Effekter av provbehandlingar på genomåtervinning via encelliga genomik | isme journal

Effekter av provbehandlingar på genomåtervinning via encelliga genomik | isme journal

Anonim

ämnen

  • Bakteriell genomik
  • metagenomik

Abstrakt

Encellens genomik är ett kraftfullt verktyg för att få tillgång till genetisk information från okultiverade mikroorganismer. Metoder för att hantera prover före encellig genomisk amplifiering kan påverka kvaliteten på de erhållna genomerna. Med användning av tre bakteriestammar visar vi att jämfört med kryokonservering återvinns encellsgenom av lägre kvalitet när provet bevaras i etanol eller om provet genomgår fluorescens in situ hybridisering, medan provkonservering i paraformaldehyd gör det helt olämpligt för sekvensering.

Huvudsaklig

Relativt lite är känt om hur komplexa mikrobiella samhällen fungerar, till stor del på grund av svårigheten att odla de flesta mikrober (Rappe och Giovannoni, 2003). Även om metagenomik kan ge information om hela samhällets genetiska förmåga, är det svårt att koppla förutsagda genfunktioner till specifika organismer med metagenomik (Morales och Holben, 2011). En metod för att hantera dessa utmaningar är encellsgenomik, där en enstaka mikrobiell cell isoleras från ett prov, lyseras och dess genom förstärks genom multipla förflyttningsamplifiering (MDA; Lasken, 2012; Blainey, 2013).

När man arbetar med miljö- eller kliniska prover är det vanligtvis opraktiskt att arbeta med färska prover. De flesta prover måste bevaras på något sätt innan de studeras genom encellig genomik. En möjlig svårighet är att konserveringsmetoder kan orsaka skada på DNA: et som skulle påverka genomgenomvinning negativt. Effekten av behandlingar på cellerna är särskilt viktig inom encellsgenomik eftersom det redan är fastställt att processen producerar ofullständiga genom även med färska celler (Marcy et al., 2007). Den genomsnittliga uppskattade genomfyllbarheten av 650 enkelcellsgenom som är offentligt tillgängliga i IMG (//img.jgi.doe.gov) är 41%, baserat på närvaron av konserverade enkelkopieringsgener med metoden i Rinke et al. (2013).

Syftet med denna studie var att testa effekterna av vanliga provbehandlingar på utvinning av genom från enstaka celler. Tre metoder för provkonservering testades: kryokonservering med 20% glycerol som kryoprotektant, konservering i 70% etanol och konservering i 4% paraformaldehyd. Eftersom paraformaldehydbehandling orsakar tvärbindningar mellan nukleinsyror och proteiner testade vi celler exponerade för 4% paraformaldehyd med och utan att deras tvärbindningar vändes genom värmebehandling. Dessutom finns det efterfrågan på att erhålla encellsgenom från särskilda taxa inom en mikrobiell gemenskap. En vanlig metod för denna typ av isolering använder fluorescens in situ hybridisering (FISH) för att identifiera målcellerna (Podar et al., 2007; Haroon et al., 2013). Således inkluderades celler som hade genomgått ett typiskt FISH-protokoll utan föregående fixering (Yilmaz et al., 2010) som en ytterligare behandling för att separera FISH-protokollet från fixeringsstegen.

För att bestämma om GC-innehållet i ett genom skulle påverka resultaten valdes tre bakteriestammar med olika genomiska G + C-innehåll: Pedobacter heparinus DSM 2366, 42% GC; Escherichia coli K12-MG1655, 51% GC; och Meiothermus ruber DSM 1279, 63% GC. Dessa har kompletta genomsekvenser tillgängliga och har samma cellstruktur (Gram negativ) för att kontrollera för stora skillnader i lyseffektivitet. Fyrtio celler av var och en av de tre stammarna genomgick var och en av de fem behandlingarna som beskrivs ovan (figur 1).

Schematisk för experimentellt arbetsflöde. För tydlighets skull är behandlingen färgkodade i hela figuren och är: blå, kryo - kryokonservering; grön, FISH - FISH-behandling; gul, EtOH - etanolfixering; orange, PFA xlänkar - paraformaldehydfixering med tvärbindningar omvänd; röd, PFA - paraformaldehydfixering med tvärbindningar intakt; brun, Pos-positiva kontroller (brunnar var och en med 100 kryokonserverade celler); lila, Neg - inga cellnegativa kontroller. Layouten som användes för enstaka cellisoleringar i en 384-brunnsplatta visas. Varje stam / behandlingskombination sorterades separat på en platta per stam. MDA-steget i denna figur plottar Cp-värdena (inflektionspunkten) för realtid MDA-amplifieringskurvor för alla tre bakteriearter kombinerade. MDA-reaktionen körs under 16 timmar, så alla brunnar som inte visar någon förstärkning vid den tiden indikeras som 16+ på diagrammet. Varje kolumn i diagrammet sammanfattar data från 120 separata MDA-reaktioner, med undantag för den negativa kontrollen, som innefattar 60 reaktioner. 16S rRNA-gencreening indikerar procentandelen av brunnarna för varje behandling som producerade en 16S rRNA-gensekvens från referensorganism.

Bild i full storlek

Alla celler genomgick en alkalisk lys och MDA (Woyke et al., 2011). Tiden vid vilken inflexionspunkten för realtidsförstärkningskurvorna inträffar (korsningspunkt; Cp-värde) korrelerar med fullständigheten av de återhämtade encellsgenomen (kompletterande figur S1). CP-beställningen rankades enligt följande: kryokonservering

För att eliminera eventuella förspänningar på grund av varierande sekvenseringsdjup, delades sekvenserna slumpmässigt till ett täckningsdjup på 315 × för varje enstaka amplifierade genom (SAG; Kompletterande figur S2). Avläsningarna mappades till referensgenomen, en de novo- enhet utfördes och de sammansatta data mappades också till referensgenomen.

Cryopreservation resulterade i SAG med den högsta procentandelen av genomet som utvunnits för alla tre bakteriestammar (figur 2; Kompletterande figur S3). FISK-behandling gav minskad genomstäckning och etanol-konservering resulterade i den lägsta mängden av genomet som utvunnits. Dessa behandlingar skiljer sig väsentligt från varandra (figur 2; Kompletterande figur S3). Trots trenden för celler med högre GC-innehåll att ha högre MDA Cp-värden finns det ingen tydlig effekt av GC-innehåll på mängden genom som återvinns genom de olika behandlingarna (kompletterande figurer S1 och S3).

( a ) Täckningsområden för varje kombination av organismer / behandling. Cryo - kryokonservering, EtOH - etanolkonservering, FISH - FISH-behandling. De horisontella svarta linjerna i mitten av varje plot representerar de fullständiga referensgenomen och de vertikala färgade linjerna indikerar vilka delar av genomet som återfanns i enheterna. Rödare färger indikerar att fler enstaka celler innehöll den regionen i sin montering. ( b ) Procent av genomerna som utvunnits för varje behandling med de enskilda cellerna från alla tre organismerna i genomsnitt i genomsnitt och felstängerna indikerar en standardavvikelse. Ljusgrå staplar indikerar genomåterhämtningen genom att kartlägga läsarna till referensgenomen. Ett baspar ansågs återhämtas om minst 10 läsningar kartlades för att täcka det. Mörkgrå staplar är genomgenomhämtningen genom att kartlägga contigs producerade av de novo- montering till referensgenomen. Behandlingarna skiljer sig väsentligt från varandra (ANOVA; P <0, 0001).

Bild i full storlek

Bristen på amplikoner från celler behandlade med paraformaldehyd beror sannolikt på att tvärbindningarna förhindrar phi29-polymeraset från att komma åt DNA. Värmebehandlingen för att vända tvärbindningarna var antingen otillräcklig för att vända dem eller resulterade i DNA-strängbrott och depurination som skadade DNA tillräckligt för att det inte kunde förstärkas.

FISH-processen är avsedd att förbättra tillgången till oligosonden till dess RNA- eller DNA-målställe i cellerna. Eftersom detta kan leda till större tillgång av phi29-polymeraset till DNA: t, kan man förvänta sig att MDA från denna behandling skulle vara den mest effektiva. Det faktum att MDA-kinetiken försenades och att genomgenomhämtningen minskades jämfört med de kryokonserverade proverna indikerar att andra faktorer måste vara involverade. Eftersom tvättstegen borde ta bort komponenterna i FISH-buffertarna före MDA påverkar de inte direkt MDA-processen. Således är den minskade genomåtervinningen troligen härledd från skada på DNA under FISH-behandlingen. Eftersom FISH-processen kan denaturera hög-AT-regioner av DNA vid de använda temperaturerna, kan det ensträngade DNA som resulterar vara mer mottagligt för skador (Blake och Delcourt, 1996). Denna tolkning stöds av genomgenomvinning i den låga GC-organismen P. heparinus som är lägre än i de andra två organismerna (kompletterande figur S3). Dessutom har det visats att formamid kan bryta ner purinkärnosider (Saladino et al., 1996). Små skador kan förklara minskningen av genomet som återhämtats av MDA.

Den signifikanta minskningen i genomåtervinning från etanolbevarade celler är utmanande att förklara. Det är osannolikt att etanol skulle kunna överföra och hämma MDA-reaktionen eftersom cellerna tvättades två gånger före sortering och själva sorteringsprocessen resulterar i betydande utspädning av provet (Rodrigue et al., 2009). Eftersom det inte finns någon känd mekanism för etanol för att skada DNA, måste den väsentliga reduktionen i mängden av utvunnen genom bero på att polymeraset har begränsat åtkomst till DNA. Etanol får proteiner att denaturera och fällas ut (Yoshikawa et al., 2012). Dessa kan aggregeras runt DNA och förhindra åtkomst av polymeraset.

Även om encellsgenomik har stor potential att ge insikt i det stora antalet mikrober som inte har odlats, kan provhantering i hög grad påverka fullständigheten av encellsgenom. Våra resultat antyder att prover som har arkiverats genom konservering i paraformaldehyd kommer att vara olämpliga för produktion av encellsgenom och att etanolbevarade prover sannolikt kommer att producera encellsgenom med reducerad kvalitet. Därför rekommenderar vi användning av kryokonserverade prover för bästa resultat och fixeringsfria FISH (Yilmaz et al., 2010; Haroon et al., 2013) om målinriktad flödesortering ska användas.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur

  2. 2.

    Kompletterande figur

  3. 3.

    Kompletterande figur

    Författarens bidrag

    SC, PH och TW utformade studien och utformade experimenten. SC utförde experimenten. SC och PS analyserade data. SC, PS, PH och TW skrev manuskriptet.

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på ISME Journal: s webbplats (//www.nature.com/ismej)