Ganoderma lucidum polysackarider minskar methotrexat-inducerad tunntarmsskada hos möss via induktion av epitelcellsproliferation och migration | acta Pharmacologica sinica

Ganoderma lucidum polysackarider minskar methotrexat-inducerad tunntarmsskada hos möss via induktion av epitelcellsproliferation och migration | acta Pharmacologica sinica

Anonim

Abstrakt

Syfte:

För att studera effekterna av Ganoderma lucidum polysackarider (G1-PS) på metotrexat (MTX) -inducerad tunntarmsskada hos möss och de underliggande mekanismerna.

metoder:

BALB / c-möss användes för in vivo- studie. Mössen administrerades med G1-PS (50, 100 eller 200 mg / kg, ig) under 10 d och injicerades med MTX (50 mg / kg, ip) på d 7 och 8 för att inducera tarmskador, och sedan offrades på d 11 för morfologisk undersökning och vävnad malondialdehyd (MDA) och superoxid-dismutas (SOD) mätningar. Innan man offrade samlades blodprover för att analysera immunoglobulin A (IgA). Rått tarm IEC-6-celler användes för in vitro- studie. Cellproliferation och migration bedömdes med användning av MTT-metod respektive en in vitro- såradmodell. Transformerande tillväxtfaktor p (TGFp) proteinuttryck bestämdes med ELISA-analys. Ornitindekarboxylas (ODC) och c-Myc mRNA-expressionsprofiler bestämdes med användning av RT-PCR.

Resultat:

MTX-behandling orsakade allvarlig slemhinneskada, ökade MDA-nivåerna i tunntarmen signifikant och minskade SOD- och serum-IgA-nivåer hos BALB / c-möss. G1 -PS (100 och 200 mg / kg) reverserade MTX-effekterna markant. I IEC-6-celler stimulerade G1 -PS (0, 1, 1 och 10 μg / ml) signifikant cellproliferationen. Vidare stimulerade Gl-PS (10 μg / ml) markant migrationen. Dessutom ökade G1 -PS (10 och 20 μg / ml) uttrycket av ODC och c-Myc mRNA. G1 -PS (upp till 20 μg / ml) hade emellertid ingen effekt på uttrycket av TGFp-protein.

Slutsats:

Resultaten antyder att G1 -PS skyddar tunntarmen mot MTX-inducerad skada via induktion av epitelcellsproliferation och migration.

Introduktion

Tarmslemhinnebarriären (IMB), som är den första försvarslinjen mot en fientlig miljö, är sammansatt av ett enda lager av columnar epitel med mellan epiteliala täta korsningar. Intestinal mucositis är en klinisk term som används för att beskriva biverkningarna av cancercemoterapi på tarmslemhinnans yta, till följd av dysfunktion hos IMB. Typiska symtom är uppblåsthet, buksmärta och diarré. Cirka 40% - 100% av cancerpatienter som genomgår kemoterapi utvecklar slemhinnor 1, 2, 3, 4 och 50% av dessa patienter kräver en minskning av dosen kemoterapi eller tillfällig upphörande av behandlingen. Mucositis är ibland dödlig. Emellertid har ingen effektiv behandling för mukosit utvecklats.

Under de senaste åren har forskare fokuserat på traditionell kinesisk medicin för dess terapeutiska effekter och låg toxicitet. Ganoderma lucidum (Leyss, ex Fr) Karst (G l ) har använts allmänt för att främja hälsa och livslängd i Kina i tusentals år. Ganoderma lucidum polysackarider (G1-PS) innefattar de kritiska biologiska aktivitetskomponenterna av Gl . Gl-PS har rapporterats förhindra oxidativ skada 5, skydda levern och minska glukosnivån i serum utan att orsaka toxicitet 6, 7 . Dessutom modifierar G1 -PS biologiska och immunsvar 8 .

Tyvärr har liten uppmärksamhet ägnats åt effekterna av G1 -PS på gastrointestinal slemhinnefunktion. I denna studie använde vi en murin modell av tarmskador som inducerades med metotrexat (MTX), som är en folatantagonist, för att utvärdera den skyddande rollen för G-PS i IMB. Tarmens epitelcellinje IEC-6 användes också som en in vitro- sårmodell för att utvärdera G1-PS: s roll på epitelcellsproliferation och cellrestitution för att belysa de möjliga verkningsmekanismerna för G-PS vid behandlingen av IMB.

Material och metoder

material

Ganoderma lucidum polysackarider (G1-PS) isolerades från kokande vatten-extrakt av fruktkroppar av Ganoderma lucidum (Leyss, ex Fr) Karst följt av etanolutfällning, dialys och proteinutarmning med användning av Sevag-metoden. G1-PS är glykopeptid med en molekylvikt av 584 900. Förhållandet mellan polysackarider och peptider är 93, 61%: 6, 49%. Polysackariderna bestod av D- rhamnos, D- xylos, D- fraktos, D- galaktos, D -mannos och D- glukos med ett molförhållande av 0, 779: 0, 964: 2, 944: 0, 167: 0, 389: 7, 94. Polysackariderna kopplades samman genom p-glykosidbindningar. G l -PS är ett hasselfärgat vattenlösligt pulver som vänligen tillhandahölls av Fuzhou Institute of Green Valley Bio-Pharm Technology.

Inavlade kvinnliga BALB / c-möss (7–8 veckor gamla) köptes från avdelningen för försöksdjur vid Health Science Center vid Peking University i Peking, Kina. Djuren hölls i miljöstyrda förhållanden med 12-timmars ljus / 12-timmars mörka cykler och tilläts fri tillgång till vatten och standardlaboratorium.

IEC-6-celler erhölls från Cell Bank of Peking Union Medical College (Peking, Kina). IEC-6-celler bibehölls rutinmässigt i närvaro av Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) (Gibco BRL, USA) innehållande 5% inaktiverat fetalt kalvserum (FCS), 10 ug / ml insulin, 2, 8 g / L natriumbikarbonat, 100 U / ml penicillin G-natrium och 100 μg / ml streptomycinsulfat.

MTX köptes från Zhejiang Hengrui Pharmaceutical Co, Ltd. Malondialdehyde (MDA) och superoxid dismutase (SOD) -analyssatser köptes från Nanjing Jiancheng Biology Research Center. TGFp ELISA-kitet köptes från Wuhan Boster Bio-engineering Co, Ltd. Primär, och sekundära antikroppar för mätning av IgA erhölls från Sigma Chemical Co.

Murine MTX-inducerad enteritmodell

Djuren tilldelades slumpmässigt till fem grupper som innehöll nio djur vardera. Möss fick ig en gång dagligen under 10 på varandra följande dagar av (1) låg dos G 1 -PS (50 mg / kg), (2) mellandos G 1 -PS (100 mg / kg), (3) hög dos G1-PS (200 mg / kg), (4) vehikel ( dvs steril fysiologisk saltlösning), som användes som en modellkontroll, och (5) vehikel ( dvs steril fysiologisk saltlösning) som en normal kontroll. Med undantag för grupp (5) injicerades mössen intraperitonealt (ip) med MTX (50 mg / kg) den sjunde och 8: e dagen. Två dagar efter avslutad kurs av MTX (den 11: e d) avlivades mössen genom cervikal dislokation. Därefter skördades tarmvävnadsproven och bereddes för histologiska studier. De andra segmenten av tarmen avlägsnades för att bestämma MDA- och SOD-nivåer. Innan mössen avlivades erhölls blodprover från varje djur för att utföra biokemiska analyser (plasma IgA-nivå). Experimenten godkändes av djurvårds- och forskningsetikutskottet vid Peking University Health Science Center.

Intestinal morfologi och histopatologi

Vävnadsprover av tarmen (0, 5 cm) erhölls på ett avstånd av 15 cm från pylorus hos varje djur efter laparotomi. Avbildning med hjälp av ljusmikroskopi (LM) och transmissionselektronisk mikroskopi (TEM) utfördes för morfologiska och histopatologiska studier. Vävnadssektionerna färgades med hematoxylin och eosin för avbildning med användning av LM.

Mätning av MDA- och SOD-nivåer

Kvantitativa MDA- och SOD-mätningar utfördes med vävnader som erhölls från tarmen med användning av MDA- och SOD-analyssatserna.

Mätning av totalt immunoglobulin A

En sandwich-ELISA-teknik användes såsom tidigare beskrivits 9 .

Bestämning av IEC-6-cellproliferation

IEC-6-celler (3 x 104) ympades i plattor med 96 brunnar (Costar, USA) i närvaro av DMEM innehållande 5% FCS. Kulturerna behandlades med olika koncentrationer av G-PS. Efter 44 timmars inkubation vid 37 ° C och 5% CO2, utfördes en kolorimetrisk MTT-analys som tidigare beskrivits 10 . Kulturerna inkuberades med tetrazoliumsalttiazolylblått (20 ul) i en koncentration av 5 mg / ml under ytterligare 4 timmar. Cellsupernatanterna kasserades och cellerna lyserades med användning av dimetylsulfoxid (DMSO). Metaboliseringen av MTT korrelerar direkt med cellnumret och kvantifierades genom att mäta absorbansen vid 570 nm (referensvåglängd 450 nm) med användning av en mikroplåtläsare.

Bestämning av ODC- och c-Myc-mRNA-expressionsprofiler med RT-PCR-analys

MRNA-expressionsprofilerna för ODC och c-Myc i IEC-6-celler utvärderades med användning av omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT-PCR) med Access RT-PCR-systemet (Takara, Japan) enligt tillverkarens förfaranden. IEC-6-celler som behandlades med eller utan G1-PS skördades efter 12 timmars inkubation. Det totala RNA extraherades med användning av TRIzol-reagens (Invitrogen, USA). Koncentrationen av RNA kvantifierades spektrofotometriskt. CDNA syntetiserades med användning av Advantage RT-for-PCR-kitprotokollet (Promega, USA). Utspädda alikvoter från dessa reaktioner användes därefter som mallar för PCR.

Kommersiella primrar för att råtta glyceraldehyd 3-fosfat-dehydrogenas (GAPDH) (sense, 5′-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3 ′ och antisense, 5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ′), råtta ODC (sense, 5′-TGCTTGACTG antig 5′-TTCTCATCTGGCTTGGGT-3 and) och råtta c-Myc (sense, 5′-GCTCGCCCAAATCCTGTA-3 ′ och antisense, 5′-ACCCTGCCACTGTCCAAC-3 ′) tillhandahölls av Shanghai Sangon Biologisk teknik och teknologi Co, Ltd (Peking, Kina) användes för att generera produkter på 498 bp, 355 bp respektive 385 bp. PCR-reaktionerna inkluderade 0, 4 μmol / L av varje primer, 0, 2 mmol / L dNTP: er, 1 x PCR-buffert med 15 mmol / L MgCl2 och 2 U / μL Taq-polymeras (Takara, Japan). PCR-cykelprotokollet var som följer: 45 s vid 94 ° C, 45 s vid 60 ° C (GAPDH), 57 ° C (ODC) eller 59 ° C (c-Myc) och 2 min vid 72 ° C. Detta protokoll utfördes under 24 (GAPDH) / 26 (ODC) / 26 (c-Myc) cykler och inkluderade en initial 5-minuters denaturering vid 94 ° C och en slutlig 10-minuters förlängning vid 72 ° C. De utförda cyklerna av PCR valdes för att säkerställa den exponentiella amplifieringen av alla specifika cDNA-produkter. De PCR-amplifierade proverna elektroforesades med användning av 1, 5% agarosgeler, färgades med etidiumbromid, visualiserades via UV-transillumination och kvantifierades via densitometri-skanning med användning av programvaran AlphaEaseFC V4.0.0 (Alpha Innotech Corp). ODC- och c-Myc-expressionsprofiler normaliserades relativt den för GAPDH.

Monolagsskada och mätning av epitelcellsrestitution

IEC-6-cellrestitutionsanalyser utfördes med användning av en modifierad version av en tidigare beskrivet teknik 11, 12 . IEC-6-celler pläterades i sex-brunnars polystyrenplattor (Costar) med normalt tillväxtmedium och fick tillgå sammanflöde. Ett denuderad epitelialsår skapades på ett standardiserat sätt genom att skrapa IEC-6 monolager med en 200-mikros pipettspets. Efter skrapningen tvättades cellerna två gånger med D-Hanks buffert för att avlägsna återstående cellskräp. De sårade monolagen odlades under 42 timmar i DMEM innehållande 2% FCS i närvaro eller frånvaro av G-PS. Sårområden sågs under mikroskopet vid olika tidpunkter efter att ha skadats och fotograferats med ett Olympus IX71-mikroskop. Det nekade sårområdet (ROI, region av intresse) kvantifierades med användning av LEICA QWIN-programvara (Tyskland). Två sårområden per brunn analyserades. Varje grupp testades i tre exemplar och minst tre oberoende experiment utfördes. Restitution beräknades som migrationsförhållandet med användning av följande ekvation: (ROI 0 h –ROI 42 h ) / ROI 0 h × 100%. Uppgifterna uttrycks som medelvärdet ± SD (standardavvikelse) som representerar minst tre oberoende experiment.

IEC-6-cells supernatantuppsamling och bestämning av TGFp-nivåer

Samlingen av IEC-6-cellsupernatanter utfördes såsom beskrivits tidigare 13 . IEC-6-celler pläterades i 6-brunnsskålar med en densitet av 2, 5 x 105 celler / skål. Efter 24 timmar ersattes mediet med medium som hade kompletterats med olika koncentrationer av G-PS. IEC-6 monolager skadades med användning av en 200 mikroliter pipetspets som tidigare beskrivits. Cellerna tvättades två gånger med D-Hanks buffert och inkuberades därefter med färskt medium som hade kompletterats med G1-PS. Efter 24 timmar uppsamlades cellsupernatanterna. Utsöndring av TGFp från supernatanter bestämdes med användning av ett ELISA-kit för sandwich enligt tillverkarens protokoll.

Statistisk analys

Data analyserades med användning av envägs ANOVA följt av testet med minst signifikant skillnad (LSD). P- värden som låg under 0, 05 ansågs statistiskt signifikanta.

Resultat

Morfologiska och histologiska resultat

Såsom visas i figur 1 störde G1 -PS inte de morfologiska och histologiska egenskaperna hos jejunum hos möss. Alla vävnadssektioner i tarmen i kontrollgruppen var normala. I vävnadssektionerna hos de MTX-behandlade mössen observerade vi villusförkortning, varierande fusionsgrader, epitelatrofi, ett minskat antal kryptceller, kryptförlust och utvecklingen av abscesser i krypter. Dessutom noterade vi en inflammatorisk infiltration i lamina propria. Antalet bägge celler minskade signifikant i villi och krypter. Även om de histopatologiska särdragen i MTX + G1-PS 100 mg / kg-behandlad grupp var liknande resultaten i den MTX-behandlade gruppen, var den totala tunntarmsskada i MTX + G l -PS 100 mg / kg-behandlad gruppen var mindre än för den MTX-behandlade gruppen.

Image

Morfologi för den murina jejunum under förstoring av 100 och 200. Normal: grupp av normal kontroll; MTX: grupp av MTX-modell; G1 -PS: grupp av 100 mg / kg G1 -PS under MTX-stress. Dessa fotografier är representativa exempel på en grupp med nio möss.

Bild i full storlek

Undersökning av tarmens ultrastruktur avslöjade att mikrovillierna i den normala kontrollgruppen var långa, rikliga och snyggt arrangerade, medan mikrovilli i den MTX-behandlade gruppen minskades, förkortades och stördes. Några av mikrovillierna avlägsnades. Svullnad av kärnmembranet och mitokondrier observerades. Ultrastrukturella förändringar i tarmen i MTX + G1-PS 100 mg / kg-behandlad grupp förbättrades jämfört med de i den MTX-behandlade gruppen (figur 2).

Image

Förändringar av tarmens ultrastruktur. (A) normal kontrollgrupp. (B, D, E) MTX-modellgrupp. (C, F) grupp av 100 mg / kg G1-PS under MTX-spänning. Pilen (D) indikerar svullnad av kärnmembran. Pilen (D, E) indikerar snäv korsning. * indikerar svullnad av mitokondrier.

Bild i full storlek

G1 -PS minskade MDA-nivåer men ökade SOD-nivåer i tarmens möss

Vi visade att koncentrationen av MDA i tarmen hos möss i den MTX-behandlade gruppen var signifikant högre än i den normala kontrollgruppen ( P <0, 001). Vi observerade dock minskningar i MDA-koncentrationen i MTX + G1-PS-grupper på ett dosberoende sätt (figur 3). SOD-nivån i MTX-modellgruppen var emellertid nedreglerad jämfört med nivån i kontrollgruppen ( P <0, 01). MTX-inducerade minskningar i SOD svarade på G1-PS-behandling på ett dosberoende sätt ( P <0, 05) (figur 4).

Image

Effekt av G1 -PS på MDA-innehåll i supernatant homogenat för tarmen i MTX-inducerade möss. n = 9. Medelvärde ± SD. c P <0, 01 vs normal kontroll. e P <0, 05, f P <0, 01 mot MTX-modell.

Bild i full storlek

Image

Effekt av G1 -PS på SOD-innehåll i supernatant homogenat av tarmen i MTX-inducerade möss. n = 9. Medelvärde ± SD. c P <0, 01 vs normal kontroll. e P <0, 05, f P <0, 01 mot MTX-modell.

Bild i full storlek

Koncentrationen av IgA i serum

Koncentrationen av totalt serum-IgA mättes med användning av en ELISA. MTX-behandling minskade signifikant den totala serum-IgA-koncentrationen jämfört med den normala kontrollen ( P <0, 05). G1-PS-behandling höjde koncentrationen av IgA på ett dosberoende sätt (figur 5).

Image

Effekt av Gl -PS på serum-IgA-nivå i MTX-inducerade möss. IgA-nivå visar med OD 490- värde. n = 7. Medelvärde ± SD. b P <0, 05 vs normalt. e P <0, 05 mot MTX-modell.

Bild i full storlek

Effekt av G1 -PS på spridningen av IEC-6-celler

Cellerna inkuberades med olika koncentrationer av G-PS (0, 1, 1 och 10 | ig / ml) under 48 timmar. Såsom visas i tabell 1 främjade G1 -PS signifikant spridningen av IEC-6-celler på ett dosberoende sätt jämfört med kontrollen. Proliferationsgraden var 34% högre i celler som behandlades med 10 μg / ml G1-PS jämfört med den i kontrollcellerna.

Full storlek bord

G1 -PS-modulerade mRNA-expressionsprofiler av ODC och c-Myc i IEC-6-celler

Semikantitativ RT-PCR användes för att bestämma effekten av Gl-PS på ODC och c-Myc mRNA-uttrycksprofiler i IEC-6-celler. Såsom visas i figurerna 6 och 7 uttrycktes ODC- och c-Myc-mRNA i IEC-6-celler. G 1 -PS (10 och 20 μg / ml) behandling uppreglerade signifikant uttrycket av ODC och c-Myc mRNA jämfört med det i den normala kontrollgruppen (figur 6 och 7).

Image

MRNA-uttrycket av ODC och GAPDH i IEC-6-celler genom RT-PCR. (A) 1–4: IEC-6-celler behandlades med 0, 5, 10 och 20 μg / ml G1-PS och det är mRNA-uttryck för ODC. a – d: IEC-6-celler behandlades med 0, 5, 10 och 20 μg / ml G1-PS och det är mRNA-uttryck för GAPDH. (B) PCR-produkter kvantifierades genom densitometrisk avsökning och ODC-uttryck normaliserades i förhållande till det stabila uttrycket av GAPDH, som användes som intern kontroll (intensitetsförhållande: ODC till GAPDH). Värden representerar medel ± SD från tre oberoende experiment. b P <0, 05, cP <0, 01 vs normalt.

Bild i full storlek

Image

MRNA-uttrycket av c-Myc och GAPDH i IEC-6-celler genom RT-PCR. (A) 1–4: IEC-6-celler behandlades med 0, 5, 10 och 20 μg / ml G1-PS och det är mRNA-uttryck för c-Myc. a – d: IEC-6-celler behandlades med 0, 5, 10 och 20 μg / ml G1-PS och det är mRNA-uttryck för GAPDH. (B) Kvantifiering av RT-PCR-data. n = 3. b P <0, 05 vs normal kontroll.

Bild i full storlek

G1 -PS förbättrade IEC-6-cellersättning

Såsom visas i tabell 2 orsakade G1 -PS en dosberoende förbättring av tarmepitelcellsrestitution i en väl etablerad sårmodell med IEC-6-cellmonolager. Vi upptäckte en 36% ökning av återställningen av IEC-6-celler som behandlades med 10 μg / ml G1-PS jämfört med kontrollcellerna.

Full storlek bord

Effekter av Gl-PS på TGFp-nivåer i IEC-6-cellkultursupernatanter

Nyare bevis har stöttat en central roll för TGFp i processen för tarmepitelrestitution 14 . Därför mättes produktionen av TGFp för att bestämma den möjliga involveringen av detta cytokin i GI-PS-medierad restitution. Ingen signifikant effekt observerades på produktionen av TGFp efter G1-PS-behandling (tabell 3).

Full storlek bord

Diskussion

Tarmens epitelbarriär, inklusive de biotiska, mekaniska och immunitetsbarriärerna, är en avgörande barriär mot patogeninfektion. Tidigare studier har inte visat en effektiv metod för att förhindra IMB-skada 15 . Det är nödvändigt att utveckla naturliga läkemedel som är effektiva vid behandling av IMB-dysfunktion och samtidiga sjukdomar. I den aktuella rapporten undersöktes effekterna av G1 -PS på tarmens epitelbarriär.

Kemoterapi ger vanligtvis strukturell skada på tarmslemhinnan hos cancerpatienter 16 och orsakar biverkningar såsom svår enterokolit. I överensstämmelse med tidigare studier 17 avslöjar resultaten av den aktuella studien att MTX inducerade tunntarmsskada, som kännetecknas av villusförkortning och fusion, epitelial atrofi, kryptförlust, inflammatorisk infiltration av lamina propria och uttömmning av bägare celler. G l -PS-behandling reducerade tarmslemhinnan i denna studie och minskade magslemhinneskador i en tidigare studie 18 .

Ökad oxidativ stress och minskat antioxidantförsvar har påvisats i tarmslemhinnebiopsier hos patienter med MTX-inducerad skada på tunntarmsepitelet. Dessa skador kan minskas med antioxidant. Som tidigare rapporterats har skyddande effekter av olika antioxidanter, såsom curcumin 19, åldrad vitlöksekstrakt 20 och N-acetylcystein 17, visats i MTX-inducerad tunntarmsskada. MDA används ofta vid mätning av lipidperoxidnivåer och korrelerar med graden av lipidperoxidation. SOD-nivåer korrelerar med eliminering av fria radikaler. G1-PS har använts i stor utsträckning som antioxidanter in vivo och in vitro 21, 22, 23 . I den här studien undersökte vi därför om G1-PS hämmar MTX-inducerad tunntarmsskada via sänkande MDA-nivåer och ökande SOD-nivåer. Vi visade att MDA-nivån i tunntarmsslemhinnan hos MTX-behandlade möss ökades anmärkningsvärt, vilket tyder på att MTX-behandlingen orsakade oxidativ skada och lipidperoxidation i tarmslemhinnan. MTX-inducerade ökningar i MDA-nivåer dämpades efter administration av G-PS (figur 3). Dessa fynd kan indikera att G1 -PS skyddar tarmvävnad mot MTX-inducerad lipidperoxidation. Föreliggande studie demonstrerade också att den MTX-inducerade nedregleringen av SOD hämmades genom GI-PS-behandling i tarmslemhinnan hos möss (figur 4). Dessa resultat antyder att effekterna av G1-PS kan uppnås via dess antioxidant- och fria radikala eliminerande aktiviteter.

Immunoglobulin A (IgA) är en viktig komponent i tarmens immunologiska barriär och är det vanligaste immunglobulinet vid slemhinnans yta där det spelar en avgörande roll i slemhinneskyddet 24 . Den skyddande barriären i mag-tarmsystemet försämras i IgA-brist, och personer med IgA-brist tenderar att utveckla gastrointestinala infektioner 25, 26 . G1 -PS är välkända modulatorer för immunsystemet 27, 28 . I denna studie fann vi att MTX-behandlade möss uppvisade en reducerad nivå av serum IgA. Detta resultat indikerar att slemhinnans immunbarriär dysfunktion uppstår under MTX-inducerad tarmskada. G1 -PS återställd nivån av IgA, vilket tyder på att G1 -PS förstärkte tarmimmunitet.

Observationer under de senaste åren har visat förmågan hos mag-tarmkanalen att snabbt återställa kontinuiteten i ytepitelet efter omfattande förstörelse. Tre olika faser har identifierats. Först migrerar epitelceller som ligger intill eller precis under den skadade ytan in i såret för att täcka det denuderade området, vilket är en process som har betecknats epitelrestitution. För det andra sker epitelcellsproliferation för att fylla på den minskade cellpoolen. Slutligen möjliggör mognad och differentiering av epitelceller epitelet att upprätthålla sin funktionella verksamhet 12 . Den inledande mekanismen som bidrar till snabb återförslutning av epitel-defekter efter slemhinneskada är migrering av livskraftiga epitelceller från sårmarginen in i den denuded area, vilket är en process som inte kräver cellproliferation 29 . Uppgifterna som presenterades i denna studie avslöjade att G1 -PS i en koncentration av 10 μg / ml förstärkte migrationen av tarmepitelceller i en in vitro- modell som efterliknade de tidiga celldelningsoberoende stadierna av epitelrestitution. När G1-PS tillsattes omedelbart efter såret ökade de betydligt tarmens epitelcellmigration på ett dosberoende sätt. Även om den exakta mekanismen för restitution inte har klargjorts har cytokin TGFp visat sig spela en viktig roll i stimuleringen av cellmigration efter sår. Vissa studier har visat att tarmens epitelcellsrestitutionsprocess stimuleras via en TGFp-beroende väg 30, 31 . I andra fall var emellertid tarmens epitelcellsrestitution oberoende av TGFp 32 . I vår studie fann vi att G1 -PS inte påverkade TGFp-uttryck i IEC-6-celler efter att ha skadats. Dessa resultat kan indikera att G1 -PS stimulerar restitution möjligen genom en TGFp-oberoende väg.

Epitelcellsproliferation, som är en annan väsentlig mekanism för att förmedla återförslutning av slemhårsår i tarmen, främjades väsentligen genom G1-PS-behandling i vår undersökning. Denna effekt var dosberoende och maximala effekter detekterades i en koncentration av 10 μg / ml G1-PS.

Polyaminerna är en grupp av allmänt distribuerade organiska katjoner som är intimt involverade i regleringen av gastrointestinal slemhinnetillväxt 33 . ODC, som är ett pyridoxalt fosfatberoende enzym, är det första hastighetsbegränsande enzymet för biosyntes av polyaminer. Omfattningen av ODC-mRNA-uttrycket korrelerar med cellproliferationen. Behandling av gastrointestinala ursprungsceller med difluormetylornitin, som är en självmordsubstratinhibitor av ODC och inducerar utarmning av intracellulära polyaminer, hämmar spridning 34, 35 . Dessutom kan induktion av ODC-genen spela en viktig roll i signalvägarna som är associerade med flera onkogener. Transformation genom aktiverad ras , v-src och myc verkar vara tätt kopplad till ODC-genuttryck och polyaminackumulering 36, 37, 38 . ODC är ett transkriptionellt mål för c-Myc 39, som har en central roll i spridningen av normala celler. Efter mitogen stimulering av vilande celler induceras c-Myc snabbt och förblir förhöjd, vilket antyder att det krävs för kontinuerlig celltillväxt 40 . I den aktuella studien observerades en ökning av c-Myc och ODC- genuttryck (figur 6 och 7) i IEC-6-celler 12 timmar efter exponering för G1-PS. c-Myc och ODC- genuttryck var sammanfallande med den stimulerande effekten på cellproliferation (tabell 1).

Sammanfattningsvis visade den aktuella studien att G1 -PS minskade MTX-inducerad tarmtoxicitet. Vi demonstrerade att G1-PS ökade antioxidationen och tarmimmuniteten in vivo , påskyndade sårreparation genom att stimulera cellproliferation och migration in vitro och uppreglerat c-Myc och ODC mRNA-uttryck. G1 -PS hade emellertid inga effekter på TGFp-nivåer. Sammantaget visade vi en ny skyddande effekt av G1 -PS på tarmbarriären via induktion av epitelcellsproliferation och migration. Föreliggande studie kan tillhandahålla en farmakologisk grund för den kliniska användningen av G1-PS för att förhindra enterit hos patienter som får kemoterapeutiska medel. Tidigare studier har visat att celldifferentiering också spelar en viktig roll för att skydda tarmbarriären. Effekten av G1 -PS på celldifferentiering bedömdes emellertid inte i denna studie. Därför krävs ytterligare undersökning med användning av molekylära markörer såsom sackar-isomaltas och alkaliskt fosfatas.

Författares bidrag

Li-hua CHEN, Wei-dong LI och Z hi-bin LIN designade forskningen; Li-hua CHEN utförde forskningen; Wei-dong LI och Zhi-bin LIN bidrog med nya analysreagens och verktyg; Li-hua CHEN och Wei-dong LI analyserade data; och Li-hua CHEN skrev uppsatsen.