Gangliosid-synthas-knockout i onkogen-transformerade fibroblaster tappar gangliosider och försämrar tumörtillväxt | onkogen

Gangliosid-synthas-knockout i onkogen-transformerade fibroblaster tappar gangliosider och försämrar tumörtillväxt | onkogen

Anonim

ämnen

  • glykolipider
  • onkogenes

Abstrakt

Biologiskt aktiva membrangangliosider, uttryckta och frisatta av många mänskliga tumörer, antas för att signifikant påverka tumörprogression. Brist på en modell för fullständig och specifik tumör gangliosidutarmning in vivo har emellertid hindrat belysningen av deras roll. Här rapporterar vi skapandet av ett nytt, stabilt, genetiskt inducerat tumörcellsystem som resulterar i specifik och fullständig blockad av gangliosidesyntes. Vildtyp (WT) och GM3 syntas / GM2 syntas dubbel knockout (DKO) murina embryonala fibroblaster transformerades med användning av amphotropa retrovirusomvandlade onkogener (pBABE-c-Myc T58A + H-RasG12V). De transformerade cellerna, WTt respektive DKOt, bevisade jämförbara integrerade kopieringsnummer och onkogenuttryck. Gangliosidsyntes blockerades fullständigt i DKO t- cellerna, viktigt utan att utlösa en alternativ väg för gangliosidesyntes. Gangliosidutarmning (till <0, 5 nmol / 10 7 celler från 9 till 11 nmol / 10 7 WT t eller otransfekterade normala fibroblaster) påverkade inte negativt cellproliferationskinetiken men minskade cellmigrationen på fibronektinbelagda brunnar, i överensstämmelse med våra tidigare observationer i gangliosid-utarmade normala humana fibroblaster. Påfallande, trots liknande onkogenuttryck och tillväxtkinetik, visade DKO t- celler signifikant försämrad tumörtillväxt i syngena immunkompetenta möss, vilket understryker tumörcells gangliosides avgörande roll och tillhandahåller ett idealiskt system för att undersöka deras verkningsmekanismer in vivo .

Introduktion

Gangliosider är biologiskt aktiva glykosfingolipider, allestädes närvarande i däggdjursceller och består av en negativt laddad sialinsyrainnehållande kolhydrathuvudgrupp fäst vid en ceramid som förankrar molekylen främst i den yttre broschyren i cellmembranets lipid-skikt. Dessa molekyler erkänns ha flera effekter - till exempel fungerar som cellyteceptorer och markörer, deltar i intercellulär kommunikation och modulerar cellsignalering, cellcykling och cellmobilitet (Allende och Proia, 2002; Regina Todeschini och Hakomori, 2008) .

Gangliosider av tumörer är särskilt viktiga. De är båda mycket uttryckta (Hakomori, 1973) och kastas aktivt från tumörcellytan både in vitro och in vivo (Ladisch et al., 1983). Deras utgjutning kan förändra funktionen hos normala celler närvarande i tumörens mikromiljö, vilket ursprungligen antyddes av fynd av potent immunsuppressiv aktivitet hos skjulet gangliosider av ett murint lymfom (Ladisch et al., 1983). Därefter har immunosuppressiv aktivitet av tumörgangliosider som skjutits ut av många olika tumörtyper rapporterats (Floutsis et al., 1989; Uzzo et al., 1999; Buggins et al., 2001; Shurin et al., 2001) som ytterligare stödjer konceptet att dessa kasta gangliosider kan störa cellulära immunsvar som är kritiska för effektiv antitumörimmunitet. I kontrast till dessa undertryckande effekter har senare förbättrats effekter på funktionen hos andra celler som finns i tumörens mikromiljö. Exempelvis ökade anrikning av membranen hos normala fibroblaster med komplexa gangliosider tillväxtfaktorinducerad receptoraktivering, signalering och cellproliferation (Li et al., 2001; Liu et al., 2004). Och membrangangliosidberikning av vaskulära endotelceller förstärkte VEGF-inducerad signalering och de tillhörande cellulära responserna av proliferation och migration som är viktiga för angiogenes (Liu et al., 2006).

Studier in vivo kopplar också tumör gangliosider med tumörbildning och progression. Två exempel är (1) dramatiskt ökad tumorigenicitet hos dåligt malig gangliosidfattiga murina tumörceller genom anrikning av deras membran med gangliosider renade från besläktade mycket tumörgena tumörceller (Ladisch et al., 1987) och hos människor (2) höga nivåer av cirkulerande tumörgangliosider vid diagnos förknippas med snabbare tumörprogression av neuroblastom (Valentino et al., 1990). Sammantaget antyder dessa studier att tumörcells gangliosider kan ha en kritisk underlättande roll i tumörbildning och progression.

Det som har saknats för att definitivt testa denna hypotes är emellertid en tumörmodell där förändringen i tumörcells gangliosiduttryck är konstitutiv, fullständig och selektiv. För att uppnå detta inledde vi en ny, genetisk strategi som försökte stabilt och maximalt tömma tumörcells gangliosidesyntes. Genom kombinerat knockout (Yamashita et al., 2005) av två viktiga gangliosidsyntesenzymer, GM3-syntas (GM3S) och GM2-syntas (GM2S), visat i kompletterande figur 1, fann vi murina embryonala fibroblaster (MEF) för att bli nästan fullständigt uttömda av gangliosider. Vi transformerade dessa celler och vildtyp (WT) MEF med c-Myc och H-Ras oncogenes (Thompson et al., 1989). De transformerade WT-cellerna bibehöll den normala gangliosidprofilen, medan de transformerade dubbla knockout-cellerna (DKO) -cellerna utarmades och uppvisade en slående hindrad tumörtillväxt. Detta genetiskt gangliosidutarmade tumörcellsystem tillhandahåller en värdefull modell för in vivo och in vitro- studier som är riktade mot att tydligt definiera rollen för gangliosider i tumörbildning / progression. Resultaten kan till slut utgöra grunden för en nyinriktad terapeutisk strategi för mänsklig cancer.

Resultat

c-Myc T58A / H-Ras G12V- transformation av MEF: er

Fibroblaster (MEF) odlades från E11.5-embryon av GM3S / GM2S DKO och kullmatt WT-möss, som vi uppfödde genom att korsa GM3S-knockout med GM2S knockout-möss. Onkogenerna c-Myc och H-Ras kombinerades i en plasmid (pBABE-c-Myc T58A + H-RasG12V). Amphotropa retrovirus innehållande plasmiden genererades från AmphoPack-293-cellinjen genom transfektion (Kendall et al., 2005). Dessa användes för att infektera MEF från lågpassage (p4–5) kulturer av GM3S / GM2S DKO och kullmatt WT-möss. Den infekterade MEF observerades för karakteristiska förändringar i morfologi som indikerar framgångsrik transduktion. Kolonier med förändrad morfologi och förlust av kontaktinhibering odlades för> 30 passager för att eliminera otransfekterade celler. Kolonier som valts slumpmässigt för ytterligare utvärdering och hänvisades till som WT t (transformerad WT MEF) och DKO t (transformerad GM3S / GM2S DKO MEF) expanderades för användning i de efterföljande experimenten och alikvoter frusna.

Morfologi för WT och GM3S / GM2S DKO MEF före transformation var liknande (figurerna la och c), medan de onkogen-transformerade cellerna (WT t och DKO t ) skilde sig från den otransformerade MEF och också från varandra. Båda hade mindre cytoplasma och var mindre än de otransformerade cellerna (figurerna Ib och d), medan DKO t- cellerna hade en mer utplattad morfologi och var mindre refraktila än WT t- cellerna.

Bekräftelse av omvandling av MEF. Faskontrastfotomikroskopi av odlade MEF: er. Nyckel: otransformerad WT MEF ( a ) och DKO MEF ( c ) och c-Myc T58A / H-RasG12V-transformerad vildtyp (WT t , b ) och GM3S / GM2S dubbel knockout (DKO t , d ) celler. RT – PCR-analys ( e ) visar den transkriberade H-RasG12V-mutationen i transformerade WTt- och DKOt-celler men inte i otransformerade celler (P, N, är positiva och negativa kontroller för H-RasG12V). Western blot-analys visar överuttryck av onkogenproteiner, c-Myc och H-Ras, i de transformerade WTt- och DKOt-cellerna, men inte i otransformerade celler ( f, högra körfält).

Bild i full storlek

Omvänd transkriptas-polymeras-kedjereaktion (RT – PCR) -amplifiering visade att H-RasG12V-onkogen uttrycktes i både WTt- och DKOt-celler, men inte i den otransformerade MEF (figur 1e), som förväntat. Western blots dokumenterade överuttryck av c-Myc / H-Ras i de transformerade men inte de otransformerade MEF: erna (figur 1f), med liknande uttrycksnivåer i de två transformerade populationerna (WT t och DKO t ). För att oberoende verifiera dessa resultat kvantifierade vi H-RasG12V DNA och mRNA i den transformerade MEF med realtid PCR och kvantitativ RT – PCR. Det relativa antalet integrerade kopior av H-RasG12V var lika (1, 0 respektive 1, 20, WT t respektive DKO t ; Tabell 1). Dessutom var det relativa uttrycket av den transducerade H-RasG12V också jämförbart om än något högre i DKO t- cellerna (1, 58 mot 1, 0 i WT t- celler, tabell 1). Från dessa kvantitativa studier drar vi slutsatsen att integration och expression av de transducerade onkogenerna är likartade i WT t- och DKOt-cellerna.

Full storlek bord

Cellulära gangliosider

Två tillvägagångssätt användes för att bedöma gangliosider - mycket känslig metabolisk ( 14 C-galaktos / glukosamin) radiomärkning / HPTLC autoradiografi för att upptäcka gangliosid-neosyntes och därmed aktiviteten hos målenzymerna och direkt kemisk detektion / HPTLC densitometri för att bestämma förändringar i cellulär gangliosidinnehåll inducerad av knockout. GM3S / GM2S DKO MEF, före onkogen transformation, visade praktiskt taget fullständig utarmning av cellulära gangliosider (0, 4 nmol / 10 7 DKO MEF vs 8, 5 nmol / 10 7 WT MEF, figur 2a), vilket bekräftade att dessa celler skulle vara användbara för de planerade onkogena transformationerna . Efter c-Myc / H-Ras onkogen transformation transformerades gangliosidssyntes och expression i WT-cellerna, medan knockout av GM3S- och GM2S-enzymaktivitet bibehölls i DKO t- cellerna (figur 2b), i vilka radiomärkta nyligen syntetiserade gangliosider var frånvarande och, såsom kemiskt detekterat, förblev cellulära gangliosider väsentligen fullständigt uttömda (0, 5 nmol / 107 celler mot 11 nmol / 10 7 WT t- celler, figur 2b). Konservering av den gangliosid-utarmade fenotypen vid in vivo- passage av DKO-cellerna, ett väsentligt kännetecken för ett användbart modellcellsystem för in vivo- studie, testades också. Växande DKO-tumörer ( vide infra ) explanterades och de återvunna tumörcellerna analyserades. Återigen demonstrerades frånvaron av gangliosidesyntes och uttryck (figur 2c), liksom underhåll av onkogen transformation (genom PCR-amplifiering av H-RasG12V, ej visad).

Glykosfingolipidinnehåll i c-Myc / H-Ras-transformerade GM3S / GM2S dubbel knockout DKO t och transformerade vildtyp WT t MEFs. ( a ): HPTLC av gangliosider av icke-transformerade DKO- och WT-kontroll-MEF: er visualiserade med resorcinol; svaga band som ses i DKO-celler genom resorcinolfärgning kan vara gangliosider adsorberade från FCS i mediet. ( b ): Gangliosider av de transformerade cellerna, WTt och DKOt, metaboliskt radiomärkta med 14 C-galaktos / glukosamin, renade och visualiserade genom resorcinolfärgning och autoradiografi av samma HPTLC-platta. DKO-prover visar nästan fullständig nedbrytning av gangliosid (resorcinolfläck) och blockad av gangliosidsyntes (metabolisk radiomärkning); dubletten som migrerar ovanför GM3 i DKO t autoradiogram är resorcinol negativ, alltså icke-gangliosid, förorenande. ( c ): Gangliosider av tumörceller av WT t och DKO t efter passage in vivo . Cellerna återvanns från tumörexplanteringar och behandlades som i ( b ). ( d ): HPTLC-detektion av gangliosidprekursorerna ceramid, glukosylceramid och laktosylceramid i DKO- t och WT-celler. Ceramid (vänster) och GlcCer / LacCer (höger), jämfört med standarder, visualiserades genom charring respektive orcinolfärgning. ( e ): stapeldiagrammet visar medelvärden ± sd-koncentrationer ( n = 3) av dessa gangliosidprekursorer. Jämförelse av DKO t med WT t- celler ökade glukosylceramid mildt (65%, P = 0, 05); ökningar av ceramid (30%) och laktosylceramid (36%) var inte signifikanta.

Bild i full storlek

Kritisk för validering av en specifikt gangliosid-utarmad modell är bekräftelse av endast minimala förändringar i koncentrationer av andra relaterade molekyler till följd av förändringar i enzymaktivitet i den metaboliska vägen blockerad. Dessa kan orsakas antingen genom aktivering av en alternativ väg inte till skillnad från den som observerades i GM3S knockout-musfibroblaster (Shevchuk et al., 2007) eller av ackumulering av uppströms gangliosidprekursorer, ceramid och de neutrala glycolipiderna glukosylceramid och laktosylceramid (kompletterande figur 1) . Gangliosidesyntes med en alternativ väg upptäcktes inte, varken genom metabolisk radiomärkning eller genom direkt HPTLC-färgning (figurerna 2a – c), och det fanns endast mindre ökningar av de neutrala glykolipiderna och ceramid (figur 2d och e).

Fästning, morfologi, spridning och migration av onkogen c-Myc / H-Ras-transformerad MEF

Förmågan hos WT t och DKO t celler att vidhäfta var lika och effektiv. Av 8, 5 × 105 celler pläterade / brunn i sex-brunnars plattor hade 93% av WT t och 96% av DKO t- celler fästs inom 4 timmar efter plätering, vilket indikerar att gangliosidutarmningen av DKO t- celler inte störde deras förmåga att följa (kompletterande figur 2). Kultur på olika extracellulära matriser (ECM) lyfte fram några morfologiska skillnader mellan WT t och DKO t cellerna före och efter att de hade nått sammanflytning (figur 3). På alla testade matriser verkade DKO t- celler mer platt, vilket bibehöll en nästan perfekt monolager med en enda cell, medan WT t- cellerna var anordnade i ett korsande mönster tydligt särskilt vid låg celldensitet och var mycket refraktila med flerskiktsorienterade mönster och stapla upp celler med hög celltäthet.

Morfologi av de c-Myc / H-Ras-transformerade WTt- och DKOt-cellerna. Fotomikrografier (100 ×) av transformerade WTt- och DKOt-celler tagna i områden med låg celltäthet (kolumner A, 24 timmar efter plätering) och hög celltäthet (kolumner B, efter sammanflöde). Klara skillnader ses i morfologi och tillväxtmönster för onkogen-transformerade celler, både på obelagd plast och på flera extracellulära matriser (ECM) - kolagener IV och I, fibronektin, laminin och poly-D-lysin.

Bild i full storlek

Den totala proliferationskinetiken, analyserad genom cellräkning och med 3H-tymidinupptag, var väsentligen identisk för WT t- och DKOt-cellerna, både på plast och på fibronektinbelagda plattor (figur 4). Befolkningens fördubblingstider (∼ 11, 3 h) och tillväxthastigheter i logfasen ( k = 2, 1 / dag) var lika. Denna och liknande mättnadstäthet för de två populationerna indikerade att det inte fanns någon negativ effekt av gangliosidutarmning på den intrinsiska förmågan hos DKO t- celler att autonomt sprida sig. Det fanns inte heller några tecken på ökad apoptos av de gangliosidutarmade cellerna; i en 4-dagars kultur analyserad med FACS med 7-AAD och annexin-V fanns 10, 3 ± 6, 4 mot 8, 71, 5 apoptotiska celler, WT t vs DKO t , respektive ( P = 0, 56).

Proliferation av WTt- och DKOt-celler. ( a, b ): 3 x 10 ^ celler utsädes / brunn i plattor med 12 brunnar och räknades dagligen under 7 dagar. ( c, d ): celler ympades vid 300 / brunn i plattor med 96 brunnar och 3H-tymidinupptag kvantifierades dagligen. ( a, c ): fibronektinbelagda plattor. ( b, d ): obelagda plastplattor. Varje punkt representerar medelvärdet ± sd för sex experiment.

Bild i full storlek

Cellmigration bedömdes på olika matriser. Den mest betydande migrationen av WT-celler inträffade på fibronektin och var flera gånger mer än för baslinjemigration på en obelagd yta (figur 5). Den fibronektinrelaterade förbättrade migrationen var väsentligen frånvarande i de gangliosidutarmade (DKO t ) cellerna. Fibronektinassocierad migration hämmades också fullständigt av en anti-integrin P1-antikropp, anti-CD29, vilket implicerade ett integrin-relaterat gangliosidkrav för denna migration (figur 5). Migrering av WT t vs DKO t celler på flera andra matriser (BSA, kollagen-1, laminin) var liknande och endast något större än migration på obelagda ytor (kompletterande figur 3). Dessa resultat stöder vidare en särskilt stark effekt av frånvaro av gangliosid på integrinförmedlad migration.

Cell migration av WT t och DKO t celler. 3 × 10 3 WT t- eller DKOt-celler utsädes / brunn och 4-timmars migration på obelagda (vänster) eller fibronektinbelagda brunnar (mitten), eller fibronektinbelagda brunnar med anti-CD29-antikropp (höger) bedömdes. Migrering i Transwell-kulturerna kvantifierades med spektrofotometri såsom beskrivs i material och metoder. Stänger representerar medelvärdet ± sd för flera analyser i två till fem separata experiment. WT t -cellmigration på fibronektin upphävdes av anti-integrin P1-antikropp. DKO t -cellmigration reducerades signifikant på fibronektinbelagda brunnar ( P <0, 0001).

Bild i full storlek

Tumorigenicitet hos onkogen-transformerad MEF

Ett initialt in vitro- test av de transformerade cellers potentiella förmåga att bilda tumörer var att bedöma effekten av tumörcells gangliosidutarmning på tumörgenerisk potential genom att kvantifiera bildandet av kolonier av WT t och DKO t- celler i mjuk agar (Villar et al., 2007). Dessa experiment gav en blandad bild, medan WTt-celler bildade något fler kolonier än gjorde DKOt-celler (431 ± 27 mot 366 ± 12 / brunn, P = 0, 02), DKOt-cellerna tycktes bilda större kolonier (figur 6a).

Tumorigenicitet hos onkogen-transformerade WTt- och DKOt-celler. ( a ) In vitro ympades 5 x 104 celler / brunn i mjuk agar i plattor med sex brunnar, inkuberades under 2 veckor och fotograferades sedan. Koloninummer kvantifierades med användning av programvaran Quantity One 4.6.7 (Bio Rad, Hercules, CA, USA) vid inställningar för känslighet = 1.0 och medelvärde = 1. Stapeldiagrammet visar det genomsnittliga antalet kolonier per brunn. ( b ) Tumörbildning dokumenterades för 100% av både DKO t- och WT t- cellinjektioner. Tumörer inducerades i möss genom id-injektion av 10 5 WT t- celler (vänster flank, svarta pilar) och 105 DKO t- celler (höger flank, röda pilar). Tumörer och tumörvolymer 18 dagar efter injektion visas. Den genomsnittliga tumörvolymen för DKO t var signifikant mindre än för WT t- tumörer ( P = 0, 008). En fullfärgsversion av denna siffra finns tillgänglig på Oncogene- tidskriften online

Bild i full storlek

Resultaten med avseende på tumörbildning i denna nya modell för genetisk tumörcells gangliosidutarmning var mycket intressanta. Alla möss injicerade med 10 5 WT t- celler id (i vänster flank) och 10 5 genetiskt gangliosid-utarmade DKO t- celler (i höger flank) bildade tumörer (figur 6a) av både WT t och DKO t celler (100 % incidens), vilket visar att onkogen transformation var effektiv och inte motverkades av den genetiska gangliosidutarmningen. Det var emellertid viktigt att skillnaden i tumörtillväxt var slående: 16 dagar efter ympning var den genomsnittliga tumörvolymen WT t (408 ± 104 mm 3 ) åtta gånger än för DKO t- tumörer (50 ± 34 mm 3, P = 0, 002, Figur 6a). Detta sågs också i ett separat oberoende experiment (kompletterande figur 4). Väsentligt nedsatt tumörtillväxt av DKO-celler i syngena immunkompetenta möss visar att tumörgangliosider påverkar tumörbildning in vivo . Således kommer denna modell av stabil och specifik gangliosidutarmning i onkogen-transformerade celler att utgöra ett idealiskt system för att undersöka molekylära mekanismer för tumör gangliosidverkan, inklusive effekterna av tumör gangliosider på tumör-värdinteraktion i tumörens mikromiljö.

Diskussion

Gangliosider, en brett distribuerad molekylklass, har studerats omfattande för att definiera deras biologiska cellulära funktioner. Detta har framkallats av deras framträdande i hjärnvävnad (Ledeen, 1978), de allvarliga genetiska sjukdomarna som härrör från mutationer i de biosyntetiska och kataboliska enzymer, som förändrar gangliosiduttryck (Jeyakumar et al., 2002), och det ofta förändrade gangliosiduttrycket i tumörceller (Hakomori, 1996). Det senare åtföljs i sin tur av slående gangliosidutgjutning i tumörens mikromiljö (Ladisch et al., 1983), vilket väckte den spännande frågan om tumörgangliosider har en roll i tumörbildning. I själva verket tyder in vitro- bevis på en stor handling av gangliosider över tumörens mikromiljö - att dessa molekyler som kastas av tumörceller påverkar värdcellens funktion. Men bristen på en adekvat in vivo- modell hade varit ett formellt gap i att testa denna möjlighet. Här, genom att transformera fibroblaster som är genetiskt utarmade av gangliosider, försökte vi skapa en syngen murin tumörcellmodell där gangliosidbiosyntesen är konstitutivt, fullständigt och specifikt hämmas.

Vi undersökte initialt GM3S knockout-musmodellen (Yamashita et al., 2003) på grund av dess nästan fullständiga utarmning av gangliosider i hjärnan och på grund av att en naturligt förekommande punktmutation i den humana GM3S-genen (Simpson et al., 2004) helt blockerar gangliosidesyntes av humana fibroblaster (Liu et al., 2008). Fibroblaster av GM3S-knockout-mus hade emellertid oväntad aktivering av den normalt tyst alternativa O-syntetiska vägen vilket resulterade i betydande syntes av komplexa gangliosider (Shevchuk et al., 2007), vilket negerade modellens användbarhet för att studera effekterna av gangliosidutarmning på tumörbildning. Kombinerad knockout av GM3S och GM2S (se kompletterande figur 1), å andra sidan, blockerar även den "O" -vägen, och en mus som skapats genom korsning av de två enda knockouts hade helt blockerat syntes av gangliosid i hjärnan (Yamashita et al., 2005).

Eftersom dessa möss dör tidigt i livet, med vitmaterialpatologi och CNS axon degeneration, isolerade vi embryonala fibroblaster. Dessa MEF tappades nästan fullständigt gangliosid, vilket tillät oss att skapa gangliosid-utarmade tumörceller med en amfotropisk retrovirus-härledd plasmid (pBABE-c-Myc T58A + H-RasG12V). Både WT- och DKOt-celler hade stabila transformerade genotyper och jämförde med otransformerade celler stabila gangliosidfenotyper, vilket bekräftade att onkogen c-Myc / H-Ras-transformation i sig inte förändrade gangliosiduttryck eller aktiverade en alternativ gangliosidesyntesväg i antingen WT t eller DKO t- cellerna. Stabil, selektiv och konstitutiv hämning av gangliosidssyntes och utarmning av cellulära gangliosider - utan varken alternativ vägsaktivering eller någon signifikant ökning av andra prekursormolekyler (speciellt ceramid) i DKO t- celler - övervinner flera problem med tidigare metoder, inklusive ofullständig hämning av glykosfingolipid syntes, till exempel genom antisense-transfektion av glukosylceramid-syntas (Deng et al., 2002), och endast övergående och mindre än specifik gangliosid-hämning av tillgängliga farmakologiska hämmare, såsom PDMP (Inokuchi et al., 1989). Modellen är stabil in vivo och ger ett idealiskt system för studier av tumörtillväxt och verkningsmekanismer.

Vi undersökte nästa cellbiologiska egenskaper hos dessa nya konstitutivt gangliosidutarmade DKO-celler. Cellproliferationskinetik skilde sig inte åt mellan WT t och DKO t celler, och det fanns ingen ökning i apoptos av DKO t celler. Detta var viktigt eftersom det utesluter direkta cytotoxiska effekter av gangliosidutarmning på de transformerade cellerna som en potentiell orsak till minskad tumörgenicitet, det vill säga att reducerad gangliosidutarmad tumörtillväxt inte bara är relaterat till ökad toxicitet av gangliosidutarmning på cellviabilitet eller spridningspotential . Avsaknaden av direkta cytotoxiska effekter passar med frånvaron av någon väsentlig ökning av DKO t- celler från gangliosidprekursorer (särskilt ceramid), ökningar som har kopplats till cell apoptos (Schenck et al., 2007). Den enda lilla ökningen av ceramid i DKO t- cellerna överensstämmer med fynd (Yamashita et al., 2005) om ingen ökning av hjärn ceramid hos DKO-möss.

En biologisk in vitro -cellfynd som signifikant förändrades i DKO t- cellerna var deras förmåga att migrera. Eftersom tumörcellmigration är viktig för den metastatiska processen har många tidigare studier utvärderat effekterna av kvalitativa och kvantitativa gangliosidförändringar på in vitro- migrationen av tumörceller av olika celltyper och på olika matriser. Vid denna tidpunkt är det svårt att dra en enda enhetlig slutsats eftersom förbättring av gangliosiden av migration hittades i vissa studier (Saha et al., 2005; Cazet et al., 2009) och hämning hos andra (Hyuga et al., 1999; Mitsuzuka et al., 2005). De olika fynden kan mycket väl vara relaterade till celltyp eller en följd av specifika olika förändringar i gangliosidkompositionen i dessa tidigare studier. Detta kommer att kräva ytterligare undersökning. Här observerades den största förbättringen av migrationen av WT-celler på en fibronektinyta, upphävdes när cellgangliosiderna var frånvarande och hämmades av anti-integrin-P1-antikropp. Tillsammans pekar resultaten på ett integrin-relaterat gangliosidkrav för denna migration (ett koncept som överensstämmer med tidigare tanke) och pekar på den förändrade migrationen som möjligen avser de efterföljande observationerna om tumörtillväxt av dessa celler nedan.

Vårt ultimata syfte med att utveckla denna modell är att fullt ut kunna utforska effekterna av specifik tumörcell gangliosidutarmning in vivo . Även om DKO t- cellbeteende i mjuk agar (endast mildt drabbade) inte gav ett särskilt starkt antydning, visar den slående försämringen av DKO t tumörtillväxt tydligt den hämmande konsekvensen av tumörcells gangliosidutarmning på tumörigen potential in vivo . Flera nya och viktiga slutsatser kan dras: för det första antyder minimala in vitro- konsekvenser trots fullständig frånvaro av alla gangliosider att gangliosider inte är absolut nödvändiga för tumörcellöverlevnad. Ändå hindrades tumörtillväxt, vilket antydde att värdledda gangliosider inte kan kompensera för denna frånvaro i tumörcellerna; för det andra står den uppenbara mildheten hos in vitro- förändringarna i DKO t- cellen i skarp kontrast till den hämmande effekten på tumörtillväxt in vivo , vilket stöder konceptet att en kritisk faktor i tumörpromotering kan vara effekterna av att kasta tumörgangliosider på normal värdcellfunktion värdtumörens mikromiljö. Mekanismer kan till exempel inkludera direkta modifierande effekter av utgjutna gangliosider på normal cellfunktion (genom att binda till dessa normala celler i mikromiljön) eller en "skyddande" roll av gangliosider på tumörcellytan, mot värdförsvar såsom antitumör immunsvar. in vitro- fynd stöder båda dessa mekanismer - förstärkta svar på VEGF hos normala vaskulära endotelceller berikade med gangliosider, vilket kan uppstå genom att kasta bort (Liu et al., 2006) och hämning av immunsvar från tumörgangliosider (Ladisch, 2003). Således, förutom att titta på tumörcellen själv för att förstå rollen för gangliosider i tumörbildning, i våra framtida studier kommer det att vara både viktigt och nu möjligt med vår nya modell för oss att undersöka tumör-värdinteraktioner in vivo i detta sammanhang.

Sammanfattningsvis skapar och skapar dessa studier en ny modell för studien av mekanismerna för effekter av gangliosider på både cellbiologi in vitro och tumörbildning in vivo . Fördelarna med systemet är att gangliosidutarmning är fullständig, det finns liten förändring av uppströms föregångare för gangliosider med potentiell biologisk aktivitet, systemet är genetiskt stabilt, DKO t- celler kan bilda tumörer och gangliosidfenotyper av både WT t och DKO t , bevaras vid passage in vivo . Sammantaget kommer dessa egenskaper att tillhandahålla ett idealiskt modellsyngent system för att bättre förstå mekanismer genom vilka gangliosidutarmning hindrar tumörbildning, en långvarig fråga av stort intresse för cancerbiologi med implikationer för utvecklingen av nya riktade terapier.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

  3. 3.

    Kompletterande figur 3

  4. 4.

    Kompletterande figur 4

  5. 5.

    Kompletterande figurlegender

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)