är involverat i bröstcancerpatogenesen 8, 9, 10 och en låg GATA3-nivå är associerad med dålig prognos 11, 12, 13 . Mutationer i GATA3 som minskar eller avskaffar dess DNA-bindande förmåga finns ofta i mänskliga bröstcancer, och GATA3 befanns nyligen vara en av tre gener muterade i> 10% av alla bröstcancer 14, 15 . I flera musmodeller av bröstcancer korrelerar Gata3- uttrycket omvänt med tumörprogression och metastaser: förlust av GATA3 sammanfaller med förlust av differentiering, övergången från adenom till karcinom och början av tumörspridning. Återintroduktion av Gata3 i MMTV-PyMT-karcinom inducerar differentiering, undertrycker spridning 10 och minskar tumörinitierande kapacitet 16 . Hur GATA3 inducerar tumördifferentiering och hämmar spridning och vilka molekylära och cellulära händelser som ligger nedströms GATA3 är emellertid okända.

MikroRNA (miRNA) är små, icke-kodande RNA som modulerar genuttryck post-transkriptionellt, antingen genom att hämma translation eller genom att orsaka nedbrytning genom bindning till de 3 'otranslaterade regionerna (UTR: er) för mål-messenger-RNA (ref. 17). miRNA är både positiva och negativa regulatorer för cancermetastas 18, 19, 20 . Företräde för GATA-medierad miRNA-reglering har nyligen fastställts: GATA1 främjar erytrocyttdifferentiering genom miR-451, vilket antyder att GATA-faktorer använder miRNA för att fatta beslut om cellens öde 21 . I bröstkörtlarna främjar miRNA som let-7 mammar-differentiering och reglerar självförnyelse 22, 23 . Men miRNA nedströms GATA3 har ännu inte undersökts.

I denna studie förutspådde vi att GATA3 samordnar genuttrycksnätverk involverade i metastaser genom miRNA-medierade mekanismer. Vi undersökte molekylvägarna genom vilka GATA3 reglerar differentiering och metastas och identifierade miR-29b, en miRNA nedströms GATA3 som modulerar tumörens mikromiljö, metastas och epitelplastisitet.

RESULTAT

GATA3 undertrycker lungmetastaser från bröstcancer från människa och mus

Mänskliga bröstcancer klassificeras i flera undertyper som är prognostiska för resultat 24 . Kliniskt är basala, trippelnegativa bröstcancer mer aggressiva och dåligt differentierade 25 . I mänskliga bröstcancerlinjer 26 uttrycks GATA3 på en högre nivå i luminal kontra basal A- och basal B-subtyper (fig. 1a), i överensstämmelse med dess luminallokalisering (kompletterande figur S1a).

( a ) GATA3- expressionsnivåer från basal A, basal B och luminala bröstcancercellinjer. Mikroarray-datauppsättning anpassas från ref. 25. ** envägsanalys av varians P <0, 001. ( b ) Relativa Gata3- nivåer i 4T1-celler ± Gata3 mätt med qPCR ( n = 8 oberoende erhållna biologiska prover, ** P <0, 001). ( c - g ) BALB / c-möss injicerades med 4T1-celler ± Gata3 i den inguinala bröstfettkudden. Tumörer fick växa i tre veckor och mättes ( c ) och immunohistokemisk färgning för GATA3 i primära tumörer utfördes ( d ). Lungorna samlades och undersöktes med avseende på metastaser ( e ). ( n = 12 oberoende möss per grupp, * P <0, 01.) Representativa H&E-bilder ( f ) och immunohistokemisk färgning för GATA3 ( g ) i lungmetastaser visas. ( h, i ) CD31 immunohistokemisk medelintensitet ( h ) och F4 / 80 immunohistokemisk medelintensitet ( i ) i primära 4T1 ± Gata3-tumörer. (Värden härrörande från n = 8 oberoende tumörer per grupp och 10 slumpmässiga fält per tumör.) Representativa bilder visas under graferna ( * P <0, 05). ( j ) BALB / c-möss injicerades iv med 4T1-celler ± Gata3. Bioluminescensavbildning utfördes på dag 14 efter injektion och möss avlivades omedelbart efter avbildning ( n = 10 oberoende möss per grupp). ( k ) GATA3 immunohistokemisk färgning av 4T1 ± Gata3 experimentell iv injicerade lungmetastaser. ( l ) BALB / c-möss saminjicerades iv 1: 1 med kontrollceller märkta med RFP (4T1-RFP) och Gata3-uttryckande celler märkta i GFP (4T1-Gata3 – GFP). Möss avlivades på dag 12 efter injektion och procentsatserna av RFP- och GFP-positiva celler bestämdes med flödescytometri ( n = 12 oberoende möss per grupp; ** P <0, 002, parat t- test). Data rapporteras som medelvärde ± sem Skalstänger, 200 μm ( d, f, g, k ) och 100 μm ( h, i ).

Bild i full storlek

Vi överuttryckte Gata3- mus i basala 4T1-celler för att utvärdera metastas i en immunkompetent modell och human GATA3 i basala MDA-MB-231-celler (benämnd MDA231), linjer med låg endogen GATA3 (fig. 1b och kompletterande figurer S1b, c och S2a, b). Ortotoptransplantation av stabilt transducerade 4T1-Gata3-celler till BALB / c-möss gav upphov till tumörer som var lika stora som 4T1-kontrollceller, men visade en signifikant minskning av antalet och storleken på spontana lungmetastaser (Fig. 1c – f). Intressant nog, medan primära 4T1-Gata3-tumörer uttryckte GATA3, var lungmetastaserna mestadels GATA3-låga (fig. 1 g och kompletterande fig. Sd), vilket tyder på att metastatiska celler förlorade GATA3-uttryck. Vi observerade inte någon skillnad i proliferation in vivo eller i kultur (Kompletterande Fig. S1e, f), vilket antydde att GATA3 orsakar inga inneboende defekter på livskraft, och att skillnaden i metastas beror på in vivo mikro-miljöinteraktioner. I själva verket uppvisade 4T1-Gata3-tumörer signifikanta minskningar i tumörvaskulatur och makrofaginfiltrat (Fig. 1h, i). I överensstämmelse med detta fann vi en tvåfaldig minskning av serum-VEGF-A-nivåer i möss som bär ortotiska 4T1-Gata3-primära tumörer (kompletterande figur S1g), vilket tyder på att GATA3 reglerar VEGF-A in vivo .

Mänskliga MDA231-GATA3-celler injicerade i nakna möss bildade mindre tumörer än MDA231-Kontrollceller, med minskad tumörvaskulatur och makrofaginfiltrat och utsöndrade mindre VEGF-A (kompletterande fig. S2c – g). MDA231-GATA3-celler visade ingen skillnad i proliferation i kultur eller i livskraftiga tumörområden, men uttryckte högre nivåer av apoptotiska markörer och uppvisade mer nekros in vivo (kompletterande fig. S2h – k). Dessa data stöder konceptet att mikro-miljöinteraktioner är kritiska för GATA3-medierad metastasinhibition.

Därefter undersökte vi om GATA3 endast begränsar tumörcells förmåga att sprida sig från det primära stället, eller om det också påverkar de senare stadierna av metastas, till exempel kolonisering. Följaktligen inokulerades vi cellerna direkt i cirkulationen genom intravenös (iv) injektion (genom svansvenen) för att bilda experimentella metastaser. För både 4T1- och MDA231-celler minskade GATA3 lungmetastaser (fig. 1j och kompletterande fig. S2l). Vi validerade att dessa experimentella metastaser upprätthöll GATA3-överuttryck (Fig. 1k). Sålunda hämmar fördröjd GATA3-expression också de sena stegen av metastas.

För att bestämma om GATA3-uttryckande celler kan konkurrera med kontrollceller märkte vi 4T1-celler med RFP (kontroll) eller Gata3 – GFP, blandade dem i ett 1: 1-förhållande och saminjicerade dem iv. Efter 2 veckor fann vi att 4T1 -Gata3 – GFP-celler stod för endast ∼ 20% av de totala metastatiska cellerna i lungan, medan 4T1-RFP-celler stod för ∼ 80% (Fig. 1l). Dessa resultat indikerar att GATA3 ger en konkurrensnackdel in vivo .

GATA3 främjar differentiering och begränsar cellmigrering

Eftersom GATA3 reglerar luminalens öde, försökte vi avgöra om GATA3-medierad metastasundertryckning innebär celldifferentiering. I tvådimensionell cellodling hade MDA231-kontrollceller en mer spindelformad, mesenkymal morfologi, medan MDA231-GATA3-celler uppvisade en mer epitelial fenotyp (fig. 2a). I en sårskrapsanalys migrerade MDA231-kontrollceller som enstaka celler för att stänga såret, medan MDA231-GATA3-celler migrerade som ett kollektivt ark (kompletterande fig. S3a). I tredimensionell (3D) Matrigelkultur, som bättre efterliknar fysiologiska förhållanden 27, 28, var GATA3-överuttryckande MDA231 och Hs578T mänskliga basceller mindre invasiva än deras kontroller (Fig. 2b och kompletterande fig. S3b – d och videor S1 och S2 ).

( a ) Faskontrastbilder av MDA231-celler ± GATA3 i 2D-kultur. ( b ) Faskontrastbilder av MDA231-celler ± GATA3 inbäddade i 3D Matrigel. (Se även kompletterande videor S1 och S2.) ( C ) Relativt uttryck av epitelmarkörer ( CDH1 , KRT8 , KRT18 ), mesenkymala markörer ( FN1 , SNAI1 , SNAI2 , ZEB1 , ZEB2 , VIM , HMGA2 , RANK ) och stora inflammatoriska och stamiska -associerade väggener inklusive NF-KB ( STAT3 , RANK ), Wnt ( FZD1 ) Igelkotten ( Gli3 ) och Notch ( JAG1 ). ( n = 8 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05 för alla gener.) ( d - f ) Flödescytometri-analys av cellytemarkörerna EpCAM och CD49f i MDA231-celler ± GATA3 ( d ) och kvantifiering ( e ) av n = 8 oberoende experiment, ** P <0, 001. Ett representativt histogram för CD49f-uttryck visas i ( f ). ( * P <0, 01 genom sannolikhetsbinning χ 2- test.) ( G, h ) Antal tumörsfärer från enstaka MDA231-celler ± GATA3 ( * P <0, 02; g ) och representativa faskontrastbilder ( h ) av n = 3 oberoende experiment utförda i tre exemplar. Uppgifterna rapporteras som medelvärde ± sem Alla skalfält, 100 μm.

Bild i full storlek

Med användning av kvantitativ PCR (qPCR) fann vi att GATA3 ökade expressionsnivån för luminalgener och minskade expressionsnivån för basal, EMT, stamness och inflammatoriska gener (fig. 2c och kompletterande fig. S3e, f). Trots dessa genuttrycksförändringar var 4T1-Gata3-celler morfologiskt lika med 4T1-kontrollceller (kompletterande fig. S3g). GATA3 inducerade också basalceller för att anta en fenotyp av luminalcellytan kännetecknad av minskad CD49f (integrin a6) och ökat EpCAM-uttryck 29 (fig. 2d – f). Vidare bildade MDA231-GATA3- och 4T1-Gata3-celler färre, mindre och mindre invasiva tumörsfärer från enstaka celler (fig. 2g, h och kompletterande fig. S3h). Sammantaget indikerar dessa resultat att GATA3 främjar ett luminaldifferentieringsprogram och motsätter sig basal / EMT-tillståndet.

GATA3 främjar miR-29b- uttryck

Förutom de cellintresse effekterna av GATA3 på differentiering, blev vi fascinerade av iakttagelsen att GATA3-uttryckande tumörer hade reducerat serum VEGF-A och tumörvaskulatur. VEGFA- promotorn saknade emellertid tydliga GATA3-bindande ställen, och GATA3 minskade inte aktiviteten hos en luciferasreporter innehållande VEGFA- promotorn (kompletterande figur S3i). Vi resonerade därför att GATA3 reglerar VEGFA och kanske andra pro-metastatiska gener indirekt genom miRNA och genomförde en skärm i MDA231-celler ± GATA3 med qPCR-miRNA-arrayer. Av 88 utvärderade miRNA var mi-29b den mest uppreglerade miRNA i MDA231-GATA3-celler (fig. 3a, b och kompletterande tabell S1), och expressionsnivån för miR-29b ökades också i Hs578T-GATA3-celler (kompletterande fig. S4A). Familjen miR-29 består av tre medlemmar med samma utsädessekvens: miR-29a, miR-29b och miR-29c (kompletterande fig. S4b). Vi fann också att miR-29a och miR-29c ökades med GATA3 (kompletterande figur S4c), varvid miR-29a var ∼ 400 gånger rikare än miR-29c vid basalnivåer.

( a, b ) Åttionåtta miRNA screenades med användning av qPCR-miRNA-matriser i MDA231-celler ± GATA3 ( a ) och uttrycket miR-29b validerades ytterligare med TaqMan qPCR ( b ). ( n = 8 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05.) ( c ) MDA231-celler samtransfekterades med en miR-29a / b1-Luc-reporter och pcDNA-EGFP (kontroll) eller ökande mängder pcDNA-GATA3. Brandlyssiferas normaliserades till Renilla luciferas och plottades relativt kontrollen. ( n = 5 oberoende experiment utförda i tre exemplar, * P <0, 05.) ( d ) MDA231-celler samtransfekterades med pcDNA-eGFP eller pcDNA-GATA3 och miR-29a / b1 – Luc-reportrar innehållande GATA-platsdeletioner. Den icke-muterade (WT) reportern användes som kontroll. Brandlyssiferas normaliserades till Renilla luciferas och plottades relativt kontrollen. ( n = 3 oberoende experiment utförda i tre exemplar, * P <0, 05.) ( e, f ) Relativ TGF-ß – Luc-reporteraktivitet ( e ) och NFκB – Luc-reporteraktivitet ( f ) i MDA231-celler ± GATA3, med och utan TGF-ß1, sRANKL eller TNF-a-stimulering. ( n = 5 oberoende experiment utförda i tre exemplar, * P <0, 05.) ( g, h ) Relativt miR-29a, miR-29b och miR-29c-uttryck i primärt humant basalliknande, HER2, luminal A och luminal B bröstcancer ( g ) och i primär humant östrogenreceptor (ER) -positiva och negativa tumörer ( h ). Mikroarray-datauppsättning anpassas från ref. 32. ( n = 93primär brösttumörprov, * Kruskal – Wallis teststatistik, P <0, 05.) ( I ) Relativt miR-29a, miR-29b och miR-29c uttryck i primär musbasala och luminala bröstcancer. Mikroarray-datauppsättning anpassas från ref. 36. ( n = 41 primära tumörer från enskilda möss och 5 normala bröstkörtlar, *** P <0, 001.) ( J ) Relativt miR-29b-uttryck i 67NR, 168FARN, 4TO7 och 4T1-celler, med metastatisk förmåga som visas nedan. Mikroarray-datauppsättning anpassad från ref. 37. ( k ) Relativ Gata3- och miR-29b-uttryck i primära normala mammala epitelceller, adenom- och karcinomceller från MMTV-PyMT-möss, med metastatisk förmåga som visas nedan. ( n = 6 oberoende erhållna biologiska prover per grupp, * P <0, 05.) Data rapporteras som medelvärde ± sem

Bild i full storlek

Promotorn miR29a / bl , som tidigare identifierats 30, innehåller tre GATA3-bindande ställen (kompletterande fig. S4d). GATA3 ökade aktiviteten hos miR29a / b1- promotorns reporter (fig. 3c) och att radera GATA-platserna minskade GATA3-medierad reporterinduktion, vilket visade att dessa platser är nödvändiga och funktionella (fig. 3d).

Som tidigare studier visade att miR-29b är negativt reglerad av TGF-p och NF-KB (refs 30, 31, 32) undersökte vi också om GATA3 hämmar TGF-p- och NF-kB-vägarna, och därmed reglerade miR-29b indirekt. I själva verket inhiberade GATA3 TGF-p- och NF-KB-reporteraktiviteter och dämpade TGF-p-inducerad EMT och komponenter i TGF-p-vägen transkriptionellt (fig. 3e, f och kompletterande fig. S4e – g). Stimulering med rekombinant TGF-p, TNF-a eller sRANKL minskade miR-29a och miR-29b nivåer i kontroll, men inte GATA3, celler (Kompletterande Fig. S4h, i). Således inducerar GATA3 expression av miR-29b direkt (genom att binda GATA-platserna på promotorn) och indirekt (genom att hämma TGF-p- och NF-KB-vägarna).

miR-29-uttryck berikas i mer differentierad bröstcancer och normala luminalepitelceller

Vi undersökte om miR-29 korrelerar med mer differentierade bröstcancer, som är förknippade med bättre patientresultat 12 . I en miRNA-datauppsättning av 99 primära humana brösttumörer 33 var nivåerna för alla tre miR29-medlemmarna högre i luminala och östrogenreceptorpositiva (ER +) tumörer (Fig. 3g, h). Dessutom associerades miR-29c med mer gynnsamma prognoser i en metaanalys av över 1 000 bröstcancer 34 och med luminal differentiering i en oberoende datasats med över 100 mänskliga brösttumörer 35 .

Vi använde sedan en miRNA-datauppsättning av musbrösttumörer 36 och fann att miR-29-medlemmar uttrycktes på högre nivåer i luminal jämfört med basalmodeller (Fig. 3i). I normala epitelceller som isolerats från musens bröstkörtlar, uttrycktes alla miR-29-medlemmar vid högre nivåer i luminalfraktionen (kompletterande fig. S5a – c).

Därefter undersökte vi om miR-29b är omvänt relaterat till metastaserande förmåga. Med användning av en datauppsättning av syngena cellinjer med varierande metastatisk kapacitet 37, 38 fann vi att uttrycket av miR-29b var lägst i celler med de högsta metastatiska kapaciteterna (fig. 3j och kompletterande fig. S5d). I MMTV-PyMT-modellen, som härmar progressiva stadier av human luminal bröstcancer 39, hade adenom- och karcinomceller minskat uttryckningsnivåerna för Gata3 och miR-29b jämfört med normalt epitel (fig. 3k), med de lägsta nivåerna i karcinomstadiet sammanfallande med metastaser. Tillsammans visar dessa resultat att miR-29- uttryck korrelerar med mer gynnsamma resultat, mer differentierade fenotyper i normala celler och cancerceller och reducerad metastatisk potential.

miR-29b främjar och upprätthåller luminaldifferentiering

Därefter undersökte vi om miR-29b främjar luminalegenskaper. MMTV-PyMT-tumörer blir mindre differentierade under tumörprogression 39 . Stabilt överuttryck av miR-29b i en primär cellinje härledd från ett sent stadium MMTV-PyMT-karcinom resulterade i en mer epitelial fenotyp, högre luminalmarkör och lägre basalmarköruttrycksnivåer (Fig. 4a, b). Dessutom främjade miR-29b förgrening av PyMT-cellaggregat i 3D Matrigel (fig. 4c), ett särdrag hos normal greningsmorfogenes 40 .

( a ) Faskontrastbilder av PyMT-celler ± miR-29b i 2D-kultur. ( b ) Relativt uttryck av luminala ( Krt8 , Esr1 och Gata3 ) och basala ( Krt14 ) epitelmarkörer i PyMT-celler ± miR-29b med qPCR ( n = 6 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05 för alla gener.) ( c ) Faskontrastbilder av PyMT ± miR-29b-aggregat inbäddade i 3D Matrigel. ( d ) Faskontrastbilder av MDA231-celler ± Zip29-knockdown. ( e ) Flödescytometri-analys av CD49f (integrin a6) och CD29 (integrinPi) cellytuttryck i MDA231-celler ± Zip29. Representativa histogram av n = 5 oberoende experiment ( * P <0, 01 genom sannolikhet binning χ 2 test). ( f ) Faskontrastbilder av HMLE-celler ± Zip29. ( g ) Representativ flödescytometri-analys av cellytan CD24 och CD44-expression av HMLE-celler ± Zip29. ( n = 5 oberoende experiment.) ( h ) Relativt uttryck av epiteliala och mesenkymala markörer i HMLE-celler ± Zip29 med qPCR. ( n = 6 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05.) ( i ) Western blot-analys av fosfo-Smad3, vimentin och aktin i HMLE-celler ± Zip29. ( j ) Flödescytometri-analys av CD44 hi / CD24 låg population i HMLE-celler ± Zip29 och ± LY-364947. ( n = 4 oberoende experiment, * P <0, 05.) Data rapporteras som medelvärde ± sem Alla skalfält, 100 μm. Oklippta bilder av blotting visas i tilläggsfiguren S9a.

Bild i full storlek

Vi undersökte sedan om förlust av miR-29b inducerar en de-differentierad, mesenkymal fenotyp. Vi genererade miR-29b-knockdown-celler med hjälp av miR-Zip29b lentivira, som stabilt knockdown endogena miRNA. Även om nivåerna för miR-29b minskade som förväntat observerade vi också minskningar i nivåerna för miR-29a och miR-29c, förmodligen på grund av deras liknande sekvenser (Kompletterande figur S6a, d). MDA231-Zip29-celler var mer långsträckta, utskjutande och spindelliknande, uttryckte lägre GATA3 och hade ökade nivåer av CD49f och CD29 (fig. 4d, e och kompletterande fig. S6b), två markörer för basal / stamcellpopulationen som har miR. -29b-bindande platser. Förlust av miR-29b i mus 4TO7-celler orsakade också en spindelliknande morfologi och ökade mesenkymala markörnivåer (kompletterande fig. S6c, d).

Vi utökade våra resultat till normala humana mammary celler (HMLE), som uppvisar fenotypisk plasticitet in vitro 6 . HMLE-Zip29-celler var mer långsträckta och spindelliknande och hade ökade mesenkymala och minskade epitelmarköruttrycksnivåer. EMT-programmet har tidigare kopplats till stamliknande drag 6 . Förlust av miR-29b ökade CD44 hi / CD24 låga stamcell-anrikade fack och ökade nivån av stamcellmarköruttryck (Fig. 4f – i och kompletterande Fig. S6e, f). Förlust av miR-29 ökade också basal- / stamcellmarkörer i PyMT- och 4T1-celler (kompletterande fig. S6g – j).

HMLE-Zip29-celler hade högre basala nivåer av fosfo-Smad3 (fig. 4i), vilket antyder att miR-29b-nedslagning ökar okontrollerad TGF-p-signalering, vilket främjar EMT. I överensstämmelse med detta, inhiberar TGF-p-signalering med användning av LY-364947 i HMLE-Zip29-celler reverserade den ökade CD44 hi / CD24- låga populationen (Fig. 4j). Sammantaget indikerar dessa resultat att miR-29b främjar differentiering, och förlust av miR-29b orsakar de-differentiering och ökar nivån av mesenkymal marköruttryck som är karakteristisk för ett förfäderliknande tillstånd, som åtminstone delvis medieras av en ökad nivå av TGF-p-signalering.

miR-29b nedreglerar pro-metastatiska gener som modifierar tumörens mikromiljö och indirekt reglerar epitelplastisitet

Vi använde prediktionsalgoritmer för att generera en lista över kandidat-miR-29b-mål 41, 42, 43 . Även om transkriptionsfaktorer associerade med EMT (till exempel SNAI1, TWIST eller ZEB1 ) inte hade miR-29b-bindande ställen i sina 3 ′ UTR, innehöll TGFB , en potent inducerare av EMT och de-differentiering miR-29b-bindande ställen ( Fig. 5a). Dessutom innehöll ITGA6 (CD49f) och ITGB1 (CD29), som upprätthåller och förbättrar stamhet 44 och används vanligtvis markörer för att identifiera baspopulationen, miR-29b-bindande platser i deras 3 ′ UTR. Intressant nog identifierade vi miR-29b-platser i många mikromiljögener involverade i angiogenes, kollagenombyggnad och matrisnedbrytning, inklusive ANGPTL4 , LOX , MMP2 , MMP9 , PDGF och VEGF (fig. 5a), som har varit inblandade i att främja metastas 4, 45 . För att bestämma om miR-29b modulerar dessa gener direkt, klonade vi dessa 3 TR UTR: er i luciferasreporterare och samtransfekterade dem med antingen miR-29b eller kontrollimiterar. För alla testade UTR: er minskade miR-29b luciferasaktivitet med 40–80% (fig. 5b), vilket delvis lättades när miR-29b-ställena muterades (fig. 5c), vilket indikerar att dessa platser är funktionella och specifika för miR-29b.

( a ) Beräkningsförutsagda interaktioner mellan miR-29b och 3 'UTR: er för flera mRNA: er involverade i differentiering, EMT, angiogenes, ECM-tvärbindning och ECM-proteolys. Frösekvensen miR-29b är i röd och de komplementära bindningsställena är i grönt. De mutationer som genererats inom de 3 ′ UTR: erna för c är i lila. ( b, c ) Vildtypen ( b ) och mutanten ( c ) 3 'UTR: er av de angivna miR-29b-målen klonades i dubbla luciferasreporterare och samtransfekterades med miR-29b eller cel-67-kontrollmimik. Renilla luciferasaktivitet mättes 48 timmar efter transfektion och normaliserades för eldflucicifas ( n = 5 oberoende experiment utförda i tre exemplar, * P <0, 05). ( d, e ) Relativt miR-29b-uttryck ( d ) och mRNA-uttryck av angivna miR-29b-mål ( e ) i stabilt transducerade 4T1-celler ± miR-29b ( n = 8 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05.) ( f, g ) Western blot ( f ) och flödescytometeranalys ( g ) av 4T1-celler ± miR-29b för ANGPTL4, LOX, VEGF-A och ITGA6 (CD49f). ( * P <0, 01 genom sannolikhetsbinning χ 2 test). Data rapporteras som medelvärde ± sem Oavskärda bilder av blotting visas i kompletterande figur S9b.

Bild i full storlek

Vi omvandlade stabilt 4T1- och MDA231-celler med miR-29b och bekräftade dess överuttryck (fig. 5d). I både 4T1- och MDA231-celler undertryckte miR-29b endogena mRNA-nivåer av målgener (fig. 5e och kompletterande fig. S7a, b). Vi validerade en delmängd av mål på proteinnivån med Western blot- och cellytfärgning och fann att miR-29b minskade nivåerna av ANGPTL4, ITGA6 (CD49f), LOX och VEGF-A (fig. 5f, g). Dessa resultat antyder att miR-29b nedreglerar en kohort av pro-metastatiska gener involverade i differentiering och modifiering av tumörens mikromiljö.

miR-29b-uttryck undertrycker lungmetastas

För att bestämma om miR-29b undertrycker metastas injicerade vi möss med 4T1-Control eller 4T1-miR-29b-celler ortotopiskt. Även om det inte fanns någon skillnad i primär tumörstorlek, hade 4T1-miR-29b tumörer signifikant färre blodkärl och en minskad nivå av fibrillar kollagen (Fig. 6a – c). Det är viktigt att möss med 4T1-miR-29b-tumörer hade färre och mindre metastaser (Fig. 6d). miR-29b minskade också signifikant storleken och antalet experimentella lungmetastaser i både 4T1- och MDA231-celler (fig. 6e och kompletterande fig. S7c – e).

( a ) BALB / c-möss injicerades med 4T1-celler ± miR-29b i bröstfettkudden för att bilda primära ortotoptumörer. Tumörer fick växa under tre veckor och mättes ( n = 8 oberoende möss per grupp). ( b, c ) Representativa bilder av 4T1 ± miR-29b primära ortotoptumörer färgade för CD31 för att utvärdera tumörvaskulatur ( b ) eller picrosirius röd för att utvärdera fibrillar kollagen ( c ). ( d ) Representativa H&E-bilder av lungmetastaser från möss injicerade med primära 4T1 ± miR-29b-tumörer. ( e ) BALB / c-möss injicerades iv med 4T1-celler ± miR-29b och bioluminescensavbildning genomfördes dag 14 efter injektion. Möss avlivades omedelbart efter avbildning ( n = 10 oberoende möss per grupp.) Representativa H&E-bilder av lungmetastaser visas nedan. ( f ) Relativt uttryck av miR-29b-mål i primära normala mammala epitelceller och primära MMTV-PyMT-adenom- och karcinomceller mätt med qPCR ( n = 6 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05). ( g, h ) FVB / n-möss injicerades iv med PyMT-celler ± miR-29b och avlivades efter sex veckor. En representativ uppsättning av grova lungor ( g ) och H&E-bilder av lungmetastaser ( h ) visas ( n = 8 oberoende möss per grupp). ( i, j ) FVB / n-möss injicerades iv med PyMT-celler ± Zip29 för att slå ned endogen miR-29b, och bioluminescerande avbildning genomfördes på vecka tre ( i ). Grafen visar antalet yttre lungmetastaser per lunglabb ( j ; n = 8 oberoende möss per grupp, * P <0, 05). Uppgifterna rapporteras som medelvärde ± sem Skalstänger, 100 μm ( b - d ), 200 μm ( e ), 1 cm ( g ) och 1 mm ( h ).

Bild i full storlek

När miR-29b-nivåerna sjunker under tumörprogression hos MMTV-PyMT-möss, undersökte vi om några miR-29b-mål ökar parallellt. I karcinom, där miR-29b-nivåerna var lägst, ökade uttrycksnivån för många miR-29b-mål (Fig. 6f). Dessutom visade PyMT-miR-29b-celler minskade måluttrycksnivåer (kompletterande fig. S7f – h) och minskade signifikant lungmetastas (fig. 6 g, h). Omvänt ökade förlust av miR-29b i PyMT-, 4T1- och MDA231-celler spontana och experimentella lungmetastaser och EMT-markörer in vivo (fig. 6i, j och kompletterande fig. S8a – f). Sammantaget visar dessa resultat att miR-29b fungerar som en metastaserundertryckare i mänskliga och musmodeller av bröstcancer.

miR-29b undertrycker metastas genom att undertrycka mikro-miljömål

För att få ytterligare inblick i hur miR-29b undertrycker metastas undersökte vi om nivåerna för miR-29b-mål ökar efter miR-29-knockdown. Många miR-29b-mål som vi identifierade uppreglerades efter förlust av miR-29, inklusive ANGPTL4 , LOX , MMP9 , VEGFA , ITGA6 och ITGB1 (Fig. 7a och 4e). Dessutom ökade knock-out för miR-29 nivån på 3 ′ UTR-luciferasreporterare för miR-29b-mål (fig. 7b), vilket ytterligare validerade dessa som bona fide- mål.

( a ) Relativt uttryck av miR-29b-mål i Zip29-knockdown-celler med qPCR ( n = 5 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05). ( b ) 3′UTR-reportrarna för de angivna miR-29b-målen samtransfekterades med anti-miR-29b eller kontrollinhibitor i HEK293T-celler. ( n = 3 oberoende experiment utförda i tre exemplar, * P <0, 05.) ( c, d ) BALB / c-möss injicerades iv med 4T1-celler ± miR-29b som återuttryckte ANGPTL4, LOX, MMP9 eller VEGF-A och avlivades vid två veckor. Representativa fluorescensmikrografier av lungorna togs med ett dissektionsmikroskop ( c ) och GFP fluorescensintensitet kvantifierades ( d ). ( n = 8 oberoende möss per grupp, * P <0, 01.) Data rapporteras som medelvärde ± sem Skala, 1 mm.

Bild i full storlek

Vi undersökte om återställande av uttrycket för fyra miR-29b-mål, med kända roller i angiogenes och ECM-ombyggnad, skulle öka metastasen. miR-29b enbart inhiberade metastas och återuttryck av ANGPTL4, LOX, MMP9 eller VEGF-A i 4T1-miR-29b celler återställde lungmetastas (Fig. 7c, d), vilket indikerar att miR-29b undertrycker metastas, åtminstone i del genom att reglera dessa mikro-miljögener.

Reglering av miR-29b förmedlar GATA3: s förmåga att undertrycka metastaser och främja differentiering

För att avgöra om GATA3-medierad metastasundertryckning och differentiering kräver miR-29b slog vi ner miR-29b i MDA231-GATA3-celler. GATA3-överuttryck främjade epitelklustering och samtidig förlust av miR-29b upphävde effekterna av GATA3, vilket resulterade i långsträckta, spindelliknande celler (Fig. 8a). På liknande sätt orsakade förlust av miR-29 i T47D luminala bröstcancerceller, som starkt uttrycker endogen GATA3, en mesenkymal morfologi åtföljd av en ökning av nivåerna av EMT-markörer och måluttryck (kompletterande fig. S8g – i). Således erhåller tumörceller mesenkymala egenskaper i frånvaro av miR-29b, även med höga nivåer av GATA3-uttryck.

( a ) Faskontrastbilder av MDA231-celler ± GATA3 ± Zip29. ( b ) Relativt uttryck av miR-29b mål ANGPTL4 , LOX , MMP9 , PDGFC och VEGFA i MDA231-celler ± GATA3 ± Zip29 med qPCR ( n = 6 oberoende erhållna biologiska prover, * P <0, 05). ( c ) 3′UTR-reporterna för de angivna miR-29b-målen transfekterades till MDA231-celler ± GATA3 ± Zip29 och luciferasaktiviteten mättes. ( n = 3 oberoende experiment utförda i tre exemplar.) ( d ) Bioluminescerande avbildning av möss injicerade iv med MDA231-celler ± GATA3 ± Zip29at fyra veckor efter injektion ( n = 8 oberoende möss per grupp). ( e, f ) BALB / c-möss injicerades med 4T1-celler ± Gata3 ± Zip29 i bröstfettkudden. Tumörer fick växa i fyra veckor och lungorna undersöktes för spontana metastaser ( e ). Representativa H&E-bilder visas ( f ). ( n = 10 oberoende möss per grupp, * P <0, 05.) ( g, h ) BALB / c-möss injicerades iv med 4T1-celler ± Gata3 ± Zip29 knockdown och avlivades två veckor efter injektion. Antalet lungytmetastaser kvantifierades ( g ) och immunfluorescensfärgning utfördes för E-cadherin (grön) och vimentin (röd; h ; n = 8 oberoende möss per grupp, ** P <0, 01). ( i ) Föreslagen modell för hur GATA3 främjar differentiering och undertrycker bröstcancermetastas genom reglering av miR-29b. Uppgifterna rapporteras som medelvärde ± sem Skala, 100 μm ( a ), 200 μm ( f ) och 50 μm ( h ).

Bild i full storlek

Vi undersökte om GATA3 nedreglerade miR-29b-mål och fann att nivåerna för uttryck och 3 ′ UTR-reportrar för miR-29b-mål, inklusive ANGPTL4 , LOX , MMP9 och VEGFA , minskade med GATA3; denna hämning reverserades delvis i GATA3-Zip29-celler (fig. 8b, c). Betydande, fann vi att miR-29 knockdown vänt GATA3-medierad undertryckning av experimentella och spontana metastaser och ökade vimentinuttrycksnivån (fig. 8d – h och kompletterande fig. S8j), vilket indikerar att störning av miR-29b dämpar det anti-metastatiska och pro-differentieringsfunktioner för GATA3. Tillsammans visar våra resultat att miR-29b är en viktig nod nedströms GATA3 som kontrollerar differentiering och uttrycket av pro-metastatiska gener som är involverade i modifiering av tumörens mikromiljö, vilket i slutändan leder till undertryck av metastaser (Fig. 8i).

DISKUSSION

I den här studien visar vi att GATA3 främjar luminaldifferentiering och undertrycker lungmetastas genom miR-29b, ett antimetastatiskt mikroRNA som främjar differentiering och reglerar tumörens mikromiljö (Fig. 8g). Vi demonstrerar att GATA3 ökar expressionsnivån för miR-29b, som är utsökt positionerad för att hämma flera steg som krävs för metastas: ett nätverk av mRNA involverat i stamness / EMT, angiogenes, proteolys, ECM-signalering och ECM-ombyggnad har miR-29b- bindande webbplatser och är bona fide miR-29b mål. Även om vi inte hittade miR-29b-platser i klassiska EMT-främjande transkriptionsfaktorer, ITGA6 (CD49f) och ITGB1 (CD29), markörer för basal / stamcellpopulation som tidigare varit inblandad i att upprätthålla och förbättra stamhet 44 och TGFB2 och TGFB3 , allt hade miR-29b-bindande platser. När miRNA: er agerar pleiotropiskt och modulerar en rad biologiska processer, representerar de en idealisk uppsättning av mål genom vilka transkriptionsfaktorer som GATA3 kan fungera.

Förlusten av GATA3 utlöser fibroblastisk transformation och cellinvasion 46 och sammanfaller med början av angiogenes, inflammatorisk cellrekrytering och spridning 10 . Det har visats att GATA3 reducerar tumörvaskulatur och makrofaginfiltrat, komponenter i tumörens mikromiljö som främjar metastas 16, 47 . Vid mänsklig bröstcancer korrelerar GATA3 med högre E-cadherin- och ER-uttrycksnivåer 13 . Dessa observationer antyder att främjande av differentiering i primära tumörer begränsar metastas av både icke-cell-autonoma mekanismer (till exempel angiogenes, inflammation, ECM-ombyggnad) och cell-autonoma mekanismer (till exempel ökad cellvidhäftning).

Vid bröstcancer är nivån av uttrycket miR-29b högst i goda prognostiska, väl differentierade cancerformer i luminaltyp och hämmar metastas, den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall. miR-29b främjade luminaldifferentiering; omvänt främjade förlust av miR-29b mesenkymala egenskaper och metastaser. Samtidig förlust av miR-29b i GATA3-uttryckande celler återställde metastaser och upphävde GATA3: s förmåga att främja differentiering, vilket indikerar att miR-29b är en viktig nod som utövar sina antimetastatiska effekter av cellintrinsiska och cell-extrinsiska mekanismer. Vi fann att miR-29b-medierad metastasinhibition berodde på förtryck av dess mål. Av dessa påverkar ANGPTL4 lungsådd genom att störa endotelcellkorsningar 45 ; LOX ökar vävnadsfibros och integrinförmedlad överlevnadssignalering 48 ; MMP9 ombyggnad av ECM och släpper sekvenserad VEGF-A (ref.49); och VEGF-A främjar angiogenes. Intressant nog har dysregulering av familjen miR-29 varit inblandad i vävnadsfibros 50, 51, 52 och många cancerformer, inklusive leukemi, lungcancer, levercancer, rabdomyosarkom och melanom 32, 53, 54, 55 .

TGF-β signalling activates the promoters of many of the same genes that are miR-29b targets, including LOX , MMPs and VEGFA (refs 56, 57, 58), and is a potent inducer of EMT. We found that GATA3 inhibited TGF-β and that TGFB2 and TGFB3 are miR-29b targets. Therefore, to repress TGF-β-induced activation of its target genes, GATA3 inhibits the signalling network directly at the transcriptional level and indirectly at the post-transcriptional level through miR-29b (that is, degradation and translational inhibition of already-made TGFB mRNAs). This multi-tiered system ensures efficient GATA3-mediated inhibition of TGF-β signalling. Interestingly, miR-29b also increased GATA3, and loss of miR-29b decreased GATA3, suggesting that GATA3 and miR-29b form a positive feedback loop and act collaboratively to reinforce fate decisions. The exact mechanisms of how GATA3 and miR-29b function in cell-type-specific manners remain to be further investigated.

Our work on miR-29b adds to the growing body of evidence implicating miRNA-mediated regulation of cancer and the tumour microenvironment. Previous studies have shown that many microRNAs play important pro- and anti-metastatic roles by regulating diverse cellular processes used during metastasis 20, 59, 60 . Future work aimed at identifying other GATA3 targets and determining their function will allow us to further understand the role of GATA3 in development and cancer.

Rather than functioning as a classical tumour suppressor, GATA3 defines a distinct class of pro-differentiation factors capable of also modifying the tumour microenvironment. The identification of one GATA3 target, miR-29b , illustrates how epithelial plasticity, the tumour microenvironment and metastasis are linked. Finally, miRNAs are being pursued as potential anti-cancer agents 61, 62 . Whether increasing miR-29b levels in primary breast tumours improves patient survival will ultimately determine the therapeutic use of miR-29b mimics.

METODER

Animal studies.

All animal experiments were performed at UCSF, and reviewed and approved by the UCSF IACUC. Mice were housed under pathogen-free conditions in the UCSF barrier facility. BALB/c and nude mice were purchased from Simonsen Laboratories. FVB/n mice, originally from Jackson Laboratories, were bred in-house. For experimental metastasis experiments, age-matched female mice were injected iv (through the tail vein) with 1×10 5 cells (4T1), 5×10 5 cells (MDA-MB-231) or 5– 10×10 5 cells (PyMT) in PBS. For primary tumours and spontaneous metastasis assays, age-matched female mice were injected with the indicated number of cells in 1:1 DMEM/Matrigel (BD Biosciences) into the fourth mammary fat pad without clearing. Tumour measurements were made blinded, using a caliper at least once per week, and volumes were calculated using the formula: V = 0.52×(length) 2 ×width. Bioluminescence imaging was performed using an IVIS Spectrum and image radiance values were normalized using Living Image (Caliper LifeScience).

Cell kultur.

MDA-MB-231, T47D, Hs578T, HEK293T, GP2, 4T1 and 4TO7 cells were obtained from the ATCC, LBNL or UCSF Cell Culture Facility, and grown in standard conditions (DMEM with 10% FBS). The immortalized human mammary epithelial cells (HMLE) were obtained from J. Debnath (UCSF, San Francisco, CA) and W. Hahn (Harvard University, USA) and maintained in MEGM (Lonza) as previously described 63 . The PyMT cell line was generated by isolating a late-stage MMTV-PyMT/FVB tumour, dissociating the cells in collagenase, and culturing in DMEM/F12 media supplemented with 5% FBS, insulin and hydrocortisone. For TGF-β stimulation, cells were serum-starved for 18–24 h before adding TGF-β1 or TGF-β2 (R&D Systems) at 5 ng ml −1 . For TGF-βR inhibition, cells were grown in standard conditions with 10 μm LY-364947 (Calbiochem) or dimethylsulphoxide (Sigma). For cells embedded in Matrigel, cells were aggregated overnight on ultralow attachment plates (Corning) and then embedded into growth-factor-reduced Matrigel (BD Biosciences) the next day. Cells were grown in serum-free media supplemented with insulin–transferrin (Invitrogen) and 50 ng ml −1 of EGF (Invitrogen) or 2.5 nM FGF2 (Sigma).

Lentiviral and retroviral production.

Viral production was carried out using calcium-phosphate-mediated transfection of HEK293T or GP2 cells. Virus was concentrated by ultracentrifugation, and added to cells with Polybrene. Stably transduced cells were selected in puromycin, G418 or hygromycin for at least 5 days or selected by FACS.

Plasmids.

Several plasmids were obtained from Addgene including: pcDNA-miR-29b from J. Mendell (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD; plasmid 21121; ref. 64), pcDNA-GATA3 from G. Hotamisligil (Harvard School of Public Health, Boston, MA; plasmid 1332; ref.65), p3TP-Lux from J. Massagué (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY; plasmid 11767; ref. 66), SBE4-Luc from B. Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD; plasmid 16495; ref. 67), pWZL Blast VEGF-A from R. Weinberg (MIT, Cambridge, MA; plasmid 10909; ref. 68) and pBabe Angptl4 from J. Massagué (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY; plasmid 19156; ref. 45). Several plasmids were gifts, including: pBM-IRES–puro and pBM-Mmp9 from E. Raines 69 (University of Washington, Seattle, WA) and G. Bergers (UCSF, San Francisco, CA), pMSCV-miR-29b from A. Goga (UCSF, San Francisco, CA), pLV-LOX from V. Weaver (UCSF, San Francisco, CA), pGL3-V2774 (containing the VEGFA promoter) from K. Xie (MD Anderson, Houston, TX) and pGL3-miR29–Luc (containing the miR29a/b1 promoter) from J. Mott 30 (University of Nebraska, Omaha, NE). The pMSCV-Luciferase retrovirus was generated using XhoI and EcoRI from pGL3 (Promega). The pmiRZip-29b (System Biosciences) to stably knockdown miR-29b expression was used following the manufacturer's instructions and contained the following shRNA sequence: 5′-GTAGCACCGTTTGAAATCAATGCTCTTCCTGTCAGAACACTGATTTCAAATGGTGCTATTTTT- 3′.

For the 3′UTR luciferase reporters, the 3′ UTRs were PCR amplified from genomic DNA, cloned into pCR2.1 by TOPO cloning (Invitrogen) and verified by sequencing. Fragments were then digested with XhoI, SgfI and/or NotI and cloned into the psiCheck2 reporter (Promega). The psicheck2- ITGB1 3′ UTR plasmid was a gift from P. Gonzalez 44 (Duke University, Durham, NC). Site-directed mutagenesis to mutate the miR-29b seed in the 3′ UTR reporters or to delete the GATA sites in the pGL3-miR29–Luc reporter was performed according to the manufacturer's instructions (Stratagene). All mutants were verified by sequencing. Primer sequences used to generate the wild-type and mutant 3′ UTRs and the GATA mutants are detailed in Supplementary Tables S3–S5.

miRNA PCR arrays and qPCR.

Total RNA was isolated from cells using the miRNeasy Mini Kit (Qiagen). For miRNA PCR arrays (SABiosciences), MDA231 cells±GATA3were screened according to the manufacturer's instructions. Complementary DNA was synthesized using the RT 2 miRNA First Strand Kit (SABiosciences). Data were analysed using SABiosciences software. For qPCR, cDNA was synthesized using the Superscript III RT First Strand Kit (Invitrogen). qPCR was performed using FastStart Universal SYBR Green master mix (Roche) in an Eppendorf Mastercycler realplex machine. Ct values were normalized to actin and GAPDH, and relative expression was calculated using the 2 ΔΔCt method. For quantification of miRNA expression, TaqMan probes were used according to the manufacturer's protocol (Applied Biosystems). Ct values were normalized to RNU48 (human samples) or snoRNA202 (mouse samples). Primer sequences for qPCR were found using the Harvard Primer Bank and are detailed in Supplementary Table S2.

Serum cytokine analysis and ELISA.

Sera from mice bearing 4T1 primary tumours were collected when the mice were euthanized. Samples ( n = 5 per group) were analysed in duplicate by Eve Technologies, using a multiplex bead platform. For analysis of secreted VEGF-A from cells in vitro , supernatants were collected in triplicate 48 h after serum-starvation and analysed by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) according to manufacturer's instructions (R&D Systems).

Cell viability assays.

Cell viability over several days was measured using the CellTiter MTT Assay according to the manufacturer's instructions (Promega). Cells were seeded in triplicate at the same initial density, and attenuance at 590 nm was read on sequential days using a plate reader (Bio-Rad).

Luciferase assays.

For 3′ UTR assays, HEK293T or MDA231 cells were co-transfected with the indicated sicheck2 wild-type or mutant reporter and either miR-29b, control cel-67, anti-miR-29b or anti-control mimic (100 nM final) using Dharmafect Duo (Dharmacon).

For the TGF-β and NF-κB reporter assays, the SBE4-Luc, p3TP-Lux or pGL-NF κB-Luc reporter was co-transfected with Renilla luciferase (pRL-TK) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) into MDA231 cells. Cells were serum-starved overnight, and then stimulated with 5 ng ml −1 TGF-β (R&D), 500 ng ml −1 sRANKL (Invitrogen) or 100, ng ml −1 TNF- α (Peprotech) for 24 h.

For the miR-29a/b1 promoter reporter assays, the pGL3-miR-29–Luc wild-type or mutant reporter was co-transfected with pRL-TK and either pcDNA-eGFP (control) or pcDNA–GATA3 into MDA231 cells. Lysates were collected 48 h post-transfection. Renilla and firefly luciferase activities were measured using the Dual-Luciferase Reporter System and a GloMax luminometer (Promega). Transfection efficiency was normalized to the control luciferase.

Immunostaining and histology.

Tissues were fixed in 4% PFA overnight, and paraffin processed or embedded into OCT for frozen sections. Standard haematoxylin and eosin (H&E) staining was performed for routine histology. Picrosirius red staining was performed as previously described 48 and fibrillar collagen visualized using crossed polarizers. Standard antigen retrieval was performed using citrate or proteinase K for immunohistochemistry 9 . The TSA Amplification Kit (Perkin Elmer #NEL700A001KT) was used according to the manufacturer's instructions. Primary antibodies were incubated overnight, and secondary antibodies were incubated for 1 h. The following antibodies were used at the indicated concentrations: CD31 (BD Pharmingen #553370, 1:50), F4/80 (Invitrogen #MF48000, 1:100), phospho-histone H3 (Cell Signaling #9701, 1:100), cleaved caspase-3 (Cell Signaling #9661, 1:100), GATA3 (R&D #AF2605 1:50 and Abcam #ab32858, 1:100), E-cadherin (Zymed #13-1900, 1:500), biotinylated anti-rat (Jackson #112-067-003, 1:300), biotinylated anti-rabbit (Dako #E0431, 1:300) and biotinylated anti-goat (Jackson #305-067-003, 1:300). Fluorescent antibodies 488-anti-rabbit and 568-anti-rat were from Molecular Probes (Invitrogen #A11008 and #A11077, 1:600), and confocal microscopy was performed on a Nikon C1si confocal microscope. Image analysis was performed using ImageJ or Nikon software.

Time-lapse microscopy.

Bright-field time-lapse videos were collected on a Zeiss Axiovert S-100 microscope. The temperature was held at 37 °C and CO 2 was held at 5% by using a CTI Controller 3700 and Temperature Control combination. Images were acquired every 20 min and assembled into videos using MetaMorph (Molecular Devices).

Western blotting.

Cells were lysed in RIPA buffer plus protease inhibitors (Roche) or directly in Lamelli Buffer with dithiothreitol. Protein concentration was measured using the BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Lysates were subjected to SDS–PAGE, transferred to PVDF membranes, blocked in 5% BSA, incubated with primary antibody overnight and visualized using ECL Detection Reagents (Pierce). Exposures were acquired using a LAS-4000 Imager (Fuji). Antibodies used include: actin (Santa Cruz #sc-47778, 1:1, 000), LOX (Novus #NB100-2527, 1:500), VEGF-A (Abcam #ab46154, 1:1, 000), ANGPTL4 (Invitrogen # 40-9800, 1:250), GATA3 (R&D #AF2605 1:1, 000), phospho-Smad3 (Cell Signaling #9520, 1:1, 000), vimentin (Cell Signaling #5741, 1:1, 000), nucleolin (Abcam #ab22758, 1:1, 000), HRP anti-rabbit and HRP anti-mouse (GE Healthcare #NA9340 and #NXA931, 1:5000) and HRP anti-goat (Invitrogen #811620, 1:5000).

Flow cytometry.

To sort primary mouse mammary epithelial cells into basal and luminal fractions, mammary glands from adult virgin females were digested with collagenase. Organoids were collected by brief centrifugation and digested with trypsin to dissociate into single cells. The cells were stained with antibodies against CD49f, CD24 and lineage markers (CD45, CD31, Ter119) (eBioscience #17-0495-82, 48-0242-82, 12-0451, 11-0311-85, 11-5921-82, respectively; all used at 1:150), as described previously 70 . Antibodies against CD29, GATA3, CD44, CD24 and EpCAM (eBioscience #12-0299-71, 12-0241-81, 50-9966-41, 12-0441, 17-0247-41 and 50-9326-41, respectively; all used at 1:150) were used to stain cell lines. For the GATA3 stain, cells were permeabilized using 0.2% Triton X-100. Analysis and cell sorting were performed on an LSRII or FACS Aria II (Becton Dickinson), and analysed using FlowJo (TreeStar) or FACSDiva software (BD Biosciences).

Statistical analysis.

Statistical analysis was performed using Prism 4 software (GraphPad Software). All data are presented as mean±sem, unless otherwise stated. When two groups were compared, the two-tailed Student t -test was used, unless otherwise stated. When three or more groups were compared, the one-way analysis of variance test was used, followed by Tukey's test to determine significance between groups. To compare histograms collected from the flow cytometer, we used the probability binning χ 2 test on FlowJo (TreeStar). We considered P <0.05 as significant.

Accession numbers for data sets.

The data set generated has been deposited to GEO under the primary accession number GSE42468. Eight reference accession data sets were reanalysed in the study, including six from the GEO database (GSE7842, GSE19783, GSE22220, GSE23938, GSE23977 and GSE23978) and two from the ArrayExpress database (E-MEXP-2289 and E-TABM-157).

anslutningar

Primära anslutningar

Gene Expression Omnibus

  • GSE42468

Hänvisade anslutningar

ArrayExpress

  • E-MEXP-2289
  • E-TABM-157

Gene Expression Omnibus

  • GSE19783
  • GSE22220
  • GSE23938
  • GSE23977
  • GSE23978
  • GSE7842

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information

Excel-filer

  1. 1.

    Supplementary Tables 1–5

    Kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Time-lapse imaging of MDA231-Control breast cancer cells cultured in 3D Matrigel.

    MDA231-Control cells were embedded into growth factor reduced Matrigel after re-aggregation overnight on low adhesion plates. 3D cultures were grown in serum-free media with 2.5 nM FGF2. Cells were imaged using a Zeiss Axiovert inverted brightfield microscope every 20 min for 48 h at 37 °C and 5% CO 2 . Images were assembled and played at 8 frames s −1 .

  2. 2.

    Time-lapse imaging of MDA231-GATA3 breast cancer cells cultured in 3D Matrigel.

    MDA231-GATA3 cells were embedded into growth factor reduced Matrigel after re-aggregation overnight on low adhesion plates. 3D cultures were grown in serum-free media with 2.5 nM FGF2. Cells were imaged using a Zeiss Axiovert inverted brightfield microscope every 20 min for 48 h at 37 °C and 5% CO 2 . Images were assembled and played at 8 frames s −1 .