Funktionellt distinkta subpopulationer av cpg-aktiverade minne-celler | vetenskapliga rapporter

Funktionellt distinkta subpopulationer av cpg-aktiverade minne-celler | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Differentiering
  • Genreglering i immunceller
  • Immunologi
  • Transkription

Abstrakt

Under den återkallade responsen från B-celler (Bc) resulterar snabb celldelning i flera subpopulationer av Bc. TLR-9-agonisten CpG-oligodeoxynukleotid i kombination med cytokiner orsakar Bc-aktivering och uppdelning in vitro och ökat ytuttryck av CD27 i en subpopulation av Bc. Vi antog att den prolifererande CD27 lo- subpopulationen, som har en lägre frekvens av antikroppssekretionsceller (ASC) än CD27 hi- plasmablaster, ger alternativa funktioner såsom cytokinsekretion, costimulering eller antigenpresentation. Vi utförde genomskriven transkriptionell analys av CpG-aktiverad Bc sorterad i odelade, spridande CD27 lo och spridning av CD27 hi subpopulationer. Våra data stödde en alternativ hypotes, att CD27 lo- celler är en kortvarig pre-plasmablastpopulation, som uttrycker gener associerade med Bc-receptorredigering. Odelade celler hade ett aktivt transkriptionsprogram med icke-ASC B-cellfunktioner, inklusive cytokinsekretion och costimulering, vilket antydde en koppling mellan medfödda och adaptiva Bc-svar. Transkriptomanalys föreslog ett genreglerande nätverk för CD27 lo och CD27 hi Bc differentiering.

Introduktion

Flera grupper har föreslagit en "arbetsdelning" mellan populationer av återaktiverad minne B-cell (mBc). Några av de föreslagna binära klassificeringarna inkluderar: antikropp kontra cytokin som producerar Bc 1, 2, effektor kontra regulatorisk Bc (granskad i 3 ), plasmaceller mot vilande mBc 4 och central mot effekt mBc 1 . Sådana klassificeringsscheman fokuserar generellt på terminalfunktionerna för aktiverad naiv Bc 5, 6, snarare än den tidiga differentieringen av återaktiverad mBc. Det är emellertid inte klart att aktiverad och delande mBc kan delas in i endast två kategorier: antikroppssekretion och en annan funktion, eller hur adjuvanser som oligodeoxynukleotider (CpG) kan förändra en sådan balans.

Bland de biologiska aktiviteterna för aktiverad IgG-klassomkopplad är mBc uppdelning, antikroppssekretion, cytokinsekretion och antigenpresentation (granskad i 7 ). I flera in vitro Bc-aktiveringssystem blir 30–50% av aktiverade Bc antikroppssekretionsceller (ASC) av den tredje celldelningen 8, 9 . In vivo sker sådan aktivering vid T-cellzon-lymfoid follikelgränsen, där Bc genomgår samstimulering med T-follikulära hjälpceller (TFh). Aktiverat mBc presenterar antigen och tillhandahåller ömsesidig cytokinstimulering till T-celler 10, 11 .

Bc-aktivering och proliferation kan också induceras genom CpG som verkar genom Toll-liknande receptor 9 (TLR-9). TLR-9-agonister förbättrar produktionen av antikroppar genom att Bc svarar på vaccin 12 och är i kliniska prövningar som vaccinadjuvans 13 . Vi har tidigare visat att en kombination av CpG 2008 ODN och cytokiner (IL-2, IL-10, IL-15 och BAFF) kan inducera in vitro mBc-differentiering till CD138 + plasmaceller 9 . Tidigare postulerades en arbetsdelning mellan CpG-aktiverad Bc, inklusive en uppdelning i antikropp och cytokinsekreterande celler 14 . Dessa studier har emellertid inte undersökt potentiella signalnätverk och transkriptomönster i delmängderna av CpG-aktiverad mBc. En sådan analys är viktig för att förstå skillnaderna mellan TFh och TLR-9 aktiverad mBc och antikroppssvaret genererat av dessa två vägar, särskilt med avseende på Bc-svar på TLR-9-adjuvanerade vacciner 15, 16 .

Här har vi använt transkriptomanalys för att karakterisera skillnader mellan CpG ODN-aktiverad, klassomkopplad, mänsklig mBc i tre fenotypiska kategorier: icke-uppdelande, aktiverad uppdelning och aktiverad-uppdelande-antikropp som utsöndrar Bc. Vår grupp och andra har tidigare beskrivit ökat ytuttryck av CD27 som korrelerande med divisionsberoende antikroppssekretion i CpG-stimulerad CD27 + klassomkopplad mBc 9, 17 . CD27 hi- celler har en högre frekvens av antikroppsutsöndrande celler än CD27 lo celler 18 . Av denna anledning antagade vi att CD27 lo- celler tillhandahåller andra germinala Bc-funktioner såsom cytokinproduktion, antigenpresentation eller samstimulering för T-celler. Vaccinadjuvans såsom CpG kan förändra balansen mellan dessa tillstånd.

För detta ändamål beskriver vi signifikanta skillnader mellan genuttrycksmönster för CpG-aktiverad CD27 hi IgG-utsöndring kontra CD27 för icke-utsöndrande mBc. Dessa transkriptionsmönster föreslår två genuttrycksvägar i prolifererande CpG-aktiverade mBc, med uppreglering av antikroppsproduktionsvägar i CD27 hi- undergruppen, och uppreglering av NF-kB-aktiveringsvägar i CD27 lo- underuppsättningen före differentiering till en plasmablastfenotyp. Genuttrycksmönster i odelade celler visade överraskande aktiv transkription av antigenpresentation, cytokinsekretion och samstimuleringsgener.

Resultat

CpG-stimulerade mänskliga minne B-celler är CD27 heterogena

För att undersöka en potentiell arbetsfördelning mellan CD27 hi- och CD27 lo- celluppsättningarna testade vi hypotesen att CD27 lo- celler fungerar i antigenpresentation, samstimulering eller cytokinproduktion. CpG-aktiverat humant mBc uppvisar betydande heterogenitet när de delar upp och differentierar, särskilt med avseende på IgG-sekretion och sekretionshastigheter. In vitro CpG ODN-stimulering av IgG-klassomkopplad, CD27 + humant perifert blod mBc leder till utveckling av en CD27 hi pre-plasmablast-underuppsättning som innehåller en högre frekvens av ASC än motsvarande CD27 lo- undergrupp, även om IgG-sekretionshastigheter bland ASC i endera är identiska 18 .

Vid 96 timmars stimulering med CpG plus en kombination av cytokiner (IL-2, IL-10, IL-15; CpG + CK) visade IgG-klassomvandlad human mBc ökad intracellulär IgG efter två celldelningar (fig. La) och heterogent uttryck av CD27 (fig Ib). Fraktionen av CD27 hi- celler ökade i varje generation upp till division 4 (Fig. 1c). Kvantitativa ELISPOT (qELISPOT) -analyser (Fig. Ld) visar en typisk bimodal fördelning av encelliga IgG-sekretionshastigheter och en IgG-utsöndrande cellfrekvens på endast 27%. För att undersöka de funktionella aktiviteterna för CpG-aktiverade och uppdelande av CD27 lo- celler, sorterade vi CD19 + Bc vid 96 timmar i CD27 hi, CD27 lo och odelade cellpopulationer (sortera grindar som visas i tilläggsfiguren S1 online) och utförde genom- bred transkriptomanalys. Medan CD19-nivåerna minskade blygsamt på proliferationsceller, var> 95% av cellerna inom CD19 + sorteringsgrinden. Relativa CD27-gennivåer var som förväntat för de sorterade delmängderna (se kompletterande figur S2 online). Kontrollanalys av CD3-, CD4-, CD8A- och CD8B-mRNA-uttryck genom genuppsättning och analys av CD3 med qRT-PCR visade inga bevis på kontaminering av T-celler (se kompletterande Fig. S2 online).

Normalt humant perifert blod Bc uttömdes av IgM + -celler, färgades med karboxifluorosceinsuccinimidylester (CFSE), vilket minskar i koncentration med varje celldelning och placerades i kultur med CpG ODN + IL2, IL10, IL15 och BAFF. (a) Vid 96 timmars stimulering visade flödescytometrisk analys intracellulärt IgG-innehåll ökat i avdelningar 2–5 och (b) endast en delmängd celler i avdelningar 2–5 har ökat i CD27-uttryck jämfört med odelade celler. (c) Procentandelen CD27 hi- celler per generation ökar i divisionerna 2 till 4, med en uppenbar minskning i division 5+ som kan bero på spridningen av data. Representativa data från 1 individ, n = 10 försökspersoner i 5 separata experiment. (d) Histogram av semi-kvantitativ ELISPOT-data vid denna tidpunkt visar bifasisk IgG-sekretionshastighet för det tidiga återkallningssvaret, men endast 27% av celler som utsöndrar IgG. Celler sorterades i CD27 lo, CD27 hej och odelade celler underuppsättningar som i (b) för genuppsättningsanalys. Representativa data från 1 individ, n = 10 försökspersoner i 5 separata experiment.

Bild i full storlek

Vi analyserade först resultat av genuppsättningen för signifikanta skillnader mellan CD27 hi, CD27 lo och odelade cellpopulationer från samma ämne med hjälp av en parad SAM-analys. 6 954 sonduppsättningar visade sig vara signifikant differentiellt uttryckta mellan CD27 lo och odelade vid falsk upptäcktsnivå (FDR) -nivå 0, 01. Vi valde 4 615 differentiellt uttryckta gener baserade på följande kriterium: en gen förklaras differentiellt uttryckt om minst en associerad sonduppsättning uttrycktes signifikant differentiellt. När en strängare signifikansnivå användes (FDR = 0, 008), hittades 3.093 sonduppsättningar (2.238 gener) signifikanta (tabell 1). Detta representerar en stor skillnad mellan dessa två cellpopulationer. När man jämför CD27 hi med CD27 lo- celler på FDR = 0, 01-nivå, visade sig endast 7 sonduppsättningar vara signifikant olika. Bristen på statistisk effekt beror på två skäl: a) viss överlappning av cellpopulationerna som sorterade b) provstorleken för denna studie (sex individer) är relativt liten och vi använder en mycket rigorös signifikant nivå för att testa gendifferentiering. När FDR = 0, 03 användes för denna jämförelse kunde vi hitta 2 771 betydande sonduppsättningar (2 033 gener). Expressionnivåer av flera biologiskt relevanta gener bekräftades genom efterföljande kvantitativa RT-PCR-experiment (p-värden i kompletterande tabell S2). Rad-normaliserade värmekartor (Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4 och Fig. 5) visar gener med minst en sonduppsättning som skilde sig väsentligt mellan CD27 lo och CD27 hi (†), gener i jämförelsen av CD27 lo till odelade celler som hade minst en sond som fanns inom uppsättningen av betydande sonduppsättningar vid FDR = 0, 01-nivå (*) eller FDR = 0, 008 (**).

Full storlek bord

(a) Rad-normaliserade värmekartor av genombredd transkriptionell analys med användning av Affymetrix U133 2.0 Plus-arrayer (n = 6 försökspersoner). Alla sonder visas för varje planerad gen. Med undantag av CD80 uttrycktes de flesta gener för antigenpresentation / samstimulering på högre nivåer i odelade celler. En dolk (†) indikerar gener med minst en sond som enligt SAM-analys visade sig vara signifikant olika mellan CD27 lo och CD27 hi vid FDR = 0, 03 (n = 2746 sonder). En asterisk är (*) indikerar gener i jämförelsen av odelade till CD27 lo- celler som hade minst en sond signifikant annorlunda vid FDR = 0, 01 (n = 7500 sonder) och två asterisker (**) är bredvid gener som fortfarande var signifikanta (CD27 lo / odelad jämförelse) vid FDR = 0, 008 (n = 3093 sonder). (b) Kvantitativ RT-PCR bekräftade relativa RNA-nivåer av CD40, CD74, CD80 och CD83 (n = 10 försökspersoner, inklusive samma 6 försökspersoner som analyserades genom genuppsättning) (parade T-test p-värden i kompletterande tabell 2). Poängen i varje fiolplott är medianvärdet och parenteserna indikerar interkvartilintervallet med tillägg av sannolikhetsdensiteten för data vid olika värden. (c) Flödescytometriska analyser av normal humant Bc stimulerad under 96 timmar med CpG + CK bekräftade relativa proteinnivåer per generation i överensstämmelse med RNA-nivåer för CD80 och CD83 och en högre andel CD27 lo- celler i division 1 och 2 (n = 3 försökspersoner ). Den odelade subpopulationen uttrycker högre nivåer av dessa gener. (d) Genarrayanalys visar meddelanden för IL-6, IL-7, IL-24, TNFSF12 (april), Lymphotoxin A (LTA), producerade i större mängder av odelade celler än de andra cellundergrupperna. Medan TNF och IL1A var signifikant olika mellan grupper vid en FDR = 0, 03, var de inte signifikanta vid lägre FDR: er (n = 6 försökspersoner). (e) Relativa IL-6-RNA-nivåer bekräftades med qRT-PCR. (n = 10, parade T-test p-värden i tilläggstabell 2). Poängen i varje fiolplot är medianvärdet och parenteserna indikerar interkvartilområdet med tillägg av sannolikhetsdensiteten för data vid olika värden. Förutom IL-15 producerar de odelade cellerna högre mängder av dessa cytokinmeddelanden. IL-15-meddelandet var signifikant högre i CD27 hi- celler än i CD27 lo .

Bild i full storlek

AICDA och EXO1, som har varit inblandade i somatisk hypermutation och klassomkopplingskombination, har mer omfattande mRNA-nivåer i CD27 lo- celler. Detta antyder att cellerna kan genomgå receptorredigering. IL2RA uttrycktes också vid högre nivåer av CD27 lo- celler. CCL22, CD80 och BCL2L11 uttrycktes också vid högre nivåer i CD27 lo- celler än i CD27 hi eller i odelade celler (n = 6 individer, SAM-analys q-värden i kompletterande tabell 1). (†) minst en sond som signifikant skiljer sig mellan CD27 lo och CD27 hej vid FDR = 0, 03, SAM-analys, (*) CD27 lo / undivided, åtminstone en sond signifikant, FDR = 0, 01, (**) CD27 lo / odelad vid minst en sond signifikant vid FDR = 0, 008. (b) AICDA-, IL2RA- och CCL22-mRNA-nivåer bekräftades med qRT-PCR. CCL22-nivåer mellan CD27 hi och odelade celler var inte signifikant olika (n = 10 försökspersoner, parade T-test p-värden i kompletterande tabell 2). Poängen i varje fiolplot är medianvärdet och parenteserna indikerar interkvartilområdet. AID-protein uttrycktes i högre nivåer i division 1 och 2, där CD27 lo- celler dominerar. Representativa data från 1 visad patient, n = 4 försökspersoner i 2 separata experiment. (c) Genarrayanalys visade att medan AICDA, IL2RA och EXO1 var mer omfattande i CD27 lo- celler, var många andra kärncentrummarkörer på högre nivåer i odelade celler. Naiva cellmarkörer CD5 och ABCB1 uttrycktes inte i mängder som skulle indikera naiv cellförorening. (d) Uttrycksnivåer av 7 GC-associerade gener bekräftades med qRT-PCR.

Bild i full storlek

(a) Mellannivåer för många B-cellutvecklingsmolekyler i CD27 lo- celler antyder en övergående fenotyp som överensstämmer med att utveckla pre-plasmablaster involverade i receptorredigering före differentiering (n = 6 försökspersoner, SAM-analys q-värden i kompletterande tabell 1). (†) minst en sond som signifikant skiljer sig mellan CD27 lo och CD27 hej vid FDR = 0, 03, SAM-analys, (*) CD27 lo / undivided, åtminstone en sond signifikant, FDR = 0, 01, (**) CD27 lo / odelad vid minst en sond signifikant vid FDR = 0, 008. (b) Kvantitativ RT-PCR bekräftade relativa RNA-nivåer av BACH2, CD27, PRDM1 (BLIMP-1), XBP-1, IgL och HSPA5 (BiP) (n = 10 försökspersoner, parade T-test p-värden i kompletterande tabell 2 ). Poängen i varje fiolplot är medianvärdet och parenteserna indikerar interkvartilområdet.

Bild i full storlek

Vi sorterade normal human mBc vid 60 timmars stimulering med CpG + CK och placerade isolerade CD27 hi, CD27 lo och odelade celler tillbaka till kultur med färska CpG + cytokiner. Flödescytometrisk analys 48 timmar senare visade att CD27 hi- celler förblev CD27 hi, medan CD27 lo celler blev CD27 hi . Detta stöder hypotesen att CD27 lo- celler är en kortvarig population som differentierar till CD27 hi- celler. N = 4 försökspersoner i 3 separata experiment.

Bild i full storlek

Fungerar CpG-inducerad CD27 lo Bc som antigenpresenterande, co-stimulerande eller cytokinsekreterande celler?

Eftersom samstimuleringsmolekyler har visat sig uttryckas i mBc-odlingssystem 19, 20 antog vi att CpG-stimulerade CD27 lo Bc skulle ha transkriptom-mönster rika på antigenpresentation och samstimuleringsmolekyler. Vi undersökte därför de relativa genuttrycksnivåerna för: CD22, CD24, CD40, CD69, CD74, CD80, CD81, CD83, CD84, CD86, CD96, Class II Transcriptional Activator (CIITA) och HLA antigen.

Figur 2a visar expressionsnivåer för utvalda gener i varje delmängd (CD27 hi, CD27 lo och odelad). Odelad Bc hade högre expression av transkript för proteiner involverade i T-cell-B-celladhesion, samstimulering och antigenpresentation, inklusive: CD40, CD83, CD74, CD96 och CIITA. RNA-nivåer för HLA-antigen inklusive HLA-DP HLA-DQ och HLA-DR var på högre nivåer i odelade celler. I överensstämmelse med ökad antigenpresenterande aktivitet uttrycktes också transkript för proteiner involverade i MHC klass II-sammansättning, HLA-DO och HLA-DM i högre grad än de odelade cellerna än CD27 lo och CD27 hi- cellerna. Däremot hade det co-stimulatoriska proteinet CD80 högre expressionsnivåer i CD27 lo- celler än i de andra cellundergrupperna. CD86-transkriptionsnivåer var något högre i CD27 lo- celler, men skilde sig inte signifikant från CD27 hi- och odiveceller. Vi bekräftade resultaten av genuppsättningen för CD40, CD74, CD80 och CD83 med kvantitativ RT-PCR (fig. 2b). Kompletterande tabell 2 innehåller p- värden från ojusterad parad t- test för jämförelser av qRT-PCR-data från alla 3 cellundersättningar. De få proverna med nollvärden för genuttryck jämfördes med användning av en oparad t- test.

Vi undersökte också variation i cellytproteinnivåer med celldelning med flödescytometri. CD80-proteinnivåerna var högre i tidigare celldelningar, vilket överensstämmer med högre antal CD27 lo Bc i dessa divisioner. Däremot sjönk CD83-proteinuttrycksnivåerna efter delning 2 (fig. 2c), som korrelerade med högre nivåer av CD27 hi- celler i senare generationer. Medan dessa data inte utesluter antigenpresentation / samstimulering av CD27 lo- celler, stöder de bättre en alternativ hypotes om att odelad Bc bättre kan tjäna denna funktion.

Därefter undersökte vi cytokintranskriptuttryck mellan de tre celltyperna (Fig. 2d). Ett antal murina modeller har visat fenotyper av regulatorisk Bc (Breg), kännetecknad av mönster av cytokinsekretion (granskad i 3 ). Humant och murint Breg producerar flera cytokiner inklusive: IFN-y, IL-4, IL-6, IL-10, LT-a, TNF-a och IL123 samt IL-la, IL-1p, IL-8 14 och IL-7 21 . Efter CpG-stimulering hittade vi mycket få cytokintranskript producerade i CD27 lo- celler. IFNA1, IFNB1, IFNG, IL-1p, IL-4, IL-8, IL10, IL-12a och IL13, uttrycktes inte differentiellt. Transkript för IL-6, IL-7 och IL-24 uttrycktes differentiellt i de odelade cellerna, med minimal expression i CD27 hi och CD27 lo prolifererande Bc-underuppsättningar (Fig. 2d). Relativa förändringar i IL-6-transkriptionsnivåer bekräftades med qRT-PCR (fig. 2e). Också av intresse producerades låga men statistiskt signifikanta nivåer av IL-15 mRNA av CD27 hi- celler (fig. 2d). Detta konstaterande överensstämmer med IL-15-produktion rapporterad av andra i plasmaceller 22 . IL-15-uttryck antyder möjligheten av paracrinstimulering, med CD27 hi- celler som utsöndrar IL-15 för att stödja proliferation av CD27 lo- celler.

Sammantaget var det de CpG-stimulerade men odelade mBc, inte CD27 lo- cellerna, som producerade högre transkriptionsnivåer för proteiner med nyckelroller i antigenpresentation, samstimulering och cytokinproduktion.

AID är uppreglerat i CD27 lo- populationer

Eftersom de icke-antikroppsutsöndrande CD27 lo- cellerna resulterande från CpG-stimulering av IgG-klassomkopplad mBc inte uttryckte antigenpresenterande eller cytokintranskript, såg vi efter andra transkriptomönster som uttrycks differentiellt i CD27 lo- celler för att identifiera andra potentiella funktionella roller för dessa celler.

CD27 lo- celler uttryckte signifikant högre nivåer av aktiveringsinducerat cytidindeaminas (gensymbol AICDA, proteinförkortat AID) mRNA än CD27 hi eller odelad CpG-stimulerad mBc (fig. 3a). Detta bekräftades också med kvantitativ RT-PCR (fig. 3b). Flödescytometriska data visade ökat intracellulärt AID-protein efter delning 1 och 2, där CD27 lo- celler dominerar, och en reducerad mängd bortom delning 3 (Fig. 3c). Uppreglering av AICDA, en regulator av Ig-genomarrangemang 23, föreslog en alternativ hypotes att dessa CpG-stimulerade, IgG + mBc var kapabla att receptorredigering innan de begick till en plasmacellsfenotyp. AID-aktivitet kan induceras genom TLR-aktivering och kan också vara en indikator på receptorredigering som vanligtvis sker i kärncentret 24, 25 . Underpopulationen CD27 lo hade också högre nivåer av EXO1, ett dubbelsträngat DNA-exonukleas som krävs för somatisk hypermutation 23 (fig. 3a), såväl som IL-2-receptor-alfa (IL-2Ra / CD25), en markör för Bc-aktivering i kärncentrum 26 . Emellertid uttryckte CD27 lo Bc inte differentiellt andra gener som finns i kärncentrum Bc såsom BCL6, CD19, CD40, CD44, LTA, CD20, PAX5, SPIB, STAT6, TNF, LRMP, TCL1A, PTPRC (CD45), WEE1 och BCL3 (fig. 3d). Kvantitativa rt-PCR bekräftade expressionsnivåer av BCL6, CD19, CD40, PAX5, PTPRC, STAT6 och TCL1A (fig. 3e). Även om en möjlig tolkning av ökad AICDA i CD27lo-celler är kontaminering av naiva Bc såg vi inte differentiellt uttryck av CD5 eller ABCB1 med CD27 lo- celler (fig. 3d).

Andra transkriptomelement signifikant uppreglerade i CD27 lo B-celler

Gener av intresse som visade sig vara signifikant uppreglerade i CD27 lo- celler i jämförelse med CD27 hi- celler inkluderade inte bara AICDA och CD80 (fig. 3a), utan också kemokinligand 22 (CCL22), BCL2L11 (Bim) en regulator för apoptos i Bc, och undertryckare av cytokiner 2 (SOCS2), en cytokininducerad modulator av Jak / Stat-vägar som nedreglerar cytokinsignalering 27, IL-5-inducerad CISH 28 och HRAS, som visat sig förmedla ERK-aktivering som svar på B cellreceptoraktivering 29 . Detta föreslog en mekanism för korssamtal mellan BCR-ligering och cytokinreceptorsignalering av det adaptiva immunsvaret och den antigenoberoende aktiveringen av TLR9 utlöste Bc-svar. Såsom visas i figur 2b visade qRT-PCR för relativa RNA-nivåer av CD80 statistiskt signifikanta skillnader mellan varje delmängd. Medan skillnaderna i CCL22-uttryck mellan CD27 hi och CD27 lo såsom bedömdes med qRT-PCR var signifikanta, var skillnaderna mellan CD27 hi och odelade celler inte (fig. 3b). IL2Ra-genen uttrycktes också differentiellt mellan CD27 hi och CD27 lo celler med qRT-PCR men inte mellan CD27 lo och odelade celler.

Flera andra gener identifierades genom SAM-analys som signifikant högre i expression i CD27 lo- celler, även om de vid låga totala expressionsnivåer (Fig. 3a). Dessa inkluderade ITGAL (CD11a), som tillsammans med ITGB2 (CD18) kan bilda LFA-1, ett vidhäftande komplex för kärncentrum, men motsvarande uttrycksnivåer för ITGB2 sågs inte. Intressant nog uttrycktes RCAN1, som hämmar calcineurin, en signaltransduktionsmodulator mellan TLR, cytokiner och NF-KB 30, också i CD27 lo- celler. Liksom SOCS2 kan detta ge återkopplingshämning av cytokininducerad signalering i aktiverad Bc efter CpG-stimulering.

CD27 lo- celler uttrycker mellanliggande nivåer av B-celldifferentieringstranskript

Om CpG-stimulerade CD27 lo- celler var en kortvarig population, som genomgick receptorredigering innan ytterligare differentiering, antog vi att de borde ha nivåer av Bc-differentieringsmarkörer som är högre än odelade celler och lägre än CD27 hi- celler. Vi fann faktiskt differentiellt uttryck för många proteiner associerade med Bc och plasma celldifferentiering (Fig. 4a). Dessa inkluderade CD27 och CD38, markörer associerade med antikroppsutsöndande plasmablaster in vivo och in vitro 17 och immunoglobulingener. På liknande sätt var uttrycket av HSPA5 (BiP) mRNA, ett protein involverat i utsöndring av immunglobulin och andra proteiner 31 också högre i CD27 hi- celler. Minskningar i expressionsnivåer mellan CD27 lo och CD27 hi- celler sågs för CD19, en pan-B-cellmarkör som markant nedreglerades i plasma-celldifferentiering och CD20 (MS4A1; granskad i 11 ). I överensstämmelse med tidigare observationer 9 sågs inte stora ökningar i transkript från mogna plasmacellmarkörer syndecan-1 (SDC1 eller CD138) i denna population före plasmablast.

Sammantaget antydde data en progression av transkriptionsmönster mot plasma celldifferentiering med början med odelade celler, som fortskrider genom CD27 lo och sedan CD27 hi- celler med det mest uttalade plasmacellstranskriptomönstret. CD27 hi- celler uppvisade ett transkriptionsmönster associerat med plasmacell-differentiering. Detta inkluderade ökad PRDM1 (Blimp), en transkriptionsfaktor som driver differentiering av plasmaceller och förtrycker det mogna Bc-programmet; och transkriptionsfaktorn XBP1 som induceras av Blimp och är associerad med antikroppssekretion 32 . I överensstämmelse med detta mönster minskade uttrycket av BACH2, en transkriptionell repressor av PRDM1 33 . IRF4, en hämmare av Blimp och en repressor av BCL6 34 ökade i expressionsnivån i CD27 hi- populationen jämfört med CD27 lo . PAX5, som inducerar BACH211 uttrycktes differentiellt i odelade celler, liksom BCL6 och IRF8, vilket är förenligt med en mBc-fenotyp och förtryckning av plasmacellfenotypen 11 . RUNX2, producerades på högre nivåer i CD27 hi- celler än i odelade celler, medan det omvända var sant för RUNX3, ett mBc-transkript. För alla dessa transkript uttrycktes mellannivåer i CD27 lo- celler, i överensstämmelse med CD27 lo- celler med en övergående fenotyp mellan den för odelade celler och CD27 hi- celler. Kvantitativ RT-PCR bekräftade differentiell expression av generna CD27, Igλ, HSPA5, BACH2, XBP1 och PRDM1 (Fig. 4b).

För att ytterligare utforska resultatet av CD27 lo celldelning sorterade vi celler vid 60 timmar av CpG + CK-stimulering (fig. 5) och placerade dem tillbaka i kultur i 48 timmar. Som förväntat förblev CD27 hi- celler CD27 hi och fortsatte att prolifera, i överensstämmelse med en pre-plasmablast eller plasmablast fenotyp. CD27 lo- celler förblev inte CD27 lo, men ökade i CD27-uttryck när de spridit sig. Detta överensstämmer med en cellpopulation som hade avslutat övergången till en plasmablastfenotyp och stöder slutsatsen att CD27 lo- populationen är övergående.

Nätverksanalys

Därefter utförde vi transkriptom nätverksanalys genom användning av Ingenuity Pathways Analys och letade efter möjliga anslutningsvägar mellan ingångsstimulerna i vårt in vitro- stimuleringsprotokoll (IL-2, IL-10, IL-15, BAFF och CpG) och det observerade fenotyper av CD27 lo- och CD27 hi- celler (Fig. 6). Det finns åtminstone två vägar aktiva i Bc som inte involverar Bc-receptorn som kan resultera i CD27 lo fenotyp. Först kan TLR9 aktivera NF-KB 35, vilket har visats vara en markör för receptorredigering i Bc 36 . Genmål för NF-KB som vi visade sig vara uppreglerade i CD27 lo- celler inkluderar IL2RA, BCL2L11, CD80 och AICDA. Detta kluster av uppreglerade NF-kB-mål antyder att NF-kB kan vara aktivt i subpopulationen CD27 lo . I en andra aktiveringsväg kan IL-2 och IL-15 genom verkan av den vanliga IL-2-receptorns y-kedja aktivera olika Jak / STAT-proteiner 37, 38 . IL-10 kan också aktivera STAT3 39 vilket kan öka produktionen av IRF4, en nyckelregulator för Bc-differentiering.

Samma stimuleringsförhållanden kan resultera i antingen CD27 lo eller CD27 hi fenotyper och progression från en till en annan. CpG, via TLR9, kan aktivera ΝΦ − κΒ, en markör för receptorredigering i Bc. Genmål för NF-KB inkluderar flera gener som visas uppregleras i CD27 lo- celler (i guld), inklusive AICDA. BAFF (TNFSF13) har också visat sig öka AICDA-produktionen. I en separat väg kan Jak-proteiner, inklusive Jak3, aktiveras genom verkan av de vanliga gammakedjecytokinerna, IL2 eller IL-15, vilket resulterar i fosforylering av STAT-proteiner såsom STAT3, STAT5 och STAT6. IL-10 kan också aktivera STAT3. STAT3 kan i sig eller med STAT6 öka produktionen av IRF4, en nyckelregulator för Bc-differentiering. Induktion av IRF4 vid låga nivåer kan stimulera produktionen av AICDA, en produkt av NF-KB och vid högre nivåer inducerar IRF-4 produktion av PRDM-1, en nyckelplasmablastregulator. När IRF-4-nivåerna ökar kan således celler utvecklas från CD27 lo fenotyp till en CD27 hi fenotype. NF-KB kan också aktivera transkription av SPIB som negativt reglerar PRDM1 (BLIMP1). PRDM1 undertrycker sedan BCL6 och AICDA. PRDM1, STAT6 och IRF4 kan också förbättra produktionen av XBP1 vilket är nödvändigt för produktion av immunglobulin. HSPA5 (BiP), en förmedlare av immunoglobulinvikning är också ett mål för XBP1 och uppregleras i CD27 hi- celler.

Bild i full storlek

Graderad produktion av IRF4 kan utlösa olika B-cellersvar 34 . Inducerat vid låga nivåer av IRF4 kan utlösa produktion av AICDA, som vi fann uppreglerade i CD27 lo celler. Inducerat vid högre nivåer inducerar IRF4 produktion av PRDM-1, en nyckelplasmablast-utvecklingsgen, som uppreglerades i CD27 hi- celler. Detta tillhandahåller ett medel genom vilket samma stimuleringsförhållanden kan resultera i antingen cellfenotyp och en mekanism med vilken CD27 lo- celler kan utvecklas till en CD27 hi- fenotyp då IRF4-nivåerna ökar över tiden. IRF4 ökar också aktiveringen av XBP1, en kritisk regulator för immunoglobulinproduktion uppreglerad i CD27 hi- celler. HSPA5 (BiP), en förmedlare av immunoglobulin-vikning i ER är också ett mål för XBP1 och befanns vara uppreglerad i CD27 hi- celler.

NF-KB kan också aktivera transkription av SPIB, vilket också kan ge en annan interaktionspunkt för CD27 lo- nätverket med PRDM1 (BLIMP1), en nyckelregulator för plasmablast (CD27 hi ) differentiering 11 . PRDM1-uttryck undertrycker i sin tur BCL6 34, 40 och AICDA 34 . Så även om det finns separata vägar till de två fenotyperna, verkar dessa vägar ha punkter av ömsesidig reglering.

Omfattande skillnader i transkriptomprofiler mellan CpG-stimulerade minne-B-deluppsättningar

Kompletterande tabell S1 listar 2 747 sonder med statistiskt signifikanta skillnader mellan CD27 lo och CD27 hi- cellpopulationer (SAM-analys, FDR = 0, 03). Förutom de genuppsättningar som undersöktes med avseende på våra hypoteser uttrycktes andra intressanta gener differentiellt mellan cellundersättningarna. Dessa grupperas här till genuppsättningar som är relativt uppreglerade eller nedreglerade när celler överförs från odelade till CD27 lo till CD27 hi fenotyper.

Figur 7A visar en värmekarta för utvalda gener. Ökad uttryck med celldelning var meddelanden inklusive: SLAMF7, en CD2-familjemedlem som inducerar Bc-spridning 41 ; TNFRSF17 (BCMA eller CD269) en receptor för plasmacellöverlevnadsfaktorn BAFF; IL6-receptor och IL6-signalomvandlare (IL6ST), som tillsammans sänder IL-6-signaler för att stimulera Bc-uppdelning; lågdensitets-lipoproteinreceptor (LDLR) som kan vara en markör för Bc-aktivering; och IFN-a-receptor 2 (IFNAR2); liksom CD59, en potent komplementhämmare och möjlig signalmolekyl 42 . Relativa RNA-nivåer av CD59, IL6R och TNFRSF17 (BCMA) bekräftades med qRT-PCR (fig. 7b).

(a) Värmekarta för utvalda gener av intresse. Gener som ökar i expression med celldelning inkluderar: SLAMF7, TNFRSF17 (BCMA) IL6-receptor och IL6-signalomvandlare (IL6ST), lågdensitets-lipoproteinreceptor (LDLR) en markör för Bc-aktivering; och IFN-a-receptor 2 (IFNAR2); liksom CD59, en hämmare av komplement och möjlig signalmolekyl. Gener av intresse som nedregleras med celldelning inkluderar FCRL-familjemedlemmar, FAM129C, CCR6, CCR7 och CXCR5; FOXP1, IL-4-receptor och SLAMF6. CD27 lo- celler visade mellanliggande expression av FCRL4 och uttryckte inte andra molekyler associerade med FCRL4 + -celler inklusive RANKL (TNFSF11) och CCNB2. (b) Relativa uttrycksnivåer för utvalda gener bekräftades med qRT-PCR. Poängen i varje fiolplott är medianvärdet och parenteserna indikerar interkvartilområdet. (n = 10 försökspersoner, parade T-test p-värden i tilläggstabell 2). Vi undersökte nyttan av CD59 som en surrogatmarkör för IgG-uttryck. (c) Relativa genuttrycksnivåer av CD59 bekräftades genom kvantitativ RT-PCR. (d) CD59 och CD27 uttrycks båda vid högre nivåer i samma cellpopulation som bedömdes genom flödescytometrisk analys. (e) CD59-uttryck ökade med celldelning, men högst 50% av CD59 hi- celler i någon enda generation färgade för intracellulär IgG. Representativa data från 1 visad patient, n = 4 försökspersoner i 2 separata experiment.

Bild i full storlek

Ett antal gener av intresse nedreglerades med celldelning (Fig. 7a) inklusive FCRL-familjemedlemmar FCRLA, FCRL1, FCRL3 och FCRL4. Medan CD27 lo- celler visade mellanuttryck av FCRL4, uttryckte de inte andra molekyler associerade med FCRL4 + -celler inklusive RANKL (TNFSF11), CCNB2 (fig. 7a) eller RUNX2 (fig. 4a), så detta är en unik population . Också nedreglerades FAM129C, ett Bc-specifikt transkript, kemokinreceptorer CCR6, CCR7 och CXCR5; FOXP1, en nödvändig tidig transkriptionell regulator 43 för Bc; IL-4-receptorn och SLAMF6, en medlem av CD2-familjen uttryckt vid vila Bc 44 . Relativa nivåer av FCRL3, FAM129C, CCR6, CCR7, IL4R och CXCR5 bekräftades med qRT-PCR (fig. 7b). Dessa förändringar överensstämmer med vilande Bc-differentiering i plasmablaster och pekar på nya molekyler som kan utforskas som markörer för antikroppsproduktion.

Nya markörer av Bc-undergrupper som utsöndrar antikroppar är av intresse för att isolering av Ig-utsöndrande celler baserat på ytuttryck av Ig eller andra kända cellytemarkörer är svårt. Till och med CD27 hi -cellundersättningar har i allmänhet bara 50% av celler som producerar antikropp 18 . Med tanke på ökningen i CD59-transkript i CD27 hi- subset-genarray, bekräftade vi expression med qRT-PCR (fig. 7c) och undersökte nyttan av CD59 som en markör för IgG-producerande celler. Vi stimulerade normal mBc under 96 timmar med CpG och cytokiner och fann att på proteinnivå var CD27 hi- celler CD59 hi (Fig. 7d). CD59-proteinuttryck ökade också med celldelning, men inte mer än 50% av CD59 hi- celler i någon generation färgade för intracellulärt IgG (fig. 7e). CD59 verkade liknar, men inte bättre än, CD27 som en markör för att diskriminera dessa populationer.

Diskussion

En alltmer sofistikerad förståelse av den mänskliga CD27 + -klassens omkopplade svar på Bc återkallas från studier som identifierar subpopulationer av aktiverad human mBc. Dessa svar är kända för att vara heterogena 4, 11, med antikroppsutsöndrande celler, cytokinsekretionsceller 45, antigenpresenterande och co-stimulatoriska 20 celler, och en mBc-pool 46 som alla dyker upp i samma minnesåterkallande svar. Att förstå arbetsfördelningen mellan de olika aktiverade mBc-delmängderna, särskilt när de ändras av adjuvans under vaccination, kan göra det möjligt för oss att förspänna svaret för att gynna en uppsättning funktioner. Det är av denna anledning som vi fokuserade på TLR-9 aktiverade CD27 + mBc, eftersom CpG ODN-adjuvans aktivt utvecklas för att öka vaccinsvar 47, 48 .

Tidigare transkriptomanalyser av Bc-underuppsättningar har undersökt differentiellt genuttryck i musens naiva och minneundersättningar från mjälte, eller humant Bc från tonsil 49, 50, och identifierat olika antal gener eller prober (50-450 humana gener, ∼ 3000 murina gener, ∼ 5 500 murina prober) uttryckt differentiellt mellan Bc-underuppsättningar. Våra resultat demonstrerade ∼ 2 000 differentiellt uttryckta gener mellan paren i det aktiverade minnet Bc-underuppsättningar vid en FDR = 0, 03. Det finns flera viktiga skillnader i studiemetodik som står för denna skillnad med de mänskliga studierna. Först använde ett antal av dessa artiklar en metod för matematisk igenkänning som inte angav en falsk upptäckt eller statistisk signifikansnivå, så mängden differentiellt uttryckta gener är inte direkt jämförbara. Dessa studier undersökte inte heller skillnaderna mellan delning, antikroppsutsöndring och icke-delande subpopulationer av mBc. Däremot rapporterar vi transkriptomanalys av subpopulationer av stimulerad mBc baserat på generering och uttrycket av CD27. Dessutom använde många av dessa rapporter en äldre genuppsättning med 12 000 sonduppsättningar, jämfört med vår användning av andra generationens genuppsättningar med ∼ 54 000 sonduppsättningar. Indeed, many B cell and cell division specific genes lacked corresponding probes in the older arrays. Finally, our results suggest a novel functional division between the proliferating and undivided populations of CpG activated, class switched mBc, as well as several potential feedback mechanisms that may regulate the partitioning of CpG activated, class switched mBc into antibody secreting, receptor editing, and antigen-presenting phenotypes.

Several groups have described patterns of cytokine secretion by activated murine and human Bc in vivo and in vitro 3, 51 . Stimulation by synthetic CpG-B class ODN, such as the CpG 2006 used in our experiments, has been reported to induce up-regulation of activation markers, IL-12, and IL-6 by Bc in bulk culture 52 . We found CpG-induced IL-6, IL-7, IL-15, and IL-24 transcripts at the highest levels in the activated but undivided Bc population. IL-24 belongs to the IL-10 family of cytokines, and has been reported to inhibit plasma cell differentiation of human germinal center Bc 53 . It is notable that IL-6 and IL-7 were the other predominant cytokine genes highly expressed in the undivided sub-population. IL-7 expression and signaling is associated with recombination activating genes in germinal center Bc 54, and IL-6 acts as an autocrine growth and differentiation factor. However, in our experimental system, CpG-stimulation of class-switched mBc does not appear to induce strong, polarizing cytokine secretion associated with classical Breg functions of Th1 versus Th2 immune response deviation 3 .

Although derived from an in vitro system, our finding of contemporaneous transcription of IL-6, IL-7, and IL-24 genes do suggest a possible mechanism for activated but undivided mBc to regulate CD27 lo sub-populations within a germinal center or T cell independent lymphoid follicle. Active gene expression and secretion of these cytokines by undivided Bc could regulate Bc subsets expressing high levels of the IL-6R, IL-7R, and IL20/22R complexes, leading to suppression of plasma cell differentiation while supporting proliferation and receptor editing in a subset of the CpG activated Bc. Consistent with this hypothesis is our finding that CD27 lo cells are a proliferating but non-antibody secreting population, with a gene expression pattern suggesting receptor editing and affinity maturation potential. The availability of such adaptive mechanisms after antigen-independent Bc activation also suggests a linkage between innate and adaptive Bc responses, suggesting further mechanisms for the actions of vaccine adjuvants, and targets for future in vivo studies.

Of note, we also found that the undivided cells were not inactive, but appear to have an antigen presentation/co-stimulation phenotype, as suggested by high transcript levels of class II HLA antigens and CD83. We show that these transcripts were generally downregulated by CpG+CK, with intermediate levels in the proliferating CD27 lo population. The exceptions are CD80 and CD86 whose transcripts are increased in CD27 lo cells. In addition to their role in T cell co-stimulation, these proteins are upregulated on CpG-activated mBc and, when engaged can increase the antibody production 55 . This suggests that CD80 and CD86 may play a role in activating antibody production within the CD27 lo population. This might provide a pathway for CD4 potentiation of antibody secretion during the transition from T cell-independent CpG activation to a more T cell-dependent adaptive immune response.

Also of interest, we found that the CD27 lo Bc subpopulation expresses AICDA and precedes CD27 hi cells in Bc development. Transcriptome profiling by others found AICDA expression in bulk cultures of stimulated mBc 56 . Our study points to the CD27 lo subpopulation as being the primary producers of AICDA in such systems. CpG is known to stimulate proliferation in CD27 - mBc population found in healthy human subjects and enriched in SLE patients 57 . This Bc population was also reported to be FCRL4 -, while the proliferating CD27 lo population that we describe here had a higher FCRL4 expression compared to expanding CD27 hi cells. Like FCRL4 + Bc identified in other studies 2, the CD27 lo cells also expressed higher amounts of AICDA, SOX5, and ITGAX, than CD27 hi cells, while other markers of FCRL4 + cells (RUNX2, CCNB2, and TNFSF11) were not co-expressed. Thus, while there are similarities between the CD27 lo subpopulation in CpG+CK-stimulated mBc and the populations described by others, the CD27 lo transitional phenotype described here is unique.

Finally, our work suggests another potential point of interaction between co-cultured CpG-stimulated mBc subsets that could stimulate further studies. IL-6 receptors and IL6ST were upregulated in CD27 hi subpopulation, indicating a mechanism through which the activated but undivided Bc subpopulation, which produces IL-6 transcripts, might support plasmablast development. Others have proposed a Bc IL-6 signaling autocrine loop 58, although it is beyond the scope of this study to confirm it in this system.

The gene regulatory network model generated from our data implies a dependency of CD27 lo subpopulation development and AICDA expression upon NF-κB activation. Although receptor editing in early Bc has been associated with NF-κB activation 36, it is difficult to assess alterations of NF-κB signaling in mBc, as early Bc development can be severely compromised by NF-κB disruption 59 . There is a recent case report of reduced NF-κB signaling in EBV-transformed Bc from two patients with mBc deficiencies 60 . While our analyses suggest that NF-κB may play a role in development of the CD27 lo subpopulation, due to the redundancy of cellular signaling, other pathways may yet be found that provide that role as well.

metoder

Human Subjects Protection.

This study was approved by the Research Subjects Review Board at the University of Rochester Medical Center. Informerat samtycke erhölls från alla deltagare. Research data were coded such that subjects could not be identified, directly or through linked identifiers, in compliance with the Department of Health and Human Services Regulations for the Protection of Human Subjects (45 CFR 46.101(b)(4)).

Myeloma Cell Culture

Myeloma cell lines were maintained in log-phase growth as previously described 61 and used for controls in flow cytometry: MPR-1130 (established in our laboratory), MC/CAR and Ramos cell lines (ATCC, Manassas, VA).

B Cell Isolation and CpG activation

Human peripheral blood mononuclear cells were isolated by Ficoll gradient centrifugation as previously described 9 . Negative magnetic immunoaffinity bead separation (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) was used to isolate total Bc. Anti-IgM-PE antibody (BD Biosciences, San Diego, CA) and anti-PE beads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) were used to deplete IgM expressing naïve and mBc. Pacific Blue Succinimidyl Ester (PBSE) (Carlsbad, CA, USA). Flow cytometric analysis was performed on all isolates, showing >90% purity of the isolates.

Freshly isolated CD27+ IgG enriched human peripheral blood Bc were cultured in the presence of CpG 2006 (10 ng/ml, Oligos, etc., Wilsonville, OR), plus recombinant human cytokines IL-2 (20 IU/ml), IL-10 (50 ng/ml), IL-15 (10 ng/ml) (all from BD Biosciences, San Diego, CA), and recombinant human BAFF (75 ng/ml, Chemicon, Temecula, CA) PC-L medium (IMDM medium, lacromin (50µg/ml, Seracare, Milford, MA), insulin (5µg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), penicillin/streptomycin (1x, Invitrogen, Carlsbad, CA), gentamicin (15µg/ml, Invitrogen), heat-inactivated fetal bovine serum (10% v/v, Invitrogen), normocin (0.1% v/v, Invivogen, San Diego, CA) in round-bottomed 96-well plates (BD Biosciences, San Diego, CA). All cells were cultured at 37°C, 5% CO 2 .

Flow Cytometric Analysis

Data om Bc-yt- och intracellulära markörer och CFSE-märkning samlades in som tidigare beskrivits 9 på en LSR II-cytometer med FACS Diva datainsamlingsprogramvara. Antikroppar som användes för cytometri inkluderade anti-CD27-APC-H7, anti-IgG-PE-CY5, CD83-PECy7 (BD Bioscience, San Diego, CA) anti-AID (Cell Signaling), antiCD59-APC (abCAM), anti- CD80-Alexa 647 (Serotec), anti-CD19-PE-Cy7, anti-murint IgG-Alexa A680 (Invitrogen), Data gated, analyserades och visades med användning av Flowjo-programvara (Treestar, Ashland, OR).

Fluorescensaktiverad cellsortering

CFSE-färgade celler skördades, tvättades och räknades. Cellerna färgades med Live / Dead Violet (Invitrogen, Carlsbad, CA), tvättades och färgades med anti-CD27-APC-H7-antikropp (BD Bioscience, San Diego, CA) på is. FACS-cellsorter utfördes på levande celler. All cellsortering utfördes vid University of Rochester Medical Center Flow Cytometry Core Facility.

Transkriptionell analys

Humant CD27 + IgG-anrikat mBc märkt med PBSE (Invitrogen) och stimulerat med CpG + CK eller CD40L + IL-4 under 80 timmars rundbotten 96-brunnars plattor. Cellerna skördades, tvättades, räknades, färgades med anti-CD27-APC-H7 (BD-biovetenskap) och Live / Dead Green (LifeTechnologies, Carlsbad, CA). Cellerna från varje donator sorterades i tre prover - Odelad, delande CD27 låg och Dividing CD27 hög. Cellerna suspenderades i RLT-buffert (RNeasy Kit för RNA Isolation, Qiagen, Hilden, Tyskland), homogeniserades med en QIAshredder-kolonn och knäpps fryst i flytande kväve. En kärnanläggning, Functional Genomics Center vid University of Rochester, utförde prov som utfördes cDNA-generering med hjälp av WR-Ovation Pico System (NuGEN Technologies, San Carlos, CA). Data från de hybridiserade Affymetrix U133 Plus 2.0-chips normaliserades med användning av GCRMA-metoden. Det öppna källkodsstatistikpaketet R-Bioconductor, Excel (Microsoft, Redmond, WA), Partek Genomic Suite (St. Louis, MO) och Ingenuity Pathways Analys (Ingenuity, Redwood City, CA) programvaror användes för analys och jämförelser. Anpassad mjukvara utvecklad i Mathematica (Wolfram, Champaign, IL) användes för att generera värmekartor. En kopia av programvaran är tillgänglig för nedladdning på //cbim.urmc.rochester.edu/software.

Kvantitativ RT-PCR

Kvantitativ RT-PCR utfördes av Functional Genomics Center vid University of Rochester, en kärnanläggning. Tio provuppsättningar analyserades med qRT-PCR, samma 6 uppsättningar RNA analyserades med genarray och ytterligare 4 uppsättningar celler från olika försökspersoner, stimulerades och sorterades med samma förhållanden. Omedelbart efter insamling lyserades sorterade celler i RLT-buffert och passerade genom en Qiashredder-kolonn (båda från Qiagen, Germantown, MD) och knäpps fryst i flytande kväve. Prover lagrades vid -70 ° C tills RNA-extraktion. RNA extraherades med användning av RNeasy Micro Kit med DNA-kolonn enligt rekommendation av tillverkaren (Qiagen). Kvantitativ RT-PCR utfördes på tre experimentella replikat per prov i TaqMan® Array Snabbplattor med TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG på StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Life Technologies, Carlsbad, CA) med 10 ng cDNA i varje 10 ul reaktion. RNA-kvalitet bekräftades av närvaron av intakt rRNA med en Agilent 2100 Bioanalyzer (Santa Clara, CA).

För analys beräknades värdena för relativ kvantitet (RQ) för varje gen med användning av ΔΔC T (C q ) metod 62 . Cq-värden för varje gen normaliserades till totalt RNA-innehåll med användning av 18S RNA, normaliserades till varandra med användning av det första provet i det inlämnade partiet, ett odelat prov och åter-normaliserades sedan till medelvärdet av fyra kontrollgener valda från genuppsättningsdata, B2M, TERF21P, USP11 och RPL8.

Statistisk analys

För uppskattningar av betydelse av genarray använde vi en modifierad t- statisk (parad version) med signifikansanalys av Micorarrays (SAM) -metod 63 med användning av Bioconductor-paketet i R (www.bioconductor.org). Ett parat t- test användes för att jämföra qRT-PCR-datauppsättningar. För generna som innehöll negativa (noll) värden bekräftades signifikans med användning av en oberoende t- test. Violinplott för varje gen, som visade medel- och standardavvikelse för normaliserade RQ-värden för varje cellpopulation konstruerades med användning av R-paketet i R.

Antikroppsbelagd paramagnetisk pärlberedning

Antikroppbelagda paramagnetiska pärlor framställdes genom en modifiering av vårt tidigare publicerade protokoll 18 . Paramagnetiska mikrosfärer 8 mikrometer (Bangs Lab, Fishers, IN) 10, 12, 16 eller 30 mikrometer i diameter (Micromod DE, Tyskland) belades med streptavidin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med användning av ett kommersiellt kit (PolyLink-koppling Kit, Bangs Lab, Fishers, IN). Ytterligare SA fästes till 10 eller 16 mikron pärlor med användning av en 8-grenad PEG-polymer med aminolänkgrupper (NOF America, White Plains, NY). Streptavidinbelagda pärlor inkuberades i fotoklaverbar-biotin-IgG-lösning (PC-IgG) (Human IgG från Sigma, PC-biotinyleringssats (Ambergen, Watertown, MA). Alla pärlor tvättades över natten i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) plus 2% vikt / volym bovint serumalbumin vid rumstemperatur med långsam blandning på en rotator. Pärlkoncentrationen bestämdes med manuell räkning med användning av en hemocytometer (VWR, Westchester, PA).

Parade ELISA-ELISPOT-analyser

För både qELISPOT- och ELISA-analyser sågs fångade ab-belagda kontrollbrunnar med 96-brunns-analysplattor med IgG-bärande pärlor, varje pärlstyp i triplikatbrunnar. ELISPOT-plattorna placerades på stora sällsynta jordartsmagneter för att snabbt sätta ner magnetpärlorna till brunnsmembranet för antikroppsfrisättning. IgG frisattes från pärlorna med en 35 min 365 nm UV-exponering från en svartstråle UV-lampa (UVP, Upland, CA), med en 10 min inkubation på plats före tvätt.

Matchande ELISPOT- och ELISA-plattor pläterades med 9 replikatbrunnar av pärlor för standardkurvgenerering för att relatera totalt IgG frisatt med fläcktäthet. Plattor för cellulär ELISPOT-analys förpottades med triplikatbrunnar av varje pärlstandard. Bc uppsamlades, tvättades, räknades med trypanblått för livskraft för att beräkna levande cellantal för plätering. Vid varje tidpunkt utvecklades ELISPOT-plattor som tidigare publicerats 18 .

ELISA-plattor bearbetades genom inkubering under 1 timme vid 37 ° C med pepparrotsperoxidas-konjugerad get-anti-human IgG i PBS med 2% BSA, tvättades och inkuberades sedan med bovin-anti-get-IgG-HRP i PBS + 2% BSA i 1 vid rumstemperatur. Färg utvecklades med användning av ABTS One Component Microwell Substrate (Southern Biotech, Birmingham, AL) och avlästes vid 450 nm på en Benchmark Plus-mikroplatta-spektrofotometer (Bio-Rad, Hercules, CA).

ELISPOT och ELISA-reagens

Capture Ab, för ELISPOT- och ELISA-analyser bestod av Mouse anti-Human IgG (H + L) (Jackson, West Grove, PA). För ELISPOT-detektering använde vi fosfatas-konjugerad get-anti-human IgG (Jackson, West Grove, PA), för ELISA-detektion, peroxidas-konjugerad get-anti-Human IgG och peroxidas-konjugerad bovin anti-get-IgG, standardkurvor tillverkade med human IgG F (ab) 2- fragment (Jackson, West Grove, PA).

Nätverksanalys

En datamängd innehållande gener av intresse och motsvarande uttrycksvärden laddades upp till Ingenuity Pathways Analys (//ingenuity.com/). Varje identifierare mappades till sitt motsvarande objekt i Ingenuitys Knowledge Base. Nätverksberättigade molekyler överlappades till ett globalt molekylärt nätverk utvecklat från information i Ingenuitys Knowledge Base. Nätverk med nätverkskvalificerade molekyler genererades sedan algoritmiskt baserat på deras anslutning.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Extramaterial

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.