Förbättring av strålningsrespons i p53-bristcancerceller med aurora-b-kinasinhibitorn azd1152 | onkogen

Förbättring av strålningsrespons i p53-bristcancerceller med aurora-b-kinasinhibitorn azd1152 | onkogen

Anonim

Abstrakt

Överuttryck av Aurora-B-kinaset korrelerar med onkogen transformation och dålig prognos. Vi utvärderade effekterna av bona fide Aurora-B-kinasinhibitorn AZD1152 på tumörrespons på joniserande strålning (IR). När p53 vikt HCT116 och A549 celler förbehandlades med AZD1152-HQPA före IR observerades additiva effekter. Intressant sett observerades mer uttalade tumordödande effekter i p53-bristfria HCT116- och HT29-celler, såväl som A549-celler behandlade med den p53-hämmare cykliska pifitrin-a. Studier in vivo på xenograftade möss bekräftade förbättrad tumörtillväxtfördröjning efter kombinationen av IR plus AZD1152-IR jämfört med IR enbart. Återigen var denna effekt mer uttalad med p53 - / - HCT116 och p53-mutanta xenotransplantat. Den AZD1152-medierade radiosensibiliseringen imiterades genom knockdown av Aurora-B med en kort interferens-RNA eller genom hämning av Aurora-B genom transfektion med en inducerbar kinasdöd Aurora-B. Den radiosensibiliserande effekten av AZD1152 förlorades i CHK2 - / - och 14-3-3 - / - HCT116-celler. Sammantaget indikerar dessa data att AZD1152 kan radiosensibilisera tumörcellinjer in vitro och in vivo , det faktum att dessa effekter förvärras i p53-bristfälliga cancerceller är av potentiellt intresse för ytterligare klinisk utveckling.

Introduktion

Aurora-kinaserna utgör en familj av serin / treoninkinaser som är väsentliga för mitotisk progression och uttrycks maximalt under G2- och M-faserna i cellcykeln (Nigg, 2001; Carmena och Earnshaw, 2003). Det finns tre typer av aurorakinaser från däggdjur: Aurora-A, -B och -C.

Aurora-A lokaliseras till centrosomer och krävs för separering och mognad av centrosomer genom rekrytering av viktiga komponenter i spindelmontering. Nedbrytning av Aurora-A genom RNA-störningar blockerar G2 –M-övergången (Hirota et al., 2003). Aurora-A fosforylerar en serie framstående substrat, inklusive BRCA1 (Ouchi et al., 2004), CDC25B och p53 (Katayama et al., 2004), och celler som överuttrycker Aurora-A är resistenta mot paklitaxel, kringgår radioinducerad G 2 –M-gripande (Anand et al., 2003) och uppvisar minskad p53-beroende, cisplatin-inducerad apoptos (Katayama et al., 2004).

Aurora-B-kinas är ett av de kromosomala passagerarproteinerna som är viktiga för mitotisk progression. Aurora-B-uttryck och aktivitet regleras av cellcykeln: dess uttryck toppar sig vid G2 –M-övergången, och dess kinasaktivitet är maximal under mitos. Kromosomala passagerarproteiner lokaliseras till kinetokorerna / centromererna från profas till metafas, vid den centrala spindeln i anafas och telofas och slutligen till mittkroppen i slutet av cytokinesis. INCENP, även ett substrat för Aurora-B, krävs för att lokalisera Aurora-B till kinetochores. Aurora-B-aktivering utlöses av autofosforylering efter associering med dess substrat INCENP. I däggdjursceller bildar Aurora-B ett stort kromosompassagerarkomplex med INCENP, Survivin och Borealin (Adams et al., 2001; Carmena och Earnshaw, 2003; Meraldi et al., 2004; Andrews, 2005).

Förutom det väsentliga bidraget till cytokinesis (Giet et al., 2005) uppfyller Aurora-B minst två ytterligare, distinkta men ändå relaterade funktioner: Aurora-B-fosforylerade histon H3 på Ser 10 (krävs för kondensation av kromosomer) och krävs för den spänningsavkännande spindelmonteringskontrollen och korrigering av fel i fästningen av mikrotubulor till kinetokorer. Förlust av Aurora-B-funktion resulterar i misslyckande med att behålla kontrollpunktproteiner vid kinetokoren och en åsidosättande av den taxol-känsliga, spänningsavkännande spindelkontrollpunkten (Ditchfield et al., 2003; Hauf et al., 2003).

Identifieringen av Aurora-B-hämmare har varit ett huvudmål för läkemedelsföretag sedan upptäckten att motsvarande genlokus ofta förstärks i humana cancerformer och att Aurora-B är överuttryckt på mRNA och proteinnivå i flera humana cancercellinjer (Bischoff et al., 1998), inklusive tjocktarmen, bröst- och prostatacancer. Små molekyler kan selektivt rikta in sig på den enzymatiska aktiviteten hos kinaser genom att uppta det katalytiska ATP-bindningsstället (och ibland substratet). Flera Aurora-kinasinhibitorer har nyligen beskrivits, inklusive ZM447439 (Ditchfield et al., 2003; Gadea och Ruderman, 2005), Hesperadin (Hauf et al., 2003) VX-680 (Harrington et al., 2004) och AZD1152 (Wilkinson et al., 2007).

AZD1152 är ett acetanilid-substituerat pyrazol-aminokinazolindihydrogenfosfatförläkemedel med god löslighet, vilket gör det lämpligt för föräldradministrering. AZD1152 är en specifik Aurora-kinasinhibitor med selektivitet för Aurora-B-kinas (Ki 0, 4 n M), och visar stark specificitet över en panel med ytterligare 50 testade serintreonin- och tyrosinkinaser. Behandling av humana tumörcellinjer med AZD1152-HQPA (det aktiva läkemedlet i human plasma) in vitro leder till undertryckande av fosforylering av histon H3 på serin 10. AZD1152-HQPA visar en ny verkningsmekanism genom att påverka kromosominriktning och segregering, orsakar att celler inte delar sig, blir polyploid och genomgår slutligen apoptos. AZD1152-HQPA är aktiv över en mängd olika tumörcellinjer, inklusive MCF7, Colo205, HCT116, SW620, HeLa och A549, med en hämning av kolonibildning (IC 50 ) på 20-30 n M för hämning av histon H3-fosforylering ( Wilkinson et al., 2007).

Att kombinera läkemedel med strålning är en vanlig praxis i cancerbehandling och syftar till att uppnå större terapeutiska effekter än med enkelmodal terapi. Taxaner, som blockerar celler i mitos genom att öka mikrotubulstabiliseringen, har tidigare visats modifiera radiosensitivitet på ett tids- och cellcykelberoende sätt (Milas et al., 1999). Detta fynd fick oss att utvärdera effekten av AZD1152-inducerad hämning av Aurora-B-kinas på radiosensitiviteten hos tumörceller in vitro och in vivo .

Resultat

Minskad klonogen överlevnad i tumörceller förbehandlade med AZD1152-HQPA

Vi analyserade först de fysiologiska konsekvenserna av AZD1152-hämning av Aurora-B-kinasaktivitet genom att analysera fosforyleringsstatusen hos det avgörande Aurora-B-substratet, histon H3. Inkubering av HCT116 kolontumörceller med AZD1152-HQPA under 24 timmar ledde till fullständig hämning av histon H3-fosforylering och vi observerade olika spindelmorfologi med multipel spindelpol i de AZD1152-HQPA-behandlade cellerna jämfört med kontrollceller (figur 1a). På motsvarande sätt, och i överensstämmelse med tidigare rapporter, avslöjade cellcykelanalyser att AZD1152-HQPA-behandlade celler gradvis ackumulerade ett DNA-innehåll större än 4 N, vilket indikerar polyploidisering på grund av mitotiskt fel (figur 1a). Dessutom har ett stort antal mikrokärnor och multinucleatceller detekterats i cellerna exponerade för AZD1152-HQPA i HCT116-cellinjerna (figur la). Detta antyder att den mitotiska katastrofen snarare än apoptos (ungefär 10% sub-G1 som i figur la) dominerar i AZD1152-relaterad celldöd. Klonogena överlevnadsanalyser avslöjade vidare att AZD1152-HQPA effektivt inhiberade kolonibildning i området 10 n M till 1 μM, med IC50 för cellinjerna p53 - / - HCT116, HT29 och A549: 20.12, 150 och 20.16 n M, respektive (figur 1c) och förbättrad celldöd vid administrering 24 timmar före joniserande strålning (IR) -behandling i de olika cellinjerna (figurerna 3a, c och 5). Vi undersökte vidare inverkan av Aurora-B-hämning av AZD1152-HQPA på BubR1-lokalisering till kinetokorer och observerade en minskning av BubR1-lokalisering till kinetokorer (en anti-kinetochore CREST-antikropp har använts för att markera kinetokorerna som inte har förändrats genom hämning av Aurora-B av AZD1152) i p53 - / - HCT116-cellerna med 24 timmars exponering av 100 n M AZD1152-HQPA (figur 1d).

Image

Klonogen överlevnad av cellinjer exponerade för ett koncentrationsområde av AZD1152-HQPA. ( a ) Överst: kemisk struktur för AZD1152 och dess aktiva metabolit AZD1152-HQPA (höger). Nedre: immunofluorescensbilder av mitotiska p53 viktprocent HCT116-celler exponerade för 100 n M AZD1152-HQPA under 24 timmar. Behandlade celler färgades för DNA (blått), tubulin (grönt) och fosfo-histon-H3 (rött). Färgning visar, efter långvarig exponering för AZD1152-HQPA, celler som kommer in i efterföljande mitoser med flera spindelpoler, centrosomer och frånvaro av histon H3 ser-10-fosforylering, en karakteristisk fenotyp av Aurora-B-inhiberade celler. Mikrokärnor och multinukleasion visas i HCT116-cellerna efter 24 timmars exponering av 100 n M AZD1152-HQPA (nedan till höger) jämfört med kontroll (nedan till vänster). ( b ) Histogram för DNA-innehåll för p53 vikt HCT116-celler exponerade för 100 n M AZD1152-HQPA under 24 timmar. ( c ) Klonogen överlevnad av olika cellinjer exponerade för ett koncentrationsintervall av AZD1152-HQPA. En representant för tre oberoende experiment (utförda i triplikat) visas, X ± sd ( d ) BubR1-lokalisering till kinetokorer visas i p53 - / - HCT116-cellerna med (överst) eller utan (botten) 24 timmars exponering av 100 n M AZD1152-HQPA. Kinetokorer märktes med CREST-serum.

Bild i full storlek

Cellcykelrespons på IR- och AZD1152-HQPA-behandling

Cellcykelanalys avslöjade att AZD1152-HQPA-behandling under 24 timmar hade en stor påverkan på cellcykeln för flera cancercellinjer som skilde sig i deras p53-status (p53 - / - HCT116, p53 wt HCT116 (figur 2a och b) och HT29-cellinjer ; data visas inte). Den mest framträdande förändringen inducerad genom monoterapi med AZD1152-HQPA var en ansamling av celler med> 4 N DNA-innehåll. 24 timmar efter behandlingen med IR observerades ett mer uttalat G2-M-block i p53 - / - HCT116-celler än i vildtyp (vikt) HCT116-celler (59 ± 7 mot 27 ± 5%, respektive), och AZD1152-HQPA var effektivare för att inducera polyploidisering i p53 - / - HCT116-celler än i p53- vikt HCT116-motsvarigheter (63 ± 12 mot 51 ± 15%, respektive). När celler exponerades för både IR och AZD1152-HQPA reducerades ackumuleringen av> 4 N DNA-innehållsceller jämfört med behandling med AZD1152-HQPA enbart i båda cellinjerna med HCT116: 18 ± 1 mot 51 ± 15%; p53 - / - HCT116: 25 ± 12 mot 63 ± 12%, respektive; Fig. 2a och b). Men när celler som tidigare inkuberats med AZD1152-HQPA under 24 timmar exponerades för IR och analyserades genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 24 timmar senare, ändrades inte ackumuleringen av celler med> 4 N DNA-innehållsceller jämfört med celler exponerade för AZD1152-HQPA enbart. Detta fenomen observerades i p53 - / - HCT116 såväl som i deras p53- vikt HCT116 motsvarigheter (data visas inte).

Image

Kombinatorisk effekt av AZD1152-HQPA med joniserande strålning (IR) på cellcykeln. ( a ) p53 vikt HCT116: celler inkuberade med AZD1152-HQPA under 24 timmar inducerar ackumulering av> 4 N DNA-innehåll. IR (6 Gy) inducerar ett måttligt G2-M-block 24 timmar efter behandlingen. En 24 timmars exponering av AZD1152-HQPA följde omedelbart med 6 Gy IR ledde till en dramatisk nedgång i> 4 N-celler (18%) jämfört med AZD1152-HQPA enbart (58%). ( b ) p53 - / - HCT116-celler: celler inkuberade med AZD1152-HQPA under 24 timmar inducerade en större ackumulering av> 4 N DNA-innehållsceller än i p53- vikt HCT116-cellinjen (52 mot 31%, respektive). Behandling av celler med IR (6 Gy) orsakade ett mer uttalat G2-M-block än i p53 vikt HCT116. Behandling av celler med AZD1152-HQPA under 24 timmar följde omedelbart med 6 Gy IR ledde till en dramatisk nedgång i> 4 N-celler jämfört med AZD1152-HQPA enbart (75% för icke-bestrålade celler kontra 37% för 6 Gy). ( c ) Western blotting visar p21 Cip / WAF1- uttrycket på 24 timmar efter 100 n M AZD1152-HQPA-exponering (DMSO som kontroll) i p53 vikt och p53 - / - HCT116 celler. En representativ aspekt av tre oberoende experiment visas.

Bild i full storlek

Vi jämförde sedan p21 Cip / WAF1- uttrycket i p53 wt och p53 - / - HCT116 (24 timmar efter 100 n M AZD1152 HQPA). I figur 2c visar vi en ökning av p21 Cip / WAF1- expression i AZD1152-exponerade p53 vikt HCT116-celler jämfört med dimetylsulfoxid (DMSO) exponerade kontrollceller; emellertid i p53 - / - HCT116-celler förblir emellertid p21 Cip / WAF1- uttryck nästan odetekterbar. Detta antyder att p21 Cip / WAF1 spelar en viktig roll i cellernas svar på Aurora-B-hämning av AZD1152.

p53-beroende effekt av AZD1152-HQPA och IR-kombination

Klonogena överlevnadsanalyser avslöjade en mer uttalad förbättring av tumörcelldödande vid exponering för AZD1152-HQPA under 24 timmar följt av IR i både p53 - / - HCT116-cellinjen (figur 3a) såväl som i p53-mutanten HT29-cellinjen (figur 7a). Under liknande förhållanden detekterades endast en måttlig förbättring av celldödning med IR och AZD1152-HQPA i p53 viktprocent HCT116-celler (figur 3b). Dessa resultat antydde att antitumoreffekten av kombinationsterapin (IR plus AZD1152-HQPA) beror på den funktionella statusen för p53. För att undersöka denna möjlighet mer detaljerat behandlade vi A549-celler (som innehåller funktionell p53) med cyklisk pifitrin-a, en kemisk p53-hämmare, och observerade att under betingelser med p53-hämning ökade celldöd efter exponering av IR plus AZD1152-HQPA, vilket föreslår en kritisk roll för p53 för att förmedla denna effekt (figur 3c och d).

Image

Klonogena överlevnadskurvor. Klonogena överlevnadskurvor för p53 - / - HCT116 ( a ) och p53 vikt HCT116 ( b ) celler förbehandlade 24 timmar med 20 n M AZD1152-HQPA (PE AZD / PE DMSO : 22, 5 respektive 26, 3%). Data representerar medelvärdet av tre oberoende experiment i tre exemplar, X ± sd 'AZD-norm ctrl'-kurvan är överlevnadsfraktionen av AZD1152-behandlade celler normaliserade av överlevnadsfraktionen av celler utan bestrålning; kurvan 'AZD1152' är överlevnadsfraktionen av AZD1152-behandlade celler normaliserade av överlevnadsfraktionen av AZD1152-behandlade celler utan bestrålning. Klonogena överlevnadskurvor för A549-celler förbehandlade 8 timmar med 20 μM pifitrin-a ( c ) eller dimetylsulfoxid (DMSO) ( d ) och exponerades sedan för 40 n M AZD1152-HQPA under 24 timmar (PE AZD / PE DMSO : 34.4 och 73.3 %, respektive). En representativ aspekt av två oberoende experiment (utförda i tre exemplar) visas, X ± sd

Bild i full storlek

Behandling in vivo av xenotransplantat mänsklig cancer genom kombinationen av AZD1152 plus IR

Behandling av möss som bär subkutan p53 vikt HCT116-cell xenografts avslöjade en ökning i tumörtillväxtfördröjningen (TGD) inducerad av AZD1152 plus IR jämfört med IR enbart (16 dagar för att uppnå en genomsnittlig tumörvolym på 800 mm 3 i kontroller jämfört med IR enbart (26 dagar)), AZD1152 ensam (22 dagar) och IR och AZD1152 (30 dagar); Figur 4b). p53 - / - HCT116-tumörer behandlade med AZD1152 plus IR uppvisade också en mer uttalad TGD (40 dagar) än tumörer behandlade med IR enbart (29 dagar; figur 4c). Figur 4a sammanfattar in vivo TGD erhållna för p53 vikt mot p53 - / - HCT116 efter exponering för IR ensam (10 respektive 8 dagar) och i kombination med AZD1152 (15 respektive 19 dagar). Således har AZD1152 en särskilt uttalad effekt på strålningssvaret för tumörer med p53-brist in vivo , i överensstämmelse med p53-beroendet som observerats in vitro . Den p53-muterade HT29-cellinjen gav liknande in vivo- resultat (figur 4d). Återigen hade AZD1152 enbart en begränsad effekt på tillväxten av HT29-tumörer (27 dagar för att uppnå en genomsnittlig tumörvolym på 800 mm 3 för AZD1152-behandlade celler jämfört med 25 dagar för kontroll), medan AZD1152 kombinerat med IR ledde till en signifikant TGD (52 dagar för IR plus AZD1152 jämfört med 43 dagar för IR ensam), såsom visas i figur 4d.

Image

Subkutana xenograftmodeller med AZD1152 och joniserande strålning (IR) -kombinerade behandlingar. ( a ) TGD: er i möss injicerade med p53 vikt- eller p53 - / - HCT116-celler, behandlade med IR ensam eller kombination av IR med AZD1152. In vivo- experiment i en subkutan xenograft av ( b ) p53 vikt HCT116, ( c ) p53 - / - HCT116 och ( d ) HT29-celler behandlade med vehikel (kontroll) eller AZD1152 ensam eller kombinerad med IR. n = 6 per grupp, medel tumörvolym ± sem visas.

Bild i full storlek

Påverkan av utarmning av Aurora-B på strålningsrespons

För att bedöma bidraget från Aurora-B till den radiosensibiliserande effekten som observerades med AZD1152-behandling slog vi ner Aurora-B med hjälp av två distinkta korta störningar RNA (siRNA) heteroduplexer (figur 5a). Som förväntat skulle utarmningen av Aurora-B kunna förbättra IR-svaret för både p53 vikt (figur 5b) och p53 - / - (figur 5c) celler.

Image

Ioniserande strålning (IR) -respons i Aurora-B korta störnings-RNA (siRNA) knockdownceller. ( a ) Western blot bekräftar framgångsrik utarmning av Aurora-B med användning av siRNA. p53 wt ( b ) och p53 - / - HCT116 ( c ) bestrålades (2 Gy) 48 timmar efter transfektion av siRNA Aurora-B (siRNA B) eller siRNA-kontroll (siRNA ctrl), och PE bestämdes. En representativ aspekt av tre oberoende experiment (utförda i tre exemplar) visas, X ± sd

Bild i full storlek

För att ytterligare belysa det fysiologiska bidraget och den potentiella mekanismen för Aurora-B använde vi en tetracyklininducerbar kinas-död; Aurora-B (DN) -mutant transfekterades stabilt in i HEK293-celler (Girdler et al., 2006). Expression av DN Aurora-B reducerade fosforylering av histon H3 (Girdler et al., 2006), inducerade polyploidi (figur 6a) och komprometterade klonogen överlevnad (Girdler et al., 2006). I likhet med resultaten erhållna med Aurora-B siRNA-transfekterade celler observerade vi en förbättring av strålningssvaret i HEK293-cellerna efter tetracyklininduktion av DN Aurora-B (figur 6b) jämfört med celler odlade i frånvaro av tetracyklin eller wt. HEK293-celler (figur 6c). Pifitrin-exponering påverkade inte bestrålningsresponsen med varken wt- eller kinasdöd Aurora-B-uttryck. Utarmning eller hämning av Aurora-B kan öka strålningssvaret, men AZD1152 förmedlar ytterligare radiosensibiliserande potential.

Image

Ioniserande strålning (IR) -respons i Aurora-B-inducerbara mutantcellinjer ( a ) Karakterisering av HEK293-celler stabilt transfekterade med en tetracyklininducerbar kinas-död Aurora-B-konstruktion (Hek DN) eller vildtyp (wt) Aurora-B ( Hek wt) via western blot. Aurora-B-proteinuttryck bestämdes efter 1 μg ml -1 tetracyklin (Tet +) 24 timmar induktion eller ingen tetracyklin (Tet). Representativ cellcykelanalys efter 1 μg ml −1 tetracyklininduktion (40 h) som visas på botten. Den kvantitativa jämförelsen av procenttal> 4N DNA-innehåll efter 1 μg ml −1 tetracyklin (Tet) 40 timmar eller inget tetracyklin i dessa två cellinjer visas till höger. Hek DN ( b ) och Hek wt ( c ) antingen oinducerades eller inducerades (1 ug ml 1 tetracyklin), behandlades med 2 Gy bestrålning 24 timmar senare och PE bestämdes (vänster paneler). Högerpaneler representerar samma experimentella förhållanden i närvaro av 20 μM pifitrin. Kolonibildning efter tetracyklininduktion av den dominerande negativa Aurora-B-mutanten (tet) eller AZD1152 (AZD) eller AZD1152 kombinerad med tetracyklininduktion (AZD plus tet) i HEK293 DN-cellinjen ( d ) visas. En representativ aspekt av tre oberoende experiment (utförda i tre exemplar) visas, X ± sd

Bild i full storlek

Cellcykelberoende effekt av AZD1152-HQPA-medierad radiosensibilisering

För att bestämma en förmodad cellcykelspecificitet för AZD1152-HQPA-medierad radiosensibilisering, valde vi HT29-celler i antingen G2 / M- eller G1 / S-fasen i cellcykeln och behandlade dem med AZD1152-HQPA och / eller IR. Celler anrikade i G2 / M-fasen radiosensibiliserades väl av AZD1152-HQPA (figur 7b). Denna radiosensibiliserande effekt av AZD1152-HQPA var mindre uttalad när den bedömdes på populationen berikad i G1 / S-fasen, vilket antyder att radiosensibilisering medierad av AZD1152 är cellcykelberoende (figur 7c).

Image

HT29-cellinjer exponerade för kombination av AZD1152-HQPA och bestrålning. ( a ) HT29-celler behandlades med 400 n M AZD1152-HQPA eller dimetylsulfoxid (DMSO) (kontroll; PE AZD / PE DMSO : 23, 2%) under 24 timmar och bestrålades därefter med olika doser. Cellcykelfördelning av HT29-celler utan behandling visas till höger. En representativ aspekt av tre oberoende experiment (utförda i tre exemplar) visas, X ± sd ( b ) G2 – M (PE AZD / PE DMSO 60%) och ( c ) G1 – S (PE AZD / PE DMSO 59%) HT29 celler utvalda av FACS enligt DNA-innehåll exponerades för AZD1152-HQPA 400 n M och bestrålades. En representativ aspekt av två oberoende experiment (utförda i tre exemplar) visas, X ± sd

Bild i full storlek

Frånvaro av radiosensibilisering av AZD1152 i CHK2 och 14-3-3 σ-bristfälliga cellinjer

För att bestämma om andra G2 / M-kontrollpunktsproteiner än Aurora-B kan vara involverade i AZD1152-medierad radiosensibilisering, bedömde vi jämförelsevis svaret av wt, CHK2 - / - och 14-3-3 σ - / - HCT116-celler till IR och / eller AZD1152-HQPA. Påfallande visade vi att knockout av CHK2 eller 14-3-3 helt avskaffade den radiosensibiliserande effekten av AZD1152-HQPA (figur 8).

Image

Analys av G 2- kontrollpunkt som svar på kombinatorisk behandling. ( a ) CHK2 - / - HCT116-celler förbehandlades med 20 n M AZD1152-HQPA eller 1 μM ZM447439 under 24 timmar och bestrålades vid indikerade doser. ( b ) Klonogena överlevnadskurvor för 14-3-3 σ - / - HCT116-celler förbehandlade med 5 n M AZD1152-HQPA eller 1 μM ZM447439 under 24 timmar och bestrålades. En representativ aspekt av tre oberoende experiment (utförda i tre exemplar) visas, X ± sd

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie analyserade vi de potentiella effekterna av AZD1152 för att hämma Aurora-B-kinas i konjugering med IR, i syfte att förbättra strålterapiresultaten hos cancerpatienter.

AZD1152 är en radiosensibiliserare in vitro och in vivo

Flera Aurora-kinasinhibitorer (Keen och Taylor, 2004), inklusive ZM447439 (Ditchfield et al., 2003), Hesperadin och VX-680 och AZD1152, har nyligen beskrivits. Här beskriver vi att AZD1152-HQPA kunde hämma kolonibildning på ett dosberoende sätt i flera humana cancercellinjer. Vi har tidigare rapporterat att IR kan ge upphov till bildandet av mikronukleaerade celler och efterföljande mitotisk katastrof (Zhang et al., 2006), vilket höjer möjligheten att IR kombinerat med hämning av cellcykelkontrollpunkter (som normalt undviker mitotisk katastrof; Castedo et al. ., 2004) skulle vara särskilt effektiva för att inducera tumörcelldöd. Nyligen visade en annan studie (Tao et al., 2005) att aktivering av spindelkontrollpunkten följt av mitotisk glidning initierar apoptos, underlättat av KSP (kinesin-5, ett mitotiskt spindelmotorprotein) hämning. AZD1152-inducerad hämning av Aurora-B kan potentiellt åsidosätta spindelkontrollen och sannolikt underlätta strålningsinducerad celldöd.

P53-beroende effekt av AZD1152 på IR-svar

Vi observerade en större ansamling av celler innehållande> 4 N DNA-innehållsceller i p53 - / - HCT116-cellinjen än i p53- vikt HCT116-cellinjen. Dessa resultat överensstämmer med tidigare resultat i tumör- och normala celler behandlade med ZM447439 och avslöjade den cytoprotektiva verkan av en p53-medierad postmitotisk kontrollpunkt (Ditchfield et al., 2003). Det är troligt att i frånvaro av p53 fortsatte celler att cykla genom avvikande mitoser, vilket slutligen resulterade i celldöd. I överensstämmelse med detta scenario visade klonogena överlevnadsanalyser att AZD1152-behandling ledde till förbättrad celldöd vid IR-behandling i närvaro av icke-funktionell p53. På liknande sätt var omfattningen av in vivo- effekten mer potent med p53 - / - eller p53-mutanta celler. I HT29-celler antyder omfattningen av TGD i djur behandlade med AZD1152 och IR-grupp, jämfört med den måttliga TGD i möss behandlade med AZD1152 enbart en synergistisk interaktion . In vivo- resultat erhållna med HCT116 kolonkarcinom bekräftade att celler med p53-brist (jämfört med tillräckligt med p53-celler) uppvisade en mer uttalad TGD tillhandahållen genom AZD1152-behandling, vilket understryker påverkan av p53 på systemet.

Denna observation antyder att denna Aurora-B-hämmare kan ha en intressant differentiell effekt på normala kontra tumörceller. Tumörceller där p53-systemet ofta inaktiveras är särskilt känsliga för den radiosensibiliserande effekten av AZD1152, kanske på grund av frånvaron av en radioskyddande p53-beroende cellcykelkontrollpunkt som säkerhetskopierar spindelkontrollpunktsystemet för att förhindra spridning av celler som bär onormala genomer (Keen och Taylor, 2004). Följaktligen skulle fel i spindelmonteringscheckpunkten (som en följd av AZD1152-behandling) och G1-gripandet efter onormal mitos (som en följd av p53-defekter) vara särskilt dödliga efter DNA-skador av IR (Zhou och Bartek, 2004).

Genetisk hämning av Aurora-B visar additiva effekter med bestrålning men ger inte ytterligare synergi i celler med p53-brist

I denna studie hade genetisk hämning av Aurora-B med användning av siRNA eller en villkorlig tetracyklininducerbar DN Aurora-B-mutant radiosensibiliserande effekter på flera cellinjer. Emellertid observerades ingen ytterligare synergi av strålning och Aurora-B-hämning i celler som saknade funktionell p53. Vi observerade en skillnad mellan AZD1152-behandling och genetisk hämning av Aurora-B av siRNA eller uttryck av DN-mutanten. Även om AZD1152 och genetisk Aurora-B-hämning hade liknande effekter på cellcykeln (polyploidy) och klonogen överlevnad (i frånvaro av IR), misslyckades genetisk Aurora-B-hämning inte att återkapitulera den förbättrade radiosensibiliseringen som observerades i celler med p53-brist. Vi kunde också visa att AZD1152-medierad ytterligare radiosensibilisering i celler där Aurora-B hämmades av en DN-mutant. Det faktum att AZD1152 förmedlar ytterligare minskning av klonogen överlevnad i celler där Aurora-B hämmas illustrerar också skillnader mellan genetiska och farmakologiska metoder mot Aurora-B. Integriteten för p53-p21 Cip / WAF1- beroende postmitotisk kontrollpunkt styr svaret på hämning av Aurora-kinaser. Det visade sig nyligen att endoreduplicering och apoptos som svar på VX-680 är begränsade i p53 wt- celler och markant förstärkt i celler som saknar p53. Skillnaden i svar på VX-680 bland dessa cellinjer korrelerar med tidpunkten för induktion av p21 Cip / WAF1 och dess förmåga att hämma cyklin E-cdk2-aktivitet (Gizatullin et al., 2006). Vi visar också en ökning av p21 Cip / WAF1- uttryck i AZD1152-exponerade p53 med HCT116-celler jämfört med DMSO-exponerade kontrollceller, medan det finns lite p21 Cip / WAF1- uttryck i p53 - / - HCT116-celler. Dessa antyder samspelet mellan p53, dess nedströms effektor p21 Cip / WAF1 och Aurora-kinaser.

Sammantaget skulle dessa resultat kunna återspegla markanta skillnader i termer av varaktighet och intensitet av Aurora-B-hämning mellan den genetiska och den farmakologiska metoden, men man kan inte utesluta det faktum att AZD1152 utövar en off-target-effekt på andra cellulära mål än Aurora-B .

Cellcykel (G 2 –M) -beroende effekt av AZD1152 på bestrålning

I G2 / M-fasen var celler mer känsliga för den kombinerade behandlingen med AZD1152 plus IR än när de var i G- eller S-faserna i cellcykeln. Tumörer med defekta kontrollpunkter såsom de med mutant p53 tenderade selektivt att ackumuleras i G2 efter DNA-skada. G2 / M-kontrollpunkten förhindrar celler från att initiera mitos när de upprätthåller DNA-skador under G2, eller när de går vidare till G2 med orubbliga skador som har orsakats under de föregående S- eller G1-faserna (Kastan och Bartek, 2004). p53-oberoende G2-cellcykelkontrollpunkter (Kastan och Bartek, 2004) arresterar celler vid G2 / M-gränsen efter DNA-skada av IR eller andra DNA-skadliga medel. Att G2 / M-cellpopulationen uppvisar högre känslighet för IR när den kombineras med AZD1152 har lovande terapeutiska konsekvenser, särskilt om de kombineras med fraktionerad strålterapi, vilket får celler att ackumuleras i G2 / M-gränsen (Pawlik och Keyomarsi, 2004).

Frånvaron av radiosensibilisering av AZD1152 eller ZM447439 i CHK2 - / - eller 14-3-3 σ - / - celler antyder att en normal G2 –M-kontrollpunkt (som beror på närvaron av CHK2 och 14-3-3 σ) är kritisk för den terapeutiska effekten av AZD1152.

Sammanfattningsvis avslöjar denna studie att sekventiell behandling med AZD1152 och IR förbättrar celldöd i HCT116, HT29 och A549 cancer. Denna effekt var mer uttalad i frånvaro av funktionell p53 och i G2 / M-anrikade celler. Prekliniska data erhållna på möss som bär mänskliga cancer xenografts tyder starkt på att den radiosensibiliserande effekten av AZD1152 motiverar ytterligare klinisk undersökning.

Material och metoder

Celllinjer

HCT116 humana kolorektala cancercellinjer (p53 vikt, p53 - / -, CHK2 - / - och 14-3-3 σ - / - ) var en vänlig present från B Vogelstein (Bunz et al., 1998; Chan et al., 1999; Jallepalli et al., 2003). HT29 kolorektal cancercellinje (p53- och Raf-muterad) och A549 humana icke-småcellig lungcancerceller (som bär en intakt p53-väg) erhölls från American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HCT116- och HT29-celler bibehölls i McCoys 5A-medium (Gibco, Worcester, MA, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (ATGC, Cergy Pontoise, Frankrike), 1% PS (Gibco), 1% L-glutamin (Eurobio, Les Ulis, Frankrike), 1 mM natriumpyruvat (Gibco) och 10 m M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES; Sigma, St Louis, MO, USA), i en fuktig atmosfär innehållande 5% CO 2 vid 37 ° C. A549-cellinjen hölls i RPMI 1640-medium (Eurobio) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (ATGC), 1% PS (Gibco), 1% L-glutamin (Eurobio), 1 m M natriumpyruvat (Gibco) och 10 m M HEPES (Sigma). Stabila, isogena cellinjer som uttrycker Aurora-B-transgener (vi genererade stabila cellinjer som uttrycker wt Aurora-B-kinaset, såväl som transgener som har platsmutanter utformade för att hämma katalytisk aktivitet. Vi muterade separat asparaginsyran i det mycket bevarade DFG-motivet, underdomän VII, till asparagin (DN)) under tetracyklinstyrning genererades med användning av det FRT-Flp-baserade systemet som tidigare beskrivits (Girdler et al., 2006). Kortfattat klonades öppna läsramar till en pcDNA5-FRT-TO-vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) modifierad för att innehålla en N-terminal Myc-epitop-tagg. Resulterande vektorer samtransfekterades i Flp-In TRex-HEK293-celler med pOG44, en plasmid som kodar för Flp-rekombinaset. Efter selektion i hygromycin samlades kolonier, expanderades och transgenuttryck inducerades med 0, 25–1 μg ml −1 tetracyklin. Cellodlingsförhållanden utfördes såsom beskrivits (Girdler et al., 2006).

Klonogena överlevnadsanalyser

Celler ympades i triplikat i plattor med sex brunnar eller en 25 cm 2 kolv i ett intervall av 100–80 000 celler per brunn i enlighet med strålningsdosen som levererades till cellerna, experimentella förhållanden och de olika cellinjerna för att ge 20 –200 kolonier per kolv eller väl. När cellerna var fästa levererades en enda dos fotonbestrålning med / utan läkemedel. Celler odlades i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator under 10-14 dagar. Enskilda kolonier (> 50 celler per koloni) fixerades och färgades under 20 minuter med en lösning innehållande kristallviolett och metanol. Pläteringseffektiviteten (PE) motsvarar andelen frönade celler som växer till kolonier under de specifika odlingsförhållandena för en given cellinje. PE AZD är procentandelen frönade celler som växer till kolonier när de utsätts för AZD1152-HQPA för en given cellinje. PE DMSO är procentandelen frönade celler som växer in i kolonier när de utsätts för DMSO (används som kontroll) för en given cellinje. Vi beräknade förhållandet PE AZD / PE DMSO som en uppskattning av procentandelen celldödande i vissa cellinjer orsakade av AZD1152-HQPA enbart med användning av en kolonibildningsmetod. Överlevnadsfraktionen, uttryckt som en funktion av bestrålning, beräknades enligt följande: överlevnadsfraktion = kolonier räknade / (utsäde celler × PE / 100). En röntgenapparat på 200 kV (0, 66 Gy min −1 ) användes för in vivo- experimenten och en Cesium-137-källa (1, 85 Gy min −1 ) användes för in vitro- experiment. IC 50- värdena för de olika cellinjerna har beräknats med mjukvaran GraphPad Prism 5.01 från Windows.

Aurora-B-kinasinhibitorer

AZD1152 (tillhandahålls av AstraZeneca Pharmaceuticals, Macclesfield, UK) är en Aurora-kinasinhibitor med selektivitet för Aurora-B. AZD1152 är en fosfatförläkemedel som omvandlas in vivo till det aktiva medlet AZD1152-HQPA (utspädd i DMSO i en koncentration av 10 mM). AZD1152-HQPA (Ki: Aurora-A 1370 n M, Aurora-B-INCENP 0, 36 n M, Aurora-C-INCENP 17 n M, relativ molekylmassa 507, 57) användes in vitro . Screening av en kinaspanel indikerade att testning i doser upp till 100 gånger högre än de som krävs för att hämma Aurora-B, AZD1152-HQPA inte signifikant hämmar någon av följande 27 kinaser: JAK3, v-ABL, IGFR, ZAP70, P38, CDK1, CDK2, JNK1A, PKA, MEK, MTK, TEK, TRK, EGFR, ErbB2, P70, PLK, PDGFRa, PDGFRb, PI3K, KIS, KDR, FLT1, FLT3, FGFR, C-KIT och B-sRAF. Varaktigheten av cellinkubering med AZD1152 in vitro var 24 timmar, om inte annat anges. ZM447439 (tillhandahålls av AstraZeneca Pharmaceuticals) är en Aurora-kinasinhibitor. I in vitro -kinasanalyser med användning av renade rekombinanta proteiner inhiberade ZM447439 Aurora-A och -B med ICso-värden av respektive 1000 och 50 n M (Girdler et al., 2006).

siRNA

Följande siRNA följdes för analyser: två mänskliga Aurora-B (QIAGEN, Hilden, Tyskland), GGAGGAGGAUCUACUUGAU; AURKB 2 (HP Genomewide siRNA 1027400) och AURKB 5 (HP-validerad siRNA 1027400). Den första siRNA AURKB 2 har framgångsrikt bekräftats i tidigare siRNA-experiment. siRNA-transfektioner genomfördes med Oligofectamine-transfektionsreagens (Invitrogen) och ett icke-specifikt dubbelsträngat RNA (QIAGEN) användes som kontroll. Glödgning av komponenten siRNA-strängar och transfektionsprocedurer utfördes som tidigare beskrivits (Elbashir et al., 2001).

P53-hämmaren

Pifithrin-a (Komarov et al., 1999) användes för p53-hämning i A549-celler. Den slutliga koncentrationen som användes i experimenten var 10–20 μM i medium med serum. Pifitrin-a tillsattes 8 timmar före AZD1152-behandling.

Cellcykelanalys

Skamkontroll och 6 Gy-bestrålade celler med / utan läkemedelseksponering skördades genom trypsinisering vid den angivna tiden efter bestrålning, tvättades med iskall PBS, fixerades i 70% etanol och lagrades vid -20 ° C. Före DNA-analys märktes DNA-innehåll med 0, 1 μg ml -1 propidiumjodid (PI) och 1 mg ml −1 RNAse. Cellcykelanalysen utfördes med flödescytometri (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Rening av utvalda cellcykelpelpopulationer

24 timmar efter inkubation med AZD1152-HQPA trypsiniserades HT29-celler, neutraliserades med medium, centrifugerades och färgades sedan med 10 | ig ml-1 Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, USA) under 30 minuter vid 37 ° C i frånvaro av ljus. Prover tvättades en gång och återuppslammades i medium innehållande 0, 5 μg ml -1 PI. Val av G2 – M- och G1 –S-fasceller utfördes med användning av en FACS Vantage SE (BD Biosciences).

Immuno (cyto) kemi och antikroppar

HCT116-celler ympades i 12-brunnars plattor, inkuberades med 100 n M AZD1152-HQPA under 1 eller 24 timmar och fixerades i 4% paraformaldehyd (Sigma) under 30 minuter. Cellerna permeabiliserades sedan med PBS innehållande 0, 1% Triton X-100 under 3 minuter och inkuberades med 1 mg ml-1 BSA / PBS-blockerande lösning. Celler inkuberades med fosfo-histon-H3 PhH3 (1: 500, katalog nr 06–570; Upstate Cell Signaling Solutions, Danvers, MA, USA) och monoklonal anti-p-tubulin från mus (1: 200, katalognr. ATN01 -A; Cytoskelet, Denver, CO, USA) primära antikroppar, följt av inkubering med get-anti-kaninimmunoglobulin G (IgG) konjugerat till Alexa 555 fluorokrom (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) eller anti-mus IgG Alexa 488 konjugat (1: 500, Molecular Probes) sekundära antikroppar. Den monoklonala anti-BubRl-musen (1: 100, katalognr. B34920; BD Transduction Laboratories) -antikropp hade använts och en human antikinetokore-antikropp (1: 200, erhållen från patienter med calcinosis cutis, Raynaud-fenomen, esophageal motilitetsstörning, sclerodactyly och telangiectasis (CREST) ​​syndrom) tillhandahöll vänligen av JC Brouet, Hopital St Louis, Paris, Frankrike. P21 Cip / WAF1- antikroppen (1: 500; katalognr. 05–345, Upstate) har använts för att detektera p21 Cip / WAF1- uttryck 24 timmar efter 100 n M AZD1152 HQPA i p53 wt och p53 - / - HCT116. Kromosomer färgades med 1 ug ml 1 Hoechst 33324 i PBS under 5 minuter. Tricolor-bilder slogs samman med Adobe Photoshop (v 8.0). En monoklonal antikropp från mus mot Aurora-B-kinas (BD Biosciences) vid en 1: 1000-utspädning användes för immunblotting.

Xenograft in vivo hos nakna möss

Kvinnliga athymiska nakna möss mellan 6 och 8 veckors ålder (Janvier CERT 53940, Le Genest St Isle, Frankrike) användes för tumörens xenograftmodell. Experimenten in vivo genomfördes vid Institut Gustave Roussy under djurvårdslicensen C94-076-11 (Ministere de l'Agriculture). Totalt 3 × 10 6 HT29 eller p53 vikt och p53 - / - HCT116-celler implanterades subkutant i höger flank av varje mus. Behandlingen inleddes när tumören var minst 5 mm i diameter. Möss tilldelades slumpmässigt till fyra grupper: A, kontroll; B, IR ensam, 4 Gy (p53 vikt och p53 - / - HCT116) eller 6 Gy (HT29) två gånger på 2 dagar; C, AZD1152 ensam, 10 mg kg −1 per dag (p53 vikt HCT116) eller 35 mg kg −1 per dag p53 - / - HCT116 och 40 mg kg −1 per dag HT29) under 4 dagar; D, AZD1152 kombinerad med IR (24 timmar efter administrering av AZD1152, liknande schema som IR enbart) under 4 dagar. Läkemedelskontroll eller vehikelkontroll administrerades intraperitonealt. Tumörstorleken mättes två gånger i veckan med en elektronisk bromsok. Uppföljning av individuell mus genomfördes under 30–60 dagar för att erhålla en genomsnittlig tumörvolym på minst 800 mm 3 efter behandlingsstart. Tumörvolymen uppskattades från 2-D tumörmätningar (sex eller åtta möss per grupp) med användning av följande formel: tumörvolym = längd (mm) × bredd 2 ( mm2 ) / 2.