Ex vivo expansion av normala och kroniska myeloida leukemiska stamceller utan funktionell förändring med användning av en nup98hoxa10homeodomain-fusionsgen | leukemi

Ex vivo expansion av normala och kroniska myeloida leukemiska stamceller utan funktionell förändring med användning av en nup98hoxa10homeodomain-fusionsgen | leukemi

Anonim

ämnen

  • Stamceller från cancer
  • Kronisk myeloid leukemi
  • Genetisk transduktion

Abstrakt

HOX- gener har implicerats som regulatorer för normal och leukemisk stamcellsfunktion, men i vilken utsträckning dessa aktiviteter är kopplade förstås dåligt. Tidigare studier avslöjade att transduktion av primitiva mushematopoieticceller med en NUP98HOXA10homeodomain ( NA10HD ) fusionsgen möjliggör en efterföljande snabb och markant expansion in vitro av hematopoietiska stamcellnummer utan att orsaka deras transformation eller avreglerad expansion in vivo . För att bestämma om tvingat uttryck av NA10HD i primitiva humana celler skulle ha en liknande effekt jämförde vi antalet långvariga odlingsinitierande celler (LTC-IC: er) som finns i kulturer av lenti- NA10HD mot kontrollvirusomvandlade CD34 + -celler ursprungligen isolerade från humant navelsträngsblod och patienter med kronisk fas (CP) med kronisk myeloid leukemi (CML). Vi fann att NA10HD kraftigt ökar produktionen av både normala och Ph + / BCR-ABL + LTC-IC, och denna effekt är särskilt uttalad i kulturer som innehåller tillväxtfaktorproducerande matare. Intressant nog påverkade NA10HD inte den initiala cellcykelkinetiken för de transducerade cellerna eller deras efterföljande differentiering. Dessutom visade immunodeficienta möss som återbefolkades med NA10HD- transducerade CP-CML-celler under mer än 8 månader inga bevis på förändrat beteende. Således tillhandahåller NA10HD ett nytt verktyg för att förbättra både normal och CP-CML stamcellexpansion in vitro , utan att uppenbarligen förändra andra egenskaper.

Introduktion

Hematopoietiska stamceller (HSC) är ansvariga för livstidsproduktionen från mogna blodceller. Detta uppnås genom generering av förfäder som producerar olika linjer av blodceller samt dotter-HSC genom självförnyelseavdelningar. Många faktorer som är väsentliga för skapandet, utvidgningen och underhållet av HSC: er in vivo har nu identifierats. 1 Framträdande bland dessa är HOX-familjen av transkriptionella regulatorer. 2 Dessa inkluderar ett antal HOX- gener, såsom HOXB4, som förbättrar musens HSC-expansion under specifika förhållanden in vitro . När de uttrycks som en del av fusioner med nukleoporin 98-genen ( NUP98 ) stör andra HOX- gener också differentiering och / eller bidrar till utvecklingen av myeloida leukemi. Som en del av en större undersökning av egenskaperna hos dessa naturligt förekommande och konstruerade gener identifierade vi ett extremt potent HOX -derivativ som består av de 5 ′ sekvenserna av ett NUP98 cDNA och hemmodern (HD) för HOXA10 cDNA (nedan benämnd NA10HD ). 3, 4 Spännande, stimulerar denna fusionskonstruktion en mycket snabb och markerad expansion in vitro av transducerade mus-HSC: er, och ändå bibehåller dessa celler normal HSC-funktionalitet in vivo . 3, 4 Egenskaperna hos NA10HD har därmed tillhandahållit ett kraftfullt nytt verktyg för att manipulera och undersöka självförnyelsebeteendet hos primitiva murina hematopoietiska celler.

Föreliggande studie utformades för att undersöka om tvångsöveruttryck av NA10HD också skulle ha en förmåga att främja självförnyelse / expansion av primitiva humana hematopoietiska celler. För detta ändamål skapade vi en lenti-viral vektor som kodar NA10HD och använde den för att transducera mänskliga CD34 + -celler isolerade från olika källor. Dessa inkluderade prover av normalt humant navelsträngsblod (CB) och prover erhållna från patienter med kronisk fas (CP) kronisk myelooid leukemi (CML) i vilka de mest primitiva facken hade en variabel representation av Ph + / BCR-ABL + celler. Urvalet av CML-patientprover med antingen övervägande Ph + / BCR-ABL + eller övervägande normala celler i deras primitiva fack möjliggjorde effekter av NA10HD på primitiva normala humana HSC i både nyfödda och vuxna vävnader att utvärderas och jämföras med effekterna på primitiva humana celler där en första "hit" (skapande av BCR-ABL- onkogen) har inträffat. Effekter på CP-CML-celler är av särskilt intresse på grund av deras postulerade reducerade självförnyelsespotential, vilket indikeras av den långa latenta perioden innan CP-CML blir uppenbar (5–7 år), 5, 6, 7 och den mycket långsamma hastigheten vid vilken CP-CML-stamceller ackumuleras. En relativ brist i självförnyelseförmågan hos CP-CML HSC: er förklarar också den överlägsna, om än kortlivade, konkurrerande återbefolkningsaktiviteten som uppvisas av återstående normala HSC: er i CML-patienter omedelbart efter att de fått intensiv kemoterapi, 8 och den underlägsna retentionen av Ph + / BCR-ABL + långsiktig kulturinitierande cell (LTC-IC) aktivitet in vitro under samma optimerade förhållanden. 9, 10 Defekt självförnyelsebeteende är också karakteristiskt för BCR-ABL- transformerade mus-HSC: er. 11, 12, 13, 14

De studier som presenteras här visar att transduktion av primitiva normala och BCR-ABL + (CP-CML) celler med NA10HD möjliggör en förbättrad generation av LTC-IC av båda genotyperna utan en påvisbar effekt på deras genomförande av normala differentieringsprogram eller andra bevis på ytterligare transformation vid långvarig uppföljning av deras avkom i transplanterade immunbristmöss. Således tillhandahåller NA10HD ett nytt verktyg för att förbättra både normal och CP-CML stamcellexpansion in vitro , utan att uppenbarligen förändra andra egenskaper.

Resultat

NA10HD- transduktion av CD34 + CB-celler ger en snabb och långvarig ökning av LTC-IC utan att påverka deras differentiering

För att bestämma om tvingat uttryck av NA10HD skulle främja expansion av normala humana HSC: er in vitro, använde vi förhållanden som skulle vara biologiskt lika de som användes i tidigare musexperiment (figur 2a). Detta involverade transduktion av CD34 + CB-celler och sedan mätning av det totala antalet transducerade (GFP + ) HSC: er (här analyserade som LTC-IC) närvarande både omedelbart efter transduktion och senare, efter odling av cellerna i ytterligare 7 dagar i GF-SFM (att är efter totalt 2 och 9 dagar in vitro under förhållanden som tidigare visat sig upprätthålla omanipulerade CB LTC-IC under denna period 21 ). Transduktionseffektiviteten som uppnåddes med användning av detta protokoll var 62 ± 11 ( NA10HD- virus) och 72 ± 19% (kontrollvirus), bestämd utifrån frekvensen av GFP + -celler inom CD34 + -populationen närvarande i GF-SFM-kulturer 7 dagar efter -transduction. Dessa 7-dagars suspensionskulturmätningar bekräftade de höga och liknande titrarna för båda viruslagren erhållna med användning av K562-celler (figur 1) och motiverade direkta jämförelser av effekterna av de två olika viruspreparaten.

Tvingat uttryck av NA10HD i CD34 + CB-celler ger en snabb och långvarig ökning av LTC-IC in vitro. ( a, e ) Experimentella konstruktioner som används för att bedöma effekter av NA10HD på LTC-IC-aktivitet i kulturer av transducerade CD34 + CB-celler med användning av bulk ( a ) och begränsande utspädning ( e ) LTC-IC-analyser. Celler analyserades både i slutet av exponeringen för virus (dag 2) och efter ytterligare 7 dagar (dag 9) i GF-SFM-suspensionskulturer. Data för kontrolltransducerade celler visas som öppna symboler / staplar och data för NA10HD- transducerade celler visas som svarta symboler / staplar. ( b ) Jämförelse av totalt cellantal i 6-veckors bulk-LTC initierade med kontroll- eller NA10HD- transducerade celler. Värden som visas är genomsnitt ± sd ( n = 3). ( c ) Jämförelse av LTC-IC-aktiviteten hos kontroll- eller NA10HD- transducerade celler mätt med deras 6-veckors CFC-innehåll i bulk LTC-IC-analyser. De visade värdena är medelvärden ± sem ( n = 3) av CFC-utgångar uttryckta per 10 4 startande (dag 0, företransduktion) celler. ( d ) Samma data som i panel ( c ) men normaliserade till motsvarande värden för samma antal omanipulerade CD34 + -celler i de två respektive CB-prover för vilka detta initialvärde bestämdes och visades som ett tidsförloppsdiagram. ( f ) Jämförelse av frekvensen av kontroll och NA10HD- transducerade LTC-IC detekterade genom begränsande utspädningsanalys. De visade värdena är baserade på de kombinerade data från två experiment och uttrycks per 10 6 startceller (företransduktion).

Bild i full storlek

Det totala antalet celler (figur 2b) och CFC (figur 2c) närvarande i bulk 6-veckors LTC: er inställda med NA10HD- transducerade CD34 + CB-celler omedelbart efter transduktion var båda signifikant högre än motsvarande värden för kontrollvirusomvandlade celler ( 10 respektive 30 gånger högre). Bulk LTC-IC-analyser utförda på transducerade celler odlade i GF-SFM under ytterligare 7 dagar (dag 9 i GF-SFM) visade en ytterligare, om än blygsam (tvåfaldig) ökning av det differentiella utbytet av CFC: er mellan LTC-IC-analyserna av NA10HD- och kontrolltransducerade celler (figurerna 2b och c). I förhållande till pretransduktionsvärden var den slutliga ökningen av NA10HD- transducerade LTC-IC-härledda CFC: er 60 gånger, medan antalet kontroll-transducerade LTC-IC-härledda CFC: er var <två gånger högre än pretransduktionsnumret (figur 2f) . LTC-IC-mätningar med användning av begränsande utspädningsanalysprotokoll (figur 2d) detekterade ∼ 14 gånger fler LTC-IC i analyserna av de NA10HD- transducerade cellerna analyserades antingen omedelbart efter transduktion eller efter att cellerna hade hållits under ytterligare 7 dagar i GF -SFM jämfört med kontrolltransducerade celler (figur 2e). Sex-veckors CFC-utgångar per LTC-IC beräknade i dessa begränsande utspädningsanalysförsök både omedelbart och 7 dagar efter transduktion gav värden för NA10HD- transducerade LTC-IC som visade sig något minskade (7 och 4 CFC / LTC-IC) relativt kontrollerna (16 och 12 CFC: er / LTC-IC), som liknade tidigare publicerade värden för CB LTC-IC, analyserades på liknande sätt. 17 Således verkar det troligt att NA10HD- uttryck resulterar i en expansion av CB LTC-IC som kan ha något mindre proliferativ potential. Mer än 90% av de erhållna kolonierna i alla dessa kulturer var granulopoietiska och kunde inte skiljas i storlek och utseende mellan grupperna (data visas inte). Således är den stora effekten av tvingat NA10HD- uttryck i primitiva normala humana hematopoietiska celler en snabb och långvarig ökning av antalet celler som visar LTC-IC-aktivitet utan att ändra deras differentieringspotential.

NA10HD- transduktion av primitiva CP-CML-celler ger en snabb ökning av Ph + / BCR-ABL + CML LTC-IC utan att påverka deras differentiering in vitro

Effekterna av tvingat NA10HD- uttryck på Ph + / BCR-ABL + och på samexisterande normala vuxna LTC-IC från CP-CML-patienter undersöktes med användning av en liknande experimentell konstruktion (figur 3a), som utformats för CB-experimenten. För CML-experimenten valde vi fyra CP-patientprover vars LTC-IC-fack vi tidigare visat sig sträcka sig från övervägande Ph + / BCR-ABL + (> 93%) till övervägande normal (<6% Ph + / BCR-ABL +, Kompletterande tabell S1). CD34 + -cellerna från dessa prover transducerades med användning av samma överprimeringsprotokoll över natten som för CD34 + CB-cellerna, men en kortare exponeringsperiod för virus för att möjliggöra senare in vivo- experiment med samma transduktionsprotokoll utan att medföra en signifikant förlust av CP-CML-celler med repopuleringsaktivitet. Bedömning av effektiviteten för genöverföring till CD34 + CML-celler uppnådda med användning av den kortare exponeringen för virus var liknande (46 ± 11% för NA10HD- viruset och 52 ± 10% för kontrollviruset, figurerna 1c och d) som den erhållna med CD34 + CB-celler.

Tvingat uttryck av NA10HD i CD34 + -celler från CML-patienter främjar en snabb och långvarig ökning av LTC-IC utan effekter på deras förmåga att differentiera. ( a ) Experimentell design som användes för att bedöma effekten av NA10HD på LTC-IC-aktivitet i kulturer av CD34 + -celler isolerade från fyra CP-CML-patientprover som ursprungligen innehöll variabla antal Ph + / BCR-ABL + LTC-IC-analyser utfördes 2 och 7 dagar efter transduktion (dag 3 och 8 i GF-SFM-suspensionskulturer). ( b ) Data för kontrolltransducerade celler visas som öppna symboler / staplar och data för NA10HD- transducerade celler visas som svarta symboler / staplar. Jämförelse av totalt antal GFP + -celler i 6 veckor gamla LTC: er initierade med NA10HD - eller kontrolltransducerade celler (vänster panel) och tidskursdata från ett experiment (patient 2). ( c ) Jämförelse av antalet GFP + CFC i de 6 veckor gamla LTC-initierade med NA10HD - eller kontrolltransducerade celler i suspensionskulturerna bedömdes 2 och 7 dagar efter exponering för virus. Alla värden normaliserades till dag 0-värdet för varje patient. Pilarna anger värden under detektionsgränsen som motsvarar datapunkten. ( d ) Giemsa-färgning av celler (huvudsakligen makrofager) som finns i den icke-vidhäftande fraktionen av 5 veckor gamla LTC: er initierade med kontrolltransducerade celler från patient 2 jämfört med den icke-vidhäftande fraktionen av motsvarande LTC initierade med NA10HD- transducerad celler som visar sig innehålla huvudsakligen granulocyter. Skala bar: 50 μm. ( e ) Mikrofotografier av kolonier producerade i metylcellulosa-analyser av LTC-härledda CFC: er som härrör från både kontroll- och NA10HD- transducerade CML-celler som illustrerar deras normala utseende. Skala bar: 500 μm. ( f ) Representativa FACS-profiler av immunfärgade celler skördade från CFC-analyser av 6-veckors LTC initierade med kontroll- eller NA10HD- transducerade celler som visar deras liknande innehåll av mogna eryroid (GlyA + CD33 - ), omogna (CD33 + CD15 + ) och mogna (CD33 - CD15 + ) granulocyter och monocyter / makrofager (CD33 + CD14 + ).

Bild i full storlek

Bulk LTC-IC-analyser utförda 2 dagar efter transduktion (dag 3 i GF-SFM) visade en konsekvent markerad och selektivt förbättrad produktion av GFP + celler (figur 3b) och CFC (figur 3c) från NA10HD- transducerade celler efter 6 veckor . För två av CML-proverna (patienter 2 och 3) var denna skillnad väl upprätthållen under ytterligare 5 dagar (7 dagar efter transduktion och dag 8 i GF-SFM), men förlorades i de andra två fallen (figur 3c). Celler som frisattes i båda typerna av LTC: er skiljer sig huvudsakligen från granulopoietiska celler med mycket sällsynta sprängningar (figur 3d). De CFC som var närvarande i slutet av de 6 veckorna med LTC i båda fallen genererade också kolonier av celler med en normal morfologi (figur 3e) och fenotyp (figur 3f). Sammantaget visar dessa fynd att tvingat uttryck av NA10HD förbättrar produktion av LTC-IC i primitiva celler från CP-CML-patienter utan att påverka deras förmåga att differentiera.

För att särskilja effekter av NA10HD- transduktion på primitiva Ph + / BCR-ABL + och återstående normala celler i samma prover, genotypades CFC: er som producerades i LTC-IC-analyserna. Dessutom genomfördes seriella LTC-IC-analys (replikerande) experiment och kolonierna genotypades igen (figur 4a). NA10HD- transducerade celler uppvisade samma konsekvent markant ökning i LTC-IC-tal (bulkanalyser) vid bedömning 2 dagar efter transduktion (kompletterande tabell S2). Genotypningsanalyserna visade en snabb och särskilt markant ökning av Ph + / BCR-ABL + LTC-IC (figur 4b). Denna effekt av NA10HD på Ph + / BCR-ABL + LTC-IC var tillräcklig för att förhindra detektering av någon åtföljande effekt på primitiva normala LTC-IC i tre patiensprover. För patient 4, där endast normala LTC-IC: er var detekterbara i inmatningscellerna (figur 4c och kompletterande tabell S2), var emellertid en signifikant förstärkande effekt av NA10HD på vanliga LTC-IC för vuxna uppenbar. Resultaten av de sekundära bulk-LTC-IC-analyserna av NA10HD- transducerade celler visade vidare en fortsatt markant förbättring av normal och Ph + / BCR-ABL + LTC-IC-produktion i de primära LTC: erna (figur 4b och c). Dotter CFC: er som genererades i dessa sekundära LTC-IC-analyser var återigen morfologiskt normala (data visas inte). Dessutom visade G-bandade metafaser av NA10HD- transducerade celler från både normala och Ph + / BCR-ABL + LTC-härledda kolonier inga nya kromosomavvikelser (data visas inte).

NA10HD förbättrar markant utvidgningen av normala och Ph + / BCR-ABL + LTC-IC in vitro i LTC och har den största effekten på de mer primitiva CD34 + CD38 - celler. ( a ) Experimentell design (med celler från samma fyra CP-CML-patienter studerade i figur 3). Analyser utfördes på celler som hade bibehållits i GF-SFM-suspensionskulturer under 3 dagar efter exponering för virus. ( b ) Data för kontrolltransducerade celler visas i öppna symboler / staplar och för NA10HD- transducerade celler visas i svarta symboler / staplar. Jämförelse av det absoluta antalet LTC-härledda GFP + BCR-ABL + CFC som finns i primära (wk 6) och sekundära (wk 12) LTC-IC-analyser normaliserade till dag 0-värden (företransduktionsvärden, prickade linjer) erhållna från samma antal att starta CD34 + -celler från samma patient. Pilarna anger värden under detektionsgränsen som motsvarar datapunkten. ( c ) Samma data för de LTC-IC-härledda GFP + normala ( BCR-ABL - ) CFC: erna visas separat för patient 4 (eftersom inga BCR-ABL + CFC: er hittades i LTC: er initierade med dessa celler). ( d ) Jämförelse av BCR-ABL- transkriptnivåer som en funktion av NA10HD- transkriptnivåer (kvantifierat relativt GAPDH- transkript) i extrakt av enskilda kolonier producerade från CFC genererade i 6-veckors LTC initierade med transducerade celler från patienterna 1, 2 och 3. Resultaten uttrycks som 2 - (Ct BCR − ABL − Ct GAPDH) för BCR-ABL transkript och 2 - (Ct NA10HD − Ct GAPDH) för varje koloni ( R 2 = 0, 0007; Pearson test som visar ingen signifikant korrelation, P = 0, 87) . ( e ) Jämförelse av effekten av NA10HD på CD38 + och CD38 - delmängder av CD34 + CML-celler (patient 2). Visade data är det absoluta antalet LTC-härledda GFP + BCR-ABL + CFC producerade i primära (wk 6) och sekundära (wk 12) LTC-IC-analyser uttryckta per 105 startande CD34 + CD38 + celler eller CD34 + CD38 - celler . ( f ) Samma experimentella konstruktion följdes som i panel ( e ) men CD34 + CD38-cellerna delades dessutom in i en Rho + och Rho-fraktion (celler från patient 1). Pilar visar detektionsgränser. ND, inte gjort.

Bild i full storlek

Som förutsagits från övervägande av GFP + och Ph + / BCR-ABL + -kolonier i LTC-IC-analyser av NA10HD- transducerade celler från patienterna 1-3, kunde NA10HD- transkript också lätt detekteras i samma kolonier (figur 4d). Dessa nivåer var mycket varierande mellan enskilda kolonier, men visade ingen korrelation med BCR-ABL- transkriptnivåer i samma kolonier ( R2 = 0, 0007, P = 0, 87; Pearson-test). Ett liknande variabelt uttryck av NA10HD sågs i transducerade K562-cellkloner (kompletterande figur S1A), där BCR-ABL- transkriptnivåer var mer lika varandra (och de nivåer som uppmättes i kontrollomvandlade K562-celler, P = 0, 92 parade t - test, data visas inte). NA10HD- transducerade K562-celler visade inte heller någon förändring av deras känslighet för imatinib-mesylat (kompletterande figur S1B), vilket indikerar att det tvingade uttrycket av NA10HD inte har någon effekt på BCR-ABL-kinasaktivitet.

NA10HD: s förmåga att förbättra CML LTC-IC-tal in vitro är begränsad till en primitiv underuppsättning av CD34 + -celler

För att karakterisera cellerna som NA10HD syftar till att producera ökat antal Ph + / BCR-ABL + LTC-IC in vitro , genomförde vi ytterligare experiment med samma design som visas i figur 4a, men börjar med olika FACS-renade underuppsättningar av CD34 + celler (isolerade från patienter 1 och 2). Dessa inkluderade startpopulationer av CD34 + CD38 + och CD34 + CD38 - celler (figur 4e) eller CD34 + CD38 + -cellerna plus CD34 + CD38 - cellerna underindelades i enlighet med deras förmåga att flyta ut Rho (figur 4f). Tvungen expression av NA10HD i CD34 + CD38 + -cellerna förbättrade CFC-utgångarna i både de primära och sekundära LTC-IC-analyserna för de transducerade cellerna. Däremot var LTC-IC: er i motsvarande analyser av kontrolltransducerade celler under detekterbara nivåer, som förväntat från experiment med icke-manipulerade celler. 10 LTC-IC-siffrorna erhållna från NA10HD- transducerade CD34 + CD38 + -cellerna var emellertid fortfarande mycket lägre (∼ 3000-faldigt) än de som erhölls från NA10HD- transducerade CD34 + CD38-celler, eller Rho-delmängden av dessa . Även om de två senare delmängderna representerar små fraktioner av den totala CD34 + -populationen (∼ 10% respektive ∼ 0, 1%), står deras bidrag till den NA10HD- stimulerade produktionen av LTC-IC: er för huvuddelen av ökningarna uppmätt från totala CD34 + -celler.

NA10HD har liten effekt på långsiktig tillväxt eller differentiering av primära CML-celler i NSG-möss

För att utvärdera effekterna av NA10HD- transduktion av primitiv CP-CML-celltillväxt och differentiering i in vivo- miljö, transplanterade vi sublett bestrålade NSG-möss intravenöst med 106 CD34 + -celler vardera från patienterna 1 eller 2 (med övervägande Ph + / BCR-ABL + LTC-IC: er) omedelbart efter transduktion. Vi analyserade därefter det humana cellinnehållet i BM-aspirater erhållna från dessa möss upp till 36 veckor senare (figur 5a). Resultaten visade att oberoende av vektorn som användes för att transducera de initiala cellerna upprätthölls en population av mänskliga myeloida celler under hela perioden som mössen följdes med ingen (patient 1) eller mycket få (och endast vid tidiga tider, patient 2) humana lymfoida celler detekterade, som förväntat för transplantationer av Ph + / BCR-ABL + CP-CML-stamceller. Ungefär 15 till 30% av de mänskliga cellerna som regenererades var GFP + i både myeloida (CD33 + ) och lymfoida (CD19 / 20 + ) linjer (figur 5b). GFP + CD34 + -celler detekterades också i BM-aspiraterna erhållna 8 veckor efter transplantation (0, 02 ± 0, 01% och 0, 01 ± 0, 01% i mottagare av NA10HD - respektive kontrolltransducerade celler från patient 1 och 0, 35 ± 0, 13% och 0, 02 ± 0, 01% respektive för patient 2). Bedömning av frekvensen (per 10 4 närvarande humana CD45 + -celler) och genotyp av de mänskliga CFC: erna närvarande i 8-veckors BM-aspirat visade att både Ph + / BCR-ABL + och normala humana CFC: er också lätt kunde detekteras i samma BM aspireras från mössen (tabell 1). Nio månader efter transplantation var Ph + / BCR-ABL + CML-celler fortfarande lätt detekterbara i BM av NSG-möss, vilket visades av nivåerna av BCR-ABL i både GFP + och GFP - regenererade humana celler (figur 5c ) och genom den begränsade närvaron av NA10HD- transkript i humana celler GFP + (figur 5d). Ph + / BCR-ABL + CFC upptäcktes också i analyser av humana CD45 + -celler skördade vid denna tidpunkt och var möjligen mer utbredda i NA10HD- transducerade (GFP + ) celler (tabell 2). Nivåerna av BCR-ABL- transkript som hittades i NA10HD- uttryckande kolonier och kontrollkolonier var emellertid inte statistiskt olika (data visas inte). Dessutom var både morfologin (figur 5e) och Lin-markörer (kompletterande figur S2) uttryckta på cellerna som de producerade in vitro oskiljbara från de kolonier som producerades av CFC: erna i de ursprungliga primära CP-CML-proverna från dessa patienter. Undersökning av mjältarna som avlägsnats från mössen 9 månader efter transplantation visade att alla mänskliga celler som var närvarande var myeloida, i överensstämmelse med den lymfoidbristiga chimerismen som sågs i BM av samma möss (figur 5f).

NA10HD- transducerade CML-celler visar ostört repopuleringsaktivitet i NSG-möss. ( a ) Experimentell design. Den skördade avkomman av 106 initiala CD34 + -celler från patienterna 1 och 2 injicerades omedelbart efter transduktion i var och en av åtta subletalt bestrålade NSG-möss som sedan övervakades som indikerat. ( b ) Data för kontrolltransducerade celler visas i öppna symboler / staplar och för NA10HD- transducerade celler visas i svarta symboler / staplar. Jämförelse av procentandelen total human myeloid (CD45 + CD33 + CD14 + CD15 + GlyA +, topppanel) och mogna B-lymfoider (CD45 + CD19 + CD34 -, bottenpanel) GFP + celler detekterade i BM av NSG-mössen vid olika tidpunkter efter transplantation. Data för patient 1 visas i den vänstra panelen och för patient 2 i den högra panelen. ( c ) Jämförelse av BCR-ABL- transkriptionsnivåer i FACS-renade humana CD45 + -celler erhållna från BM från möss transplanterade med NA10HD - eller kontrolltransducerade CP-CML-celler 35 veckor innan. Resultaten uttrycks som 2 - (Ct BCR − ABL − Ct GAPDH) . ( d ) Jämförelse av NA10HD- transkriptionsnivåer i humana CD45 + GFP - (vit stapel) och humana CD45 + GFP + (svarta staplar) celler isolerade från BM av fem (av de åtta ursprungliga) möss som transplanterats med NA10HD- transducerade CML-celler 35 veckor innan. Resultaten uttrycks som 2 - (Ct BCR − ABL − Ct GAPDH) . Skillnaden mellan de två värdena är statistiskt signifikant (** P = 0, 008, Mann – Whitney). ( e ) Wright-Giemsa-färgade cytospiner från kolonier producerade från CFC skördade från möss som fick transducerade celler från patient 1 som visade normal myeloid differentiering i båda fallen. ( f ) Närvaro av mänskliga myeloida celler och frånvaro av humana B-lymfoida celler i mjälten från möss transplanterade 35 veckor innan med kontroll- eller NA10HD- transducerade celler.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Full storlek bord

Effekter av NA10HD på primitiva humana hematopoietiska celler förmedlas inte av påvisbara förändringar i deras spridning eller överlevnad

Nästa frågade vi om tvångsuttryck av NA10HD kan påverka cellcykelens inträde eller cellcykelövergångstid för primitiva humana hematopoietiska celler. Följaktligen isolerades enskilda CD34 + CD38-celler med FACS från CB, transducerades och infördes sedan, 24 timmar senare, i en mikrofluidisk cellodlingsgrupp innehållande ett stort antal nanoliter-volymbrunnar förbelastade med GF-SFM. 22 De laddade flisen hölls vid 37 ° C och celler avbildades var 5 min under 96 timmar för att bestämma frekvensen och hastigheten för klonbildning av GFP + -cellerna. Resultaten avslöjade inga skillnader mellan NA10HD- transducerad och kontroll (GFP + ) CB-celler (figur 6). På dag 5 efter transduktion (efter 2 dagar i den mikrofluidiska matrisen) var således medelstorleken för klonerna som producerades av NA10HD - och kontrolltransducerade celler densamma (figur 6c). På liknande sätt visade K562-celler transducerade med NA10HD inte heller någon skillnad i deras klonogena effektivitet (kompletterande figur S3A), inte heller i deras fördubblingstid i bulksuspensionskulturer (kompletterande figur S3B), och detta senare resultat höll i minst 10 passager (data inte visad).

NUP98-HOXA10HD förändrar inte den initiala celldelningskinetiken för transducerade CD34 + CD38 - CB-celler. ( a ) Ljusa fält- och fluorescerande mikrofotografier av kloner genererade från enstaka NA10HD och kontrolltransducerade CD34 + CD38 - CB-celler efter 4 dagar i mikrofluidkulturer i GF-SFM. Enstaka celler som framgångsrikt infekterats kunde lätt skiljas från icke-uttryckande celler genom deras GFP-fluorescens. Skala, 100 μm. ( b ) Jämförelse av hastigheterna för celldelning av individuella transducerade celler (kloner som innehöll 100% GFP + celler efter 96 timmars kultur) när de avbildades var 5 min. Data plottas som de ackumulerade hastigheterna för avslutande av en, två och tre divisioner under den övervakade perioden, uttryckt som en procent av antalet övervakade celler / kloner ( n = 43 för kontrolltransducerade celler (grå symboler) och n = 67 för NA10HD- transducerade celler (gröna symboler). ( c ) Kontroll- och NA10HD- transducerade populationer laddades sekventiellt i mikrofluidcellcellskulturen. En uppsättning fluorescerande bilder togs i slutet av experimentet för att identifiera GFP + -kloner. % transducerade kloner beräknades genom att dela antalet GFP + kloner med det initiala antalet enstaka celler för varje population Celler avbildades var 5 min och tiden för första, andra och tredje division identifierades genom manuell inspektion av videorna. av livskraftiga celler i varje klon i slutet av experimentet räknades manuellt. Kloner märktes som stillastående om de innehöll en enda livskraftig cell som inte hade delats under experimentets gång.% viabiliteten var mätt genom att räkna antalet kloner, transducerade eller inte, som innehöll åtminstone en livskraftig cell i slutet av experimentet dividerat med det initiala antalet enstaka celler för varje population. Resultaten visas som medelvärde ± sd

Bild i full storlek

Diskussion

Många gener har nu identifierats ha en roll i att reglera HSC-expansion, men få av dessa har hittills översatts till kliniskt användbara strategier för att utvidga normala eller leukemiska humana HSCs ex vivo . På samma sätt har dessa fynd ännu inte lett till förbättrade metoder för att behandla human akut leukemi. Ändå har HOX- genfamiljen och relaterade regulatorer förblivit av största intresse, baserat på bevis på effekterna av deras störda (förhöjda) uttryck i primitiva normala och leukemiska celler. 2 Sådana studier stöder den allmänt avhandlade avhandlingen att en fullblåst leukemi involverar förvärv av en deregulerad självförnyelsemekanism som delar funktioner med den operativa i normala HSC.

Intressant nog finns det flera exempel där förändrad Hox- genfunktionalitet har gett markanta förbättrande effekter på olika HSC-undergrupper utan att orsaka eller bidra till en leukemogen process. Det första exemplet var demonstrationen att tvingat överuttryck av HOXB4 i vuxna BM-BM-celler kan producera en markerad (40-faldig) expansion av HSC i kortvariga kulturer innehållande tidigt verkande GF med återupptagande av ett normalt tillväxt- och differentieringsbeteende efter deras transplantation till en in vivo- miljö. 23 Efterföljande studier visade en mer blygsam effekt av tvingat överuttryck av HOXB4 på odlade humana hematopoietiska celler. 24 På senare tid beskrev vi en liknande men kraftigt förstorad effekt (> 1000-faldig expansion av HSC: er) i kortvariga kulturer av primitiva mus-BM-celler transducerade med NA10HD , igen utan att störa den efterföljande normala funktionaliteten hos den expanderade HSC när de transplanterades in vivo . 3 Dessa fynd följdes sedan av en liknande studie i icke-mänskliga primatceller där en markant men kortvarig effekt på neutrofil återhämtning erhölls med användning av NA10HD- transducerad benmärgs CD34 + -celler. 25 Således verkar det som förstärkning / förvärv av självförnyelse och bidrag till leukemogenicitet kan dissocieras molekylärt.

Vi demonstrerar nu att tvingat överuttryck av NA10HD i primitiva mänskliga celler gör det möjligt att öka antalet LTC-IC närvarande efter korta perioder av kultur markant (> 10 gånger över startnummer). Detta fynd uppfyller således förväntningarna från tidigare studier inklusive observationen att effekterna på mänskliga celler är mindre än de som rapporterats för möss. Den möjliga expansionen av en mer differentierad delmängd av humana LTC-IC: er (kännetecknad av en reducerad CFC-utgång) som observerats här påminner om resultaten som erhölls när icke-mänskliga primattransplantationer transducerades med NA10HD . 25 Skillnader i vektorer och cellmanipuleringsprotokoll måste dock också betraktas som potentiella olika bidragsgivare till liknande resultat.

Här erhöll vi bevis för att effekterna på primitiva normala humana celler inkluderar HSC: er i CB och vuxen BM (CP-CML-patient 4 vars HSC: er var övervägande normala), vilket antyder en potentiell bred tillämpbarhet av detta fynd i framtiden. Som ett första test av en möjlig leukemogen aktivitet av NA10HD i transducerade humana celler undersökte vi dess effekt på tillväxten och differentieringen av primitiva Ph + / BCR-ABL + CP-CML-celler med LTC-IC ( in vitro ) och NSG-musrepopulering aktivitet ( in vivo ). Inom tidsramarna för dessa experiment (2 respektive upp till 8 månader) förändrades dock tillväxten av NA10HD- transducerade normala celler eller Ph + / BCR-ABL + -celler. Det fanns heller ingen uppenbar effekt på deras cellcykelkinetik eller efterföljande förmåga att differentiera in vitro (eller in vivo ) och inga bevis för progression till leukemi. Sammantaget indikerar dessa fynd att tillräckligt förhöjda nivåer av NA10HD selektivt kan uppreglera sannolikheten för självförnyelse av normala och Ph + / BCR-ABL + humana HSC och / eller deras omedelbara avkomma.

Ytterligare bevis på att NA10HD påverkar självförnyelsemaskineriet hos primitiva mänskliga och musceller på liknande sätt kan härledas från resultaten av experiment utformade för att karakterisera den huvudsakliga undergruppen av mänskliga CD34 + -celler som påverkas. Dessa visade att de primära målen är Rho - CD38 - delmängden av CD34 + -celler, en population tidigare visat sig vara i G0. Intressant nog fann vi att under den inledande 2-dagarsperioden, när en markant ökning av LTC-IC-aktivitet upptäcktes, fanns färre än 20% av de konstruerade CD34 + CD38 - CB-cellerna avslutat en första division. Dessa resultat antyder att NA10HD överför LTC-IC-aktivitet på normal CD34 + CD38 - Rho - celler som annars inte skulle ha denna egenskap och kan göra det även innan cellerna lämnar G0. Ett prejudikat för en sådan effekt tillhandahålls av tidigare observationer av den motsatta effekten som erhölls på starkt renade, vilande mus-HSC, där dessa visade sig genomgå samordnade förändringar i transkriptionsfaktoruttryck och förlust av långvarig repopuleringsaktivitet långt innan en första division. 26 Det är också viktigt att notera att vissa CD34 + CD38-celler inte producerar CFC inom 6 veckor under LTC-förhållanden men gör det efter 12 veckor. 27, 28 Vi fann också att det transducerade NA10HD- cDNA ökade utsignalen från sekundära LTC-IC från normala såväl som CML-celler som utsäts i primära LTC-celler. Detta antyder antingen att NA10HD förbättrar självförnyelsen av celler som normalt visar 6-veckors LTC-IC-aktivitet eller att NA10HD rekryterar djupt vilande celler med större självförnyelsespotential i den detekterbara LTC-IC-poolen.

En ökad chimerism in vivo men opåverkad differentiering och avgränsning av linjer har också sett hos autologa icke-mänskliga primatmottagare av transducerade celler, 25 såväl som i kongen 3, 4 eller allogena mottagare 29 av NA10HD- transducerade celler. På senare tid har AML1a visat sig ha en liknande effekt på HSC för mus. 30 BMI1, en annan nyckelregulator för normala och leukemiska stamceller, visade sig förbättra human CML LTC-IC-aktivitet och även replikeringsförmågan hos klonogena CML-celler, men deras differentiering förblev opåverkad. Men när CB CD34 + -celler konstruerades för att uttrycka både BCR-ABL och BMI1, initierade dubbelt transducerade celler en lymfoid leukemi hos mottagarmöss. 31 NA10HD- fusionsgenen framstår således som ett potentiellt mer selektivt och följaktligen lovande verktyg för att utvidga normala HSC: er och CP-CML-stamceller. Emellertid kommer all översättning av en sådan strategi till klinisk praxis helt klart att kräva ytterligare ansträngningar för att undvika risk för oönskade vektorintegrationsplatser och en mer långvarig bedömning av NA10HD i icke-mänskliga primatmodeller.

Det är intressant att notera att en mycket markant effekt av NA10HD på både primitiva normala och Ph + / BCR-ABL + i proverna erhållna från CP-CML-patienterna sågs när cellerna hölls in vitro under LTC-förhållanden, medan för transducerade CB-celler upprätthållna i kortare kulturer innehållande endast GF, fanns det endast minimala bevis för en fortsatt HSC-expansion. Således verkar det troligt att effekten av NA10HD på mänskliga mål kan vara beroende av ytterligare extrinsiska led som tillhandahålls av stromalceller. Denna möjlighet är förenlig med tidigare mus-HSC-experiment som har visat en kritisk effekt av de tillsatta cytokinerna för att möjliggöra HOX -genöveruttryck för att rädda självförnyelsemekanismen för mus-HSC: er som hålls in vitro . I dessa har IL-3, IL-6 och SF alla visats vara positiva effektorer i motsats till TPO, som i kombination med andra cytokiner visade sig vara hämmande. 4 Därför kan NA10HD- genererade primitiva CML-celler också erbjuda en intressant modell för att undersöka förmågan hos extrinsiska faktorer att påverka CP-CML stamcells självförnyelsespons.

Denna studie dokumenterar också för första gången den långsiktiga och i stort sett myeloida begränsade regenererande kapaciteten som CP-CML-stamceller kan visa i sublett bestrålade NSG-möss när de transplanteras med tillräcklig CP-CML-stamceller. Dessutom visar vi att ett relativt kort transduktionsprotokoll kan uppnå en överföringseffektivitet för dessa celler för att möjliggöra uppföljning av deras beteende under perioder på mer än 8 månader. Avsaknaden av en signifikant effekt av NA10HD på dessa celler eller deras avkommor under flera månader argumenterar mot en förmåga av NA10HD på egen hand att orsaka progression av CP-CML-celler att spränga kris även om en markant förstärkande effekt på deras självförnyelse erhålls . Nyligen utvecklad humaniserade musmodeller såsom NSG-möss som är transgena för human IL-3, GM-CSF och SCF kommer att vara av intresse för att ytterligare utvärdera den leukemogena potentialen hos NA10HD på humana HSC: er. 32

Sammanfattningsvis förstärker tvingat uttryck av NA10HD i primitiva normala humana hematopoietiska celler och deras CP-CML-motsvarigheter selektivt, snabbt, hållbart och markant deras antal in vitro i närvaro av kända och okända GF: er producerade av stromalceller. Denna effekt åtföljs inte av någon omedelbar eller öppen effekt på deras initiala cellcykelreglering eller förmåga att differentiera in vitro eller in vivo eller transformation även i CP-CML-celler. Således bör NA10HD visa sig vara ett användbart verktyg för att snabbt öka primitiva normala eller CP-CML stamcellnummer för deras ytterligare karaktärisering eller användning för testning av nya terapeutiska läkemedel.

Kompletterande information

Powerpoint-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1–3

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Leukemia-webbplatsen (//www.nature.com/leu)