Foxo transkriptionsfaktorberoende p15ink4b och p19ink4d uttryck | onkogen

Foxo transkriptionsfaktorberoende p15ink4b och p19ink4d uttryck | onkogen

Anonim

Abstrakt

FOXO (Forkhead box O) transkriptionsfaktorer är involverade i cellcykelstopp eller induktion av apoptos genom transkription av cellcykelinhibitor p27 KIP1 respektive apoptosrelaterade gener. Akt / proteinkinas B främjar cellproliferation och undertrycker delvis apoptos genom fosforylering av FOXO. Fosforylerade FOXO: er kunde inte uppvisa transkriptionell aktivitet på grund av deras kärnkraftsexport. Här visar vi att p15 INK4b och p19 INK4d transkription är associerad med FOXO-medierad G1-cellcykelstopp. Hämning av Akt-signalering av PI3K-hämmare, en PDK1-hämmare eller dominerande-negativ Akt-transfektion ökade uttrycket av p15 INK4b och p19 INK4d men inte p16 INK4a och p18 INK4c . Ektopiskt uttryck av vildtyp eller aktiv FOXO men inte inaktiv form ökade också p15 INK4b och p19 INK4d nivåer. FOXO: er bundna till promotorregioner och inducerad transkription av dessa gener. Ingen ökning i den G1-röda cellpopulationen, medierad av PI3K-hämmare LY294002, observerades i INK4b - / - eller INK4d - / - murina embryonala fibroblaster. Sammanfattningsvis är FOXO: er involverade i G 1- arrestering orsakad av Akt-inaktivering via p15 INK4b och p19 INK4d- transkription.

Introduktion

Akt (även känd som proteinkinas B, PKB) signalväg styr många cellfunktioner, såsom cellöverlevnad, cellcykelprogression, cellproliferation, hämning av apoptos, proteinsyntes och glukosmetabolism (Matsushima-Nishiu et al., 2001; Tsuruo et al., 2003; Katayama et al., 2005). Ett stort antal cancerformer är kända för att avvikande aktivera denna väg, vilket resulterar i överlevnad och spridning av cancerceller. Aktivering av denna väg beror normalt på tillväxtfaktorstimulering. Tillväxtfaktorer aktiverar fosfatidylinositid-3-OH-kinas (PI3K) och leder sedan till rekrytering av 3-fosfoinositidberoende proteinkinas 1 (PDK1) och Akt på plasmamembranet (Vanhaesebroeck och Alessi, 2000; Tsuruo et al., 2003). PDK1 och andra kinaser omvandlar Akt från en inaktiv form till en aktiv form genom fosforylering.

FOXO (benämnd efter Forkhead box O) transkriptionsfaktorer, såsom FOXO1a, FOXO3a och FOXO4 (även känd som FKHR, FKHRL1 respektive AFX), identifierades vid kromosomala brytpunkter i humana tumörer (Woods och Rena, 2002). FOXO: er är direkta mål för Akt-fosforylering och regleras negativt av Akt (Brunet et al., 1999; Woods och Rena, 2002). Akt-beroende fosforylering av FOXO resulterar i deras cytoplasmiska lokalisering, möjligen genom associering med 14-3-3 proteiner, och oförmåga att uppvisa deras gentranskriptionsaktivitet (Brunet et al., 1999; Woods och Rena, 2002). FOXO: er rapporteras vara involverade i apoptosinduktion eller cellcykelstopp genom transkription av de relaterade generna (Medema et al., 2000; Rokudai et al., 2002; Stahl et al., 2002; Suhara et al., 2002).

Eukaryot cellcykelprogression regleras strikt och främjas av aktiviteten hos fasspecifika kinaskomplex sammansatta av cyklin och cyklinberoende kinas (CDK). Cyclin D – CDK4 / 6-komplex främjar mitten av G 1- fasen och sedan främjar cyklin E – CDK2-komplex sen G1-fas. CDK-hämmare (CKI) består av INK4- och CIP / KIP-familjer och inducerar cellcykelstopp genom att blockera aktiviteten hos cyklin-CDK-komplex (Sherr och Roberts, 1995; LaBaer et al., 1997). INK4-familjen (p16 INK4a , p15 INK4b , p18 INK4c och p19 INK4d ) binder specifikt till och hämmar cyklin D – CDK4 / 6-komplex, medan CIP / KIP-familjen (p21 CIP1 , p27 KIP1 och p57 KIP2 ) binder till och hämmar cyklin E – CDK2-komplex samt andra cyklin – CDK-komplex som fungerar under hela cellcykeln. I lugna celler förekommer CKI: er i överskott till cyklin-CDK-komplex, så att cellerna hålls i ett icke-spridande tillstånd. CKI är därför kritiska förmedlare av antiproliferativa signaler, cellcykelstopp, DNA-reparation, terminal differentiering och senescens.

Tumorsuppressorgenprodukten fosfatas och tensinhomolog deleterad på kromosom 10 (PTEN) är ett lipidfosfatas. PTEN motverkar PI3K-funktionen och förhindrar PDK1 och Akt från att rekrytera till plasmamembranet, vilket resulterar i inaktivering av Akt-signalvägen. Adenoviral transduktion av PTEN till PTEN-defekta HEC-151-celler rapporterades främja p15 INK4b- mRNA-uttryck i DNA-mikroarray och omvänd transkription (RT) –PCR-analyser (Matsushima-Nishiu et al., 2001). Det är emellertid okänt om p15 INK4b- protein faktiskt är involverat i G1-gripandet och hur Akt-signalvägen reglerar p15 INK4b- uttryck. I denna studie visar vi att FOXO-transkriptionsfaktorer transkription inte bara p15 INK4b utan också p19 INK4d gener. Vidare misslyckades PI3K-hämmaren LY294002 att orsaka G1- arrest i p15 INK4b - eller p19 INK4- noll mus-härledda embryonala fibroblaster ( INK4b - / - eller INK4d - / - murina embryonala fibroblaster (MEF)). Följaktligen är FOXO-medierad p15 INK4b och p19 INK4d- transkription involverad i G1-cellcykelstopp orsakad av Akt-hämning.

Resultat

Akt-hämning orsakar G1-arrestering genom uppreglering av p15 INK4b och p19 INK4d- uttryck

För att förtydliga regleringen av INK4-familjeproteinuttryck genom Akt-signalering undersökte vi först förändringen av INK4-familjeproteinuttryck före och efter behandling av 293T-celler med PI3K-hämmaren Wortmannin eller PDK1-hämmaren Celecoxib under 24 timmar. I överensstämmelse med tidigare rapporter (Sherr och Roberts, 1995; Medema et al., 2000), hämning av Akt-signalering av uppreglerat p27 KIP1- uttryck (figur 1a). Vidare observerade vi en drastisk ökning av p15 INK4b och p19 INK4d- protein, medan hämning av Akt-signalering inte visade någon effekt på p16 INK4a och p18 INK4c- proteinnivåer (figur 1a). För att bekräfta dessa resultat behandlade vi 293T-, HepG2- och Raji-celler med en annan PI3K-hämmare LY294002 under 24 timmar. Western blot- och RT – PCR-analyser indikerade tydligt att PI3K-hämning av LY294002 orsakade p15 INK4b och p19 INK4d- protein och mRNA-uttryck i varje cellinje (figurerna 1b och c). Expressionsnivåerna p16 INK4a och p18 INK4c påverkades inte av LY294002-behandlingen.

Image

Hämning av Akt-signalering resulterar i G1-arrestering med p15 INK4b och p19 INK4d- uttryck. ( a ) 293T-celler behandlades med enbart medium (forts.), 100 n M Wortmannin (Wort.) eller 50 μM Celecoxib (Celeco.). Efter en 24-timmarsbehandling isolerades nukleära lysat och underkastades Western blot-analys med de indikerade antikropparna. ( b ) 293T-, HepG2- och Raji-celler behandlades med (+) eller utan (-) 50 mikrometer LY294002 under 24 timmar och analyserades sedan med Western blot såsom beskrivits i ( a ). Stjärnan indikerar bakgrundsband. ( c ) 293T-, HepG2- och Raji-celler behandlades med (+) eller utan (-) 50 μM LY294002 under 6 timmar och analyserades sedan med RT – PCR. ( d ) 293T-celler behandlades med (+) eller utan (-) 50 uM LY294002 under 24 timmar, och därefter immunoprecipiterades CDK4- eller CDK6-protein från de nukleära lysaten. CDK4- och CDK6-aktiviteter analyserades genom in vitro -kinasanalys med användning av rekombinant C-terminal Rb som substrat. ( e ) 293T, HepG2 och Raji-celler behandlades med (LY294002) eller utan (kontroll) 50 μM LY294002 under 24 timmar. Cellulärt DNA-innehåll bestämdes med flödescytometri. Procentandelen av G1-fasen är medelvärdet av tre oberoende experiment (inlägg). CDK, cyklinberoende kinas; RT, omvänd transkription.

Bild i full storlek

Eftersom INK4-familjeproteiner specifikt bundna till och inhiberade cyklin D – CDK4 / 6-komplex kan hämning av Akt-signalvägen orsaka cellcykelstopp. Vi bekräftade CDK4- och CDK6-kinasaktiviteter före och efter behandling av 293T-celler med LY294002. In vitro -kinasanalys avslöjade att LY294002 nedreglerade kinasaktiviteterna för både CDK4 och CDK6 eftersom CDK4 / 6-medierad fosforylering av retinoblastoma (Rb) -protein nedreglerades genom LY294002-behandling jämfört med icke-behandling (figur 1d). För att undersöka effekterna av LY294002 på cellcykelprogression utförde vi flödescytometri. När 293T-, HepG2- och Raji-celler behandlades med LY294002 under 24 timmar, observerades en ökning av den G--röstade cellpopulationen i varje cellinje (figur 1e). Dessa resultat tyder på att undertryckning av Akt-signalvägen med PI3K- och PDK1-hämmare kan orsaka G1-arrestering genom att reglera p15 INK4b och p19 INK4d- uttryck.

FOXO förbättrar transkriptionen p15 INK4b och p19 INK4d

Nästa demonstrerade vi uppregleringen av p15 INK4b och p19 INK4d genom att specifikt hämma Akt-signalvägen. Efter transfektering av vildtyp (WT) - eller dominerande-negativ (AAA) - akt cDNA till 293T- eller HepG2-celler, undersökte vi expressionsnivåerna för INK4-familjen mRNA och proteiner med hjälp av RT – PCR och Western blot-analys. MRNA- nivåerna för generna p15 INK4b och p19 INK4d ökades i AAA- akt- transfektanter jämfört med de i tomma vektortransfektanter (Mock) (figur 2a). Omvänt nedreglerades dessa mRNA-nivåer i WT- akt- transfekterade celler. Ingen förändring i p16 INK4a och p18 INK4c mRNA-nivåer observerades i varken transfektant (figur 2a). Parallellt med dessa resultat hittade vi en ökning i p15 INK4b och p19 INK4d- proteinuttryck i AAA- akt- transfektanter och en minskning av dessa proteinuttryck i WT- akt- transfektanter (figur 2b).

Image

Involvering av Akt och FOXOs i uttrycket p15 INK4b och p19 INK4d . ( a och b ) 293T- och HepG2-celler transfekterades med en pFLAG-CMV-2-vektor som kodar ingen (Mock) eller WT- eller AAA-Akt. Efter transfektion i 24 timmar utfördes RT-PCR ( a ) eller western blot ( b ) analyser som beskrivits i figur 1. Stjärnorna indikerar bakgrundsband. ( c och d ) 293T-celler transfekterades med en pcDNA3-vektor som kodar ingen (Mock) eller WT-, AAA- eller HR-FOXO1a / 3a. Efter transfektion i 24 timmar utfördes RT-PCR ( c ) eller western blot ( d ) analyser som beskrivits ovan. Stjärnorna indikerar bakgrundsband. CMV, cytomegalovirus; FOXO, Forkhead box O; RT, omvänd transkription; WT, vild typ.

Bild i full storlek

FOXO är transkriptionsfaktorer nedströms i signaleringsvägen Akt och inaktiveras av den i en fosforyleringsberoende cytoplasmisk translokation (Brunet et al., 1999; Woods och Rena, 2002). För att bekräfta detta fenomen utförde vi Western blot-analys med hjälp av cytoplasmatiska och nukleära lysat från tomma vektor (Mock) eller WT- eller AAA- akt transfektanter. Kärnkraftsuttrycket för både FOXO1a och FOXO3a minskade i WT- akt- transfektanter jämfört med det i håna transfektanter, medan det nukleära uttrycket för båda proteinerna ökade i AAA- akt- transfektanter (kompletterande figur S1). För att utvärdera sambandet mellan FOXOs och p15 INK4b eller p19 INK4d- genuttryck övervakade vi därefter p15 INK4b och p19 INK4d mRNA och proteinuttryck i WT eller muterade FOXO1a- eller FOXO3a-uttryckande celler. I experimenten använde vi den aktiva formen (AAA, mutanten saknar de tre Akt-fosforyleringsplatserna för kärnexport) och den inaktiva formen (HR, mutanten saknar transkriptionell förmåga på grund av dess oförmåga att binda till DNA) av FOXO. Överuttryck av WT- eller AAA-FOXOs i 293T-celler inducerade p15 INK4b och p19 INK4d mRNA och proteinuttryck (figur 2c och d). Eftersom varken HR-FOXO1a eller HR-FOXO3a hade någon effekt på p15 INK4b och p19 INK4d mRNA och proteinuttryck (figurerna 2c och d), verkade transkriptionella aktiviteter av FOXO1a och FOXO3a vara väsentliga för uttrycken. Uttrycksnivåerna för p16 INK4a och p18 INK4c påverkades inte av FOXO-uttryck.

FOXO: er binder till p15 INK4b och p19 INK4d- promotorregioner och uppreglerar deras transkription

FOXO är kända för att reglera transkription av FasL och insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 1 ( IGF-BP1 ) (Cichy et al., 1998; Brunet et al., 1999; Suhara et al., 2002). Från dessa fynd rapporteras FOXO-konsensusbindande platser såsom visas i figur 3a (Brunet et al., 1999; Rokudai et al., 2002). Vi sökte på Forkhead-responsiva element (FHRE) i promotorregionerna för generna p15 INK4b och p19 INK4d . I p15 INK4b- promotorregionen fann vi tre överlappande domäner mycket homologa med FOXO-konsensusbindande platser (figurerna 3a och b). Vi hittade också en domän som hade hög homologi till ett FOXO-konsensusbindande ställe i p19 INK4d- promotorregionen (figurerna 3a och b).

Image

Identifiering av FHRE: er i p15 INK4b eller p19 INK4d -genpromotor. ( a ) Jämförelse av de rapporterade Xenopus- och mänskliga konsensus-FHRE: erna och FHRE: erna som finns i FasL , IGF-BP1 ( IRS ), p15 INK4b eller p19 INK4d- promotor. De understrukna nukleotiderna matchade den förutsagda FOXO-konsensussekvensen. ( b ) Genomisk struktur för p15 INK4b- eller p19 INK4d- genen. Svarta rutor visar platsernas och relativa storleken på exonerna. Platserna för de potentiella FOXO-bindande sekvenserna indikeras på uppströmsdelen av exon 1 (El). ( c och d ) Kärnekstrakt från 293T-celler som hade transfekterats med en pcDNA3-vektor som kodar ingen (-) eller WT- eller HR-FOXO1a / 3a inkuberades med biotinmärkta dubbelsträngade WT- eller Mut- p15 INK4b- oligonukleotider ( vänster paneler) eller WT- eller Mutp19 INK4d oligonukleotider (höger paneler). I vissa experiment utfördes reaktioner i närvaro (+) eller frånvaro (-) av ett 100-faldigt överskott av omärkta WT- p15 INK4b (vänsterpaneler) eller WT- p19 INK4d (högra paneler) oligonukleotider. DNA-proteinkomplex separerades genom polyakrylamidgelelektrofores och visualiserades med pepparrotsperoxidas-konjugerat streptavidin. FHRE, gaffel-svarande element; FOXO, Forkhead box O; IGF-BP1, insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 1; WT, vild typ.

Bild i full storlek

För att bevisa att FOXO: er bundna till de förutsagda platserna utförde vi elektronisk mobilitetsskiftanalys (EMSA) med dubbelsträngade oligonukleotider innehållande FHRE: er i p15 INK4b (WT- p15 ) eller p19 INK4d- genen (WT- p19 ). Som förväntat kunde vi upptäcka rörlighetsförskjutna band genom att inkubera varje oligonukleotid med kärnkraftsekstrakt från WT-FOXO1a- eller WT-FOXO3a-överuttryckande 293T-celler (figur 3c och d). FOXO1a-bindningen till WT- p15- eller WT- p19- oligonukleotiden var specifik eftersom de rörlighetsförskjutna banden inte detekterades i närvaro av 100-faldigt överskott av varje konkurrent (omärkt DNA), inkubering med nukleära extrakt från HR- FOXO1a- transfektanter eller i inkubation med den muterade p15- eller p19- oligonukleotiden (Mut- p15 eller Mut- p19 , i vilken tre nukleotider i de förutsagda FHRE: erna var muterade; figur 3c). Liknande resultat antydde att FOXO3a-bindning till WT- p15 eller WT- p19- oligonukleotid var specifik (figur 3d). För att ytterligare undersöka FOXO1a-bindningen till konserverade FHRE i p15 INK4b och p19 INK4d- promotorregioner i 293T-celler utförde vi kromatinimmunutfällningsanalys i FLAG-märkta WT-, AAA- eller HR- FOXO1a- transfektanter. WT- och AAA-FOXO1a bundna till FHRE: er av p15 INK4b och p19 INK4d- promotorregioner, medan HR-FOXO1a inte kunde binda till elementen (Kompletterande figur S2). Dessa resultat indikerar att nukleära FOXOs som uppvisar DNA-bindande förmåga specifikt kan binda till FHRE: er för p15 INK4b och p19 INK4d- promotorer in vitro och in vivo .

För att bekräfta involvering av FOXOs i p15 INK4b och p19 INK4d- transkription konstruerade vi pGL3-promotorvektorer innehållande ett 1560-bp DNA-fragment från uppströmsdelen av exon 1 av p15 INK4b- genen ( p15 ) och ett 975-bp DNA-fragment från uppströms del av exon 1 av p19 INK4d- gener ( p19 ), som båda innehöll den förmodade FHRE: n. PGL3-reporterplasmiderna transfekterades till 293T-celler tillsammans med en pcDNA3-vektor som kodar ingenting (Mock) eller WT-, AAA- eller HR-FOXO1a. Såsom visas i figur 4a ökade uttrycket WT- och AAA-FOXO1a signifikant luciferasaktiviteterna för p15 och p19 . Emellertid påverkade HR-FOXO1a-uttrycket inte reporterns aktiviteter. För att ytterligare bekräfta rollen som förmodade FHRE: er i p15 INK4b- och p19 INK4d- genuttryck, genererade vi pGL3-reportervektorer som innehåller fyra-tandemkopior av det förmodade FOXO-svarande elementet av p15 INK4b- genen (WT- p15 ) eller fem-tandemkopior av element av p19 INK4d- genen (WT- p19 ). Vi genererade också pGL3-reportervektorer som innehåller muterade FHRE: er (Mut- p15 och Mut- p19 ). Uttryck av WT- eller AAA-FOXO1a, men inte HR-FOXO1a, förstärkte signifikant reporteraktiviteterna för WT- p15 och WT- p19 (figur 4b). Vi erhöll liknande resultat i de tidigare rapporterade FHRE: erna av IGF-BP1- genen ( IRS-1 ) (figur 4b). Reporteraktiviteterna observerades emellertid inte i cellerna som transfekterats med Mut- p15 och Mut- p19 (figur 4b). Genom att transfektera FOXO3a erhöll vi liknande resultat (figur 4c). Från dessa resultat drar vi slutsatsen att FOXO: er är involverade i p15 INK4b och p19 INK4d -gentranskription via bindning till de identifierade FHRE: erna.

Image

Reglering av p15 INK4b och p19 INK4d -gentranskription genom FOXO: er. ( a ) 293T-celler transfekterades med en pGL3-vektor innehållande ingen (pGL3), ett 1560-bp DNA-fragment från p15 INK4b- promotorregionen ( p15 ) eller ett 975-bp DNA-fragment från p19 INK4d- promotorregionen ( p19 ), tillsammans med en pcDNA3-vektor innehållande ingen (Mock) eller WT-, AAA- eller HR-FOXO1a. En phRL-TK-plasmid transfekterades också som en transfektionseffektivitetskontroll. Efter 24 timmars transfektion mättes luciferasaktiviteter med analyssystemet med två luciferasrapporter. ( b och c ) 293T-celler transfekterades med en pGL3-vektor innehållande tandemkopior av oligonukleotiden som hade den potentiella FOXO-bindande sekvensen i p15 INK4b- genen (WT- p15 ) eller dess mutanta sekvens (Mut- p15 ), sekvensen i p19 INK4d- gen (WT- p19 ) eller dess mutantsekvens (Mut- p19 ), eller sekvensen i IGF-BP1- genen ( IRS-1 ). 293T-celler transfekterades också med en pcDNA3-vektor som kodar ingen (Mock) eller WT-, AAA- eller HR-FOXO1a / 3a. En phRL-TK-plasmid samtransfekterades också som en transfektionseffektivitetskontroll. Efter transfektion i 24 timmar mättes luciferasaktiviteter med analyssystemet med dubbla luciferasrapporter. FOXO, Forkhead box O; WT, vild typ.

Bild i full storlek

Vi undersökte nästa rollen för Akt i p15 INK4b och p19 INK4d- genuttryck. 293T-celler transfekterades med FOXOs tillsammans med en pFLAG-CMV-2-vektor innehållande ingenting (Mock) eller WT- eller AAA-Akt. Överuttryck av WT-Akt undertryckte något de WT-FOXO1a- eller WT-FOXO3a-inducerade reporteraktiviteterna av WT- p15 och WT- p19 (figurerna 5a och b). Varken WT- eller AAA-Akt påverkade den AAA-FOXO-inducerade aktiveringen av luciferas (figurerna 5a och d). Specifik hämning av Akt-signalvägen genom AAA-Akt-uttryck förbättrade signifikant luciferasaktiviteten för WT-p15 och WT-p19 i både WT-FOXO1a och WT-FOXO3a-transfektanter (figurerna 5a och b). Dessa resultat antyder att Akt konstitutivt undertrycker FOXO-inducerad p15 INK4b och p19 INK4d- transkription i 293T-celler.

Image

Akt reglerar negativt p15 INK4b och p19 INK4d gentranskription genom fosforylering och inaktivering av FOXO. ( a och b ) 293T-celler samtransfekterades med en pGL3-vektor innehållande tandemkopior av oligonukleotiden som innehöll den potentiella FOXO-bindande sekvensen från p15 INK4b (WT- p15 ) eller p19 INK4d- genen (WT- p19 ) tillsammans med en phRL-TK-plasmid som en transfektionseffektivitetskontroll. 293T-celler transfekterades också med en pcDNA3-vektor som kodar ingen (Mock) eller WT-, AAA- eller HR-FOXO1a / 3a tillsammans med en pFLAG-CMV-2-vektor som kodar ingen (Mock) eller WT- eller AAA-Akt. Efter en 24-timmars transfektion mättes luciferasaktiviteter med analyssystemet med två luciferasrapporter. CMV, cytomegalovirus; FOXO, Forkhead box O; WT, vild typ.

Bild i full storlek

p15 INK4b eller p19 INK4d null MEF: er visar reducerad lyhördhet för LY294002-medierad G 1- arrest

Vi undersökte först p15 INK4b och p19 INK4d expressionsnivåer i odödliga WT MEF, p15 INK4b knockout MEFs ( INK4b - / - MEFs) eller p19 INK4d knockout MEFs ( INK4d - / - MEFs) behandlade med eller utan LY294002 under 24 timmar. Som väntat uttryckte INK4b - / - MEF inte p15 INK4b , medan INK4d - / - MEF saknade p19 INK4d uttryck (figur 6a). LY294002-behandling undertryckte PI3K-aktivitet (kompletterande figur S3) och inducerade p27 KIP1- uttryck (figur 6a) i varje cellinje. Undertryckning av Akt-signalväg av LY294002 uppreglerat p15 INK4b- uttryck i WT och INK4d - / - MEF, medan det uppreglerade p19 INK4d- uttryck i WT och INK4b - / - MEF: er (figur 6a). Under förutsättningen uppskattade vi CDK4- och CDK6-kinasaktiviteter. I WT-MEF: er undertryckte LY294002 både CDK4- och CDK6-kinasaktiviteter (figur 6b). Däremot hämmade LY294002 något CDK4-aktivitet men inte CDK6-aktivitet i INK4b - / - och INK4d - / - MEF: er (figur 6b). För att bestämma rollen för p15 INK4b och p19 INK4d i G-arresteringen orsakad av Akt-inaktivering analyserade vi därefter cellcykeln med hjälp av flödescytometri efter behandling av de odödliga WT-MEF: erna, INK4b - / - MEF eller INK4d - / - MEFs med LY294002 i 24 timmar. Behandling av WT-MEF: er med LY294002 ökade cellantalet kraftigt i den G--röstade cellpopulationen, jämfört med obehandlade celler (figur 6c och d). Däremot var cellcykelmönstret nästan detsamma i INK4b - / - och INK4d - / - MEF före och efter behandling med LY294002 (figur 6c). LY294002-medierad ackumulering av Gl-röstrade celler kunde knappast observeras i INK4b - / - och INK4d - / - MEF: er (figur 6d). Dessa resultat indikerar att LY294002 inducerar G1-arrestering genom att förbättra p15 INK4b- och / eller p19 INK4d- genuttryck och att FOXO-aktivering genom Akt-inaktivering är associerad med dessa genuttryck.

Image

Resistens mot LY294002-inducerad G 1- grip i INK4b - / - och INK4d - / - MEF. ( a ) Immortaliserad vildtyp, INK4b - / - eller INK4d - / - MEF behandlades med (+) eller utan (-) 50 μM LY294002 under 24 timmar. Kärnlysat från cellerna isolerades och underkastades Western blot-analys med de indikerade antikropparna. ( b ) Vildtyp , INK4b - / - eller INK4d - / - MEF behandlades med (+) eller utan (-) 50 μM LY294002 under 24 timmar, och därefter immunoprecipiterades CDK4- eller CDK6-protein från de nukleära lysatema. CDK4- och CDK6-aktiviteter analyserades genom in vitro -kinasanalys med användning av rekombinant C-terminal Rb som substrat. ( c ) Vildtyp , INK4b - / - eller INK4d - / - MEF: er behandlades med (nedre paneler) eller utan (övre paneler) 50 μ M LY294002. Efter behandling i 24 timmar bestämdes cellulärt DNA-innehåll med flödescytometri. Procentandelen av G1-fasceller som beskrivs i varje panel är genomsnittet av tre oberoende experiment (insättning). ( d ) Procentandelen av G1, S och G2 / M-cellcykelpopulationen beräknades från tre oberoende experiment visade i ( c ). Varje vertikal stapel representerar experimentens sd. MEF: er, musembryonala fibroblaster.

Bild i full storlek

Diskussion

Mutationen av PTEN- genen observeras med hög frekvens, i nästan samma grad som tumörsuppressor p53 -genmutation i cancerceller (Bonneau och Longy, 2000), leder till avvikande aktivering av Akt-signalvägen och ger hög cellöverlevnad och förökande aktiviteter. FOXO: er är direkta mål för Akt och regleras negativt av det på ett fosforyleringsberoende sätt (Brunet et al., 1999; Woods och Rena, 2002). FOXO undertrycker cellproliferation med transkription av de apoptosrelaterade och / eller cellcykelinhibitorgenerna. p27 KIP1 är ett mål för transkription av FOXOs (Medema et al., 2000; Stahl et al., 2002), och det inducerar cellcykelstopp i vilken fas som helst. Dessutom hämmas funktionerna hos p21 CIP1 och p27 KIP1 genom Akt-beroende fosforylering och translokation från kärnor till cytoplasma (Collado et al., 2000; Rodier et al., 2001; Zhou et al., 2001; Fujita et al., 2002). Således kan aktivering av Akt-signalvägen undvika cellcykelstopp av cancerceller. Omvänt kan hämmare av vägen inducera aktiveringen av dessa genprodukter och eliminera cellcykelprogression. I själva verket har PI3K-hämmaren LY294002 observerats inducera både G1 och G2 / M-arresteringar (figur 1e; Collado et al., 2000). Enligt tidigare studier anses LY294002-inducerad G-arrestering bero på aktivering av p21 CIP1 och p27 KIP1 , medan G2 / M-arrestering av hämmaren kan uppstå som ett resultat av WEE1Hu-aktivering utöver p21 CIP1 och p27 KIP1 (Collado et al., 2000; Rodier et al., 2001; Zhou et al., 2001; Fujita et al., 2002; Katayama et al., 2005).

Matsushima-Nishiu et al. (2001) har visat att adenoviral transduktion av PTEN- genprodukten inducerar p15 INK4b- mRNA-uttryck som samma som p27 KIP1- mRNA-uttryck, sett på DNA-mikroarray och RT – PCR-analyser. Emellertid har de molekylära mekanismerna för PTEN-inducerad p15 INK4b inte klargjorts. I denna studie försökte vi sedan undersöka regleringsmekanismerna för uttrycket p15 INK4b genom Akt-signalvägen. Behandling med hämmare mot Akt-signalvägen inducerade p15 INK4b- genprodukten och samtidigt uppreglerade p19 INK4d- genprodukten (figur 1). Den dominerande negativa formen av Akt eller WT- och aktiv FOXO inducerade också p15 INK4b och p19 INK4d uttryck (figur 2). Dessa data indikerar att G1-arrestering inducerad genom att hämma Akt-signalvägen orsakas av p15 INK4b och p19 INK4d- uttryck i samarbete med p21 CIP1 och p27 KIP1- uttryck.

Ytterligare undersökning avslöjade att FOXO: er bundna till promotorregionerna för p15 INK4b- och p19 INK4d- generna och signifikant uppreglerade deras transkription (figurerna 3, 4 och 5). FOXO1a aktiverade starkt p15 INK4b- transkription och p19 INK4d- transkription, medan FOXO3a visade högre p19 INK4d- transkriptionsaktivitet än p15 INK4b- transkriptionsaktivitet (figur 4). Dessa resultat indikerar att p19 INK4d- transkription medieras av både FOXO1a och FOXO3a, men p15 INK4b- transkription kan primärt regleras av FOXO1a. Vidare minskade WT-Akt något WT-FOXO-inducerad aktivering av luciferas, medan dominerande-negativ Akt klart förbättrade luciferasaktiviteten i WT-FOXO-transfekterade 293T-celler. Överuttryck av WT- eller AAA-Akt påverkade inte AAA-FOXO-inducerad aktivering av luciferas. Därför undertryckte Akt den FOXO-medierade p15 INK4b- och p19 INK4d -gentranskriptionen genom fosforylering. Även om LY294002 arresterade cellcykeln vid G-fasen i 293T-, HepG2-, Raji- och WT-MEF-celler (figur 1 och 6), kunde G1- arrestering inte observeras i INK4b - / - eller INK4d - / - MEF: er (figur 6) . Följaktligen är induktion av p15 INK4b och p19 INK4d- expression av FOXOs en kritisk händelse i LY294002-inducerad Gc-cellcykelstopp.

I den här studien använde vi fyra olika cellinjer, 293T, HepG2, Raji och MEF. Rb är ett substrat av CDK4 / 6/2 och en negativ regulator av cellcykeln. Vid G1 / S-övergång är CDK4 / 6/2-medierad fosforylering och inaktivering av Rb nödvändig för cellcykelprogression. I 293T-celler uppvisar Rb-dysfunktioner med adenoviralt protein och SV40T-antigen och 293T-celler resistens mot Rb-medierad G-arrestering. Egentligen LY294002 arresterade något cellcykel vid G1-fasen i 293T-celler (figur 1e). Däremot inducerade LY294002 drastiskt G1-arrest i HepG2, Raji och WT MEF-celler (figurerna 1e och 6), som innehåller normal Rb som en tumörsuppressor-genprodukt (Puisieux et al., 1993; Wells et al., 2003). Dessa fynd tyder på att LY294002-medierad G1-gripning induceras av Rb-beroende och oberoende vägar. Vid Rb-oberoende G1-arrestering kan en nyckelmolekyl vara Smad3. Smad3 har en nyckelfunktion i att förmedla transformerande tillväxtfaktor-p-signalväg som hämmar cellcykelprogression vid G-fasen. Smad3 uppreglerar p15 INK4b- uttryck och nedreglerar c-Myc-uttryck, vilket resulterar i cellcykelstopp vid G1-fasen (Matsuura et al., 2004). CDK4 / 2 fosforylerar och inaktiverar Smad3 och förhindrar G1-cellcykelstopp (Matsuura et al., 2004). LY294002 kan också aktivera Smad3 och hämma cellcykelprogression vid G1-fasen i samarbete med FOXO-p15 INK4b / p19 INK4d- CDK-väg, särskilt i 293T-celler.

Metylering av CpG-ön, deletion och mutation i kromosom (Ch.) 9p21, som kodar p15 INK4b , p16 INK4a och p14 ARF- gener, observeras ofta i många cancerformer (Ruas och Peters, 1998). p14 ARF är en aktivator av p53 och inducerar indirekt p21 CIP1- uttryck (Stott et al., 1998). Defekt av kap. 9p21 orsakar därför avvikande cellcykelprogression i cancerceller. Däremot observeras knappast borttagningar eller omarrangemang av p18 INK4c ( kap . 1p32) och p19 INK4d (kap. 19p13) (Zariwala et al., 1996). Speciellt är mutation av p19 INK4d extremt sällsynt. Följaktligen är det användbart för cancergemoterapi att inducera p18 INK4c - och / eller p19 INK4d- beroende G1- arrest i både p15 INK4b - och p16 INK4a- defekta cancerceller.

Mdm2 är ett ubiquitin E3-ligas för p53. Akt fosforylerar och translokerar också Mdm2 från cytoplasma till kärnan, vilket resulterar i att främja nedbrytning av p53 och cellcykelstopp (Mayo och Donner, 2001). I cellerna som innehåller normal p53, reglerar undertryckningen av Akt-signalvägen upp p53-uttrycket och upphäver cellcykelprogression i denna mekanism. Däremot är det svårt att inducera cellcykelstopp via p53-p21 CIP1- väg i p53-defekta cancerceller. p53 av 293T-celler dysfunktioner också av SV40T-antigen, men LY294002 kan avskaffa cellcykelprogression med uppreglerande p15 INK4b , p19 INK4d och p27 KIP1 och med hämmande CDK4 / 6-kinasaktiviteter. Därför kan hämmarna mot Akt-signalväg vara användbara för många cancerceller oavsett p53- mutation.

Sammanfattningsvis visar vi att FOXO: er stoppar cellcykeln vid G-fasen genom direkt induktion av p15 INK4b och p19 INK4d- uttryck genom transkriptionella mekanismer. Omvänt undertrycker Akt p15 INK4b och p19 INK4d- uttryck genom Akt-beroende fosforylering och inaktivering av FOXO: er.

Material och metoder

Reagenser och cellkulturförhållanden

Wortmannin, LY294002 och Celecoxib köptes från Merck Calbiochem (San Diego, CA, USA), Sigma (St Louis, MO, USA) respektive LKT Laboratories (St Paul, MN, USA). Mänskliga embryonala njuren 293T-celler och humana hepatoblastom-HepG2-celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum. Humana Burkitt-lymfom Raji-celler odlades i RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum. INK4b - / - och INK4d - / - MEF tillhandahölls vänligt av Dr Mariano Barbacid (Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, Spanien) och Dr. Martine F Roussel och Charles J Sherr (St Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA) respektive och odlades som beskrivits tidigare (Latres et al., 2000; Zindy et al., 2000). Dessa MEF: er blev odödliga genom att odla dem i 2-3 månader i vårt laboratorium och användes sedan för några analyser.

plasmider

Humant WT och dominerande-negativt (AAA, K179A / T308A / S473A) akt1 cDNA i en pFLAG-CMV-2-vektor (Sigma) etablerades i vårt laboratorium (Fujita et al., 2002). Human FLAG-märkt WT- FOXO1a , AAA (T24A / S256A / S319A) - FOXO1a och HR (H215R) - FOXO1a i en pcDNA3-vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA) tillhandahöll vänligen av Drs Eric D Tang (University of Michigan Medical School, Ann Arbor, MI, USA) och Frederic G Barr (University of Pennsylvania, School of Medicine, Philadelphia, PA, USA) (Tang et al., 1999). Human WT- FOXO3a cDNA i en pcDNA3-vektor genererades av PCR med en IMAGE-klon (ID: 4137370, Invitrogen) som en mall. AAA (T32A / S253A / S315A) - FOXO3a och HR (H212R) - FOXO3a cDNA uppnåddes med användning av ett QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Flödescytometrisk analys

Cellerna behandlades med 50 μM LY294002 under 24 timmar. Flödescytometriska analyser utfördes såsom beskrivits tidigare (Katayama et al., 2005).

Övergående transfektion och Western blot-analys

Celler transfekterades med lämpliga plasmider med användning av Superfect-transfektionsreagens (Qiagen, Valencia, CA, USA). Western blot-analys utfördes såsom beskrivits tidigare (Katayama et al., 2005). Kärnfraktion extraherades med användning av ett NE-PER-extraktionssats (Pierce, Rockford, IL, USA). Vi använde antikroppar mot p16 INK4a (F-12), p15 INK4b (K-18) eller p18 INK4c (M-20) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); en antikropp mot human p19 INK4d (DCS-100) (Lab Vision, Fremont, CA, USA); en antikropp mot mus p19 INK4d (ZP002) (Invitrogen); en antikropp mot p-aktin (AC-15) (Sigma); och antikroppar mot p21 CIP1 eller p27 KIP1 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Semikantitativ RT – PCR-analys

Vi extraherade totalt RNA från celler med Trizol-reagens (Invitrogen). RT – PCR-experiment utfördes enligt beskrivningen i kompletterande material och metoder.

CDK-analys in vitro

Celler behandlades med eller utan 50 μM LY294002 under 24 timmar, och därefter immunofälldes endogena CDK4 och CDK6 från celllysat med användning av antikroppar mot CDK4 (C-22) och CDK6 (C-21) (Santa Cruz Biotechnology). CDK-analys in vitro utfördes såsom beskrivits tidigare (Ogasawara et al., 2004). Rekombinant C-terminal Rb (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) och immunutfällt CDK4 och CDK6 detekterades genom Western blot-analys. Vi använde antikroppar mot Rb och fosfo-Rb (Ser807 / 811; Cell Signaling Technology); och antikroppar mot CDK4 (DCS-35) och CDK6 (B-10; Santa Cruz Biotechnology).

Kloning av pGL3-promotorvektorer

1560-bp DNA-fragmentet av p15 INK4b- promotorregionen, −1557 till +3 och 975-bp DNA-fragmentet av p19 INK4d- promotorregionen, −975 till −1, innehållande en potentiell FOXO-bindande sekvens amplifierades genom PCR och klonades in i pGL3-promotorvektorn (Promega, Madison, WI, USA) såsom beskrivs i kompletterande material och metoder.

Kloning av pGL3-reportervektorer innehållande tandemkopior av det förmodade FOXO-responsiva elementet

Dubbelsträngade oligonukleotider innehållande en potentiell FOXO-bindande sekvens genererades genom PCR och ligerades in i pGL3-promotorvektorn såsom beskrivits i kompletterande material och metoder. PGL3-3xIRS-vektorn (IRS-1) rapporterades tidigare (Rokudai et al., 2002).

Analys av elektronisk mobilitetsskift

293T-celler transfekterades med WT- eller HR- FOXO cDNA, och de nukleära extraktionerna av cellerna användes i EMSA. De detaljerade experimentella förfarandena beskrivs i kompletterande material och metoder.

Kromatinimmunutfällningsanalys

293T-celler transfekterades med en pcDNA3-vektor som kodar ingen eller FLAG-märkt WT-, AAA- eller HR-FOXO1a. De detaljerade experimentella förfarandena beskrivs i kompletterande material och metoder.

Luciferasanalys

293T-celler samtransfekterades med en pGL3-promotorvektor som kodar ingen eller FOXO-konsensus p15 INK4b , p19 INK4d eller IRS-1-sekvens och en pcDNA3-vektor som kodar ingen eller FOXO tillsammans med eller utan aktl- cDNA. Kvantifiering av alla luciferasaktiviteter utfördes med ett dual-luciferas reporteranalyssystem (Promega). Aktiviteter normaliserades genom samtransfektion av kontrolltymidinkinas-driven Renilla luciferasplasmid phRL-TK (Promega).

PI3K-analys

Cellerna behandlades med 50 μM LY294002 under 24 timmar, och därefter mättes PI3K-aktivitet med användning av QTL-ljushastighetsklass I-fosfoinositid-3-kinas (PI3K-a, PI3K-p, PI3K-5 och PI3K-y) slutpunktsanalyssats ( QTL Biosystems, Santa Fe, NM, USA). De detaljerade experimentella förfarandena beskrivs i kompletterande material och metoder.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande material och metoder

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabeller

  2. 2.

    Kompletterande figurer

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc).