Funktionell karakterisering av en trpm2-ortolog från havsanemonen nematostella vectensis i mänskliga celler | vetenskapliga rapporter

Funktionell karakterisering av en trpm2-ortolog från havsanemonen nematostella vectensis i mänskliga celler | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Celldöd
  • Genomträngning och transport

Abstrakt

Den mänskliga icke-selektiva katjonkanalen TRPM2 representerar en mediator av apoptos utlöst av oxidativ stress. Den huvudsakliga agonisten ADP-ribos binder till den cytosoliska domänen av TRPM2, vilket är homologt med det humana ADP-ribos-pyrofosfatas NUDT9. För att ytterligare klargöra strukturen-funktionen för denna kanal, kännetecknade vi en TRPM2-ortolog från cnidarian Nematostella vectensis , efter dess uttryck i en human cellinje. Denna långt avlägsna släkting visar endast 31% total sekvenslikhet med h TRPM2, medan dess C-terminala domän har en större likhet med NUDT9-enzymet. Ström genom nv TRPM2 inducerades av ADPR, med en mer uttalad känslighet och snabbare kinetik än i h TRPM2. I motsats till h TRPM2 fanns det inget svar på H202 och knappast någon modulerande effekt av intracellulär Ca2 + . Raderingen av en sträcka av 15 rester från NUDT9-domänen i nv TRPM2, som är frånvarande i h TRPM2, förändrade inte svaret på ADPR men möjliggjorde aktivering av kanalen med H202 och ökade effekterna av intracellulär Ca2 + . Dessa fynd belyser utvecklingen av TRPM2 och etablerar nv TRPM2 som ett lovande verktyg för att dechiffrera dess komplexa grindmekanismer.

Introduktion

Den transienta receptorpotentialen (TRP) -underfamiljen för tetrameriska katjonkanaler innehåller olika medlemmar med ovanliga egenskaper, särskilt TRPM2 med dess integrerade enzymdomän 1 . Den C-terminala regionen av TRPM2 är homolog med det humana ( h ) enzymet NUDT9 som representerar ett adenosin 5'-difosforibos (ADPR) pyrofosfatas från NUDIX hydrolasfamilj 2 . Kanalgrindning kräver troligtvis bindningen men inte klyvningen av den huvudsakliga agonisten ADPR (EC 50 på ungefär 100 μM) 1 eftersom NUDT9-domänen i TRPM2 innehåller mutationer som är väsentliga för kanalfunktion som reducerar ADPRas-aktiviteten för h NUDT9-enzymet med två beställningar av storleken 3, 4, 5 . Cellulär ADPR produceras av NAD + -metaboliserande enzymer på plasmamembranet, såsom CD38, som också hydrolyserar cyklisk ADPR till ADPR 6 . Under apoptos drivs frisättningen av ADPR i cytosolen också av poly-ADPR-polymeraset (PARP) och poly-ADPR-glykohydrolas (PARG) -vägarna 7, 8 . Många experimentella data har tilldelat en viktig fysiologisk roll för TRPM2 vid typ I och typ II-diabetes, inflammation, lysosomal Ca 2+ -frisättning samt vid kardiovaskulära och neurodegenerativa sjukdomar som är nära förknippade med apoptos (för recensioner se ref 9, 10). För närvarande är den mest accepterade hypotesen för stimulering av TRPM2 genom oxidativ stress att oxidanter inducerar ackumulering av intracellulär ADPR, som i sin tur aktiverar TRPM2 5 . Som en experimentell modell för oxidativ stress används extracellulär H202 ofta och har visat sig utlösa TRPM2-aktivering 11, 12 . Det finns en positiv Ca 2+ -driven återkopplingsslinga under aktiveringen av TRPM2 eftersom Ca 2+ -inträde genom kanalporen sensibiliserar TRPM2 för aktiveringen av ADPR 1, 13, 14, 15, som alla bidrar till en dödlig ökning i intracellulär Ca 2+ -koncentration under apoptos.

För närvarande finns det lite information om de strukturella kraven för den unika aktiveringen av TRPM2, främst på grund av bristen på adekvata experimentella strategier för att korrekt ta itu med frågan. Ortologer från andra TRP-kanaler har framgångsrikt utnyttjats för att belysa de allmänt divergerande grindmekanismerna inom familjen (t.ex. ref. 16). Från fylogenetiska analyser finns det bevis på att en TRPM2-liknande kanal innehållande en NUDT9-homologregion (NUDT9H) representerar den arketypiska TRPM-kanalen av icke-metazoaniskt ursprung 17 . Detta har slutsats eftersom TRPM2-liknande kanaler är de enda representanterna för TRPM-underfamiljen i den enhetsformiga choanoflagellate Monosiga brevicollis såväl som i cnidarian Nematostella vectensis 17 . För närvarande representerar Nematostella vectensis en populär modellorganism för utvecklingen av nervsystemet 18 och immunsystemet 19 där den mänskliga TRPM2-kanalen spelar en viktig fysiologisk roll 9, 10 .

Syftet med den aktuella studien var den funktionella analysen av den TRPM2-liknande kanalen av Nematostella vectensi (nv TRPM2) efter heterologt uttryck i en human cellinje. Genom genereringen av kanalchimärer mellan nv TRPM2 och h TRPM2 kunde vi få insikt i den funktionella betydelsen av bevarade och förändrade sektioner av båda kanalerna, särskilt i NUDT9H-domänen och dess relation till kanalaktivering av ADPR, Ca 2+ och H2 O 2 . Vi rapporterar att detta tillvägagångssätt möjliggör identifiering av sekvenser som är kritiska för svaret på varje stimulans. Dessutom är våra resultat de första som ger bevis för en annan fysiologisk roll för en ADPR-gated katjonskanal från en organisme som betraktas som ett modellsystem för att studera tidig metazoan utveckling 20, 21 .

Resultat

Heterologt uttryck av TRPM2-ortologen

För den funktionella karaktäriseringen in vitro av en TRPM2-ortolog långt borta från h TRPM2, valde vi den TRPM2-liknande kanalen för havsanemonen Nematostella vectensis (jgi.Nemve1.248535 | estExt_fgenesh1_pg.C_6220005) 17 vars genom har fullständigt sekvenserats 20 och som är en modellorganism för jämförande studier och utveckling t.ex. av nervsystemet 18 . Vi bestämde oss för denna öppna läsram eftersom den ger maximal täckning av sekvensen och sekvensidentitet, jämfört med h TRPM2. Dessutom är kulturen och manipuleringen av Nematostella vectensis nu etablerad i många laboratorier världen över, vilket också möjliggör implementering av framtida in vivo- studier. Kommersiellt tillgänglig gensyntes användes för att generera den öppna läsramen bestående av 4656 baspar (bp) av den valda nv TRPM2-kanalen (kompletterande figur 1) och erbjuder dessutom möjligheten att modifiera kodonanvändningen 22 . Därmed garanterade vi bästa möjliga anpassning till däggdjursuttryckssystemet (HEK-293-celler) för våra in vitro- studier med TRPM2-ortologen utan att ändra den ursprungliga sekvensen av aminosyrarester (aa).

Sekvensegenskaper för nv TRPM2-kanalen

Den valda nv TRPM2-kanalen (1551 aa) visar en total sekvensidentitet på 31% till h TRPM2-kanalen (1503 aa). Likheten är störst i den N-terminala regionen uppströms om de förmodade transmembransegmenten (36% identitet) och i NUDT9H-domänen (39% identitet), medan regionerna som innehåller transmembransegmenten (25% identitet) och anslutningslänken till NUDT9H-domän (27% identitet) är mindre konserverade (kompletterande fig. 2). NUDT9H-domänen för nv TRPM2 (aa 1271–1551) visar 49% sekvensidentitet till motsvarande sekvens av h NUDT9-enzymet (aa 59–350), vilket är signifikant högre än mellan h NUDT9-enzymet och NUDT9H (aa 1236–1503) av h TRPM2 (34%; Kompletterande figur 3). Jämfört med h NUDT9-enzymet, i både nv TRPM2 och h TRPM2, är den förmodade ADPR-bindande domänen 3 i NUDT9H-domänen väl bevarad, inklusive den kritiska återstoden N1326 i h TRPM2 4 . Emellertid är det aktiva stället för h NUDT9-enzymet innehållande NUDIX-lådesignaturen GX 5 EX 7 REUXEEXGU 23 något annorlunda i NUDT9H i nv TRPM2 och markant annorlunda i NUDT9H för h TRPM2 (kompletterande figur 3). Ett kort aminosyramotiv inom den proximala delen av den förutsagda poröglan bidrar väsentligt till Ca2 + -genomträngningen av TRPM-kanaler 17 . I den icke-selektiva h TRPM2-kanalen består detta motiv av aminosyratripletten glutamin-isoleucin-prolin (QIP), medan det i nv TRPM2 ändras till glutamat-leucin-fenylalanin (ELF; kompletterande fig. 2). Därför innehåller nv TRPM2-kanalen signaturen för en mycket Ca 2+ -permeabel kanal 17 .

Som en slående skillnad till den primära strukturen för h TRPM2 uppvisar nv TRPM2-kanalen ett längre S1 – S2-länkområde med ett antal glutamat- och lysinrester. Denna region uppmärksammar betydande likhet med motsvarande region i h TRPM3-kanalen (kompletterande fig. 4), vilket stärker hypotesen att en TRPM2-liknande kanal representerar en gemensam förfader till den samtida TRPM-underfamiljen 17 .

Känslighet för ADP-ribos, intracellulär och extracellulär Ca 2+ och aktuell kinetik

Den funktionella karaktäriseringen av nv TRPM2 och h TRPM2 uttryckt övergående i HEK-293-celler utfördes med helcells patch-clamp-analys och kalciumavbildningsförsök. Vid måttligt ökade koncentrationer av ADPR (25–50 μM) och i frånvaro av Ca 2+ (≤10 nM) i pipettlösningen utvecklade nv TRPM2-transfekterade celler stora strömmar omedelbart efter att ha brutit in i cellen som återvände till baslinjen inom en några sekunder (fig. 1a). Amplituden hos dessa strömmar var ungefär ekvivalent med strömflödet genom h TRPM2 inducerad av en tiofaldigare högre koncentration av ADPR (fig. Ib). Som kontroll bekräftade vi att det inte fanns någon ström genom nv TRPM2 i frånvaro av ADPR i pipettlösningen eller när Ca 2+ -koncentrationen buffrades till ≤10 nM med EGTA på båda sidor om cellmembranet (Fig. 1c, d), vilket också är ett karakteristiskt drag hos h TRPM2 13, 14 . Följaktligen framkallades strömmar från både h TRPM2 och nv TRPM2 i tvåvärd fri extracellulär lösning endast när den ADPR-innehållande pipettlösningen kompletterades med 1 mikrometer Ca 2+ (fig. 2a).

(a) - (c) Mätningar av helcells patch-klämma i HEK-293-celler. Pipettlösningen innehöll 50 mikrometer ADPR (nv TRPM2) eller 300 mikrometer ADPR ( h TRPM2). Intracellulär Ca 2+ -koncentration justerades till <10 nM. (a) Omedelbar strömutveckling av nv TRPM2 efter uppnående av helcellskonfiguration (wc) i närvaro av 1, 2 mM extracellulär Ca 2+ . Strömmarna sjunker spontant och snabbt till baslinjen. (b) Typisk långsam start av strömmar av h TRPM2 registrerade under samma experimentella förhållanden som i panel a. Upprepad ströminhibering genom substitution av extern Na + med den ogenomträngliga katjonen NMDG. (c) Samma som i panel a, men hela-cellkonfigurationen upprättades i extracellulär divalent-fri lösning (DVF) i vilken Ca 2+ buffrats med EGTA till <10 nM. Strömmar utvecklades först efter det att den extracellulära DVF-lösningen ersattes med standardbadlösning innehållande 1, 2 mM Ca 2+ . (D) Strömtätheter i nv TRPM2 beroende på den intracellulära ADPR-koncentrationen. För experiment med 10 mikrometer ADPR (markerad med rött) justerades den intracellulära Ca2 + -koncentrationen till 1 mikrometer, annars var den intracellulära Ca2 + -koncentrationen under 10 nM. Som jämförelse visas motsvarande data för h TRPM2 vid 300 μM ADPR och ostimulerad nv TRPM2 (w / o) till vänster. ** Indikerar en signifikant skillnad (P = 0.01) från Studentens t-test. n = 8–16. Felfält är se

Bild i full storlek

(a) Normaliserade och överlagrade strömspår av vildtyp nv TRPM2 och h TRPM2. Varje strömspår erhölls i ett separat experiment genom stimulering med ADPR (50 um) och Ca 2+ (1 mikrometer) i pipettlösningen. Den extracellulära lösningen var alltid tvåvärd fri. För varje variant erhölls liknande resultat från minst fyra oberoende experiment. (b) Normaliserade och överlagrade strömspår av vildtyp nv TRPM2, nv TRPM2 variant (med porsignatur ELF ändrad till QLP) och h TRPM2. Varje strömspår erhölls i ett separat experiment genom stimulering med ADPR (100 um) och <10 nM Ca 2+ i pipettlösningen. Strömmar initierades genom utbyte av den extracellulära tvåvärdiga lösningen med standardbadlösning innehållande 1, 2 mM Ca 2+ . Strömflödet hämmas genom superfusion av cellerna med en lösning innehållande NMDG som huvudkation. För varje variant erhölls liknande resultat från minst 5 oberoende experiment. (c, d) Representativa strömspänningsförhållanden erhållna från helcelleppliknande klämförsök med nv TRPM2 (c) och h TRPM2 (d). Inspelningar utfördes antingen i standardbadlösning (1, 2 mM Ca 2+ ) eller i extern lösning innehållande NMDG som huvudkation. (e) Typisk strömutveckling av h TRPM2 under superfusion med standardbadlösning innehållande 10 mM H202 (tidpunkt för applicering indikerad med en pil). Intracellulär koncentration av Ca 2+ var 1 mikrometer. Strömmar hämmades upprepade gånger av NMDG. Data om h TRPM2 och nv TRPM2 sammanfattas i insättningssiffran. *** Indikerar en signifikant skillnad (P = 0, 001) från Studentens t-test. n = 9–14. Felfält är se

Bild i full storlek

För att kvantifiera kinetiken för inaktivering av nv TRPM2, mätte vi den tid under vilken 90% av den nuvarande nedgången inträffade, vilket uppgick till 14, 1 ± 4 s ( n = 7). Detta står i slående kontrast till h TRPM2, som vanligtvis visar strömmar som utvecklas långsamt och efter en karakteristisk fördröjning, beroende på de intracellulära koncentrationerna av ADPR och Ca 2+ (ref 1, 13, 14, 15, 24). Dessutom inträffade nedströmningen av h TRPM2-strömmar under flera minuter snarare än sekunder och var ofta ofullständig inom tidsramen för experimenten (fig. Ib). För att bedöma kinetiken för den nuvarande utvecklingen i nv TRPM2 under stimulering med ADPR och utan Ca 2+ i pipetten utfördes experiment i divalentfri extracellulär lösning (DVF), och strömmar initierades genom superfusion av cellerna med standardbadlösning innehållande 1, 2 mM Ca 2+ (fig. 1c). Även under dessa experimentella förhållanden visade aktiveringen av nv TRPM2 ingen fördröjning, återigen i tydlig kontrast till h TRPM2 14 .

När pipettlösningen innehöll 10 mikrometer ADPR och 1 mikrometer Ca 2+ var strömmarna för nv TRPM2 betydligt mindre än de som observerades under förhållanden där patchpipetten innehöll 25 mikrometer ADPR och ≤10 nM Ca 2+ (fig. 1d). Typiskt accelereras den ADPR-beroende strömutvecklingen av h TRPM2 med intracellulär Ca 2+ (t.ex. ref. 1). Detta demonstreras med experiment som visas i figurerna 2a och 2b i vilka strömmar antingen stimulerades med 50 mikrometer ADPR och 1 mikrometer Ca 2+ i pipettlösningen (fig. 2a; extracellulär lösning tvåvärdig fri) eller med intracelluär 100 mikrometer ADPR och Ca2 + buffrat till under 10 nM (fig. 2b; extracellulär lösning med 1, 2 mM Ca2 + ). Däremot var den nuvarande kinetiken för nv TRPM2 oskiljbar under båda experimentella förhållandena (fig. 2a, b). Dessa fynd antyder att det inte finns någon graderad modulering med intracellulär Ca 2+ på nv TRPM2 under de studerade förhållandena. Eftersom det karakteristiska pormotivet (ELF) för nv TRPM2 emellertid indikerar en hög permeabilitet för Ca 2+, kan den lokala Ca 2+ -koncentrationen vid dess föreslagna aktiveringsställen 15 vara betydligt högre i nv TRPM2 än i h TRPM2. Därför genererade vi en nv TRPM2-variant med h TRPM2-liknande poresignatur (QLP). Denna manipulation bör minska Ca 2+ -permeabiliteten för nv TRPM2 till motsvarande nivå av h TRPM2, som andra har visat med en liknande strategi 17 . Stimuleringen av h TRPM2, nv TRPM2 och nv TRPM2- (QLP) med 100 μM ADPR och ≤10 nM Ca 2+ i patchpipetten framkallade strömmar med tydligt olika kinetik (fig. 2b). I dessa experiment ersattes det initialt divalenta fria badet med en lösning innehållande 1, 2 mM Ca 2+ . I vildtyp nv TRPM2 inducerade detta en nästan omedelbar strömaktivering och en snabb inaktivering, medan den aktuella början av h TRPM2 var starkt försenad. Aktiveringskinetiken för nv TRPM2- (QLP) -varianten var något långsammare jämfört med vildtyp nv TRPM2, men var fortfarande betydligt snabbare än i h TRPM2. De nuvarande amplituderna av vildtyp nv TRPM2 och nv TRPM2- (QLP) framkallade med olika koncentrationer av intracellulär ADPR (50–300 μM) var inte märkbart olika.

Därför kan Ca 2+ -inflöde genom kanalporen på nv TRPM2 påskynda kanalens aktiveringskinetik. Denna effekt kan förklaras av ännu oidentifierade Ca 2+ -aktiverande platser nära poren 15 . Både bestämning av den relativa Ca2 + -permeabiliteten för QLP-varianten och identifieringen av dessa platser i nv TRPM2 och h TRPM2 behöver ytterligare experimentell undersökning.

I våra experiment utförda med standardbadlösning innehållande 140 mM NaCl, 1, 2 mM CaCl2 och 1, 2 mM MgCl2, visade strömspänningsrelationerna av vildtyp nv TRPM2 och nv TRPM2- (QLP) en svag dubbelrätning (visat för vildtyp nv TRPM2 i fig 2c), i motsats till den strikt linjära I / V-kurvan för h TRPM2 (fig 2d). Strömmarna reverserade vid ungefär 0 mV och deras inre komponenter inhiberades genom ersättning av extracellulär Na + med NMDG (fig. 2c, d).

Osensitivitet av nv TRPM2 mot oxidativ stress inducerad av den extracellulära appliceringen av H202

En nyckelfunktion hos alla TRPM2-kanalortologer som studerats tidigare är deras aktivering som svar på oxidativ stress 11, 12 som experimentellt simuleras genom den extracellulära appliceringen av H202 (fig. 2d). För närvarande är den mest accepterade hypotesen att H202 aktiverar kanalen indirekt genom en ansamling av intracellulär ADPR 5 . Denna vy stöds av insida-ut patch-klämma-experiment där H202 uppenbarligen inte hade några direkta effekter på TRPM2 25 . En nyligen genomförd studie rapporterade emellertid att H202 sensibiliserar h TRPM2 för aktivering genom fysiologisk kroppstemperatur genom oxidation av en metioninrest som är lokaliserad i N-terminalen av kanalen 26 . Denna specifika metioninrest är också bevarad i nv TRPM2 (kompletterande figur 2). Ändå kunde vi inte aktivera nv TRPM2 med H2O2 även i koncentrationer på 10–20 mM och i närvaro av 1 μM [Ca 2+ ] i (inlägg Fig. 2d). På liknande sätt svarade varianten nv TRPM2- (QLP) inte på H202 i varken patch-clamp-experiment (n = 4) eller i kalciumavbildningsexperiment ( n = 10).

Byte av NUDT9-domäner för nv TRPM2, h TRPM2 och h NUDT9-enzym

För att ytterligare definiera den funktionella rollen för NUDT9H-domänen genererade vi chimärer av nv TRPM2 och h TRPM2 genom att utbyta NUDT9H-domänerna. De utbytta NUDT9-sekvenserna ( h TRPM2: aa 1253–1503; nv TRPM2: aa 1289–1551) innehöll inte de funktionellt oviktiga 60 N-terminala aminosyraresterna 3 . Som kontroll smälte vi också motsvarande del (aa 77–350) av det ursprungliga h NUDT9-enzymet till varje kanal. En översikt över strukturen och de viktigaste funktionella egenskaperna för alla TRPM2-varianter som analyserats i denna studie ges i figur 3. Som förväntat var h TRPM2-kanalvarianterna som mottog NUDT9-domänen antingen från nv TRPM2 eller från h NUDT9-enzymet inaktiva ( Kompletterande figur 5; inga svar på 0, 6 mM ADPR och 1 mikrometer Ca 2+ i patchpipetten eller på extracellulär stimulering med 10 mM H202), i linje med tidigare resultat där en delvis återställande av NUDIX-konsensusmotivet i h TRPM2 var inte kompatibel med kanalfunktion 4, 5 . Däremot var nv TRPM2-chimerna som innehöll den centrala delen av h NUDT9-enzymet (nv TRPM2-NUDenz) funktionellt oskiljbara från vildtyp nv TRPM2. Detta inkluderar svaret på ADPR, okänsligheten för H202, beroendet av Ca 2+ på åtminstone en sida av cellmembranet, liksom den grindande kinetiken (fig. 4a – c).

Bild i full storlek

(a) Genomsnittsdata för helcelleppliknande klämförsök där nv TRPM2-NUDenz (nv TRPM2 med NUDT9-domänen i h NUDT9-enzymet) eller nv TRPM2- h NUD (nv TRPM2 med NUDT9-domänen i h TRPM2) stimulerades antingen med 50 μM ADPR i pipettlösningen (intracellulär Ca 2+ -koncentration ≤10 nM) eller genom extracellulär applicering av 10 mM H2O 2 (intracellulär 1 μM Ca 2+ ). ** Indikerar en signifikant skillnad (P = 0.01) från Studentens t-test. n = 5–8. Felstänger är se (b) - (e) Representativa inspelningar som visar aktuell utveckling av nv TRPM2-NUDenz (b, c) och nv TRPM2- h NUD (d), (e) efter stimulering med ADPR eller H 2 O 2 som indikerat . Under stimulering med ADPR startades experimenten i tvåvärd fri badlösning (DVF) och strömmar utvecklades först efter substitution av DVF med standardbadlösning med 1, 2 mM Ca 2+ .

Bild i full storlek

Dessutom svarade nv TRPM2-chimärerna med NUDT9H-domänen för h TRPM2 (nv TRPM2- h NUD) inte bara ADPR på samma sätt som vildtyp nv TRPM2 (fig. 4a, d) utan hade dessutom fått känslighet för H2 O 2 (fig. 4a, e). HEK-293-celler som uttrycker nv TRPM2- h NUD-chimera svarade med stora inåtströmmar vid extracellulär stimulering med 10 mM H202. Återigen var aktiveringskinetiken mycket snabb, vilket representerar ett typiskt drag för nv TRPM2. En kvantitativ analys avslöjade att under stimuleringen med 10 mM H202, fördröjningen mellan strömmen och en strömamplitud på 0, 6 nA uppgick till 3 ± 1, 4 s ( n = 7). Tiden under vilken 90% av strömmen hade minskat var 15, 5 ± 12 s ( n = 6). Som jämförelse var motsvarande värden för aktuell utveckling i h TRPM2 116 ± 54 s ( n = 10; se fig. 2d och 4e).

Identifiering av NUDT9H-sekvenserna som ger känslighet för H202

I nästa steg minskade vi sekvenskraven för överföring av H2O2-känsligheten från h TRPM2 till nv TRPM2. Vi koncentrerade oss initialt på NUDIX-rutan och intilliggande sekvenser. En detaljerad sekvensjämförelse visar en radering av en sträcka av 14 eller 15 aminosyrarester något nedströms NUDIX-rutan i h TRPM2, jämfört med nv TRPM2-kanalen respektive h NUDT9-enzymet (kompletterande fig. 3). Det är anmärkningsvärt att denna borttagning är mycket bevarad i ryggrads-TRPM2-ortholguer men saknas i ryggradslösa TRPM2-kanaler. Vidare innehåller h TRPM2 flera argininrester (R1392, R1400, R1407) inom NUDIX-domänen där både nv TRPM2 och h NUDT9-enzymet har neutrala rester istället (kompletterande figur 3).

Därför genererade vi enpunktsmutationer i nv TRPM2 med argininrester på de relevanta positionerna såväl som en nv TRPM2-variant med en motsvarande borttagning av de 15 aminosyraresterna nedströms NUDIX-rutan (kompletterande figur 3). Motsvarande helcell patch-klämdata på nv TRPM2- (Q1438R) och nv TRPM2- (Δ15) visas i fig. 5. I likhet med vildtyp nvTRPM2, båda varianterna visade liknande svar på ADPR såväl som strömhämning när Ca 2+ avlägsnades från båda sidor av cellmembranet samtidigt (fig. 5a – c). Dessutom uppvisade de två varianterna robusta svar på H202 (fig. 5a, d, e).

(a) Medeldata för nv TRPM2-varianter antingen innehållande punktmutationen Q1438R eller en radering av en sträcka av 15 aminosyrarester omedelbart nedströms NUDIX-rutan. Stimulering utfördes med 50 μM intracellulär ADPR eller 10 mM extracellulär H202 som beskrivits i fig. 4. n = 4–9. (b) - (f) Representativa inspelningar som visar aktuell utveckling av nv TRPM2-Q1438R och nv TRPM2- (Δ15) efter stimulering med ADPR (b), (c) eller H202 (d), (e) som anges. (f) Observera förekomsten av spontana strömmar såväl som utvecklingen av H202-inducerade repetitiva strömmar i varianten nv TRPM2- (Δ15).

Bild i full storlek

Som en ytterligare viktig upptäckt uppvisade nv TRPM2- (Δ15) -kanalen övergående spontana strömmar kort efter att ha brutit in i cellen (fig. 5e, f). Dessa strömmar uppgick till 65, 2 ± 24 pA / pF, utvecklades uteslutande ( n = 9 vs. n = 7 kontroller) i närvaro av intracellulär Ca 2+ (1 mikrometer i pipettlösningen) och återkom snabbt till baslinjen (fig. 5e) . Den efterföljande stimuleringen med H202 framkallade ofta repetitiva strömutvecklingar som avbröts av fullständig återgång till baslinjen (Fig. 5f, n = 6 av n = 9 experiment). Som ytterligare kontroll framkallades varken spontana strömmar eller H2O2-inducerade strömmar när vildtyp nv TRPM2-transfekterade HEK-293-celler infunderades med en pipettlösning innehållande 5 uM Ca 2+ ( n = 7).

H2O2-känsliga nv TRPM2-varianter inducerar Ca 2+ -oscillationer i HEK-293 celler

Eftersom de elektrofysiologiska experimenten på nv TRPM2- (Δ15) avslöjade att en specifik borttagning av 15 aminosyrarester modifierar nv TRPM2-kanalen från att vara enbart känslig för ADPR till att vara ytterligare känslig för H202, utförde vi kalciumavbildningsexperiment med HEK- 293 celler transfekterade antingen med nv TRPM2- (Δ15) eller nv TRPM2- h NUD. Det faktum att dessa två nv TRPM2-varianter kan stimuleras av en extracellulär stimulans, dvs. H202, är en förutsättning för detta experimentella tillvägagångssätt. Som positiv kontroll använde vi vildtyp h TRPM2, som visade en jämn och långvarig ökning av [Ca 2+ ] i som svar på H202 (Fig. 6a) som tidigare rapporterats (t.ex. ref. 27) . Däremot visade celler som transfekterats med vildtyp nv TRPM2 endast en liten ökning av [Ca 2+ ] i som svar på H202, vilket inte kunde skiljas från de från håliga transfekterade celler (fig. 6b – d). I nv TRPM2- h NUD hittades en avsevärd ökning av [Ca 2+ ] i efter appliceringen av 10 mM H202 (fig. 6d, e). Anmärkningsvärt, snarare än en kontinuerlig ökning av [Ca 2+ ] i, inducerades en karakteristisk svängning med en mellanliggande minskning av [Ca 2+ ] i relativt baslinjen i den kontinuerliga närvaron av H202 ( n = 8 av 12 celler) (fig. 6e). Endast i nv TRPM2- (Δ15) utvecklades svängningar i [Ca 2+ ] i ibland spontant ( n = 6 av 19 celler) och förbättrades under stimulering med H202 ( n = 16 av 19 celler; Fig. 6f). Svängningarna i [Ca 2+ ] i visar närvaron av en positiv feedbackmekanism under aktiveringen av specifika nv TRPM2-varianter som involverar repetitiv kanalaktivering i närvaro av intracellulär Ca 2+ . Denna mekanism förklaras bäst av en strömförbättring med intracellulär Ca 2+, i linje med de elektrofysiologiska data.

(a) - (c), (e), (f) Representativa experiment på h TRPM2, nv TRPM2, tom vektorkontroll, nv TRPM2- h NUD och nv TRPM2- (Δ15) såsom indikeras, vilket visar F340 / F380-förhållandet över tid. Extracellulär H202 (10 mM) tillsattes vid tidpunkter markerade med pilar. Maximala ökningar i F340 / F380 sammanfattas i d. Den hämmande effekten av borttagning av extracellulärt Ca 2+ visas i panel f. *** Indikerar en signifikant skillnad (P = 0, 001) utvärderad med en enkelriktad ANOVA och Bonferroni-korrigering. n = 12–19. Felfält är se

Bild i full storlek

Mutation av kritiska NUDT9H-sekvenser i h TRPM2

Eftersom några justeringar enligt sekvensen för h TRPM2 gör nv TRPM2-kanalen ytterligare känslig för H202, kan det förväntas att svar på H202 avskaffas eller dämpas i h TRPM2-ortologen med motsatta sekvensmanipulationer. Känsligheten för mutanten h TRPM2- (R1400Q + R1407G) för H202 (fig. 7a) och ADPR (fig. 7b) liksom I / V-kurvan (fig. 7c) var emellertid oförändrade, när jämfört med vildtyp TRPM2. Som en ytterligare modifiering av h TRPM2 ersatte vi hela C-terminal NUDT9H-sekvensen nedströms från NUDIX-rutan med motsvarande segment av nv TRPM2 (kompletterande figur 3). Detta segment inkluderar också sekvensen av 15 aminosyrarester som raderas i vildtyp h TRPM2 (men inte i h NUDT9-enzymet) och är en potentiell bestämmer för känsligheten för H202 och de ytterligare effekterna av intracellulärt Ca2. + . Varianten h TRPM2 - (+ Δ15), i närvaro av 1 μM [Ca 2+ ] i, var lika känslig för H202 som vildtyp h TRPM2 (fig. 7d och 8a). Reaktionen på ADPR reducerades emellertid signifikant när den intracellulära sam-agonisten Ca2 + buffrades med EGTA till <10 nM (fig. 8a, b). Närvaron av 1, 2 mM ADPR i pipettlösningen väckte endast små strömmar i h TRPM2 - (+ Δ15), jämfört med vildtyp h TRPM2, som visade en stark och snabb strömutveckling vid liknande koncentrationer (fig. 8a, c). Däremot var strömmarna för h TRPM2 - (+ +15) i närvaro av 1 μM [Ca 2+ ] i liknande de som registrerades från h TRPM2, även i koncentrationer så låga som 0, 15 mM ADPR (fig. 8a, d) .

(a), (b) Representativa helcells patchklämminspelningar av h TRPM2 dubbelmutant R1400Q + R1407G. Stimulering utfördes (a) med extracellulär 10 mM H202 eller (b) med intracellulär 0, 3 mM ADPR. (c) Motsvarande I / V-förhållande mellan strömmar registrerade i panel b. (d) Representativ helcells patchklämregistrering av varianten h TRPM2 - (+ Δ15) som innehåller den C-terminala delen av NUDT9-domänen i nv TRPM2 nedströms NUDIX-rutan. Stimulering utfördes med extracellulär 10 mM H202. Strömmar hämmades upprepade gånger av NMDG.

Bild i full storlek

(a) Medeldata för vildtyp h TRPM2 och h TRPM2 - (+ Δ15) under stimulering med antingen intracellulär ADPR (1, 2 mM + ≤10 nM [Ca 2+ ] i eller 0, 15 mM + 1 μM [Ca 2+ ] i ) eller extracellulär 10 mM H202. *** Indikerar en signifikant skillnad (P = 0, 001) från Studentens t-test. n = 6–11. Felstaplar är se (b) - (d), Representativa helcells patchklämmainspelningar på h TRPM2 - (+ Δ15) och vildtyp h TRPM2 som indikerat, antingen stimulerad med 1, 2 mM intracellulär ADPR i närvaro av ≤10 nM Ca 2+ i patch-pipetten (b), (c) eller med 0, 15 mM ADPR i närvaro av 1 μM Ca 2+ i patch-pipetten (d).

Bild i full storlek

Diskussion

Hittills har TRPM2-funktionen studerats endast med ortologer från däggdjur, där dess speciella roll som en gateway för Ca 2+ i samband med oxidativ stressmedierad apoptos upptäcktes 7, 11, 26, 28 . Här har vi för första gången funktionellt uttryckt en TRPM2-liknande kanal från Nematostella vectensis i en human cellinje. Den funktionella karaktäriseringen av denna avlägsna släkting till h TRPM2 underlättar ny insikt i den komplexa gatingfenotypen för TRPM2-chanzym. Strömmar genom nv TRPM2 inducerades av ADPR, med en större känslighet och snabbare kinetik än i den mänskliga ortologen, medan moduleringen tillhandahållen av intracellulär Ca 2+ var mindre uttalad. I slående kontrast till dess effekt på h TRPM2 hade den experimentella utlösaren av oxidativ stress, H2O2, ingen effekt på nv TRPM2. Med hjälp av ett chimärt tillvägagångssätt identifierade vi några strukturella element inom NUDT9-domänen som överförde känslighet för H202 och modulerade effekterna av intracellulär Ca 2+ på nv TRPM2 samt minskade känsligheten för ADPR i h TRPM2. Dessa fynd främjar vår förståelse av mekanismerna som är involverade i den komplexa grindprocessen för h TRPM2 med olika stimuli såväl som anpassningarna av denna katjonkanal under evolutionen.

Den nuvarande uppfattningen av ADPR som förmedlare av oxidativ stressinducerad apoptos fokuserar på rollen för däggdjurs TRPM2-kanaler som en självförstärkande gateway för kalciuminflöde 26, 28 . Det har föreslagits att stimuleringen av TRPM2 genom oxidativ stress är indirekt, innefattande en intracellulär ansamling av fri ADPR 5, 25 . Våra nuvarande fynd belyser utvecklingen av att avkänna oxidativ stress eftersom till och med låga intracellulära koncentrationer av ADPR framkallar starka och omedelbara svar i nv TRPM2 som kännetecknas av en kort varaktighet, medan H202 inte lyckas stimulera kanalen. Däremot har h TRPM2 utvecklats till en mer polymodal kanal med betydligt långsammare kinetik och en distinkt modulering av Ca 2+ . Antagligen är den långsammare kinetiken en förutsättning för förmågan hos h TRPM2 att generera en självförstärkande och långvarig tillströmning av Ca 2+, vilket ökar mottagligheten för celldöd 11 .

Baserat på en jämförande sekvensanalys av h TRPM2 och nv TRPM2, analyserade vi effekterna av borttagningen av en sträcka av 15 aminosyrarester omedelbart nedströms NUDIX-rutan samt punktmutationen Q1438R i NUDIX-rutan. Vi fann att båda mutationerna förmedlar H202-känslighet för nv TRPM2. Som en biologisk tolkning kan TRPM2 genom dessa förändringar ha utvecklats till en kanal som reagerar på oxidativ stress på ett mer mångsidigt sätt än nv TRPM2 eftersom det reagerar på ytterligare och eventuellt mer direkta signaler än enbart till ADPR. Dessa data, speciellt om nv TRPM2- (Δ15) -varianten, antyder att känsligheten för H2O 2 på något sätt är avgörande kopplad till intracellulär Ca 2+, men denna hypotes kräver omfattande framtida arbete. Det är troligt att ytterligare genetiska förändringar med samma effekt existerar eftersom de omvända förändringarna i h TRPM2, dvs chimerna h TRPM2 - (+ Δ15) och punktmutationerna R1400Q + R1407G, inte avskaffade sina svar på H2O 2 .

Jämfört med h TRPM2 uppvisar nv TRPM2 speciella egenskaper speciellt i tidskurserna för aktivering och inaktivering. TRPM2-kanalen visar reaktioner med en karakteristisk fördröjning och en gradvis utveckling av ström, följt av en mycket långsam inaktivering. Däremot sker aktiveringen av nv TRPM2 inom några sekunder, varefter en tydlig och snabb inaktivering följer. Det är viktigt att denna artsspecifika kinetik bevaras efter alla manipulationer på NUDT9-domänen och gäller dessutom för de nyligen förvärvade H2O2-svaren i specifika nv TRPM2-varianter. Därför kan det antas att de olika kinetiken inte representerar skillnader i reaktionerna av NUDT9-domänen till stimuli utan snarare återspeglar skillnader i mekanismerna för hur en stimulerad NUDT9-domän möjliggör grindning av kanalporen. Denna interaktiva process för kanalgrindning i TRPM2 förblir oklar. Framtida studier om nv TRPM2 kan hjälpa till att förbättra vår förståelse för denna fråga.

Ett karakteristiskt drag hos h TRPM2 är dess starka beroende av intracellulär Ca 2+ genom att det finns en dramatisk ökning av känsligheten för ADPR med en eller två storleksordningar när [Ca 2+ ] i ökar från 0 till 1 μM 13, 14 . Det har föreslagits att detta gör h TRPM2 till en mestadels [Ca 2+ ] i- reglerad kanal i närvaro av endogena ADPR-nivåer 24 . H TRPM2-kanalen har åtminstone ett potentiellt kalmodulinbindande domän 29 och den underlättande effekten av [Ca2 + ] i postulerades för att medieras av calmodulin 14, 29 . I nv TRPM2 finns emellertid varken den antagna kalmodulinbindningsdomänen för h TRPM2 eller andra förmodade kalmodulinbindningsställen. Upptäckten att kanalaktiveringen av både h TRPM2 och nv TRPM2 beror på Ca 2+, åtminstone på en sida av cellmembranet, antyder starkt att de antagna Ca 2+ -aktiveringsställena i närheten av h TRPM2-poren 15 också är närvarande i nv TRPM2. I linje med denna idé avslöjar våra patch-clamp-studier av nv TRPM2-varianter med förmodligen olika permeabiliteter för Ca 2+ en signifikant men relativt liten positiv feedback av Ca 2+ på kanalaktivitet. Hittills är dessa resultat kompatibla med avsaknaden av en kalmodulinbindande domän i nv TRPM2. Men nv TRPM2- (Δ15) -varianten som innehåller den specifika borttagningen av 15 aminosyrarester som är karakteristiska för h TRPM2 visade strömmar som klart är beroende av [Ca 2+ ] i . Vid kalciumavbildningsförsök med HEK-293 celler transfekterade med nv TRPM2- h NUD eller nv TRPM2- (Δ15) inträffade oscillationer i [Ca 2+ ] i antingen spontant eller efter stimulering med H202. Mot bakgrund av det icke-fysiologiska tillståndet hos en cnidariankanalchimera i ett mänskligt uttryckssystem, analyserade vi inte dessa svängningar mer detaljerat. I vilket fall som helst, eftersom positiva och negativa feedbackmekanismer är förutsättningar för svängningar, ger våra resultat bevis på att effekterna av intracellulär Ca 2+ på nv TRPM2- (Δ15), även utan bindning av calmodulin, är tillräckligt starka för att skapa observerade svängningar i [Ca 2+ ] i . Den snabba ströminaktiveringen av nv TRPM2 och dess varianter är en trolig mekanism för den erforderliga negativa återkopplingen, som saknas i den mänskliga ortologen. I våra experiment hittade vi inga svängningar i [Ca 2+ ] i . för h TRPM2. Emellertid har Ca2 + -oscillationer redan beskrivits för TRPM2 endogent uttryckt i RIN-5F-celler 11, även om dessa observationer erhölls under starkt olika experimentella förhållanden.

Kalciumavbildningsdata visar att nv TRPM2 är inaktiv i intakta celler med fysiologiska koncentrationer av intracellulär ADPR och Ca 2+ . Om stimuleringen med extracellulär H202 ökade den intracellulära nivån för ADPR, bör en robust aktivering induceras; detta var inte fallet. Dessutom var små ospecifika stigningar i [Ca 2+ ] i inducerad av extracellulär H202 inte tillräckliga för att stimulera nv TRPM2.

De funktionella egenskaperna hos nv TRPM2- (Δ15) fick oss att skapa den mänskliga varianten h TRPM2 - (+ Δ15) som visar en mycket svagare känslighet för ADPR än vildtyp h TRPM2. Detta är ett anmärkningsvärt drag eftersom rapporterade manipulationer av NUDT9-sekvensen i h TRPM2 antingen helt har avskaffat svar på ADPR eller lämnat dem oförändrade 4, 5 . Intressant nog är mutationen h TRPM2 - (+ Δ15) muterad varken i det förmodade ADPR-bindningsområdet eller i den katalytiska domänen i NUDIX-rutan, utan istället inom den C-terminala delen av NUDT9. Det starkt dämpade svaret av h TRPM2 - (+ Δ15) på intracellulär ADPR var särskilt uttalat i frånvaro av intracellulär Ca2 + . Närvaron av Ca 2+ (1 μM) i pipetten återställde dock ADPR-känsligheten till vildtypnivån. Dessa fynd med h TRPM2 - (+ Δ15) passar till hypotesen om att det drabbade området är involverat i processen som uppnår grindning av poren efter bindningen av ADPR och stödjer slutsatserna härledda från de olika kinetiken för nv TRPM2 och h TRPM2, men detta väntar på ytterligare experimentella studier.

Med användning av flera experimentella metoder med nv TRPM2-varianter har vi visat att kanalaktivering med H202 kan separeras från och inte medieras av ADPR. Mest påfallande var svar på H202 frånvarande i vildtyp nv TRPM2, även om känsligheten för ADPR är betydligt starkare än i h TRPM2. Endast genom att göra tydliga förändringar i NUDT9-domänen produceras känsligheten för H202 utan att påverka ADPR-känsligheten. På liknande sätt är varianten h TRPM2 - (+ Δ15) lika känslig för H202 som vildtyp h TRPM2 men svarar betydligt svagare på ADPR. Å andra sidan är det anmärkningsvärt att känsligheten för H2O2 och de modulatoriska effekterna av intracellulär Ca 2+ förändras parallellt i alla studerade varianter, så att dessa två aktiveringsvägar inte hittills kan diskrimineras.

Vi drar slutsatsen att h TRPM2 och dess mest avlägsna ortolog undersökt hittills, nv TRPM2, har bevarats tillräckligt under evolutionen så att nv TRPM2 kan uttryckas funktionellt i mänskliga celler. Dessutom har nv TRPM2-kanalen visat sig vara funktionell kompatibel med NUDT9-domänerna i h TRPM2 och h NUDT9-enzymet. Nyligen genomförda studier har visat en slående likhet mellan Nematostella vectensis och ryggradsdjur när det gäller genomisk organisation och geninnehåll 20, 21 . Detta kan vara en indikation på att många grundläggande cellulära processer för ryggradsdjur och cnidaria redan fanns i den eumetazoaniska förfäder. Följaktligen kunde h TRPM2 ha utvecklats från en arkaisk kanal som ursprungligen reagerade på ADPR på ett mycket känsligt men tillfälligt sätt till en som tillåter varaktiga svar. Denna modifiering kan vara ett avgörande steg för integrationen av TRPM2 i komplexa cellulära processer. Genom subtila förändringar inom NUDT9-domänen som delvis identifierades i våra experiment får TRPM2 känslighet för H202 oberoende av ADPR. Därmed kan däggdjurs TRPM2-kanaler reagera på ett expanderat spektrum av budbärare och signaler om oxidativ stress och möjliggöra katjoninflöde och förbättrad kalciuminträde.

metoder

Molekylär kloning

Aminosyrasekvensen för den TRPM2-liknande kanalen för Nematostella vectensis hämtades från den genomiska databasen JGI (//www.jgi.doe.gov/). Motsvarande cDNA (nv TRPM2; jgi.Nemve1.248535 | estExt_fgenesh1_pg.C_6220005) syntetiserades av MWG-Biotech (Ebersberg, Tyskland) som två oberoende fragment. Det 5'-terminala fragmentet på 2939 bp börjar med ett restriktionsställe för Asc I följt av Kozak-sekvensen gccacc och startkodonet och slutar med ett restriktionsställe för Hind III. Det 3'-terminala fragmentet från 1743 bp börjar med Hind III-restriktionsstället och slutar med ett stoppkodon följt av ett Xbal- restriktionsställe. Kodonanvändningen anpassades under syntesen för att säkerställa optimalt uttryck i HEK-293-celler och DNA-sekvensen (kompletterande figur 1) verifierades genom dubbelsträngad DNA-sekvensering med MWG-Biotech. Det 5'-terminala fragmentet subklonades via Asc I + Hind III i den modifierade PIRES-hrGFP-2a-vektorn (Stratagene, La Jolla, CA, USA) som innehåller ett unikt Asc I- ställe istället för ett enda Nhe I- ställe såväl som en unik Xba I-webbplats istället för en enda Xho I-webbplats. Därefter tillsattes det 3'-terminala fragmentet via ett Hind III + Xba I-kloningssteg. CDNA från h TRPM2 subklonades via EcoRI + Xbal i pIRES-hrGFP-2a-vektorn. CDNA från det humana NUDT9-enzymet (Accession No: NM_024047.3) köptes från AMS Biotechnology, (Abingdon, UK). Site-riktad mutagenes utfördes med användning av QuikChange-mutagenes-systemet (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Definierade oligonukleotider erhölls från MWG-Biotech. Varje punktmutation och chimär kanalkonstruktion verifierades genom DNA-sekvensering (MWG-Biotech). Alla procedurer utfördes i enlighet med respektive tillverkares instruktioner, såvida inte annat anges. Sekvensinställningar utfördes enligt UniProtKB-justeringsverktyget på www.uniprot.org.

Cellodling och transfektion

HEK-293-celler erhölls från den tyska samlingen av mikroorganismer och cellkulturer (Braunschweig, Tyskland) och odlades i DMEM-media (Biochrome, Berlin, Tyskland) kompletterat med 4 mM L-glutamin och 10% (v / v) fetalt kalvserum (Biokrom) och 2 mM natriumpyruvat. Övergående transfektioner av HEK-293-celler med cDNA: er från h TRPM2, nv TRPM2 eller chimära varianter utfördes med användning av FuGene 6-transfektionsreagenset (Roche, Mannheim, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Som kontroller transfekterades cellerna med PIRES-hrGFP-2a-vektorn ensam. De transfekterade cellerna hölls under 24 timmar i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Subsequently, the cells were seeded on poly-lysine-coated glass coverslips at a suitable dilution and further incubated for 3–4 h. Then, patch-clamp and calcium imaging experiments were carried out in cells visibly positive for EGFP. At least three independent transfections were used for each experimental group.

Electrophysiology

Helcellsinspelningar utfördes med användning av en EPC 9-förstärkare utrustad med en persondator med Pulse 8.5 och X Chart-programvara (HEKA, Lamprecht, Tyskland). Standardbadlösningen innehöll (i mM) 140 NaCl, 1, 2 MgCl2, 1, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 HEPES, pH 7, 4 (NaOH). För Na + -fria lösningar ersattes Na + med 150 mM N-metyl-D-glukamin (NMDG) och titreringen utfördes med HCl. Den tvåvärdiga fria badlösningen (DVF) innehöll (i mM) 150 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, pH 7, 4 (NaOH). Pipettlösningen innehöll (i mM) 145 CsCl, 8 NaCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7, 2 (CsOH) och Ca2 + -koncentrationen justerades till antingen <10 nM (10 mM Cs-EGTA, ingen Ca2 +) tillsats), till 1 um (0, 886 mM Ca 2+, 1 mM Cs-EGTA) eller till 5 um (0, 970 mM Ca 2+, 1 mM Cs-EGTA). Ca 2+ -koncentrationen av lösningarna beräknades med användning av MAXC- programmet: (//www.stanford.edu/ ~ cpatton/maxc.html). För stimulering av TRPM2 sattes Adenosindifosfatribos (ADPR; 100 mM stamlösning i destillerat vatten) till den intracellulära lösningen vilket gav en slutlig koncentration av 0, 001-1, 2 mM. Alternativt framkallades TRPM2-strömmar genom superfusion av cellerna med standardbadlösning innehållande 10 mM H202 (utspädd från en 30% stamlösning). Om inget annat anges utfördes experimenten vid rumstemperatur (21 ° C) och strömspänningsförhållandena erhölls under spänningsramper från -150 till +150 mV och tillbaka till -150 mV applicerade över 200 ms. Hållpotentialen var −60 mV. För analysen delades de maximala strömamplituderna (pA) i en cell av cellkapacitansen (pF), ett mått på cellytan. Resultatet är strömtätheten (pA / pF).

Kalciumavbildningsexperiment

För fluorescensavbildning av [Ca 2+ ] i HEK-293-celler på poly-lysinbelagda glasöverdrag placerades i standardbadlösning innehållande membranpermeabel Fura-2-acetoximetylester (1, 5 ng / mL; Invitrogen) och pluronsyra (0, 025) %) under 20 minuter vid 37 ° C. Fluorescens exciterades växelvis vid 340 och 380 nm med användning av Polychrome IV monokromator (TILL Photonics). Den utsända fluorescensen mättes vid 510 nm med användning av en Sensicam (IMAGO). Fluorescens korrigerades för bakgrund vid varje våglängd. Mätningar erhölls vid rumstemperatur (21 ° C). Standardbadlösningen och stimulering med H202 var identiska med de som beskrivits för lapp-klämma-experimenten.

Dataanalys och statistik

Data uttrycks som medelvärdet ± sem. Om ingen annan statet utfördes, genomfördes jämförelsen av två grupper med användning av en oparad Student's t-test. Kalciumavbildningsexperiment utvärderades statistiskt med användning av en enkelriktad ANOVA och Bonferroni-korrigering applicerades när flera jämförelser utfördes med samma kontrolldata. Skillnader ansågs vara signifikanta vid ** P <0, 01 och *** P <0, 001.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.