Effekt av glykogensyntas-kinas-3-inaktivering på mjölkkörtlarnas utveckling och onkogenes | onkogen

Effekt av glykogensyntas-kinas-3-inaktivering på mjölkkörtlarnas utveckling och onkogenes | onkogen

Anonim

ämnen

  • Bröstcancer

Abstrakt

Många komponenter i signalvägen Wnt / ß-catenin har kritiska funktioner vid utveckling av bröstkörtlar och tumörbildning, men ändå är bidraget från glykogensyntas-kinas-3 (GSK-3a och GSK-3β) till mammopoiesis och onkogenes oklart. Här rapporterar vi att WAP-Cre-medierad borttagning av GSK-3 i bröstepitelet resulterar i aktivering av Wnt / ß-catenin-signalering och inducerar intraepitelial neoplasi från bröstet som fortskrider till skvam transdifferentiering och utveckling av adenosquamous carcinomas vid 6 månader. För att upptäcka möjliga ß-kateninoberoende aktiviteter av GSK-3 genererade vi mammaspecifika knockouts av GSK-3 och ß-catenin. Squamous transdifferentiering av bröstepitelet dämpades till stor del, emellertid förlorade mammalepitelceller förmågan att bilda mammosfärer vilket tyder på störning av stamcellegenskaper som inte är relaterade till förlust av p-catenin enbart. Efter 10 månader visade adenokarcinom som utvecklades i körtlar som saknade GSK-3 och ß-katenin förhöjda nivåer av y-catenin / plakoglobin samt aktivering av igelkott- och notchvägarna. Sammantaget etablerar dessa resultat de två isoformerna av GSK-3 som väsentliga integratorer av flera utvecklingssignaler som verkar för att upprätthålla normal bröstkörtelfunktion och undertrycka tumörgenes.

Introduktion

Epiteliala maligniteter, inklusive de i bröstet, tros initieras i stamliknande celler som definieras av deras förmåga att självförnya och kvarstå tillräckligt länge för att upprätthålla och sprida mutationer, samt generera alla funktionella celltyper inom en given vävnad. Dessa "tumörinitierande celler" (TIC) kan uppstå från normala vuxna stamceller som en följd av förändringar i regleringen av balans mellan självförnyelse och differentiering eller från mer engagerade förfäder som har återupptagit stamcellsegenskaper under transformation. 1, 2 Bidraget från distinkta stam / stamfårceller till bröstcancer heterogenitet förblir otydligt Med identifiering av kandidatstammar och stamfamiljpopulationer som varierar i deras differentieringskapacitet belyses karaktären av TIC-befolkningen och påverkan av onkogener i denna kritiska cellpool. 1, 3 Flera bevislinjer har visat utvecklingsvägar inklusive Wnt, Hedgehog (Hh) och Notch reglerar stamcellshomeostas och har kapacitet att inducera cancer i olika vävnader när de regleras upp. Proteinserinkinaserna glykogensyntaskinas (GSK) -3a och p är delade komponenter i dessa nätverk och verkar för att reglera signaler som kommer från receptorer vid morfogen- eller ligandligering. Hämning av GSK-3 är avgörande för kanonisk Wnt-signalering vilket leder till ökade ß-kateninnivåer associerade med förhöjd proliferation och undertryckande av differentiering i ett antal vävnader. 4, 5, 6, 7 GSK-3 har visat sig interagera med Hh-vägkomponenter på flera nivåer för att hämma transkriptionella funktioner av Gli-proteiner. 8, 9, 10, 11 Flera cellinjestudier har visat att GSK-3-hämning också modulerar Notch-signalering, åtminstone delvis genom att fosforylera Notch-intracellulära domänen (NICD), och därmed förhindra kärnkraftsinträde och effektiv associering med dess målgenpromotorer. 12, 13, 14

Patologisk hyperaktivering av var och en av dessa vägar är ett kännetecken för många tumörer, inklusive bröstcancer. Även om mutationer i ß-katenin och andra vägkomponenter, såsom adenomatous polyposis coli, är några av de vanligaste signalavvikelserna som bidrar till mänsklig tumörpatogenes, är de mycket mindre frekventa i bröstcancer. Trots sällsyntheten hos mutationer har ökade cytoplasmatiska och nukleära ß-cateninnivåer dokumenterats i ~ 40% av primära bröstcancer inklusive metaplastiska bröstkarcinom, en sällsynt men aggressiv delmängd av bröstcancer som delar egenskaper hos både basalliknande och trippelnegativa bröstcancer. 15, 16, 17, 18, 19, 20 Mekanismen genom vilken Wnt / P-catenin-signalering aktiveras i dessa tumörer är okänd men kan involvera överskott av Wnt-ligandproduktion och avvikande receptoraktivering. 21, 22, 23 Wnt / ß-catenin fungerar som en stamcellöverlevnadsfaktor i kontinuerligt självförnyande system inklusive däggdjursvävnader. 24, 25 Icke-neoplastiska körtlar av MMTV-Wnt1 och de från ß-kateninmutanta möss där transgenen saknar den N-terminala regionen som innehåller GSK-3-regulatoriska platser uppvisar en expanderad stamcellsfraktion och begränsad eller försämrad kapacitet för funktionell differentiering till förmån av ett mindre engagerat celltillstånd. 26, 27 Dessutom har Wnt / ß-katenin-responsiva celler nyligen visats vara långlivade stamceller som utgör en stor andel av basfacket som kan överleva flera omgångar med lobuloalveolär vävnadsomsättning. 28 Denna pool av sårbara celler kan utgöra en utsatt population för onkogen mutation som leder till generering av TIC. Faktum är att stabilisering av en p-katenintransgen uttryckt från dess endogena promotor eller via adenomatös polypos coli-mutationer eller brist leder till hyperplasier hos mammär, åtföljd av förlust av alveolära strukturer, 29, 30, 31, 32 medan överuttryck av N-terminalt trunkerade p- katenin resulterar inte bara i äldre alveolär differentiering utan också i bildning av adenokarcinom i däggdjur. 33, 34, 35 Dessutom resulterar överuttryck av den positiva Wnt / ß-kateninregulatorn, kaseinkinas 2, liksom en förmodad Wnt / ß-kateninmålgen, cyklin D1, i bröstepitelet i hyperplasi, skvam differentiering och adenokarcinom. 36, 37

Höga nivåer av Notch-1 visade sig vara förknippade med ett sämre resultat hos patienter med bröstcancer medan omarrangemang av Notch-1 och 2 hittades i trippelnegativa bröstcancer där fusionsutskrifterna behöll exoner som kodar NICD och därmed upprätthåller transkriptionsutgångar. 38, 39, 40 Ökat antal bröststam- / stamceller har rapporterats vid förbättrad Notch-signalering. 41, 42, 43 Denna expansion av omogna celler var förutsägbar för tumörbildning vilket antydde NICD1-uttryck i bröstepitelet genererar en population av instabila, pre-maligna förfäderceller. 43 Notch-aktivitet har också visat sig resultera i luminal stamförexpansion som leder till hyperplasi och tumörgenes. 41, 44, 45 Nyligen identifierades två Notch-2 förfäderpopulationer i det luminala facket som representerar unika mammary-linjer. 46 Således kan dysreglering av Notch-aktivitet förstärka en distinkt stam- / stamfamiljepopulation inom mjölkvävnaderna, vilket kan bidra till TIC-bildning.

Hh-ligandöveruttryck är associerat med den basalliknande bröstcancertypen och dåligt resultat i termer av metastas och bröstcancerrelaterad död medan uttryck av Hh-receptor Ptch1 och transkriptionsaktivator Gli1 har detekterats i invasiva karcinom men inte i normalt bröstepitel. 47, 48, 49, 50, 51 Hh kan öka spridningskapaciteten och förbättra självförnyelse av mammala förfäder snarare än att förstärka den multipotenta stamcellspoolen och därmed störa stamcellen mot stamfädercellbalansen. 52, 53, 54, 55 I överensstämmelse inducerar Gli1-överuttryck inom bröstepitelet brösttumörer med ökade nivåer av Bmi-1, en transkriptionell repressor från polycomb-genfamiljen tidigare implicerad i stamcellsunderhåll. 56, 57

För att bedöma den funktionella konsekvensen av GSK-3-förlust från bröstepitelet och för att undersöka potentiella ß-kateninoberoende roller hos dessa proteinkinaser raderades båda GSK-3-generna specifikt i bröstvävnader i närvaro eller frånvaro av en funktionell p- kateningen. Körtlar av GSK-3-mutanta djur antog epidermal identitet via cell-autonoma mekanismer som ledde till adenosquamous carcinombildning. Även om mammal-selektiv inaktivering av p-catenin initialt subverterade epidermoid transdifferentiering av GSK-3-nollvävnad, bidrog felreglering av Hh och Notch-vägar till utvecklingen av adenokarcinom i frånvaro av GSK-3 och p-catenin. Således upprätthåller GSK-3 genom att begränsa flera vägar mammär epitelcell (MEC) -funktion och hämmar tumörbildning.

Resultat

Generering av möss som inrymmer selektiv deletion av bröstkörtlar av GSK-3a och GSK-3P

För att undersöka funktionerna hos GSK-3s i bröstkörteln genererade vi GSK-3α - / - ; GSK-3p Exon2 LoxP / Exon2 LoxP, benämnd GSK-3a - / - ; GSK-3p FL / FL- möss med selektiv deletion av bröstkörtlar av de floxerade GSK-3P-allelerna uppnådda med Cre-medierad rekombination driven av vassle-surt protein (WAP) -promotor vilket gav WAP-GSK-3 dubbla knockout-djur (WAP-DKO ). Expression av WAP-Cre-transgenen kan detekteras under estrusstadiet i den murina estruscykeln (följaktligen från ~ 4 veckors ålder) och WAP-promotorn ökas väsentligt under varje graviditet när WAP-uttryck observeras i både duktal och alveolär epitel. celler, speciellt från 15 dagar efter coitum (dpc 15). 58, 59, 60

Genomisk PCR för gravida WAP-DKO-körtlar bekräftade frånvaro av GSK-3a och förlust av GSK-3p (figur 1a). Cre-uttryck hittades i en stor andel WAP-DKO-celler som bedömdes genom immunohistokemi (IHC) (figur 2). Immunoblotting av gravid WAP-DKO-helkörtellysat demonstrerade excision av GSK-3p FL / FL- allelen (figur Ib). Orecombinerad GSK-3p närvarande i det icke-epiteliala, stromala facket (t.ex. fett, extracellulär matris, immunceller) i bröstvävnader som inte är riktade av WAP-Cre står sannolikt för det observerade återstående GSK-3p-proteinet.

Förlust av GSK-3 i bröstepitelet resulterar i MIN och skiveposdifferentiering. ( a ) Mid-gravida körtlar isolerades från antingen GSK-3a - / - ; GSK-3ß FL / FL (kontroll, c ) eller WAP-Cre; GSK-3a - / - ; GSK-3p FL / FL (WAP-DKO) -möss och PCR-analyserades med användning av primrar specifika för detektering av floxade (850 bp) och raderade (250 bp) alleler av GSK-3p, Cre (750 bp) eller GSK-3a (250 bp) som bekräftar GSK-3a-noll-status och excision vid GSK-3p-lokuset. ( b ) Representativt immunoblot av WAP-DKO-helkörtel-lysat som testats med indikerade antikroppar som indikerar utarmning av GSK-3p-protein i två Cre-positiva djur. GAPDH användes som en lastkontroll. ( c ) Hematoxylin- och eosinfärgning av körtlar avlägsnade från kontroll, WAP-DKO ( n = 14) eller WAP-ß-catenin Active ( n = 6) -möss som indikerats. Graden av transdifferentiering varierade mellan körtlar; visas är representativa bilder. * Betecknar spökceller; ett område av MIN är betecknat med ** i mittpanelen. ( d ) Utväxt från bröstkörtlar producerad genom injektion av dissocierad kontroll (Ad-GFP), GSK-3-ablaterad eller P-catenin-stabiliserad (Ad-Cre-GFP) MEC i en rensad fettkudde. Skivefoci observerades i 2/3 DKO och 3/3 ß-katenin Active MEC-transplanterade körtlar, vilket indikerar att dessa effekter är cell-autonoma och inneboende för bröstepitel.

Bild i full storlek

Jämförelse av bröstkörtlar från WAP-DKO och WAP-p-catenin Aktiva mittengravida djur. Representativa immunfärgade sektioner av körtlar avlägsnade från primiparösa djur av indikerade genotyper vid dpc 15. Vävnader undersöktes med antikroppar för att identifiera celler som bär mammalinjemarkörer (luminal K8 / 18, myoepitel K14), keratin 6 (K6, se text) och för att bedöma proliferation (BrdU, Ki67) och nivåer av p-catenin, EGFR och Cre. Liknande färgningsmönster över denna markörpanel observerades i både WAP-DKO och WAP-p-katenin Aktiva gravida körtlar med stark kärn- och cytoplasmatisk ß-katenin (insatser) och hög proliferation samt närvaro av både luminala och myoepitelceller som också starkt uttryck EGFR. Cre uttryck varierade över körtlar och representativa bilder visas. Totalt antal analyserade körtlar: WAP-DKO, n = 5; WAP-p-catenin Active, n = 3, Cre-kontroller (inkluderar GSK-3a - / - ; GSK-3ß FL / FL och ß-catenin Active ), n = 5.

Bild i full storlek

P-katenin är ett huvudsakligt GSK-3-mål implicerat i flera stadier av mammärutveckling såväl som vid onkogenes. För direkt jämförelse med GSK-3 DKO-djur genererade vi också möss med stabiliserat ß-katenin, som tidigare har karakteriserats. 31 I detta fall aktiverades endogent ß-katenin i bröstvävnader genom WAP-Cre-rekombination av den floxerade exon 3-allelen av ß-catenin (ß- catenin Exon3 LoxP / +, benämnd ß-catenin FL-Ex3 / + ) som kodar för den del av aminoterminalen som innehåller GSK-3-regulatoriska fosfodegronställen, så kallade WAP-p-catenin Active .

WAP-Cre-medierad inaktivering av GSK-3 i det murina bröstepitelet resulterar i skvam transdifferentiering

Cirka 81% av den primipara mellanpregnanta (dpc 15) WAP-DKO-körtlarna uppvisade uttalad epidermoid transdifferentiering (tabell 1, figur 1c), liknande den som hittades i WAP-p-catenin Active, i överensstämmelse med tidigare rapporter. 31, 61 Mosaikfördelningen av WAP-Cre, som återspeglar heterogeniteten i de syntetiska aktiviteterna hos celler inom individuella alveoler under eströs och vid midpregnancy, utgör sannolikt variationen i observerade fenotyper och antyder också starkt att dessa effekter är cellautonoma. Intraepitelial neoplasi från bröstkött (MIN) var en dominerande egenskap hos WAP-DKO-körtlar där lumen av alveoler fylldes med atypiska celler i ett fast mönster. Flerskiktsstrukturer som uppvisar skivepreparation med centrala spökceller (stora massor av "skugga" -celler eller cellspöken som saknade kärnkrafts- och cytoplasmatiska detaljer med tydlig bevarande av grundläggande cellulär kontur) och keratinisering observerades också ofta och tycktes uppstå inom MIN-lesioner (figur 1c ). Däremot var MIN sällsynt i WAP-p-kateninaktiva körtlar, som visade sig innehålla skivepreparation och framträdande keratinisering med många av de större skadorna helt ersatta av spökceller (figur 1c). Medan lesioner i dpc 15 WAP-DKO-körtlar tycktes uppstå från både det alveolära och duktala sekretoriska epitelet, verkade kanaler ha företrädesvis påverkats i WAP-ß-catenin Active (figur 1c). Det är inte överraskande att de transdifferentierade körtlarna av WAP-DKO och WAP-ß-catenin aktiva kvinnor kunde inte stödja näring av valpar och kullar hittades döda inom 24 timmar efter födseln utan bevis för mjölkfläckar.

Full storlek bord

För att undersöka arten av effekterna av GSK-3-borttagning på utvecklingen av bröstkörtlar berikade vi för primära MEC-mus från GSK-3α - / - ; GSK-3ß FL / FL- möss och infekterade dem med adenovirus som uttrycker Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) eller GFP enbart (Ad-GFP) som en kontroll. Vi introducerade sedan parade grupper av KO och kontrollmecer i de kontralaterala rensade bröstfettkuddarna hos 3 veckor gamla FVB-möss och tillät dem att utvecklas under en period av 8 veckor. Efter infektion med Ad-GFP genererade flytande MEC: er normala mammala epitelväxter efter transplantation (figur 1d). Däremot, efter infektion med Ad-Cre-GFP, observerades skvamfoci återigen i fettkuddar transplanterade med GSK-3 KO MEC (figur 1d). På liknande sätt återfanns även epidermoid transdifferentiering i utväxt från P-catenin Active MEC efter injektion av Ad-Cre-GFP-infekterat P-catenin FL-Ex3 / + MEC (figur 1d). Dessa data ger bevis på att effekter av bröstvävnadsspecifik ablation av GSK-3 är inneboende för bröstepitel.

Aktivering av Wnt / ß-catenin-signalering i bröstkörtlar som saknar GSK-3

Mer detaljerad analys avslöjade en korrelation mellan nivån av ß-cateninuttryck och förändringar i cellmorfologi i WAP-DKO: er och i WAP-ß-catenin Active (figur 2), eftersom ß-catenin främst hittades omgivande keratiniserade strukturer. Kärnkraftigt p-katenin observerades aldrig i kontroll (GSK-3a - / - ; GSK-3p FL / FL ) jungfruor i vilka det normalt hålls på en låg nivå och är lokaliserat främst vid membranet (figur 2). Som bedömdes genom ökad BrdU-inkorporering och Ki67-färgning, prolifererades 15 WAP-DKO-körtlar med dpc aktivt (figur 2), utöver nivån förknippad med normal brösttillväxt under graviditeten. Variabelt uttryck av cytokeratin 8/18 (K8 / 18) och cytokeratin 14, markörer av respektive luminal- och myoepiteliala linjer bibehölls inom MIN-lesionerna (figur 2). Keratiniserande epitel av både WAP-DKO och WAP-p-catenin Active var associerat med intensivt uttryck av cytokeratin 6 (K6) (figur 2), som aldrig observerades i kontrollkörtlarna. På grundval av dess expressionsmönster, som observeras tidigt i embryonal utveckling av bröstkött och i icke-spridande terminala knoppar men sällsynta i mogna körtlar, betraktas K6 som en förmodad stamfadermarkör i bröstepitelet. Eftersom K6 också finns i aktiverade keratinocyter i överhuden, är det emellertid svårt att urskilja om den observerade höjningen av K6 i WAP-DKO och WAP-p-catenin Active representerar en expansion av omogna celler eller är en konsekvens av epidermoid transdifferentiering. Flödescytometrisk analys av MEC: er renade från dpc 15 körtlar av båda stammarna med användning av CD24- och CD49f-stamcellsmarkörer för mammär avslöjade inte abnormiteter i stamcellsprofilen där förhållandena mellan luminal (CD24 hi : CD49f + ) till basal (CD24 lo : CD49f hi ) celler liknade kontrollkörtlarna (data visas inte). Detta resultat överensstämmer med positiv K6-färgning som återspeglar en övergång till epidermoid-marköruttryck i transdifferentierade celler snarare än avvikelser i mammala stamcellsavdelningen. Dessa observationer korrelerar p-kateninstabilisering med proliferation, neoplastisk lesionsbildning och förändringar i differentieringsstatus hos bröstepitel. Sammantaget visar dessa resultat att de två GSK-3-isoformerna, genom att begränsa ß-kateninnivåer och därigenom proliferation, spelar en nyckelroll för att bibehålla körtelcellens öde i däggdjurens epitel.

Förlust av GSK-3 och aktivering av ß-catenin har differentiella effekter på bröststamceller

För att ytterligare undersöka GSK-3-funktioner utnyttjade vi en mammosphere (MS) -analys för att mäta in vitro- stam / progenitorcellfrekvens i primära MEC-beredningar. 64 I avsaknad av vidhäftning till ett exogent underlag eller vidhäftning av celler kan stamceller överleva och sprida sig och vi hittade inga signifikanta skillnader i primär eller sekundär MS-bildning av GSK-3 DKO MEC genererade genom att infektera Lin - GSK-3α - / - ; GSK-3P FL / FL- celler med antingen Ad-GFP eller Ad-Cre-GFP. Intressant nog, medan CD24: CD49f-markörprofilen för MS dissocierad dag 12 efter infektion inte förändrades signifikant efter förlust av GSK-3 över replikat-experiment (figurerna 3b och c), observerades en framträdande CD24 hi : CD49f lo / - population på stabilisering av p-katenin (figur 3a och c). För att ytterligare undersöka den funktionella relevansen för dessa populationer sorterades ß-catenin Active MEC till CD24 hi : CD49f lo / - och CD24 lo / - : CD49f hi fraktioner med endast CD24 lo / - : CD49f hi celler som kan bilda sekundära MS, även om CD24 hi : CD49f lo / - MEC-populationen regenererades (data visas inte). På grundval av dessa in vitro- data drar vi slutsatsen att till skillnad från direkt stabilisering av ß-katenin påverkar GSK-3-förlusten inte signifikant stamcellkammaren i bröstkörtlarna.

Mammosfärbildning i MEC: er utarmad av GSK-3 och ß-katenin. P-catenin Active ( a ) eller GSK-3-ablated ( b ) MEC odlades under förhållanden som gynnade MS-bildning och avbildades på infektion dag 12 efter. MS dissocierades sedan och analyserades med flödescytometri för att bedöma CD24: CD49f stamcellsprofil. Visade är representativa för tre separata experiment som visar effektiv MS-bildning över alla genotyper. En CD24 hi : CD49f lo / - population observerades konsekvent i ß-catenin Active MECs. ( c ) PCR-genotypning av en alikvot av Ad-GFP eller Ad-Cre-GFP MEC av indikerade genotyper analyserade med användning av primrar som är specifika för detektion av floxade och borttagna alleler av GSK-3p (850 bp, 250 bp) och ß- catenin FL- Ex3 / FL-Ex3 (650 bp, 400 bp) som visar effektiv Cre-excision vid båda platserna vid infektion dag 12 efter.

Bild i full storlek

Brösttumörer utvecklas i frånvaro av GSK-3

Efter en median 6-7 månaders kontinuerlig avel utvecklade alla WAP-DKO och WAP-ß-catenin aktiva, men inte kontrollerande kvinnliga möss, stora storlekar av bröstkanalt adenokarcinom med atypisk skivepregdifferentiering (tabell 1, figur 4c). Det fanns ingen statistisk skillnad i överlevnadskurvor för dessa stammar ( P = 0, 2333 log-rank test, P = 0, 3706 Wilcoxon test) (figur 4c). Nästan fullständig förlust av GSK-3p i WAP-DKO-tumörer bekräftades genom detektering av markant förhöjda ß-cateninnivåer genom immunblotting (figur 4a).

Multiparösa WAP-DKO: er och WAP-ß-catenin Active utvecklar adenosquamous karcinom. ( a ) Immunoblots av helvävnadslysater av tumörer skördade från två separata multipla WAP-DKO-djur som visar förlust av GSK-3p och signifikant förhöjning av ß-catenin specifikt i tumörerna (T) jämfört med intilliggande normal bröstvävnad (N) . Totalt antal tumörbärande djur analyserade, n = 8. ( b ) Hematoxylin- och eosinfärgning av tumörer som uppstår i transgener av indikerade genotyper som visar motsvarande histopatologi. Totalt antal analyserade tumörer: WAP-DKO, n = 18; WAP-p-katenin Aktiv, n = 10. ( c ) Kaplan – Meier överlevnadsanalys av tumörbärande transgena djur som användes i studien som visade separering av WAP-DKO ( n = 18) och WAP-ß-catenin Active ( n = 10) kohorter från ¾ WAP-DKOs ( n = 4). Dödsåldern representerar det ögonblick då, på grund av förekomsten av tecken på obehag eller eftersom tumörstorleken översteg 2 cm 3, möss måste avlivas enligt institutionella och nationella bestämmelser.

Bild i full storlek

De primära tumörerna i WAP-DKO och WAP-p-catenin Active bestod av dåligt differentierade körtelstrukturer med variabel storlek och stora antal flerskiktade skivepitelstrukturer (figur 4b). De neoplastiska cellerna hade ett högt kärn-till-cytoplasmatförhållande (1: 1), en måttlig mängd granulär basofil cytoplasma och en rund till långsträckt stor kärna med fin kromatin och en till tre framträdande nukleoli. Det var markerad anisocytos (variation i cellstorlek) och anisokaryos (variation i kärnstorlek). Tillfälliga, stora multinucleated celler var också närvarande. Nästan hälften av tumörvolymen var sammansatt av flerskiktade epitelstrukturer med skivepreparation och centrala spökceller. Vissa av dessa strukturer innehöll lamellärt keratinmaterial och hade i sällsynta områden kännetecken på normalt lagrat, keratiniserat, skivepitel (epidermis). Invasion till den regionala lymfkörteln observerades ibland i WAP-DKO och WAP-ß-catenin aktiva tumörer (data visas inte).

Som förväntat höjdes p-catenin specifikt i WAP-DKO-tumörer jämfört med intilliggande normal bröstvävnad (figur 4a). Tumöruttryck av ducto-luminal (K8 / 18) och ducto-basal (K14) celler bibehölls tillsammans med K6 och EGFR (figur 5). En hög spridningsnivå var tydlig i alla tumörer baserat på Ki67-färgning (figur 5).

WAP-DKO och WAP-ß-catenin Aktiva tumörer visar Wnt-vägsaktivering, uttrycker luminal- och basalmarkörer och EGFR. Representativa immunfärgade sektioner av tumörer skördade från djur av indikerade genotyper som visar kärnkrafts- och cytoplasmatisk p-katenin som indikerar Wnt-vägaktivitet. På basis av marköruttryck är tumörer från både WAP-DKO och WAP-p-catenin Aktiva transgener EGFR-positiva och innehåller luminala och myoepiteliala / basala celler. Antal analyserade tumörer: WAP-DKO, n = 6 och WAP-p-catenin Active ( n = 3).

Bild i full storlek

Vi fann ~ 10% frekvens av lungmetastas i WAP-p-catenin Active, medan ingen av WAP-DKO-tumörerna någonsin visade sig metastasera (tabell 1). Ytterligare bedömning av metastatisk potential visade att Lin-tumörceller från två av åtta WAP-p-catenin Active kunde regenerera tumörer när de injicerades i syngeniska mottagare vilket antydde deras svaga maligna benägenhet (data visas inte). Däremot växte ingen av WAP-DKO Lin - tumörceller efter transplantation.

Tumörincidens noterades också i 20% av körtlarna som saknade tre av de fyra GSK-3-generna, det vill säga av genotypen WAP-Cre; GSK-3a - / - ; GSK-3P FL / + ; eller WAP-Cre; GSK-3a - / + ; GSK-3ß FL / FL (benämnd ¾ WAP-DKO) som uppstod med en median-latens på 14 månader, vilket statistiskt signifikant skilde sig från WAP-DKO ( P = 0, 0015 log-rank test, P = 0, 0075 Wilcoxon test) (Tabell 1, figur 4c). Inga tumörer observerades hos djur med varken bara a- eller p-isoformen av GSK-3 saknas. Den markant olika morfologin för ¾ WAP-DKO-tumörer (figur 4b) och deras låga incidens kan återspegla dessa som spontana åldersrelaterade tumörer som tidigare rapporterats i FVB-stammen snarare än att hänföras till förlust av GSK-3. Detta kan också vara fallet med det enstaka observerade fallet av tumörbildning i jungfru WAP-DKO: er (latens ~ 13, 6 månader). Vi kan dock inte utesluta möjligheten att förlust av tre av de fyra allelerna orsakar svag tumörpredisposition.

Från dessa data drar vi slutsatsen att uttömning av alla fyra allelerna av GSK-3 från musens bröstepitel leder till snabb bildning av adenosquamous karcinom som indikerar GSK-3-funktioner för att hämma tumörigenes i detta fack.

Förlust av GSK-3 driver p-kateninoberoende mammärtumorigenes

För att särskilja möjliga ß-kateninoberoende GSK-3-specifika funktioner, möss med LoxP-platser i intronerna 2 och 6 av ß-catenin (ß-catenin Exon 2-6 LoxP / Exon 2-6 LoxP, benämnd ß-catenin FL-Ex2-6 / FL-Ex2-6 ) parades med WAP-DKO för att generera djur med bröstkörtlar som saknade båda par GSK-3-alleler såväl som p-katenin (benämnd WAP-trippel knockout, WAP-TKO ) (Figurerna 6a och b). Återstående ej rekombinerade alleler av GSK-3p och p-catenin i mittengravid WAP-TKO: s bröstkammare som saknar uttryck för WAP-Cre återspeglar sannolikt närvaron av dessa proteiner i helkörtellysat (figur 6b). Påfallande räddades dpc 15 WAP-DKO-squamous transdifferentiering genom förlusten av p-catenin och inga förändringar i stamcellepopulationer observerades enligt bedömningen av CD24: CD49f-profilen (data visas inte). För att bestämma om samtidig ablation av GSK-3 och ß-catenin påverkade benägenheten för MEC: er för att bilda MS, GSK-3a - / - ; GSK-3P FL / FL ; P-catenin FL-Ex2-6 / FL-Ex2-6 MEC infekterades med antingen Ad-Cre-GFP eller Ad-GFP. Medan MS-bildning påverkades inte av Ad-GFP observerades inga sfärer någonsin i TKO-MEC: er (figur 6c). Analys av CD24: CD49f stamcellsprofil för dessa TKO MEC: er avslöjade inga avvikelser (figur 6c). För att utvärdera möjligheten att membran / vidhäftningsfunktioner för ß-catenin är nödvändiga för sfärbildning, utsatte vi ß-catenin FL-Ex2-6 / FL-Ex2-6 MEC till MS-analysen och fann att sfärbildande förmåga var normal (data inte visad). I denna kortsiktiga analys upphäver således förlust av GSK-3 och p-catenin stamcellsfunktionalitet utan störning i stamcellsavdelningen.

Mammal-selektiv deletion av GSK-3 och p-catenin (WAP-TKO) räddar epidermoid transdifferentiering och hämmar MS-bildning. ( a ) PCR-baserad bedömning av floxade och skärade alleler av GSK-3p (850 bp, 250 bp) och ß-catenin FL-Ex2-6 / FL-Ex2-6 (324 bp, 631 bp) i mitten av gravid däggdjur körtlar från GSK-3a - / - ; GSK-3P FL / FL ; P-katenin FL-Ex2-6 / FL-Ex2-6- möss medierade av WAP-Cre. ( b ) Representativt immunoblot av lyser från hela körtlarna från dpc 15 WAP-TKO-möss testade med indikerade antikroppar som visade reducerade GSK-3p- och P-catenin-proteinnivåer. ( c ) MS-bildningen fortsatte normalt i Ad-GFP-infekterad GSK-3a - / - . GSK-3P FL / FL ; P-catenin FL-Ex2-6 / FL-Ex2-6 MEC, inga sfärer bildade när P-catenin och GSK-3 togs bort samtidigt. Stamcellsprofilen CD24: CD49f påverkades inte i TKO-MEC: er. Visade är representativa för tre separata experiment.

Bild i full storlek

Efter ~ 10 månader utvecklade multipla WAP-TKO-dammar mammärumörer (tabell 1, figur 7a). Denna temporära förekomst skilde sig statistiskt signifikant från både WAP-DKO och WAP-p-catenin Aktiv tumör latenstid ( P <0, 0001 log-rank och Wilcoxon-test) (figur 7a). Till skillnad från WAP-DKOs, som utvecklade adenosquamous carcinomas med en framträdande skivekomponent, bildades acinar adenocarcinomas i WAP-TKOs med sällsynta och multifokala squamous foci närvarande i vissa tumörer (figur 7c). Båda mammalinjemarkörerna fortsatte att uttryckas i dessa tumörer tillsammans med K6, SMA, EGFR och Ki67 (figur 7e). GSK-3p-uttryck var praktiskt taget inte upptäckt i dessa tumörer (figur 7b) och laser-fångande mikrosektion visade effektivt excision vid p-catenin-lokuset i både adeno- och skvamkomponenterna i tumörer (data visas inte). Intressant nog fann vi förhöjda nivåer av y-catenin / plakoglobin (figur 7b), en armadillo-domäninnehållande p-catenin-homolog som förknippas med både klassiska och desmosomala cadheriner 65 specifikt i WAP-TKO-tumörer som antyder att det kan kompensera för förlusten av p -katenin fungerar, åtminstone på nivån av cell – cell vidhäftning. Förutom sin roll i Wnt / ß-catenin-vägen, koordinerar GSK-3 också proliferations- och differentieringssignaler genom reglering av kritiska noder i PI3K-, Hh- och Notch-signalvägar. Även om vi inte hittade någon förändring i fosforylering av PKB / Akt (som en markör för PI3K-aktivering, data inte visade), visade undersökning av totala nivåer av Hh-effektor Gli1 via immunblottning Gli1 förhöjd specifikt i WAP-TKO-tumörer (figur 7b). För att bedöma bidraget från Notch-signalering till WAP-TKO TIC-aktivitet tilläts Lin-TIC att bilda sfärer och behandlades därefter med eskalerande doser av y-sekretasinhibitor (figur 7d). Även vid låga doser av y-sekretasinhibitor observerades en minskning av antalet tumorsfärer, medan sekundär tumorsfärbildning upphävdes fullständigt (figur 7d). Sammantaget ger dessa fynd bevis på att i frånvaro av GSK-3 finns ett starkt selektivt tryck för ökningar i y-catenin tillsammans med induktion av större utvecklingssignaleringsvägar, Hh och Notch, som kan ligga till grund för p-kateninoberoende tumörgeneffekter av GSK-3-störning.

Blandad histopatologi av tumörer uppstår efter lång latens hos WAP-TKO-möss. ( a ) Kaplan – Meier överlevnadsanalys av tumörbärande transgener som visar separering av WAP-TKO ( n = 27) från både WAP-DKO ( n = 18) och WAP-ß-catenin Active ( n = 10) kohorter. ( b ) Immunoblot som visar förlust av GSK-3p och förhöjda nivåer av Gli1 och y-catenin specifikt i WAP-TKO-tumörer. GAPDH tjänar som belastningskontroll (T, tumör; N, normal). Totalt antal analyserade tumörer, n = 10. ( c ) WAP-TKO-tumörer är till stor del adenokarcinom som innehåller element av skivepreparation (toppaneler) utan ß-kateninfärgning i någon av de histologiska komponenterna. Totalt antal tumörer analyserade n = 27. ( d ) WAP-TKO tumor cells were purified, allowed to form tumorsphere and subsequently treated in triplicates with increasing concentrations of γ-secretase inhibitor as indicated. Tumorsphere were counted on day 7 of treatment (bottom panel). Efficient excision at the GSK-3β and β-catenin was confirmed by PCR genotyping of tumorsphere (top panel) from two separate tumors. ( e ) Representative immunostained sections of WAP-TKO tumors showing expression of luminal and myoepithelial/basal markers, proliferation as well as presence of K6, EGFR and SMA. Total number of tumors analyzed, n =8.

Bild i full storlek

Diskussion

GSK-3 is a primary negative regulator of β-catenin and we anticipated similar phenotypes of GSK-3 inactivation compared to genetic activation of β-catenin. Given extensive literature demonstrating that activation of Wnt signaling in mammary epithelium induces squamous differentiation, 31, 36, 37, 61, 66 it was not surprising that the loss of GSK-3 also conferred squamous potential on mammary cells. This phenotype is cell-autonomous and although strikingly similar to that observed upon direct stabilization of β-catenin, at the stem cell level GSK-3 also exhibits distinct functions. Elevation of β-catenin results in the generation of a CD24 hi population not found in the absence of GSK-3 and this may contribute to the malignant character of β-catenin tumors. We speculate that MEC response is largely determined by the specific level of β-catenin and although a lower threshold may be required for epidermoid transdifferentiation common to both WAP-DKOs and WAP-β-catenin Active glands, a stronger β-catenin signal is required for changes associated with malignancy.

GSK-3 inhibits mammary tumorigenesis by restraining signaling via multiple pathways

Deletion of GSK-3 and the ensuing elevation in β-catenin levels resulted in adenosquamous carcinomas in WAP-DKOs. Although not previously reported, stabilization of endogenous β-catenin in the mammary epithelium also led to tumors in the present study. These WAP-β-catenin Active tumors were histologically similar to those of WAP-DKOs and developed with similar kinetics suggesting that stabilization of β-catenin is the key requisite step for WAP-DKO tumor formation. Thus, elevation of β-catenin may permit MECs to re-enter the cell cycle resulting in MIN lesions that progress to adenosquamous carcinomas.

Analysis of β-catenin-independent tumors formed in the absence of GSK-3 revealed markedly elevated expression of γ-catenin/plakoglobin, suggesting a potential compensation mechanism for loss of β-catenin signaling and/or for its role in cell adhesion. This is consistent with recent findings in embryonic stem cells where γ-catenin was found to be responsive to GSK-3 inhibition and can activate TCF target genes when the levels of its expression reach a critical threshold. 67 However, despite their interactions with common cellular partners, β-catenin has well-documented oncogenic potential whereas γ-catenin was characterized as having tumor suppressor activity that may be independent of its role in mediating cell–cell adhesion. 68, 69, 70 Human tumor analysis has shown loss or reduced expression of γ-catenin is associated with poor clinical outcome and increased tumor formation and metastasis. 71, 72, 73, 74 The capacity of γ-catenin to suppress motility and migration may also underlie the lack of metastasis observed in WAP-TKOs and possibly the observed lack of MS formation in TKO MECs.

Despite what may be discerned from the volume of literature linking GSK-3 and Wnt, this protein kinase acts as a nexus in the control of several critical cellular homeostatic mechanisms, in addition to those supplied by Wnt/β-catenin. Our results suggest that GSK-3 plays an important role in mediation of Hh signaling as loss of GSK-3 resulted in elevated Gli1 expression and associated signaling. In addition, enhanced Notch signaling in the absence of GSK-3 may contribute to tumor formation through dysregulation of TIC control. We anticipate that effects of GSK-3 on Wnt, Notch and Hh signaling are ongoing, however, different proportions of the total GSK-3 pool may participate in the regulation of these pathways. GSK-3 is known to localize to different cellular compartments and may be sequestered in multi-vesicular bodies as recently proposed. 75 Hence, distribution of GSK-3 may be dependent on cellular context and the events integrated by GSK-3 and the relative strength of their output will determine observed cellular responses. Whereas WAP-TKO tumors showed significant activation of Hh and γ-catenin/plakoglobin, these pathways were essentially unchanged in WAP-DKO tumors suggesting GSK-3 predominantly functions within the β-catenin destruction complex to regulate the Wnt pathway when β-catenin is intact.

Material och metoder

Generation of mouse strains used in the study

All animals were housed at the Toronto Centre for Phenogenomics (www.phenogenomics.ca). GSK-3α −/− and GSK-3β Exon2 LoxP/Exon2 LoxP (referred to as GSK-3β FL/FL ) mutants and their wild-type littermates were generated as previously described. 76, 77 GSK-3α −/− and GSK-3β FL/FL mice were six generations backcrossed to FVB mice. At weaning, all littermates of mixed genotypes were housed by gender in groups of three to five per cage under a 12-h light/dark cycle (lights on at 0700) with ad libitum food (Purina mouse chow, Purina, St Louis, MO, USA) and water. To generate mammary gland-specific GSK-3 knockout (KO) mice, GSK-3β FL/FL animals were crossed with B6.Cg-Tg(Wap-Cre)11738Mam (obtained from Sean Egan, Hospital for Sick Children), which carries Cre recombinase under the control of the WAP promoter. WAP-Cre; GSK-3β FL/FL animals were then mated with GSK-3α −/− to generate WAP-Cre; GSK-3α −/− ; GSK-3β FL/FL, designated WAP-DKO, denoting them as mammary specific GSK-3 DKO. WAP-Cre and WAP-DKOs were also crossed to B6.129-Ctnnb1 tm2Kem /KnwJ (backcrossed onto FVB for six generations) bearing the exon 2–6 floxed allele of β-catenin (β-catenin Exon 2-6 LoxP/+, referred to as β-catenin FL-Ex2-6/+ ). This enabled generation of WAP-Cre; β-catenin FL-Ex2-6/FL-Ex2-6 and WAP-Cre; GSK-3α −/− ; GSK-3β FL/FL ; β-catenin FL-Ex2-6/FL-Ex2-6, or TKO referred as WAP-TKO WAP-Cre mice were also mated to β-catenin Exon 3 LoxP/+ (referred to as β-catenin FL-Ex3/+ ) transgenics (obtained with permission from Makoto M. Taketo and Derek van der Kooy, University of Toronto) previously described 78 to generate WAP-β-catenin Active mice.

BrdU injection

Intraperitoneal injections of mice were performed using BrdU (BD Pharmingen, Mississauga, ON, Canada) at 100 μg/g body weight. Incorporation of BrdU was detected 4 h post injection using IHC as described in 'Histology and immunostaining of tissue sections'.

Mammary epithelial single-cell preparation, enrichment and flow cytometry analysis

Mammary tumors or glands from mice killed at indicated developmental time points were dissected and digested in 1X Collagenase/Hyaluronidase (StemCell Technologies 07912, Vancouver, BC, Canada) diluted in DMEM-F12 and incubated at 4 °C overnight and then at 37 °C for 30 min, passed through a 40 μm cell strainer (BD Falcon, Mississauga, ON, Canada) and pelleted by centrifugation at 1000 rpm for 5 min at room temperature (RT). Enrichment of Lin MEC was achieved through selective depletion of hematopoietic, endothelial and stromal cells using an EasySep kit (StemCell Technologies 19757) according to manufacturer's directions. Lin cells were then stained with anti-CD49f clone GoH3 conjugated with either R-phycoerythrin, FITC or APC (CD49f-PE, CD49f-FITC, CD49f-APC), anti-CD24 clone M1/69 conjugated with PE, FITC or PerCP-eFluor 710 (CD24-PE, CD24-FITC, CD24-PerCP-eFluor 710) as well as 7-aminoactinomycin D, SYTOX Blue (Life Technologies, Mississauga, ON, Canada) or DAPI for 30 min at RT. HBSS containing 2% FBS (referred to as HF) was used as buffer. Live single cells (fixed FSC-A/FSC-W ratio; 7-aminoactinomycin D, SYTOX or DAPI-negative) were gated for analysis. Flow cytometry acquisition was performed using FACSCalibur (Becton Dickinson, Mississauga, ON, Canada) or Gallios (Beckman Coulter, Mississauga, ON, Canada) flow cytometer using a 10-color, 4-laser (488 nm blue, 561 nm yellow [co-linear], 638 nm red, 404 nm violet) at standard filter configuration. Fluorescence-activated cell sorting was carried out using FACSAria-13 color Cell Sorter (Becton Dickinson) with 488 nm blue laser at 30 psi All antibodies were titrated to determine the optimal antibody concentration. Briefly, TICs, MECs or MECs expressing GFP were stained with CD24 and CD49f (conjugated to appropriate fluorophore) and SYTOX Blue or 7-aminoactinomycin D and fluorescence-minus-one controls were used to determine the CD24 and CD49f gates. Flow cytometry analysis was performed using the Kaluza analysis software package (Beckman Coulter).

MS and tumorsphere culturing in vitro

Immediately following EasySep Magnet incubation (see above), a single-cell suspension of Lin MECs was infected with adenovirus-GFP (Ad-GFP) or adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) at a multiplicity of infection of 50. Virus was allowed to adsorb to cells for 1 h at 37 °C with gentle agitation every 10 min. Infected MECs (for MS) or enriched TICs (for TC) were then plated on ultra-low attachment plates (Corning, Costar, Tewksbury, MA, USA) in DMEM/F-12 HAM medium (Sigma, Markham, ON, Canada) containing 20 ng/ml basic fibroblast growth factor (StemCell Technologies), 20 ng/ml epidermal growth factor (StemCell Technologies) and B-27 supplement (1:50 dilution, Life Technologies) and cultured in a standard tissue culture incubator. Spheres were dissociated at 7-day intervals as follows: spheres were collected in a single tube, spun down and supernatant removed. MS were resuspended in 100 μl of 0.25% trypsin and incubated for 1 min at RT followed by 1 min of mechanical disruption by passage through a 1 ml syringe with a 26-gauge needle. HF (900 μl) was added to neutralize the trypsin and cells were counted and re-plated. To enumerate spheres, prior to enzymatic and mechanical dissociation, spheres were resuspended in a known volume and a 10th of suspension was transferred to a well of a 96-well plate and all spheres were counted. Images were captured using Hamamatsu camera (Bridgewater, NJ, USA) mounted on a Leica inverted DMIRB microscope (Concord, ON, Canada) equipped with Volocity software (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA).

Transplantation

Sorted tumor cells or Lin MECs 48 h post-Ad-infection were resuspended in DMEM-F12 medium and mixed at a 1:1 ratio with Matrigel (BD Bioscience, Mississauga, ON, Canada) on ice. One milliliter of Trypan Blue solution (Life Technologies) was added to all samples to enable visualization during injection. A mixture of Matrigel and 1, 2 or 10 × 10 3 tumor cells was injected using a Hamilton syringe near the upper #4 mammary fat pads of 6–8-week-old virgin FVB mice anesthetized with isoflurane. Similarly, 50 × 10 3 of adenovirus-infected MECs were mixed 1:1 with Matrigel and injected into cleared #4 mammary fat pad and analyzed 8 weeks later.

Histology and immunostaining of tissue sections

Mammary glands (thoracic) were harvested at indicated developmental time points. Tumors were harvested at tumor endpoint. Tissues were fixed in 4% paraformaldehyde overnight at 4 °C and placed in 70% ethanol until they were paraffin-embedded. Five micrometer paraffin sections were stained with hematoxylin and eosin. Tissue sections were deparaffinized in two 5-min changes of xylenes, rehydrated in graduated ethanols and then washed in phosphate-buffered saline (PBS). With the exception of EGFR staining where 1 m M EDTA (pH 8) was used, antigen retrieval was performed using 10 m M citrate buffer (pH 6) in a microwave at 10 min boiling following 10 min sub-boiling. Slides were cooled for 30 min. For IHC, endogenous peroxidase activity was quenched by incubating sections in 0.3% hydrogen peroxide for 30 min followed by blocking in 5% goat serum in PBS for 30 min or 5% goat serum in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% Tween-20 (TBST) for EGFR staining. For immunofluorescence (IF), sections were blocked for 30 min in IF buffer (PBS+0.2% Triton X-100, 0.05% Tween-20) containing 2% bovine serum albumin (BSA). Sections were then incubated in primary antibody (Supplementary Table 1) overnight at 4 °C in 2% BSA-PBS. Following washes with PBS for IHC or IF buffer for IF, sections were incubated for 1 h at RT with biotinylated (Dako, Burlington, ON, Canada) or Alexa Fluor (Life Technologies)-conjugated secondary antibodies for IHC or IF, respectively. For IHC, the peroxidase reaction was carried out using DAB substrate (Dako) and sections were counterstained with hematoxylin and mounted in Faramount (Dako) aqueous mounting medium. For IF, sections were mounted in ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies). IHC images were digitally captured with an Olympus digital DP 12 megapixel color camera (Olympus, Richmond Hill, ON, Canada) mounted on the Olympus BX61 motorized microscope (Olympus). IF images were captured using a Deltavision deconvolution microscope (Applied Precision Inc. Issaquah, WA, USA), that consisted of an Olympus Inverted IX70 microscope (Olympus) and motorized stage. Images were projected onto a Coolsnap CCD camera (Photometrics, Tucson, AZ, USA) and processed through Softworx software (GE Healthcare, Mississauga, ON, Canada) that contained iterative deconvolution algorithms.

immunoblotting

Fifty milligram of tissue or tumor was lysed in 1 ml of RIPA lysis buffer supplemented with complete protease inhibitor tablet (Roche, Laval, QC, Canada) and phosphatase inhibitor cocktail (Sigma) using TissueLyser (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). Lysates were cleared by centrifugation for 15 min at 4 °C and protein concentration determined by Lowry assay (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). Protein lysates (10–30 μg) containing SDS sample buffer were boiled for 5 min and loaded onto an 8 or 10% SDS–PAGE gel, followed by semi-dry transfer onto polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Etobicoke, ON, Canada). Blocking was performed for 1 h at RT in 5% non-fat milk in TBST and membranes were probed with primary antibodies (Supplementary Table 1) overnight at 4 °C. Following washes with TBST, membranes were incubated with appropriate HRP-conjugated secondary antibodies (Bio-Rad) for 45 min at RT, washed and exposed to film (Kodak, Burnaby, BC, Canada) using ECL reagent (Pierce, Thermo-Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada).

genotypning

Mouse tail tips were digested in 200 m M Tris HCl pH 8.4, 500 m M KCl containing NP40, Tween-20 and Proteinase K at 60 °C for 2 h. Genotyping of the mice was performed using one pair of appropriate primers (Supplementary Table 2).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur S1

  2. 2.

    Kompletterande figur S2

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)