Flotillin-2 främjar metastas av nasofaryngealt karcinom genom att aktivera nf-κb och pi3k / akt3 signalvägar | vetenskapliga rapporter

Flotillin-2 främjar metastas av nasofaryngealt karcinom genom att aktivera nf-κb och pi3k / akt3 signalvägar | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Metastas
  • onkogenes

Abstrakt

Lipidflotteproteiner har bekräftats vara viktiga vid cellsignaltransduktion. Vissa rapporter har visat att det avvikande uttrycket av lipidflotteproteiner är associerat med maligna fenotyper i vissa cancerformer. Emellertid återstår emellertid rollen för lipidflotteproteinet flotillin-2 (Flot-2) i nasofaryngeal karcinom (NPC) att vara omfattande karakteriserad. Här detekterades överuttryck av Flot-2 i NPC-vävnader och cellinjer genom immunfärgning och Flot-2-expression visade sig vara positivt associerat med NPC-metastas. Dessutom försvagade inhibering av Flot-2-uttryck maligniteten hos den mycket metastatiska NPC-cellinjen 5-8F genom att begränsa dess tillväxt och spridning, rörlighet och migration och minska kapaciteten för 5-8F-celler att metastasera i nakna möss. Däremot ökade tvungen överuttryck av Flot-2 maligniteten hos 6-10B, en icke-metastatisk NPC-cellinje som svagt uttrycker Flot-2. I 5-8F-shFlot-2-celler, som har inhiberat Flot-2-expression, inaktiverades dessutom NF-KB och PI3K / Akt3-vägarna. Därefter minskade MMP: s uttryck och Foxo1-aktiviteten ökades. Dessutom observerades förbättrade NF-KB- och PI3K / Akt3-aktiviteter i Flot-2-överuttryckande 6-10B-celler. Således utövar Flot-2 en pro-neoplastisk roll i NPC och är involverad i tumörprogression och metastas. Dessutom utövar Flot-2 sin roll genom NF-κB och PI3K / Akt3 signalering.

Introduktion

Metastas är ett av de främsta hinderna för effektiv behandling av tumörer, och över 90% av dödsfallen hos patienter med solida tumörer är resultatet av metastas 1, 2 . Metastas är resultatet av en komplex händelse, inklusive transformation, angiogenes, rörlighet och invasion. Tumörceller måste manipulera funktionerna i många biologiska processer för att uppnå framgångsrik metastas. Av dessa processer spelar cellmembranmodifiering en viktig roll i att initiera cellmigrering. Lipidflotte är specialiserade heterogena mikrodomäner som finns i plasmamembranet och har visat sig ha ett inflytande i många fysiologiska och patologiska processer såsom cancermetastas 3, 4, 5 .

Flotilliner är nyckelkomponenter i lipidflotte och tillhör den stomatin / förbudin (PHB) / flotillin / HflK / C (SPFH) domäninnehållande proteinfamiljen. Det finns två flotillinmedlemmar i denna familj: flotillin-1 (Flot-1) och flotillin-2 (Flot-2) 5 . Dessa proteiner kan stabilisera varandra genom att bilda en hetero-oligomer 6 . Flotilliner kan spela viktiga roller i cancerutvecklingen som positiva reglerare. En hög expressionsnivå av Flot-1 eller Flot-2 kan förbättra tumörtillväxt och tumörcellmigration. Flot-1 och Flot-2 anses vara kandidatmarkörer för lymfkörtelmetastas och för att förutsäga dålig prognos och kan vara användbara terapeutiska mål för vissa typer av cancer 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 . Vidare visades reducerat Flot-2-uttryck resultera i en minskning av lungmetastaser av bröstcancer i en musbröstcancermodell 12 .

Nasofaryngealt karcinom (NPC) är en typ av malig huvud- och nacktumör. NPC är främst utbredd i sydöstra Asien och kinesiska regionerna i Kina 14 . Strålterapi kan användas som en behandling ensam eller i kombination med kemoterapi och kirurgi 15 . Avlägsen metastas är mycket vanligt och är den huvudsakliga dödsorsaken för NPC-patienter 15 . Vår tidigare studie avslöjade att NPC-tumörceller med hög Flot-2-uttryck har en hög metastatisk potential, vilket indikerar att Flot-2 kan vara involverad i NPC-metastas 16 . En ny studie avslöjade också sambandet mellan Flot-2-uttryck och lymfkörtelmetastas hos NPC-patienter 17 . Flot-2: s roller i NPC är dock i stort sett okända.

I denna studie undersökte vi Flot-2-uttryck i NPC-cellinjer och NPC-tumörvävnader och undersökte vidare rollerna för Flot-2 i utvecklingen av NPC och de underliggande mekanismerna.

Resultat

Flot-2-expression var positivt associerat med progressionen av NPC

Flot-2-färgning var huvudsakligen lokaliserad vid membranet och i cytoplasma av epitelceller. Flot-2-uttryck var i allmänhet heterogent i NPC-tumörvävnader, med två olika mönster: diffust uttryck i de flesta levande tumörceller (fig. 1A) och fokaluttryck vid den prolifererande periferin av tumör bon (fig. IB). Positivt Flot-2-uttryck detekterades i alla NPC-vävnader. Däremot var Flot-2-expression inte detekterbart (30/38) (fig. 1D) eller detekterades vid låga nivåer (8/38) i bascellerna i nasopharynx (NP) -vävnader (fig. 1C). Både den positiva expressionshastigheten och intensiteten för Flot-2-expression i metastatiska NPC-vävnader var också signifikant högre än de i icke-metastatiska NPC-vävnader (tabell 1). Dessa fynd antyder att överuttryck av Flot-2 är relaterat till förekomsten av NPC och främjar NPC-invasion och metastas.

A, Flot-2 visade ett diffust färgningsmönster med olika intensiteter i metastaserande (övre panelen) och icke-metastatiska (nedre panelen) NPC-vävnader. B, Flot-2 visade ett fokaliseringsmönster vid periferin av NPC-bon med inget eller svagt uttryck i de centrala områdena. C, NP-vävnader med svagt Flot-2-uttryck. D, NP-vävnader med negativt Flot-2-uttryck. De histologiska manifestationerna som visas i fig 1 är representativa fall.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Uttrycksmönstret för Flot-2 i NPC-cellinjer

RT-PCR och Western blotting avslöjade allestädes närvarande uttryck av Flot-2 i alla NPC-cellinjer inkluderade i denna studie. Flot-2-uttryck var signifikant högre i 5-8F-celler än i 6-10B-celler (fig. 2A). Både 5-8F- och 6-10B-celler isolerades från SUNE-1-celler. De har en liknande genetisk bakgrund men skiljer sig i deras metastatiska förmåga - 5-8F-celler är mycket metastatiska, medan 6-10B-celler är icke-metastatiska 18 . Uttrycket av Flot-2 i icke-metastatiska 6-10B-celler var också tydligt lägre än i andra NPC-celler med metastatisk potential (fig. 2A). Detta resultat kan innebära att Flot-2 är associerad med det metastatiska inslaget hos NPC-tumörer.

A, Flot-2-expressionsnivån i 5-8F, 6-10B och andra NPC-celler detekterades genom semi-kvantitativ RT-PCR och Western blotting. Uttrycket av Flot-2 i 6-10B var svagare än i andra NPC-celler. B, halvkvantitativ RT-PCR och Western blotting användes för att detektera Flot-2-expression i 6-10B-Flot-2-celler. 6-10B-Flot-2-cellerna uppnådde en jämförbar Flot-2-expressionsnivå som den i 5-8F-celler. C, morfologin för 6-10B- och 6-10B-Flot-2-celler observerade genom inverterad mikroskopi (200 x). 6-10B-Flot-2-celler hade en mesenkymliknande morfologi med lamellipodia. D, cytoskelett av 6-10B, 6-10B-Flot-2-celler och 5-8F-celler registrerades under konfokal laserscanningsmikroskop. 6-10B-Flot-2-celler uppvisade ett liknande mikrofilamentfördelningsmönster som 5-8F-celler, bestående av en högdensitetsfördelning av mikrofilamenter på cellytan, vilket föregår bildningen av iögonfallande lamellipodia och membranflussar.

Bild i full storlek

Uppreglerande uttryck av Flot-2 främjar malignitet hos 6-10B-celler både in vitro och in vivo

En 6-10B-cellinje som stabilt uttrycker Flot-2 (6-10B-Flot-2) etablerades framgångsrikt genom att transfektera 6-10B-celler med en pcFlot-2-expressionsvektor (fig. 2B). 6-10B-Flot-2-celler uppvisade en Flot-2-expressionsnivå som var jämförbar med den för 5-8F-celler. 6-10B-celler transfekterade med pcDNA3.1 (+) tom vektor (6-10B-pcDNA3.1 (+)) användes som en kontroll. Påverkan av ektopisk Flot-2-expression på de biologiska egenskaperna hos 6-10B-celler analyserades både in vitro och in vivo .

Förbättrat Flot-2-uttryck orsakade dramatiska förändringar i morfologin för 6-10B-celler, inklusive cellernas expansion, en minskning av det nukleo-cytoplasmiska förhållandet och bildandet av lamellipodia, vilket resulterade i morfologiska egenskaper som liknar mesenkymceller men skiljer sig från klassiska epitelceller (fig. 2C). Cytoskeletfärgning avslöjade att 6-10B-Flot-2-celler uppvisade ett liknande mönster av mikrofilamentfördelning till 5-8F-celler genom att mikrofilamenten var tätt fördelad på cellytan, vilket indikerar cellulär beredning för bildandet av iögonfallande lamellipodia och membranflussar (Fig 2D). Samtidigt resulterade ektopiskt Flot-2-uttryck i en mer aggressiv spridning av 6-10B-celler, vilket återspeglas av bildandet av större och fler antal kolonier och snabbare tillväxt, troligen genom att öka andelen celler i S-fasen (Fig. 3A ).

En, MTT-analys, kolonibildningsanalys och flödescytometrisk analys genomfördes för att analysera påverkan av ektopisk Flot-2-expression på tillväxt-, spridnings- och cellcykelstadiet för 6-10B-celler. Förbättrad proliferation (signifikanta skillnader observerades sedan Day3), kolonibildning (koloninummer: 6-10B-pcDNA3.1 (+): 5, 48 ± 1, 44, 6-10B-Flot-2: 13, 67 ± 2, 45) och cellcykelprogression (S) stegförhållande (%): 6-10B-pcDNA3.1 (+): 36, 01 ± 0, 08, 6-10B-Flot-2: 20, 54 ± 0, 79) observerades för 6-10B-Flot-2-celler. B, Effekter av Flot-2 på cellrörlighet hos 6-10B-celler uppmätt med en in vitro repsårläkningsanalys. C, påverkan av Flot-2 på rörlighet och in vitro invasivitet av 6-10B-celler uppmätt med en migreringsanalys (cellnummer: 6-10B-pcDNA3.1 (+): 16, 7 ± 3, 34, 6-10B-Flot- 2: 46, 58 ± 4, 35) och en in vitro Matrigel-invasionanalys (cellnummer: 6-10B-pcDNA3.1 (+): 63, 75 ± 8, 13, 6-10B-Flot-2: 132, 21 ± 17, 63). 6-10B-Flot-2-celler visade signifikant starkare migrerande och invasiva kapacitet än för 6-10B-pcDNA3.1 (+) -celler in vitro . D, in vivo metastaseanalys av 6-10B-Flot-2-celler. Efter intraperitoneal ympning invaderade 6-10B-Flot-2-celler in i membranmuskulatur, metastasiserades till lungor och bildade flera metastaser och metastasiserades till mediastinala lymfkörtlar. Således bekräftades också den invasiva och metastatiska kapaciteten för 6-10B-Flot-2 in vivo . All data var representativ för tre oberoende experiment. Uppgifterna analyserades med en två-svansad studenttest. * Indikerar P <0, 05.

Bild i full storlek

Dessutom ökades de migrerande och invasiva förmågorna hos 6-10B-Flot-2-celler också signifikant, vilket visades genom ökad sårstängning i en repsårläkningsanalys (fig. 3B), en ökad migrationsgrad i en transwellmigrationsanalys och en förbättrad invasionsfrekvens i en Matrigel-invasionanalys (Fig. 3C). Dessutom inducerade intraperitoneal injektion av 6-10B-Flot-2-celler inte bara primära tumörknölar på ytan av bukorganen (membran, bukspottkörtel, porta, mjälte och mesenteri) hos nakna möss utan också orsakade utvecklingen av avlägsna metastaser, inklusive metastaser i lungorna och mediastina lymfkörtlar (Fig. 3D). Metastas observerades emellertid inte i 6-10B-pcDNA3.1 (+) injicerade möss (endast primära tumörer inducerades).

Knockdown av Flot-2 försämrade den metastatiska förmågan hos 5-8F-celler

Vi undersökte vidare om nedreglering av Flot-2-uttryck i 5-8F-celler kan ha en negativ effekt på deras metastatiska förmåga. Två cellinjer, 5-8F-shFlot-2-1 och 5-8F-shFlot-2-2, upprättades genom införande av två korta hårnål-RNA-expressionskassetter (shFlot-2-1 och shFlot-2-2) i 5- 8F-celler för att tystna uttrycket Flot-2. Jämfört med 5-8F-shFlot-2-1-celler hade 5-8F-shFlot-2-2-celler en lägre nivå av Flot-2-expression, detekterat med RT-PCR och Western blotting (fig. 4A). Således använde vi 5-8F-shFlot-2-2-celler i följande studier och betecknade dem som 5-8F-shFlot-2-celler. Den 5-8F-pSUPER.retro blanka vektorn transfekterade 5-8F-cellerna etablerades som en kontrollcellinje.

Ett stabilt Flot-2-knockdown fastställdes framgångsrikt i 5-8F-celler, reflekterat av RT-PCR och Western blotting. Analys visade att expressionsnivån för Flot-2 signifikant nedreglerades (mer än 75%) i 5-8F-shFlot-2-2-celler. B, Flot-2 knockdown resulterade i långsammare tillväxt (signifikanta skillnader observerades sedan Day3) och proliferation (kolonital: 5-8F-shFlot-2: 9, 3 ± 1, 52, 5-8F-pSUPER.retro: 32 ± 4, 58, 5- 8F: 27, 7 ± 3, 51), cellcykelstopp (S-stegförhållande (%): 5-8F-shFlot-2: 30, 49 ± 2, 23, 5-8F-pSUPER.retro: 42, 58 ± 3, 56, 5-8F: 40, 43 ± 3, 67) och nedsatt invasivitet hos 5-8F-celler (cellnummer: 5-8F-shFlot-2: 106, 25 ± 13, 28, 5-8F-pSUPER.retro: 185, 32 ± 30, 54; 5-8F: 227, 41 ± 17, 46), mätt med MTT-analys, mjuk agar-kolonidanningsanalys, FACS-analys och in vitro Matrigel-invasionanalys. C, Scratch-sårläkningsanalys visade att Flot-2-knockdown kunde minska rörligheten hos 5-8F-celler. All data var representativ för tre oberoende experiment. Uppgifterna analyserades med en två-svansad studenttest. * indikerar P <0, 05.

Bild i full storlek

MTT-analysen och kolonibildningsanalysen visade att spridnings- och kolonibildningsförmågan var markant begränsad i 5-8F-shFlot-2-celler jämfört med 5-8F-celler och 5-8F-pSUPER.retro-celler (fig. 4B). FACS-analys visade att reducerat Flot-2-uttryck försenade G1 till S-progressionen (Fig. 4B), vilket visade att Flot-2-knockdown kan hämma 5-8F-cellproliferation genom att inducera cellcykelstopp.

Vidare avslöjade in vitro repsårläkningsanalysen och Matrigel-invasionanalysen att hämning av Flot-2-uttryck signifikant minskade rörlighet och invasiv kapacitet för 5-8F-celler (fig. 4C, B). In vivo- analys (fig. 5) visade att 5-8F-shFlot-2-celler bildade mindre avlägsna metastaser, där endast en mus utvecklade en avlägsen metastas (1/5). Däremot observerades en hög metastashastighet hos möss ympade med 5-8F-celler (5/5) och 5-8F-pSUPER.retro-celler (4/5). Från dessa resultat kan man dra slutsatsen att nedreglerat Flot-2-uttryck försämrar metastastisk förmåga hos 5-8F-celler.

Endast en mus (1/5) utvecklade en metastas av 5-8F-shFlot-2-celler, som metastaserades till lunga och endast bildade mikrometastaser (representativt foto visas i det övre vänstra hörnet). Fyra möss (4/5) ympade med 5-8F-pSUPER.retro-celler utvecklade metastaser i mediastinala lymfkörtlar och lungor. I lungvävnaderna kunde tumöremboli lätt hittas (representativt foto visas i bilden till vänster i mitten). Alla möss (5/5) ympade med 5-8F-celler utvecklade metastaser i mediastinala lymfkörtlar och lungor. Ett representativt foto som visar metastasen till den mediastinala lymfkörteln presenteras här (det nedre vänstra hörnet). Efter intraperitoneal inokulation migrerade 5-8F-shFlot-2-celler till den membranmuskulaturen utan uppenbar invasion (det övre högra hörnet), medan 5-8F-pSUPER.retro-celler (det mittersta högra fotot) och 5-8F-celler (det nedre högra hörnet) högra hörnet) invaderade djupt in i den membranmuskulaturen. Invasionen in vivo och metastatisk förmåga hos 5-8F-celler inhiberades genom Flot-2-knockdown.

Bild i full storlek

Microarray-analys i Flot-2 tystade NPC-celler

För att utforska molekylmekanismerna för Flot-2 i NPC genomfördes cDNA-mikroarrayanalys i 5-8F-pSUPER.retro-celler och 5-8F-shFlot-2-celler. Uttrycket av 481 gener uppreglerades och uttrycket av 232 gener nedreglerades i 5-8F-shFlot-2-celler jämfört med 5-8F-pSUPER.retro-celler (kompletterande tabell 1). Dessa gener förutsägs vara involverade i många biologiska processer såsom cellvidhäftning, signaltransduktion och immunsvar. Microarray-analyserna validerades ytterligare genom att bekräfta expressionsnivåerna för slumpvis utvalda gener (både uppreglerade och nedreglerade) med användning av qPCR (kompletterande figur 1). Mikroarray-data kan uppnås från GEO Datesets databas med anslutningsnummer GSE67456.

Flot-2-knockdown ledde till nedreglerad expression av MMP: er, troligen genom att hämma aktiviteten hos NF-BB-signalvägen

Western blot-analys visade att uttrycket av MMP2, MMP7 och MMP9 tydligt nedreglerades i 5-8F-shFlot-2-celler (fig. 6B). Aktiveringen av NF-KB signalering har avslöjats för att reglera uttrycket av MMP i vissa tumörer 19, 20 . Därför har vi vidare upptäckt aktiveringsstatusen för nyckelregulatorer i NF-KB-signalering. Minskad aktivitet av NF-KB observerades i 5-8F-shFlot-2-celler och illustrerades direkt genom translokering av p50 från kärnan (aktiv) till cytoplasma (inaktiv), en lägre nivå av fosfo-p65 i kärnan, och uppregleringen av IBB (fig. 6A). Följaktligen bekräftade förändringar i uttrycket av uppströms regulatorer av NF-KB, såsom p53 21, p38 22 och GSK3P 23 också inaktiveringen av NF-KB (Fig. 6A). Dessutom är de förändrade expressionsmönstren för Bcl-xL, Bcl-2 och Bax (fig. 6B), som är proteiner involverade i cellöverlevnad och riktade av NF-KB, ett ytterligare bevis som indikerar nedreglerad aktivitet av NF- κB signalering. Sammantaget verkar det som om nedregleringen av Flot-2 försvagade uttrycket av MMP: er genom att inaktivera NF-kB-signalering, vilket senare minskade migrationsförmågan hos NPC-celler.

A, Direkt eller indirekt bevis för inaktivering av NF-KB i 5-8F-shFlot-2-celler. Cyto, cytoplasma; Nuc, kärna; WCL, helcelllysat. De reducerade expressionsnivåerna av kärnp50 och fosforylerad p65 i 5-8F-shFlot-2-celler var direkt bevis för inaktivering av NF-KB. Förbättrad IKB- och p53-expression kombinerad med lägre p38- och GSK3p-uttryck var indirekta bevis. B, Detektering av uttrycket av nedströmseffektorer av NF-KB inklusive MMP2, 7, 9, Bcl-xL, Bcl-2 och Bax. Uttrycket av MMP: er, Bcl-2 och Bcl-xL reducerades och uttrycket av Bax förbättrades i 5-8F-shFlot-2-celler, jämfört med 5-8F-pSUPER.retro-celler. C, Detektering av expressionen av E-cadherin och p-mTOR i 5-8F-shFlot-2-celler. Uttrycket av E-cadherin uppreglerades i 5-8F-shFlot-2-celler, och det fanns ingen skillnad i expression av p-mTOR mellan 5-8F-shFlot-2-celler och 5-8F-pSUPER.retro-celler. D, reducerad aktivitet av PI3K / Akt3 / Foxo1 signalaxeln i 5-8F-shFlot-2-celler bekräftades genom RNA-interferens och behandling av Akt Inhibitor VIII. Flot-2-nedslagning försämrade PI3K / Akt3 / Foxo1-axeln i 5-8F-celler, vilket demonstrerades genom inhiberad expression av PI3K, p-Akt3, p-Foxo1, CCNA1 och CCNE2 och förbättrad expression av p27, p21 och Foxo1. Liknande resultat erhölls i 5-8F-celler behandlade med Akt3 Inhibitor VIII och Akt3 knockdown i 5-8F-celler. All data var representativ för tre oberoende experiment. Gelerna har körts under samma experimentella förhållanden och de ursprungliga bilderna för klippta sådana som E-cadherin, MMPs, p-Akt3, NF-BB-faktorer och p-Foxo1 visades i böjningsfigurer 2. De västra blotbanden kvantifierades och analyseras av en två-svansad studentt-test. * indikerar P <0, 05.

Bild i full storlek

Akt3- och Foxo1-nivå i 5-8F-shFlot-2-celler

Western blot-analys bekräftade det nedreglerade uttrycket av CCNA1 och CCNE2 och uppreglerat uttryck av CDKN1A (även benämnt p21) i 5-8F-shFlot-2-celler som observerades i mikroarray-analysen (fig. 6D). FACS-analysen ovan hade avslöjat att 5-8F-shFlot-2-cellerna arresterades i G1 / S-fasen, vilket antydde ett samband mellan cellcykelreglering och Flot-2-uttryck. Mot bakgrund av detta resultat detekterades Foxo1, en negativ negativ regulator för cellcykeln i både 5-8F-pSUPER.retro-celler och 5-8F-shFlot-2-celler. Minskat uttryck av fosfo-Foxo1 (inaktiv form) var synlig i 5-8F-shFlot-2, vilket sedan ökade uttrycket av flera viktiga negativa cellcykelregulatorer såsom p21 och p27 (fig. 6D). PI3K / Akt-signalaxeln är den huvudsakliga uppströmsvägen som reglerar aktiviteten hos Foxo1 24 . I själva verket hämdes uttrycket av PI3K i 5-8F-shFlot-2-celler (fig. 6D). Emellertid förändrades nivåerna av varken Akt1 eller Akt2, de två PI3K-effekterna i de flesta fall, i 5-8F-shFlot-2-celler. Däremot minskades uttrycket av fosfo-Akt3 signifikant (Fig. 6D). En Akt-specifik hämmare, Akt Inhibitor VIII och siRNA-medierad knockdown av Akt3, applicerades för att bekräfta effekterna av Akt3 i 5-8F-celler. Aktiviteten hos Foxo1 förstärktes av hämningen av Akt-aktiviteten med Akt Inhibitor VIII (1 μM) eller knockdown av Akt3-uttrycket (fig. 6D). Vi upptäckte också aktiviteten hos mTOR och fann att p-mTOR-nivån var liknande mellan 5-8F-pSUPER.retro och 5-8F-shFlot-2-celler (fig. 6C), och därmed utesluter påverkan av PI3K / Akt / mTOR axel. Således antyder dessa fynd att Flot-2 kan aktivera Akt3, som sedan hämmar Foxo1 och främjar utvecklingen av cellcykeln. Dessutom har uppreglerat uttryck av E-cadherin påvisats för att undertrycka metastas i orala skvamösa cellkarcinomceller med inhiberad Akt-aktivitet 25 . Ett liknande resultat observerades i 5-8F-shFlot-2-celler (fig. 6C), vilket antydde att Flot-2-utarmning kunde försämra metastatisk förmåga hos 5-8F-celler genom att förbättra E-cadherin-uttryck.

Flot-2-överuttryck förbättrade aktiviteten för PI3K / Akt3 och NF-KB i 6-10B-celler

För att verifiera att Flot-2 knockdown kunde hämma aktiviteten för PI3K / Akt3 och NF-KB, från ett annat perspektiv, analyserade vi påverkningarna av Flot-2-överuttryck på 6-10B-celler. Här ökades uttrycket av fosfo-Akt3, PI3K, fosfo-p65 och fosfo-Foxo1 i 6-10B-Flot-2-celler (fig. 7A, B). Följaktligen ökades uttrycket av CCNA1, MMP2, MMP7, MMP9, GSK3p (fig. 7A, B). De negativa regulatorerna för tumörtillväxt, såsom Foxo1, p21, E-cadherin och p53, dämpades emellertid (Fig. 7A, B). Därför kan förbättrad malignitet hos 6-10B-Flot-2-celler bero på den ökade aktiviteten av PI3K / Akt3 och NF-KB som är resultatet av överuttrycket av Flot-2.

A, Förbättrad aktivitet av PI3K / A kt3-axeln bekräftades i 6-10B-Flot-2-celler genom att detektera uppreglerat uttryck av PI3K, p-Akt3 och Akt3. Ytterligare bevis inkluderar det förändrade uttrycket av nedströmseffektorer, såsom uppreglerade p-Foxo1 och CCNA1 och nedreglerade Foxo1, p21 och E-cadherin. B, NF-KB-vägen aktiverades också i 6-10B-Flot-2-celler, reflekterad av uppreglerade p-p65, GSK3P och MMP och nedreglerade p53. All data var representativ för tre oberoende experiment. Gelerna har körts under samma experimentella förhållanden och de ursprungliga bilderna för klippta sådana som E-cadherin, MMPs, p-Akt3, NF-BB-faktorer och p-Foxo1 visades i böjningsfigurer 2. De västra blotbanden kvantifierades och analyseras av en två-svansad studentt-test. * indikerar P <0, 05.

Bild i full storlek

Flot-2 kan interagera med Flot-1 och visar ett positivt relaterat uttrycksmönster i NPC-celler

Det positiva sambandet i expressionsmönstret för flotilliner, ( dvs. minskat eller ökat uttryck av det ena leder till samma uttrycksmönster för det andra), har observerats i både celler och knockout-musmodeller 6, 26, 27 . Här bekräftade vi först interaktionen mellan Flot-1 och Flot-2 i 293T-celler (fig. 8A) och 5-8F-celler (fig. 8B) genom samimmunutfällning (co-IP). Sedan upptäckte vi om flotillin-2 knockdown eller överuttryck påverkar uttrycket av dess motsvarighet, flotillin-1. Vi fann att uttrycket av Flot-2 och Flot-1 var positivt korrelerat i NPC-celler, vilket visades genom ökat eller minskat Flot-1-uttryck i 6-10B-Flot-2 respektive 5-8F-shFlot-2-celler ( Fig. 8C). Således antydde den positiva korrelationen mellan Flot-2 och Flot-1 att Flot-2 kan vara involverad i stabiliteten hos Flot-1 och Flot-1 kan spela en viss roll i resultatet av Flot-2-förändringar, även om dessa kräver ytterligare undersökning.

A, positiva band av anti-Flag (Flot-2) eller anti-His (Flot-1) detekterades i komplex som immunutfällts av anti-His respektive anti-Flag i 293T-celler. B, ett positivt band av Flot-2 detekterades i ett komplex immunutfällning av anti-Flot-1 i 5-8F-celler. C, Flot-1-uttryck var positivt associerat med det för Flot-2, vilket demonstrerades av nedreglerade Flot-1 i 5-8F-shFlot-2-celler och uppreglerade Flot-1 i 6-10B-Flot-2-celler. All data var representativ för tre oberoende experiment. Western blot-bandet kvantifierades och analyserades med en två-svansad student-test. * indikerar P <0, 05.

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie observerades överuttryck av Flot-2 både i NPC-biopsier och cellinjer. Flot-2-nedslagning försämrade maligniteten hos 5-8F-celler, vilket demonstreras av deras reducerade förmåga att bilda kolonier, migrera och invadera in vitro , liksom att metastasera i nakna möss. Tystnad Flot-2-uttryck i 5-8F-celler inhiberade NF-KB och PI3K / Akt3-signalering och minskade därefter MMP-uttryck, ökade E-cadherin-uttryck, förbättrade Foxo1-aktivitet och inducerade cellcykelstopp. För att utesluta möjligheten till klonal varians upptäckte vi också påverkan av Flot-2 knockdown på 5-8F-shFlot-2-1-celler, och vi observerade liknande resultat (data visas inte). Dessa fynd ger starka bevis på att Flot-2 spelar en viktig roll för att främja NPC-progression genom reglering av NF-BB och PI3K / Akt3-signalering.

Flotillins roller vid cancerframsteg har studerats i olika cancerformer. Knockdown av Flot-1 eller Flot-2 med RNAi hämmar proliferation, invasion, migration och metastas av cancerceller. Både Flot-1 och Flot-2 är lovande markörer för diagnos och förutsägelse av utfallet för vissa cancerformer 10, 11, 17 . Här observerade vi överuttrycket av Flot-2 i NPC-vävnader och cellinjer, och uttrycksmönstret för Flot-2 var positivt korrelerat med NPC-metastas, ett fynd som stöds av nyligen genomfört arbete som indikerar att Flot-2 kan fungera som en ny biomarkör för lymfkörtelmetastas i NPC. I enlighet med resultaten i andra cancerformer 13, 28, inhiberade knockdown av Flot-2 spridnings-, rörlighet- och invasionförmågan hos 5-8F-celler. Överuttryck av Flot-2 i 6-10B-celler resulterade i mesenkymliknande morfologi och förbättrad invasiv och metastatisk förmåga. Med dessa resultat har vi visat att Flot-2 också kan främja utvecklingen av NPC, liknande andra tumörer.

Att bryta igenom den extracellulära matrisen och källarmembranet är ett viktigt steg för metastas av cancerceller 2, 29 . Ökat uttryck av MMP: er spelar en viktig roll i att störa de extracellulära barriärerna, vilket sedan underlättar migrationen av cancerceller 30 . Den positiva korrelationen mellan Flot-2 och metastas i bröstcancer 8, melanom 11 och magcancer 31 såväl som NPC 17, demonstrerades genom klinisk patologisk analys. Den pro-metastatiska rollen för Flot-2 demonstrerades i en musbröstcancermodell 12 . Aktivering av NF-kB-signalering, observerad i de flesta cancerformer, har visat sig bidra till canceruppträdande och progression genom att reglera flera processer, inklusive cellöverlevnad och spridning, EMT (epitelial till mesenkymal övergång), inflammation och angiogenes samt metastas 19, 20 . Aktiverat NF-KB har verifierats för att uppreglera expression av MMP: er i olika metastatiska cancerformer 32, 33 . Undertrycket av NF-kB-aktivitet och hämning av metastaser som härrör från nedreglerad Flot-1 har bekräftats i esofageala och orala skvamcellcancer 7, 34 . Förhållandet mellan Flot-2 och NF-KB har emellertid sällan analyserats. Här demonstrerade de nedreglerade och uppreglerade aktiviteterna av NF-KB / MMPs i 5-8F-shFlot-2 respektive 6-10B-Flot-2-celler att den pro-metastatiska rollen för Flot-2 i NPC kan vara resultatet av dess förmåga att främja MMP: s uttryck genom att aktivera NF-KB.

PI3K / Akt-signalvägen spelar en viktig roll i grundläggande intracellulära signalöverföringssystem. Den reglerar olika cellulära och fysiologiska aktiviteter såsom celltillväxt, spridning, apoptos, angiogenes och metabolism genom fosforylering av olika nedströmseffektorer såsom Foxo1 och mTOR 35, 36 . Avvikande aktivering av PI3K / Akt-signalering bidrar emellertid till tumörgenes och metastas 37, 38 . Även om de tre isoformerna av Akt, Akt1, Akt2 och Akt3, delar betydande homologi, har Akts särskilda regleringsfunktioner identifierats i olika typer av cancer, som sammanfattas i detalj i Romano G: s granskning 39 . Hämning av Akt1 / Foxo3a / p21 / p27 observerades i bröstcancerceller med Flot-1-knockdown, vilket var förknippat med ett stopp av proliferation och tumörgenicitet 9 . Överraskande nog fungerade endast Akt3, vars roll i NPC ännu inte har rapporterats, som en effektor av PI3K och var involverad i regleringen av cellcykelkontroll vid G1 / S-kontrollpunkt i NPC-celler. Flot-2-knockdown påverkade inte aktiviteten hos mTOR, vilket utesluter rollen för PI3K / Akt / mTOR-signalaxeln, en viktig signalväg i utvecklingen av tumörer 36, 40 . Hyperaktiviteten av Akt3 har observerats i vissa cancerformer, inklusive bröstcancer 41, melanom 42, äggstockscancer 43 och hepatocellulärt karcinom 44, och det är involverat i utvecklingen av ovan nämnda tumörer genom att reglera olika nedströmsmål. Denna studie bekräftade den direkta sambanden mellan lipidflåtar och PI3K / Akt-signalering rapporterad i mantelcelllymfom 45 och bröstcancer 9 och indikerade en möjlig Flot-2 / PI3K / Akt3 signalväg.

Flotilliner tenderar att bilda hetero eller homo-oligomerer för att stabilisera varandra 6, 46 . Utarmning av antingen Flot-1 eller Flot-2-uttryck kan samtidigt minska expressionen av den andra i både Flot-1 eller Flot-2 knockout-möss och odlade celler. Det verkar som att Flot-1 är mer beroende av Flot-2 eftersom Flot-1-utarmning vanligtvis orsakar liten eller ingen uttömning av Flot-2, medan Flot-2-knockdown inte bara minskar uttrycket av Flot-1 utan också helt tappar flotillin- specifika membranmikrodomäner, en nyckelplattform för signaltransduktion 6, 12 . Således inhiberar Flot-2 knockout lungmetastas i en bröstcancermusmodell 12 . Här kan en liknande mekanism användas i NPC, eftersom minskat Flot-1-uttryck observerades i 5-8F-shFlot-2-celler och ökat Flot-1-uttryck observerades i 6-10B-Flot-2-celler. Ytterligare arbete är brådskande nödvändigt för att belysa det underliggande förhållandet mellan flotilliner i NPC.

Slutsats

Sammanfattningsvis visade denna studie att Flot-2 utövar en cancerroll i NPC och är involverad i tumörprogression och metastas. Flot-2 utövar sin roll i NPC-tumörer genom NF-KB och PI3K / Akt3-signalering. Därför kan vi spekulera i att uppreglering av Flot-2 aktiverar NF-KB, vilket därefter ökar uttrycket av MMP: er, försämrar den extracellulära matrisen och slutligen främjar metastas för NPC-celler. Dessutom aktiverar upregulation av Flot-2 PI3K / Akt3 och hämmar Foxo1-aktivitet, vilket leder till en acceleration av cellcykeln genom nedströmseffektorer av Foxo1 och därefter till spridning av NPC-celler.

Material och metoder

Cellinjer och vävnader

NPC-cellinjer (5-8F, 6-10B, CNE1, CNE2, HNE1, HNE2, HNE3, HK1, C666-1, HONE1) upprätthölls av vårt laboratorium. Celler odlades i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kompletterat med 10% FBS i en fuktig atmosfär med 5% CO2 vid 37 ° C. Trettonåtta NP-vävnader och 132 primära NPC-vävnader, inklusive 45 icke-metastatiska och 87 metastatiska NPC-vävnader, användes för analys av Flot-2-proteinuttryck genom immunohistokemi (IHC). Alla prover erhölls från patienter före behandling på Hunan Cancer Hospital (Changsha, Hunan, Kina) med deras informerade samtycke. Studien genomfördes efter godkännande av etiska kommittén vid Central South University. Metoderna genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.

Immunohistokemi (IHC)

Vävnadsglas immunoreagerades med anti-Flot-2-mus-monoklonal antikropp (1:50, Santa Cruz Biotechnology, USA) och detekterades av IHC med användning av SAB (streptavidin-biotin) -systemet (DAKO, Carpinteria, CA). Avsnitt utvärderades oberoende av två patologer som var blinda för de kliniska data. Utvärdering av färgning bedömdes med hjälp av Intensity Reactivity Score (IRS) enligt litteraturen 47 .

Tvingat uttryck av Flot-2 i 6-10B-celler och knockdown av Flot-2 eller Akt3 i 5-8F-celler

Den öppna läsramen (ORF) -sekvensen för Flot-2 amplifierades från 5-8F-cell-cDNA med användning av den främre primern 5'-AAACGGGTGCTGGAGGGAGGGC-3 'och den omvända primern 5'-CTGGGGGTGGCGGGATAGGCTG-3' och subklonades i pcDNA3.1 ( +) vektor. Två RNAi-sekvenser riktade mot Flot-2, 5'-ATGACAAAGTGGACTATCT-3 'och 5'-AAGGCAGAAGCCTACCAGAAA-3' (benämnd shFlot-2-1 respektive shFlot-2-2) klonades in i pSUPER.retro-vektorsystemet som tidigare beskrivet 48 och bekräftats genom DNA-sekvensering. 6-10B-celler eller 5-8F-celler transfekterades med 2 μg motsvarande vektorer med Lipofectamine 2000-reagens (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll. Efter två veckors selektion med G418 (6-10B) eller puromycin (5-8F) erhölls läkemedelsresistenta kloner och uttrycket av Flot-2 bekräftades genom RT-PCR och Western blotting. Därefter benämndes de förvärvade cellerna 6-10B-Flot-2, 5-8F-shFlot-2-1 och 5-8F-shFlot-2-2. Kontrollcellerna erhölls på liknande sätt. Knockdown av Akt3 utfördes enligt tidigare publicerat protokoll 49 .

Semikantitativ eller kvantitativ omvänd transkription-PCR (RT-PCR eller qPCR)

RT-PCR och qPCR-reaktioner utfördes såsom beskrivits tidigare. Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) användes som en intern kontroll. Flot-2 amplifierades med användning av den främre primern 5'-GGCTTGTGAGCAGTTTCTGG-3 'och den omvända primern 5'-TCGAAGGCTCGCTTAGAGTC-3'. GAPDH amplifierades med användning av den främre primern 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 'och den omvända primern 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGT-3'. Primrarna för qPCR tillhandahölls i kompletterande tabell 2.

Western blot-analys

Western blotting genomfördes såsom tidigare beskrivits med en mindre modifiering. Antikropparna som användes i studien är följande: polyklonal kanin anti-MMP2, anti-MMP7, anti-MMP9, anti-Bcl-xl, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-E-cadherin, anti-PI3K, anti-p53, anti-GSK3P, anti-Flot-1, anti-Akt3 (Proteintech, Wuhan, Kina), anti-fosfo-Akt3 (S472) (Abgent, Suzhou, Kina), anti-fosfo-p65 (S536), p50, anti-IκB, anti-Foxo1, anti-phospho-Foxo1 (S256), anti-p38, anti-p27, anti-p21, anti-CCNA1, anti-CCNE2 (Sangon Antibody R&D Center, Shanghai, Kina), anti -fosfo-mTOR (S2448) (ImmunoWay, Newark, DE, USA), monoklonal anti-Flot-2-mus, anti-a-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) och anti-p-aktin ( Sigma, USA). Akt Inhibitor VIII, en specifik Akt-hämmare, köptes från Merck Millipore (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Kvantifiering av signalintensiteten (IOD, integrerad optisk densitet) utfördes med Gel-Pro Analyzer-programvara (version 4.0). Expressionförändring indikerades med IOD-förhållandet målriktat protein före och efter behandlingar. Och intensiteten normaliserades med ß-Actinsignal. Alla detektioner upprepades i tre oberoende gånger.

Samimmunutfällning (Co-IP)

pEF1 / myc-His-Flot-1 och pFLAG-CMV-Flot-2 expressionsvektorer konstruerades genom kloning av Flot-1 ORF och Flot-2 ORF till pEF1 / myc-His vektor (Invitrogen, USA) och pFLAG-CMV vektor (Sigma, USA). PEF1 / myc-His-Flot-1 och pFLAG-CMV-Flot-2-vektorerna transfekterades till 293T-celler i olika kombinationer. Fyrtioåtta timmar senare bereddes celllysat och förinkuberades med agaros-IgA / IgG-pärlor under 2 timmar vid 4 ° C. Sedan avlägsnades pärlor och färska agaros-IgA / IgG-pärlor med anti-His eller anti-Flag inkuberades med lysaten över natten vid 4 ° C. Efter tvättning, denaturering och SDS-PAGE visualiserades proteinerna genom immunblotting. De endogena interaktionerna i 5-8F-celler analyserades på liknande sätt med anti-Flot-1. Experimentet upprepades i tre oberoende gånger.

Kolonibildningsanalys och mjuk agaranalys

Kolonibildningsanalyser utfördes i enlighet med en publicerad manual 50, och mjuka agaranalyser utfördes under standardanalysförhållanden 51 . Varje analys utfördes i tre exemplar oberoende. Uppgifterna uttrycks som medel ± SD för antalet kolonier. Experimenten upprepades under tre oberoende gånger.

In vitro -cellproliferationsanalys

MTT-analyser utfördes för att bedöma effekten av Flot-2 på cellproliferation enligt ett publicerat protokoll 52 . Experimentet upprepades i tre oberoende gånger.

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

FACS-analys genomfördes såsom beskrivits tidigare 53 . Experimentet upprepades i tre oberoende gånger.

Matrigelinvasionsanalys in vitro

Denna analys baserades på Boydenkammarens princip. Celler (5 x 104 ) suspenderades i serumfritt medium och laddades i det övre facket av invasionskamrar belagda med Matrigel (BD Biosciences). De nedre facken fylldes med medium. Efter 48 timmar fixerades invasiva celler, färgades och räknades i fem förutbestämda fält under ett mikroskop. Uppgifterna uttrycks som det genomsnittliga antalet celler som migrerar genom filtren. Experimentet upprepades i tre oberoende gånger.

Migrationsanalys och in vitro repa sårläkning

Förfarandena för migrationsanalysen liknade de som beskrivits för Matrigel-invasionanalysen förutom att ingen Matrigel användes och inkubationstiden var 16 timmar. Analyser med sårläkning genomfördes enligt vårt publicerade protokoll 53 . Experimenten upprepades under tre oberoende gånger.

Detektion av avlägsna metastaser i nakna möss

Celler (2 × 106 ) från varje cellinje injicerades intraperitonealt i grupper om fem 5-veckor gamla BALB / C nunu / nu- möss (SLAC Laboratory Animal Co., Shanghai, Kina). Möss avlivades 5 veckor senare. Alla möss kontrollerades noggrant genom rutinbiopsi. Lungorna och mediastinala lymfkörtlarna avlägsnades och undersöktes med H&E-färgning. Alla djurförfaranden godkändes av Animal Care and Use Committee av Central South University och utfördes i enlighet med institutionell policy.

Cytoskelettobservation

Celler färgades först med falloidin-TRITC (50 ug / ml, Sigma, USA). De cellulära morfologiska förändringarna observerades under ett ljusmikroskop (TE2000U, Nikon, Japan) och cytoskelettvisualisering registrerades med ett laserskannande konfokalt fluorescensmikroskop (Carl Zeiss Inc., Tyskland).

Statistisk analys

Ett Kruskal-Wallis H-test utfördes för att jämföra skillnaden i Flot-2-uttryck bland NP (a), icke-metastatiska (b) och metastatiska NPC (c) -grupper, och Nemenyi-testet användes sedan ytterligare för att utföra parvisa jämförelser bland a-, b- och c-grupper. Skillnader mellan medelvärden bedömdes med en två-svansad studentt-test. För alla analyser användes statistikprogramvaran SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL). Ett värde av P <0, 05 betraktades som statistiskt signifikant.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Liu, J. et al. Flotillin-2 främjar metastas av nasofaryngealt karcinom genom att aktivera NF-KB och PI3K / Akt3 signalvägar. Sci. Rep. 5, 11614; doi: 10.1038 / srep11614 (2015).

anslutningar

Genuttryck Omnibus

  • GSE67456

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.