Funktionella effekter av ccl3l1 kopieringsnummer | gener & immunitet

Funktionella effekter av ccl3l1 kopieringsnummer | gener & immunitet

Anonim

ämnen

  • Genamplifiering
  • Genexpression

Abstrakt

Variation av kopieringsnummer (CNV) blir allt viktigare som en del av människans variation i sjukdomskänslighetsstudier. Konsekvenserna av CNV förstås dock inte så väl. Här presenterar vi data som undersöker de funktionella konsekvenserna av CNV av CCL3L1 i 55 oberoende brittiska prover utan kända kliniska fenotyper. Kopieringsantalet av CCL3L1 bestämdes genom paralogue-förhållandestestet, och expressionsnivåer av makrofaginflammatoriskt protein-la (MIP-la) och mRNA från stimulerade monocyter mättes och analyserades. Uppgifterna visar ingen statistiskt signifikant förening av MIP-la-proteinnivåer med kopienummer. Det fanns emellertid en signifikant korrelation mellan kopienummer och CCL3L1 : CCL3 mRNA-förhållande. Uppgifterna ger också bevis på att expression av CCL3 dominerar i både protein och mRNA, och därför är den observerade variationen av CCL3 potentiellt viktigare biologiskt än den för CNV från CCL3L1 .

Introduktion

Copy number variation (CNV) är en vanlig form av variation i hela det mänskliga genomet. Under de senaste åren har mycket forskning genomförts för att visa det betydande bidraget från CNV till variationen som observerats mellan individer och deras inflytande på sjukdomens mottaglighet.

Även om CNV har visat sig bidra till den ärftliga variationen i humant genuttryck, erkänns inte den fulla funktionella effekten av CNV: er. På en genombredd nivå kan CNV direkt förändra uttrycksnivån för gener inom den variabla kopieringsregionen. 1, 2 Det finns emellertid mindre framsteg när det gäller att förstå de funktionella konsekvenserna av specifika kopieringsvariabla platser, särskilt de CNV som är multialleliska.

CCL3L1 / CCL4L1- kopieringsvariabelområdet är beläget på kromosom 17q12, 3 och sträcker sig över 90 kb. Varje repeterande enhet innehåller en enda kopia av CCL3L1 och CCL4L1 och flankeras av genen TBC1D3 . Det upprepade området är beläget intill två mycket nära besläktade och kopierar vanligtvis invarianta gener CCL3 och CCL4 , och tros ha utvecklats genom duplicering av den invarianta CCL3- och CCL4- regionen och successiv divergens. 4 Följaktligen uppvisar medlemmar i varje paralogöst par en hög grad (96%) av nukleotid- och proteinlikhet, varvid CCL3 och CCL3L1 är identiska vid 67/70 rester i det mogna proteinet och 747/780-ställen i den kodande sekvensen, och CCL4 och CCL4L1 är identisk vid 68/69 ligger i det mogna proteinet och 644/667 ställen i den kodande sekvensen.

Generna CCL3 och CCL3L1 kodar för makrofaginflammatoriskt protein (MIP) -1a, isoformer LD78a respektive LD78P. MIP-la är en p-kemokin med låg molekylvikt. Chemokinet fungerar som ett pro-inflammatoriskt cytokin och inducerar en mängd olika immunceller, särskilt CD8 + T-celler och omogna dendritiska celler, och hämmas av IL-4, IL-10 och IL-13. 5, 6 Det utsöndras från de flesta mogna leukocyter, huvudsakligen makrofager, som svar på stimulans, och fungerar genom att locka lymfocyter och makrofager till platser för infektion och inflammation, varvid isoformen LD78p är tvåfaldigare vid kemoattraktion av humana monocyter och lymfocyter än LD78a isoformen. 7 Av detta skäl kan CNV av CCL3L1 påverka både immunologiska störningar och autoimmunitet.

MIP-la är dessutom en naturlig ligand för CCR5, den co-receptor som används av HIV-1-virus för cellinträde. 8, 9 Isoformen LD78P har visat sig vara den mest potenta agonisten för CCR5, 7 med en överlägsen antiviral aktivitet 10 och en 10 gånger högre EC50 för att hämma viral replikation än LD78a. 7 CNV av CCL3L1 har sålunda föreslagits att begränsa HIV-1 inträde i celler, 11 och är inblandat i HIV-1-progression, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 även om detta är omtvistat. 19, 20, 21, 22

Syftet med studien var att utforska de funktionella konsekvenserna av den variabla genen CCL3L1 med flera alleliska kopior . Expression av både CCL3 och CCL3L1 mRNA mättes och jämfördes och även variationen i uttrycksnivå i förhållande till diploidkopieantalet bedömdes. Dessutom undersöktes variationen av MIP-la proteinnivåer relativt kopienummer.

Resultat

Variation i kopienummer

Mätning av kopianummer av CCL3L1 med paralogue ratio Test (PRT) utfördes på alla 55 oberoende brittiska prover. De tre oberoende PRT-systemen tilldelade konkordant kopienummer för 51/55 sampel (till inom 0, 5 av heltalsvärdet för 75% av proverna och inom 0, 75 för 93%). De fyra samplen som visade en viss överensstämmelse typades med de två mikrosatellitanalyserna, vilket möjliggjorde säkerhet för heltalskopieringsnummer. 23 Den kalibrerade obegränsade kopieringsnummerfördelningen visas i figur 1 och visar att proverna alla klusterar runt det förutsagda heltalet med tydliga mellanrum. Variationen i CCL3L1-kopienummer mellan 0–3 observerades (se tabell 1), varvid ett kopienummer på 2 var det vanligaste. Eftersom de tre olika PRT-mätsystemen visar en hög nivå av överensstämmelse i alla prover som skrivs ger detta inget bevis för skillnader i kopienumret varken mellan CCL3L1 och CCL4L1 eller för CNV i referensgenerna CCL3 och CCL4 .

Distribueringshistogram för det omkretsade CCL3L1-kopienumret i 55 icke relaterade brittiska prover genererade med PRT. Distributionen visar ett intervall på 0–3 kopior, med toppar centrerade på heltalvärdena och mellanrummen mellan kluster.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Korrelation av kopienummer med proteinproduktion

För att härleda en lämplig tidpunkt för att mäta proteinuttryck isolerades monocyter från en initial kohort av sju individer och supernatanter uppsamlades vid 2, 4, 8, 24 och 48 timmar efter LPS-stimulering. Protein mättes med ELISA, med en lägre detektionsgräns på 0, 1 ng ml −1, och trots ett enstaka uttagare, visar tidskursen en initial ökning i proteinproduktionen under de första 4 timmarna, som utjämnades med 8 timmar och sedan minskade gradvis för alla kopieringsnummer (se tilläggsfigur 1). Det fanns inget detekterbart proteinuttryck från de ostimulerade cellerna. Detta är som förväntat eftersom MIP-la inte uttrycks konstitutivt utan induceras vid stimulering. För mätning av proteinnivåer skördades därefter alla cellsupernatanter 4 timmar efter stimulering och MIP-la-produktion från makrofager mättes i tre exemplar för alla prover.

Det finns en hög grad av sekvenslikhet mellan de två isoformerna av MIP-1a som kodas av CCL3 och CCL3L1 , och vi känner inte till några kommersiellt tillgängliga antikroppar som pålitligt kan skilja mellan dem. Eftersom vårt datasæt innehöll en individ som hade ett kopienummer på noll (nollkopierade individer utgör ∼ 2% av Storbritanniens befolkning) kunde vi mäta specificiteten för ett antal kommersiella antikroppar (både monoklonala och polyklonala) (AbCam, Cambridge, Storbritannien; FoU-system, Abingdon, Storbritannien; Lifespan Biosciences, Seattle, WA, USA) för LD78a-isoformen. Det fanns inga testade antikroppar som var fullständigt specifika för LD78P och därmed mätte alla tillgängliga antikroppar båda MIP-la-isoformerna. Därför är ELISA-resultaten presenterade i figur 2 för totalt MIP-la-uttryck, som med andra tidigare publicerade rapporter som också endast mäter totalt MIP-la-uttryck. 24 Fig. 2 visar MIP-la-expression uttryckt grupperat efter genkopiering nummer, tillsammans med det stratifierade organet. Även om ett CCL3L1-kopienummer på 3 har en större spridning av uttrycksvariabilitet (sd = 10, 93), fanns det ingen signifikant skillnad i genomsnittlig MIP-la-uttrycksnivå mellan kopienumren. Det fanns emellertid antydande bevis för en svag korrelation mellan MIP-la-uttryck och kopienummer ( r = 0, 2707; P = 0, 0309).

MIP-la-proteinuttryckningsnivåer (ng ml −1 ) klassificerade med heltal CCL3L1-kopienummer .

Bild i full storlek

Med tanke på att nollkopiproverna endast motsvarar CCL3- kodat proteinuttryck, åtminstone för denna individ visar det bakgrundsexpressionen för kopieringskonstant CCL3- proteinet, LD78a, mot vilket andra prover kan jämföras. Därför, vid jämförelse av MIP-la-uttrycksnivån för alla kopienummerprover med den för nollkopiproven, antyder data faktiskt att majoriteten av det uttryckta MIP-la-proteinet är sammansatt av LD78a-isoformen. Dessutom har åtminstone vissa individer inom alla tre klasser av kopienummer en expressionsnivå för total MIP-1a mindre än den som observerats med nollkopiproverna, vilket antyder att uttrycket av LD78a också är variabelt.

Smörgås ELISA användes för att mäta MIP-la-uttryck i serum vid extraktionstillfället. Det detekterades inget protein i något av proverna, med en lägre detektionsgräns på 0, 1 ng ml −1 .

För att titta på variationen i proteinuttryck hos varje individ, kom 10 frivilliga från de 55 överens om att testas på nytt. Dessa 10 upprepade prover innefattar fyra individuella kopior, tre individer med två kopior och tre individer med tre kopior. En jämförelse av det ursprungliga MIP-la-uttrycket och uttrycket i upprepade prover visas i kompletterande figur 2a. Data visar en enskild individ, prov F, för att ha ett mycket högt MIP-la-uttryck i det ursprungliga experimentet. För denna individ fanns emellertid också bevis för MIP-la-uttryck i de ostimulerade cellerna, potentiellt på grund av kliniska symtom, även om de inte var symptomatiska vid tiden för bloduttag. För denna individ har endast de upprepade provdata använts i den vidare analysen. Det bör noteras att prov F var det enda som hade något proteinuttryck i de ostimulerade cellerna. Analys av upprepade mätningar visade att ingen av faktorerna inom patienten (tid och mätning) var signifikanta för mätning av MIP-la-uttryck.

Korrelation av kopienummer med mRNA-transkript

En viktig fördel med att undersöka mRNA-transkript är att det är möjligt att skilja mellan transkripten av CCL3 och CCL3L1 med användning av sekvensspecifika primrar. Återigen utfördes en tidsstudie på de initiala sju proverna med totalt RNA som isolerades från de lyserade makrofagerna 2, 4, 8, 24 och 48 timmar efter stimulering med LPS och efterföljande mätning av CCL3L1 genom realtid PCR. Det fanns ett initialt högt uttryck av CCL3L1- specifikt mRNA vid 2 timmar efter stimulering som minskade kraftigt över tiden (kompletterande figur Ib). Följaktligen uppsamlades allt RNA 2 timmar efter stimulering. Utan stimulering fanns det ingen detekterbar mRNA-produktion för varken CCL3 eller CCL3L1 . Det är också intressant att notera att provet med en kopia som hade förhöjd MIP-la-proteinuttryck i tidsförsöket (kompletterande figur 1) inte har förhöjd CCL3L1- mRNA-uttryck. Således är det höga observerade MIP-la-uttrycket potentiellt beroende på ett ökat uttryck av CCL3- mRNA, och faktiskt observationer av CCL3- mRNA-uttryck för samma prov visar att detta speciella prov har en större än förväntad expressionsnivå för CCL3 (medel RQ för alla sju prover = 1, 34; RQ för detta prov = 2, 14). Även om detta kan antyda att genetisk variation kan ha en roll genom närvaron av en promotorpolymorfism eller förstärkareelement, hittade inte riktad uppströms sekvensanalys några varianter (data visas inte).

Eftersom sekvensspecifika primrar kan utformas, kan realtids PCR användas för att mäta både CCL3 och CCL3L1 mRNA-transkript individuellt. Figur 3 visar mRNA-uttryck för både CCL3 och CCL3L1 grupperade efter kopienummer med stratifierade medel. Kanske som förväntat visar CCL3- mRNA-uttrycket liknande kluster av data för varje kopienummergrupp och inga bevis för en korrelation ( r = 0, 052). För varje kopienummer visar klusterna av data en spridning av uttryck, nivåer av mellan noll- och femfaldigt större uttryck relativt GAPDH , vilket antyder att det inneboende uttrycket för CCL3 är variabelt. Data för de CCL3L1- specifika transkripten visar en statistiskt signifikant korrelation av uttryck med kopienummer ( r = 0, 633; P <0, 0001), vilket antyder att CCL3L1- mRNA-transkriptionsnivån ökar med högre kopienummer. Detta antyder också att potentialen för post-transkriptionell reglering av MIP-1a som korrelation med kopienummer inte bevaras i proteinet.

mRNA-expression av ( a ) CCL3 och ( b ) CCL3L1 med heltal CCL3L1-kopienummer . MRNA-expressionsnivåerna för både CCL3 och CCL3L1 beräknades med användning av ΔΔCt-metoden och mRNA-expression av GAPDH som den endogena kontrollen.

Bild i full storlek

Förhållandet CCL3L1 : CCL3 mRNA-transkript mättes med användning av PRT för alla prover vid 2 timmar efter stimulering (se figur 4). Data visar en statistiskt signifikant korrelation ( r = 0, 877, P = 0, 0001) mellan kopienummer och CCL3L1 : CCL3 mRNA-förhållande, med tydliga kluster för varje kopienummer. Dessutom skulle data om CCL3L1 : CCL3- förhållandet antyda att det finns en större andel CCL3- mRNA-transkript än CCL3L1 ; eftersom CCL3L1 : CCL3- förhållandet skulle förutsägas vara ungefärligt ett för tvåkopierade prover eftersom lika stora mängder transkript skulle förväntas men data ger faktiskt ett medelkvot på 0, 34. Medelförhållandet mellan enkopierade prover är 0, 18, och för tre-kopieringsproven är 0, 52, vilket totalt antyder att det finns ∼ 2–3 gånger fler CCL3- transkript än CCL3L1 , för alla kopianummer av CCL3L1 vid 2 timmar efter stimulering .

Jämförelse av förhållandet CCL3L1 : CCL3 mRNA-uttryck mätt med PRT mellan heltal CCL3L1-kopienummer . Den djärva svarta stapeln representerar medelkvoten för varje kopienummer.

Bild i full storlek

Vidare mättes förhållandet CCL3L1 : CCL3 med PRT för de sju tidsförsöksproven (se figur 5). Dataförsöksdata ger bevis för en minskning av förhållandet CCL3L1 : CCL3 för dessa prover under de första 12 timmarna, följt av en relativ platåning av förhållandet. Ett sådant fall i förhållandet skulle antyda att sönderfallshastigheten för transkripten av CCL3 och CCL3L1 inte är lika. Förhållande mätningarna skulle antyda att det är sönderfallet av CCL3L1 som är snabbare än för CCL3 , vilket antyder att CCL3- transkripterna med tiden kan dominera. Om vi ​​antar att de relativa mRNA-nivåerna bevaras på proteinnivån, då CCL3- mRNA-transkripten dominerar, är det troligt att den stora majoriteten av MIP-1a som uttrycks är av isoformen LD78a (figur 6), vilket bekräftar våra observationer med MIP-la-protein. Bekräftelse med en specifik antikropp krävs dock.

Tidsstudiegraf av CCL3L1: CCL3- mRNA-uttryck, mätt med PRT, från isolerade makrofager efter LPS-stimulering för sju initiala prover. Dessa prover bestod av två exemplar med en kopia (♦), två prov med två kopior (▴) och tre prov med tre kopior (•). Det detekterades inget uttryck från ostimulerade celler.

Bild i full storlek

Grafer för tidsstudieproven som illustrerar andelen av alla MIP-la-proteinuttryck som redovisas av isoform LD78a-uttryck två-kopia och tre-kopia prover, förutsatt att mRNA-nivåer bevaras i proteinet. Området under kurvberäkningarna visar att för två kopieringsprover står LD78a för 85% av det totala uttryckta proteinet, och för tre kopior 67%.

Bild i full storlek

Vi observerade också två prover med förhöjd mRNA-uttryck för både CCL3 och CCL3L1 , ett för ett prov med en kopia och det andra för ett prov med tre kopior. Båda hade emellertid ett CCL3 : CCL3L1- förhållande som var inom räckvidden för kopieringsnumret. Detta kan antyda att en potentiellt delad förstärkare eller promotorelement orsakar ökat uttryck av både CCL3 och CCL3L1 . Ytterligare sekvensarbete kan identifiera någon variant på nukleotidnivån som kan påverka expression av båda mRNA i dessa prover.

För att titta på konsistensen av mRNA-expression i varje individ utvärderades de 10 upprepade proverna. En jämförelse med det ursprungliga CCL3L1- mRNA-uttrycket och uttrycket i upprepade prover visas i kompletterande figur 2b. Den upprepade mätanalysen fann att ingen av faktorerna inom individerna (tid och mätning) var signifikanta för mätningen av CCL3L1- mRNA-uttryck, även om det finns viss skillnad för de tre tre-kopierade proverna (H, I och J). Men att jämföra dessa data med förhållande data för upprepade prover (kompletterande figur 2c) kan man se att förhållande data inte skiljer sig väsentligt inom individer, och således speglar skillnaden i CCL3L1 mRNA-uttrycket för de högre kopiorna i CCL3- uttrycket också.

Diskussion

I denna studie försökte vi undersöka de funktionella konsekvenserna av CNV vid CCL3L1 genom analys av variation i uttryck av CCL3L1 mRNA och protein. Vi hittade ingen signifikant samband mellan kopienummer och MIP-la-proteinuttryck. Även om de uppgifter som presenteras här är karakteristiska för en europeisk befolkning, med ett smalt intervall och ett genomsnittligt kopiaantal på 2, kan en population med ett högre genomsnittligt kopieringsnummer, till exempel afrikaner, vara användbart för att utforska proteinuttryck med högre kopienummer. Eftersom dessutom studien antyder att majoriteten av MIP-la-produkterna är av isoformen LD78a, är det möjligt att varje signifikant samband mellan kopienummer och LD78P-uttryck maskeras av de högre nivåerna av LD78a. Tills en specifik antikropp kan utvecklas kan detta emellertid inte bevisas.

De mogna proteinerna, LB78a och LD78P, skiljer sig endast vid tre aminosyror belägna i position 3, 39 och 47. Den dispergerade fördelningen av dessa aminosyrasubstitutioner genom det mogna proteinet gör potentiellt bildandet av en specifik antikropp mot en eller annan av isoformerna svårare, även om dessa platser inte är evolutionsbesparade. Ändå skulle substitutionen av en serin med prolin i position tre kunna förändra proteinkonfigurationen och således teoretiskt stödja genereringen av en specifik monoklonal antikropp.

Så vitt vi vet är detta den första studien som direkt kvantifierar både CCL3 och CCL3L1 mRNA-transkript separat. Även om förhållandet CCL3L1 : CCL3 korrelerar signifikant med kopienummer, är mängden individuella mRNA-transkript inte lika, med CCL3 mRNA-transkript som dominerar. Eftersom proteindata också antyder att CCL3- isoformen LD78a dominerar, är denna observation med mRNA potentiellt bevarad i proteinet.

Övervägande av LD78a är intressant eftersom det antyder att variationen som observerats med CCL3 är potentiellt mer följd, biologiskt än CCL3L1 CNV. Faktum är att funktionellt, även om LD78p är en kraftigare agonist än LD78a, har LD78a ändå agonistaktivitet, och därför kan den, även om den är mindre potent, överstiga LD78p tre till en. Även om en tidigare studie har visat att LD78β är tvåfaldigt mer kemoattraktivt än LD78a, 7 om uttrycket av LD78β i en tvåkopierad individ endast är 15% av det totala MIP-1a-uttrycket, kommer LD78a-isoformen fortfarande att stå för de flesta av biologisk aktivitet. Det är sålunda möjligt att variationen i uttryck som observerats för CCL3 är lika sannolikt att påverka känsligheten för infektionssjukdomar och HIV-progression som CNV för LD78P.

Våra data stöder inte en tidigare studie, 24 som fann en signifikant förening av kopienummer med MIP-1a-uttryck. Tyvärr är det tyvärr inte möjligt att direkt jämföra data eftersom MIP-1a samlades in 4 timmar efter stimulering i denna studie, medan den samlades in 48 timmar efter stimulering tidigare, 24 en tidpunkt som vi observerade vara dåligt korrelerad med total effekt (se kompletterande figur 1). Även om deras ELISA-system var detsamma som vårt, innehöll den tidigare studien inte några nollkopieringsprover för att jämföra deras bakgrundsnivåer av CCL3- kodat protein. Medan den tidigare studien inte specifikt tittade på de separata mRNA-transkripterna, bedömdes förhållandet CCL3L1 : CCL3 och visade sig vara signifikant korrelerat med kopienummer, vilket är i överensstämmelse med våra observationer, även om vi inte kan bedöma om, liksom våra data, det finns en övervägande av CCL3- transkript eller inte.

Det har gjorts ett antal studier som har funnit samband mellan CNV för CCL3L1 och HIV-1-progression: 10, 13, 14, 15, 16 den biologiska rationalen är att det finns en stark konkurrens mellan MIP-1a-isoformen LD78P och HIV-1 för receptorn CCR5; alltså, ju mer LD78P det är, desto större är konkurrensen. Det finns emellertid andra studier som bestrider denna rapporterade förening, 20, 21 och i synnerhet en serie högdrivna studier som nyligen publicerats misslyckades med att replikera föreningen, 19, 22 medan en annan studie visade problemen med mätningen av CCL3L1-kopienummer och hur detta kan förväxla föreningar med kopienummer. 25 Eftersom våra data antyder att produkten av CCL3L1 är märkbart mindre riklig än den för CCL3 , skulle detta ifrågasätta den biologiska förutsättningen bakom föreningarna som observerats mellan HIV-1-progression och ökat CCL3L1-kopienummer .

Sammanfattningsvis finner vi ingen statistiskt signifikant förening av MIP-1a-proteinnivåer med kopienummer när vi undersöker de funktionella konsekvenserna av CNV av CCL3L1 . I motsats härtill finner vi bevis på att det är CCL3 som dominerar både på protein- och mRNA-nivå och därför har variation av CCL3- uttryck potentiellt mer påverkan biologiskt än CNV för CCL3L1.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen Gen och immunitet (//www.nature.com/gene)