Elongatorprotein 3 (elp3) stabiliserar snigel1 och reglerar migration av neurala vapen i xenopus | vetenskapliga rapporter

Elongatorprotein 3 (elp3) stabiliserar snigel1 och reglerar migration av neurala vapen i xenopus | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Epitel-mesenkymal övergång

Abstrakt

Elongatorprotein 3 (Elp3) är den enzymatiska enheten i elongatorproteinkomplexet, ett histonacetyltransferaskomplex som är involverat i transkriptionell förlängning. Det har länge visat sig spela en viktig roll i cellmigreringen; den underliggande mekanismen är dock okänd. Här visade vi att Elp3 uttrycks i pre-migrerande och migrerande neurala crestceller i Xenopus- embryon, och knockdown av Elp3 hämmade migration av neurala crest-celler. Intressant nog binder Elp3 Snail1 genom sin zink-finger-domän och hämmar dess ubikvitering genom ß-Trcp utan att störa Snail1 / Trcp-interaktionen. Vi visade bevis på att Elp3-medierad stabilisering av Snail1 troligtvis var involverad i aktiveringen av N-cadherin i nervkretsceller för att reglera deras migrationsförmåga. Våra fynd ger en ny mekanism för funktionen av Elp3 i cellmigrering genom stabilisering av Snail1, en masterreglerare för cellmotilitet.

Introduktion

Elongatorprotein 3 (Elp3) är den katalytiska underenheten i Elongator-komplexet som är involverad i transkriptionell förlängning. Elp3 underlättar RNA-polymeras II-transkription genom acetylering av den N-terminala svansen hos histon H3. Elp3 innehåller en C-terminal histonacetyltransferas (HAT) -domän som är väsentlig för Elongators förmåga att acetylera histoner i n vitro 1, 2 . Förutom sin roll i transkriptionell förlängning, är Elp3 involverad i många andra biologiska processer. Exempelvis visades Saccharomyces cerevisiae Elp3 modulera transkriptionell tystnad och modulera DNA-reparation 3 . I Drosophila neuroner krävs Elp3-beroende acetylering av Bruchpilot, en ELKS-familjemedlem, för reglering av strukturen för presynaptiska tätheter och neurotransmitter frisättning effektivitet 4 . I musneuroner har Elp3 visat sig reglera cellrörlighet och motorbaserad handel via acetylering av a-tubulin 5 . Intressant nog rapporterades också Elp3 att vara involverad i regleringen av cellmigration 6, och utarmning av Elp3 leder till den minskade migrationsförmågan hos melanom-härledda celler 7 . Den underliggande mekanismen för Elp3 för att reglera cellmigrering förblir emellertid svårfångad. Elp3 innehåller också en N-terminal radikal S-adenosylmetionin (SAM) bindningsdomän och har rapporterats vara involverad i DNA-demetylering 8 .

Neurala crestceller har varit en klassisk modell för att studera cellmigrering in vivo 9 . Neurala crestceller induceras längs gränsen mellan den neurala och icke-neurala ektodermen genom samspelet mellan flera signalvägar, inklusive BMP (benmorfogenetiskt protein), FGF (fibroblasttillväxtfaktor) och Wnt (protein utan vinglös typ) 10 . Efter induktion och specifikation genomgår neurala crestceller en epitelial till mesenkymal övergång (EMT), delamineras från angränsande vävnader och migrerar genom hela embryot, vilket producerar olika derivat, inklusive craniofacial ben och brosk, pigmentceller, glia och neuroner i perifera neurala systemet, för att nämna några 11 . EMT för neurala vapenceller regleras av en grupp evolutionärt konserverade transkriptionsfaktorer, inklusive Snail1 (Snail), Snail2 (Slug) och Twist1 12, 13, som modulerar cellcelladhesion och cellpolaritet för att möjliggöra för cellerna att delaminera, uppnå EMT och säkerställa korrekt migration.

Zink-finger-transkriptionsrepressorn Snail1 är en nyckelregulator för EMT som undertrycker uttrycket av epitel-specifika vidhäftande proteiner såsom E-cadherin, Muc1, Claudin och Occludin 14 . Snail1 kan dock också fungera som en aktivator för att stimulera mesenkymal gentranskription 15 . Speciellt har CREB-bindande protein (CBP) visat sig acetylera Snail1 och förhindra bildning av repressorkomplex, vilket underlättar transaktiveringsfunktionen hos Snail1 16 .

Snail1 är avgörande för migrering av neurala vapen under embryonal utveckling och har varit inblandad i EMT associerat med tumörprogression 17, 18, 19, 20 . På grund av dess kritiska roll i utveckling och tumörmetastas kontrolleras uttrycket av Snail1 fint på både transkriptions- och proteinnivåer. Snail1-proteinet är labilt med en halveringstid på cirka 25 minuter 21 . Stabiliteten hos Snail1 regleras av flera ubiquitin E3-ligaser, inklusive P-Trcpl, Fbxl14 / Fbxl5 och Mdm2 22 . Snail1-fosforylering i den centrala domänen genom glykogensyntas-kinas-3p (GSK-3p) främjar ß-Trcp-medierat protein-ubiquitination och nedbrytning 21 . Fbxl14 och Fbxl5 är två F-box ubiquitin-ligaser involverade i Snail1-nedbrytning. Under hypoxi är uttrycket av Fbxl14 och Fbxl5 nedreglerat, och Snail1 stabiliseras 22 . Snaill-proteinstabilitet kontrolleras också av inflammatoriska cytokiner genom aktivering av NF-KB, vilket sedan inducerar uttrycket av COP9-signalosom 2 (CSN2) för att förhindra interaktion mellan Snail1 med GSK-3p / ß-Trcp 23 .

Här visar vi att nedslagning av Elp3 hämmar migration av neurala vapenceller i Xenopus- embryon. Elp3 binder Snail1 genom sin zink-finger-domän och hämmar dess ubikvitering med ß-Trcp. Vi visar bevis på att Elp3-medierad stabilisering av Snail1 troligtvis är involverad i aktiveringen av N-cadherin i nervkretsceller för att reglera deras migrationsförmåga.

Resultat

Elp3 krävs för migrering av neurala vapen i Xenopus

Vi undersökte uttrycksmönstret för Elp3 i Xenopus laevis- embryon i olika stadier. RT-PCR-resultat indikerade att xElp3 uttrycks maternellt, och uttrycket upprätthålls genom de stegen som vi undersökte (fig. 1a). Genom hybridisering in situ detekterades xElp3- transkript vid djurpolen i stadium 6.5-embryon (fig. Ib). Därefter uttrycktes xElp3 i neuralplattregionen (fig. 1c) och sedan i det migrerande kraniala neurala crestområdet (fig. 1d). Vid stadierna 20 och 26 detekterades xElp3 i grenbågarna , ögonen och den blivande hjärnregionen (fig. 1e, f).

Image

( a ) RT-PCR-analys av Elp3-expression i olika stadier (St.0 till St.39). ( b - f ). Helmontering in situ hybridisering av xElp3 . Elp3- transkriptet detekteras i djurpolen vid St.6.5 ( b, sidovy, djurpolen till toppen). I St.15 uttrycks Elp3 vid den främre neuralplattan och dess gräns ( c, ryggvy, anterior till botten), och vid den sena neuruleringen är Elp3 vanligast i kranial neural crest ( d, frontal view, dorsal to toppen). Vid tailbud-stadiet uttrycks Elp3 huvudsakligen i grenbågarna (BA) och ögonen ( e, f ).

Bild i full storlek

För att studera den potentiella rollen för Elp3 i Xenopus neural crest-utveckling, använde vi specifik morpholino (MO) för att blockera uttrycket av endogen Elp3. MO blockerade effektivt expressionen av en GFP-reporter-mRNA som innehöll Elp3-målsekvensen (data visas inte). När vi undersöktes med de neurala vapen-specifika markörerna Slug , FoxD3 och Twist1 , fann vi att de neurala vapencellerna inte lyckades migrera bort från det mediala området på den MO-injicerade sidan (Fig. 2a – c, g) Saminjektion av Xenopus Elp3 mRNA återställde migrationsegenskapen hos neurala crestceller i Elp3-morfanterna, vilket bekräftar specificiteten för Elp3 morpholino (Fig. 2d – f, g).

Image

( a - f ) Elp3 MO (25 ng) med eller utan Elp3 mRNA (0, 2 ng) injicerades i en cell av fyra-cellstegsembryon och helmontering in situ hybridisering med sonder för neurala crest-markörer behandlades vid St 0, 19-21. LacZ mRNA injicerades samtidigt för att spåra de injicerade sidorna (färgade röda på de högra sidorna). ( g ) Procentandelar av embryon med minskad migration av neurala vapen som visas i ( a - f ). Resultaten kommer från tre oberoende experiment (felfält representerar SD).

Bild i full storlek

Vi testade migrationsförmågan hos neurala crestceller från Elp3-morfanterna i den cranial neural crest (CNC) explantanalysen. När de odlades in vitro , dissocierades Xenopus CNC-celler och migrerade bort från explantaten på ett fibronektinsubstrat. I själva verket migrerade cellerna från explosioner av vildtyps neurala crest från explantaten till ett betydande avstånd inom en kort period (fig. 3a, b). Däremot förblev cellerna av explanter från Elp3-morfanterna inom explantaten under den undersökta perioden, även om de dissocierades något (fig. 3a, b). När GFP-märkta neurala crestceller transplanterades i ryggregionen hos ett värdembryo, migrerade de ympade cellerna effektivt ut efter föreskrivna banor (fig. 3c). Ympade celler från liknande regioner i Elp3-morfanterna stannade emellertid mest där de transplanterades (Fig. 3c), vilket ytterligare stödde en roll som Elp3 i migration av neurala vapen.

Image

( a ) CNC-explanter dissekerades från tidiga neurulaembryon, pläterades på FN (10 ug / ml) och avbildades vid 0, 5, 12 och 20 timmar. Ytområdena för varje explant vid varje bildpunkt uppmättes, och förhållandena mellan områdena och värdena vid 0 timme visas av linjeplottet ( b ). Uppgifterna representerades som medel ± standardavvikelse (SD). ** P <0, 01; *** P <0, 001, två-tailed T-test. ( c ) GFP-mRNA (100 pg) injicerades i en cell i 4-cellsteget med eller utan Elp3-morfolino (25 ng). Vid St.15–16 dissekerades GFP-märkta CNC-explanter och ympades i normala värdembryon. Status för den fluorescerande neurala vapen avbildades vid svansstoppskedet (St.35).

Bild i full storlek

Vid rumpvävsteg blev huvudbrosken i Elp3-morfanterna ofta mindre och missbildade medan pigmenteringen av embryot var i allmänhet normal (data visas inte). De blygsamma fenotypiska effekterna på vävnad från neurala crestceller tyder på möjligheten att effekten av Elp3-knockdown kan vara kortvarig, vilket försenar snarare än att blockera migration av neurala vapen.

Elp3 stabiliserar Snail1

Snail1 är en nyckelinduktor för EMT och regulator för migration av nervkrön. Den N-terminala SNAG-domänen i Snail1 spelar en viktig reglerande roll och förmedlar protein-proteininteraktion genom att härma strukturen för histon H3-svansen 24 . Eftersom histon H3 också är ett Elp3-underlag, testade vi om Elp3 kunde interagera med Snail1 för att fungera i neuralkammutvecklingen.

Först testade vi om Elp3 interagerar med Snail1. I co-IP-analyser som utförts i däggdjursceller, kunde Elp3 dra ner Snail1 och vice versa (fig. 4a, b). Oväntat är zinkfingerdomänen, inte SNAG-domänen för Snail1, nödvändig för interaktionen (fig. 4c, d). Snail1 är ett instabilt protein eftersom det snabbt polyubikitineras och bryts ned genom den ubiquitin-proteasomala vägen. Intressant nog ökade samuttryck av Elp3 i HEK293-celler eller Xenopus- embryon dramatiskt proteinnivån för Snail1 (fig. 4e, f). Vi använde också en serie cykloheximidbaserade proteinjakter för att testa proteinstabiliteten för Snail1 med eller utan Elp3. Snail1 stabiliserades tydligt i närvaro av Elp3 (fig. 4 g, h). Dessa fynd indikerade att Elp3 kunde interagera med Snail1 och stabilisera det.

Image

( a, b ) Co-IP-analyser som visar interaktionen mellan Snail1 och Elp3. ( c ) Schematisk representation av Snail1-borttagningskonstruktionerna. ( d ) I co-IP-experiment drog Elp3 ner full längd och ∆SNAG Snail1 effektivt, men inte ∆Znf Snail1. ( e ) Samuttryck av Elp3 stabiliserar Snail1 i 293 celler med eller utan MG132-behandling (10 um). Cellerna lyserades 48 timmar efter transfektion och behandlades för Western blot-analys. MG132 tillsattes 6–8 timmar före skörden. ( f ) Samuttryck av mElp3 stabiliserar mSnail1 i Xenopus embryo. De injicerade embryona lyserades i steg 9 och behandlades för Western blot-analys. ( g, h ) Elp3 påverkar stabiliteten hos Snail1. HEK293-celler transfekterades transient med de indikerade plasmiderna. 48 timmar efter transfektion tillsattes cykloheximid (CHX) till alla proverna, och cellerna skördades sedan vid de angivna tidpunkterna (0 timmar, 2 timmar, 4 timmar och 6 timmar). Nivåerna för Snail1 bestämdes genom Western blotting med användning av anti-Myc-antikroppen ( g ). I alla fall användes a-tubulin som en belastningskontroll. De relativa nivåerna av Snail1 kvantifierades densitometriskt och normaliserades mot a-tubulin ( h ). Data visade i ( h ) var genomsnittet av tre oberoende experiment och representerade som medel ± standardfel för medelvärde (SEM). ( i ) Elp3 hämmar ubiquitination av Snail1. HEK293-celler transfekterades transient med användning av de angivna plasmiderna och behandlades under 4-5 timmar med MG132 före skörd. Snaill-proteiner immunutfälldes med användning av Strep-Tactin-pärlor och undersöktes med en anti-ubiquitin-antikropp. ( j ) Co-IP-experiment som visar att Elp3 inte interfererar med Snail1 / β-Trcp-interaktionen. HEK293-celler transfekterades transient med de angivna plasmiderna och behandlades sedan under 6–8 timmar med eller utan MG132 före skörd. Proteinerna immunutfälls med anti-Flag M2-pärlor och detekterades sedan med antikroppen mot olika taggar. WCL, helcelllysat. IB, immunblot. IP, immunutfällning. CHX, cykloheximid.

Bild i full storlek

Därefter testade vi om Elp3 dämpar ubikvitineringen av Snail1. I HEK293-celler var exogent uttryckt Snail1 starkt poly-ubikvitinerad, medan samuttryck av Elp3 tydligt sänkte nivån av ubiquitinerad Snail1 (fig. 4i), även i närvaro av överuttryckt p-Trcp (fig. 4i), en nyckel E3 ubiquitin ligas som förmedlar ubiquitinering och nedbrytning av Snail1. Vi testade sedan om Elp3 inhiberade ß-Trcp-Snail1-interaktionen för att hämma Snail1-ubiquitination. Spännande, fann vi att ß-Trcp binder Snail1 ordentligt i närvaro av Elp3, och de tre proteinerna bildade troligen ett ternärt komplex (Fig. 4j).

Vi testade om överuttryck av Snail1 kunde rädda migrationsförmågan hos neurala crestceller i Elp3-morfanterna. I själva verket återställde saminjektion av mRNA från mus Snail1 ( mSnail1 ) migrationen av neurala crestceller i Elp3-morfanterna, vilket indikeras genom färgning för de neurala crest-markörerna Slug , FoxD3 och Twist1 (Fig. 5a – g). Slug (Snail2) är en annan medlem av Snail-familjens transkriptionsfaktorer som är involverade i induktion och migration av neurala vapen 18, 25, som delar liknande C2H2-zinkfingermotiv med Snail1. Vi testade om Elp3 också interagerar med Slug. Faktum är att mElp3 dras ner effektivt xSlug i ett co-IP-experiment (kompletterande figur S1a), och samuttryck av xSlug räddar också fenotypen av Elp3-morfanter (kompletterande figur S1b, c).

Image

( a - f ) Saminjektion med mSnail1 mRNA (0, 5 ng) räddar migrationen av neurala crestceller i Elp3-morfanterna. ( g ) Procentandelar av embryon med minskad migration av neurala vapen som visas i ( a – f ). Resultaten kommer från tre oberoende experiment (felfält representerar SD). ( h, i ) Knockdown av Elp3 genom morfolino nedreglerar N-cadherin- nivån, medan saminjektion med Elp3 mRNA (0, 2 ng) återställer dess uttryck. ( j ) Procentandelar av embryon med reducerat uttryck av N-cadherin såsom visas i ( h, i ). Resultaten kommer från tre oberoende experiment (felfält representerar SD). ( k ) Uttrycksnivåerna av N-cadherin i embryon injicerade med Elp3-morfolino och Elp3-mRNA vid St 13. Båda cellerna i 2-cellstegsembryon injicerades med Elp3-morfolino (12, 5 ng / cell) ensam tillsammans med räddnings-mRNA ( 0, 1 ng / cell) eller Elp3 mRNA (0, 5 ng / cell) ensam. Totala RNA från hela embryon underkastades RT-PCR-analys för expression av de indikerade generna (cykeltal: ODC, 24; N-cadherin, 32). ( l ) Elp3 krävs för expression av N-cadherin i inducerade djurhattar. Embryonerna injicerades animalt i 2-cellssteg med tBR (0, 2 ng / embryo) och Wnt7b (0, 5 ng / embryo) för att inducera neural crest öde. Elp3-morfolino och / eller mRNA saminjicerades som angivet. Djurkappar dissekerades i steg 9 och skördades när kontrollembryon nådde St 19–21. Totala RNA från djurkapparna utsattes för RT-PCR-analys för expression av de indikerade generna (cykelnummer: histon H4, 24; N-cadherin, 31). ( m - p ) Saminjektion med mN-cadherin mRNA (0, 1 ng) räddar migrationen av neurala crestceller. LacZ mRNA injicerades samtidigt för att spåra de injicerade sidorna (färgade röda på de högra sidorna). ( q ) Procentandelar av embryon med minskad migration av neurala vapen som visas i ( m - p ). Resultaten kommer från tre oberoende experiment (felfält representerar SD).

Bild i full storlek

Snail1 utlöser vanligtvis EMT genom transkriptionell förtryckning av E-cadherin 26 och genom att aktivera mesenkymala gener, inklusive N-cadherin 27 . Intressant nog minskade knockdown av Elp3 N-cadherin- uttryck på de injicerade sidorna, och denna defekt kunde räddas genom att komplettera med xElp3 mRNA (fig. 5h – j). Resultatet bekräftades genom semi-kvantitativ PCR-analys i kontroll och injicerade hela embryon i steg 13 (fig. 5k). I djurkappar injicerade med tBR och Wnt7b för att inducera neural crest öde 28, minskade knockdown av Elp3 också uttrycket av N-cadherin , som återställdes när xElp3 mRNA saminjicerades (fig. 5l). Dessutom var överuttryck av mN-cadherin också tillräckligt för att rädda de migrerande defekterna i Elp3-morfanterna (Fig. 5m – q). Däremot visade uttrycket av E-cadherin ingen tydlig förändring i Elp3-morfanterna (data visas inte). Således föredrar vi modellen som Elp3 binder och stabiliserar Snail1, som krävs för transaktivering av mesenkymala gener.

Diskussion

Elongator-komplexet identifierades ursprungligen i jäst som en transkriptionell förlängningsfaktor som funktionellt samordnade med RNA-polymeras II 29 . Elongator-komplexet omfattar sex enheter, varav Elp3 är den katalytiska enheten som är nödvändig för katalysering av acetyleringsreaktionen. Förutom sin roll i transkriptionell förlängning, är Elp3 också involverad i cellmigration och neurogenes genom acetylering av a-tubulin 5, 30 . Vi visade här att Elp3 uttrycks i det neurala vapenområdet och krävs för migration av neurala vapen i Xenopus- embryon. Elp3 interagerar med och stabiliserar Snail1 genom hämning av dess ubikvitering med ß-Trcp. I motsats till CSN2, som stabiliserar Snail1 genom att reducera sambandet mellan Snail1 och P-Trcp 23, fungerar Elp3 emellertid inte bara genom att blockera p-Trcp-Snail1-interaktionen eftersom de tre proteinerna hittades i ett komplex. Det är fortfarande möjligt att Elp3 stör den korrekta rumsliga positioneringen eller konformationen av Trcp och Snail1 som krävs för ubiquitineringsreaktionen.

Snail1 utlöser vanligtvis EMT genom transkriptionell förtryck. E-cadherin är en karakteristisk markör som förtrycks av Snail1 under inledningen av EMT 26 . Snail1 represserar E-cadherin transkription genom att rekrytera co-repressors till promotorn och inducerar transkriptionell tystnad 24, 31, 32, 33 . I Xenopus krävs Snail1 för både specifikation och migrering av neurala crestceller och har föreslagits att fungera primärt som en repressor vid induktion av neural crest 18, 19 . Emellertid har en ökande mängd bevis visat att Snail1 också kan fungera som en transkriptionsaktivator under EMT för att stimulera mesenkymala gener, inklusive N-cadherin 27 . I cancerceller minskar Snail1-knockdown medan dess inducerade uttryck ökar N-cadherin-uttrycket 23, 24, 27, 34, 35 . Hur exakt Snail1 är involverad i N-cadherinreglering förblir emellertid okänd. I neurala crestceller medierar N-cadherin cellinteraktioner under migration och krävs för kontakthämning av rörelse som är nödvändig för den kollektiva kemotaxisen hos neurala crestceller 36 . I Elp3-morfanterna minskades uttrycket av N-cadherin signifikant, en defekt som kan räddas genom överuttryck av xElp3 (fig. 5h – k). Dessutom är överuttrycket av mN-cadherin tillräckligt för att rädda migrationsdefekten hos neurala crestceller i Elp3-morfanterna (Fig. 5m – q). Våra data gynnar en transaktiveringsfunktion hos Snail1 för att stimulera N-cadherinuttryck i neurala vapenvandring. Intressant nog har acetyleringen av Snail1 genom CBP visat sig göra Snail1 till en aktivator genom att förhindra bildning av repressorkomplex 16 . Huruvida Elp3 fungerar genom acetylering av Snail1 återstår att testa.

metoder

Etikförklaring

Vård av Xenopus laevis (Nasco), in vitro- befruktningsförfarande och manipulation av embryon utfördes i enlighet med standardprotokoll. Alla djurprotokoll godkändes av Etming Committee of Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences (tillståndsnummer: SYDW-2006–006).

Embryonmikroinjektion och helmontering in situ hybridisering

Befruktning in vitro , embryokultur, hybridisering in situ helt, montering av mRNA och mikroinjektion utfördes såsom beskrivits tidigare 37 . Sekvensen för antisense morpholino oligo (MO) för xElp3 är 5'-TTCATGTTGCCCGATGTTCCGCTAG-3 ', som riktar sig till den 5' otranslaterade regionen plus 5 baser i den kodande regionen och erhölls från Gene Tools. MO och mRNA injicerades i dorsalregionen av 2- till 4-celliga embryon. MO injicerades vid 25 ng / blastomere och 0, 2 ng / blastomere xElp3 mRNA injicerades i räddningsförsök. För hybridisering in situ användes sonderna för Slug , FoxD3 och Twist1 såsom beskrivits tidigare 37 .

Plasmidkonstruktion

Xenopus laevis i full längd och mus- Elp3- kodningsregionen erhölls genom PCR enligt sekvenser i NCBI (anslutning NM_001095505 och NM_001253812.1) och klonades sedan i pCS2 + och pCS2 + -C-Flag / pCS2 + -N-Myc-vektorer respektive. Hel-längd och trunkerade mus Snaill- konstruktioner erhölls genom PCR enligt sekvenser i NCBI (accession NM_011427) och klonades in i en pCS2 + -N-Myc-vektor. Snail1 subklonades också in i pCS2 + -C-Flag och pCS2 + -C-Strep-Flag vektorer för co-IP-analyser respektive in vivo ubiquitineringsanalyser. Mus- N-cadherin- expressionsvektorn var en gåva från Dr. Cécile Gauthier-Rouvière (CNRS, Frankrike), och uttrycksvektorn Trcp-Flag är en gåva från Dr. Wei Wu (Tsinghua University, Kina).

Omvänd transkription och polymeraskedjereaktion (RT-PCR)

För att analysera det temporala uttrycket av xElp3 under utvecklingen utfördes RT-PCR med användning av hela embryon i olika utvecklingsstadier. De använda primrarna var som följer: xElp3: 5'- TACCTGAGGATTACAGAGAC-3 'och 5'- CTCTCTCCAGTCCCATGTT-3'. Uttrycksnivåerna av N-cadherin i hela embryon eller djurkappar övervakades också genom RT-PCR för att avslöja effekten av Elp3 med användning av primrar som publicerats 38 . H4 eller ODC användes som en lastkontroll 38, 39 .

In vitro- migrationsanalys med kranial neural crest (CNC) och CNC-transplantation

In vitro- CNC-migrationsanalysen och CNC-transplantationsförsöken utfördes såsom beskrivits tidigare 40, 41 . CNC-explanter dissekerades från stadium 15–16 embryon och pläterades på fibronektin (10 μg / ml i PBS) -belagda plattor med 96 brunnar i Danilchik media (53 mM NaCl, 11, 7 mM Na2C03, 4, 25 mM kaliumglukonat, 2 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 17, 5 mM Bicine, 1 mg / ml BSA; pH 8, 3), och bilder fångades var 4–5 timmar under upp till 20 timmar med användning av ett inverterat mikroskop av Olympus IX83. De relativa ytområdena för explantaten mättes med ImageJ.

För ympningsexperiment dissekerades de neurala crestexplanterna från kran från GFP-märkta donatorembryon och insattes isotopiskt och isokroniskt i omärkta värdembryon från vilka den neurala crestvävnaden avlägsnades. De ympade embryona fick läka i 1 x MBS-medium (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2, 5 mM NaHC03, 0, 3 mM CaN03, 0, 41 mM CaCl2, 0, 82 mM MgS04, 15 mM HEPES (pH 7, 6) med antibiotika ) i 30 minuter-3 timmar vid rumstemperatur och överfördes sedan till 0, 1 x MBS innan de avbildades vid det sena halstångssteget 42 .

Coimmunoprecipitation (co-IP) -analys och immunblotting

För Snail1 / Elp3 och Snail1 / Elp3 / Trcp co-IP transfekterades HEK293-celler till plattor med 6 brunnar med de angivna plasmiderna. 48 timmar efter transfektion (behandling under 6–8 timmar med eller utan MG132 före skörd) lyserades cellerna i 700 ul lysbuffert (50 mM Tris-HCl vid pH 7, 4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA vid pH 8, 0 och 1% Triton X-100) innehållande en proteasinhibitorblandning (Roche) under 30 minuter på is. Efter centrifugering vid 14000 rpm under 15 minuter vid 4 ° C inkuberades supernatanten med Flag-M2-pärlor (Sigma) vid 4 ° C i 4 timmar och tvättades sedan tre gånger med lysbufferten vid 4 ° C under 5 minuter. De bundna proteinerna eluerades med SDS-laddningsbuffert vid 95 ° C under 10 minuter och utsattes sedan för SDS-PAGE och Western blot-analys. Antikropparna som användes var följande: anti-Flag (M2; Sigma), anti-Myc (Sigma) och anti-Elp3 (Sigma). Pepparrotsperoxidas-konjugerad anti-mus eller -rabbit IgG (Pierce) användes som den sekundära antikroppen.

In vivo ubikvitationsanalyser

Ubiquitineringsanalyser in vivo utfördes såsom beskrivits tidigare 43 . HEK293-celler transfekterades med HA-ubiquitin-konstruktionen tillsammans med de angivna plasmiderna. Därefter tillsattes 10 mikrometer av den proteasomala hämmaren MG132 4–5 timmar före skörden. Fyrtioåtta timmar efter transfektion skördades cellerna och lyserades i SDS-lysbuffert (50 mM Tris-HCl vid pH 6, 8, 1, 5% SDS) vid 95 ° C under 15 minuter. Efter en tiofaldig utspädning av lysatet med EBC / BSA-buffert (50 mM Tris-HCl vid pH 6, 8, 180 mM NaCl, 0, 5% NP-40 och 0, 5% BSA) plus proteasinhibitorer (Roche) immuncellutfälldes med Strep-Tactin-pärlor (iBA). De bundna proteinerna eluerades med användning av Laemmli-provbuffert vid 95 ° C under 5 minuter. Western blot-analys utfördes med användning av en anti-ubiquitin-antikropp (Santa Cruz Biotechnology). Membranet avdrevs sedan och återupprepades med de andra indikerade antikropparna.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Yang, X. et al. Elongator Protein 3 (Elp3) stabiliserar Snail1 och reglerar migration av neurala vapen i Xenopus . Sci. Rep. 6, 26238; doi: 10.1038 / srep26238 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.