Tidig diagnos och övervakning av skivepitelcancer genom salivmetabolomik | vetenskapliga rapporter

Tidig diagnos och övervakning av skivepitelcancer genom salivmetabolomik | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • metabolomik
  • Oral cancer upptäckt

Abstrakt

Tidig diagnos av oralt skivepitelcancer (OSCC) är en attraktiv strategi för att öka överlevnadshastigheten hos patienten. En integrerad separationsmetod för omvänd fas vätskekromatografi och hydrofil interaktionskromatografi kombinerad med tid för flygmassespektrometer har först utvecklats för att utföra global salivmetabonomisk analys för tidig diagnos av OSCC. Detta tillvägagångssätt utformades för att övervinna begränsningarna för en enda kromatografisk metod på grund av olika polaritet hos endogena metaboliter. Som ett resultat identifierades 14 potentiella salivmetaboliter. Åtta biomarkörer uppreglerade hos OSCC-patienter jämförs med kontroll och sex nedreglerade grupper. Mottagarens funktionsanalys utnyttjades för att utvärdera den diagnostiska kraften hos kandidatens biomarkörer, och relaterade metaboliska vägar har också studerats. Fem salivbiomarkörer (propionylkolin, N-Acetyl-L-fenylalanin, sfinganin, fytosfingosin och S-karboximetyl-L-cystein) gav i kombination tillfredsställande noggrannhet (AUC = 0, 997), känslighet (100%) och specificitet (96, 7%) i att skilja tidigt stadium av OSCC från kontrollen. I denna studie demonstreras framgångsrikt en omfattande salivmetabonomisk analys för att identifiera potentiella biomarkörer för att tidigt diagnostisera OSCC, vilket har fördelarna med icke-invasiv, enkel, pålitlig och låg kostnad. Dessa nya metaboliska biomarkörer har uppenbar klinisk användbarhet som hjälper till att diagnostisera OSCC i dess tidiga skede.

Introduktion

Oral cancer, en subtyp av huvud- och nackcancer, är en cancervävnadstillväxt belägen i munhålan 1, 2 . Mer än 90% av orala cancer är skivepitelcancer (OSCC) med ursprung i vävnaderna som ligger i läpparna, munhålan och svalg. Cirka 42 000 personer i USA kommer att diagnostiseras nyligen med oral cancer 2013. Världshälsoorganisationen har rapporterat oral cancer med en dödsrate på 45% efter fem år från diagnos (för alla stadier kombinerade vid diagnostid) 3 . Om oral cancer upptäcktes i tidiga utvecklingsstadier, har den en överlevnadsgrad på 80 till 90%. Tyvärr är de flesta av dessa cancerformer svåra att upptäcka i de tidiga stadierna på grund av bristen på allmänhetens medvetenhet och screeningmetod, vilket generellt skulle resultera i en dålig prognos och en låg överlevnad 4 .

För närvarande är den mest definitiva metoden för diagnos och screening för oral cancer en skalpelbiopsi. Det är tidskrävande och behöver omfattande erfarenhet. CT- eller CAT-skanningsteknologi (co-axial tomography) och teknik för magnetisk resonansavbildning har utvecklats snabbt under de senaste decennierna. CT kan emellertid endast upptäcka massans faktiska närvaro och endast en biopsi kan verifiera att massan är ondartad. Därför behövs det snabbt nya diagnostiska tekniker för att diagnostisera OSCC i dess tidiga skede. Nu har molekylbaserade biomarkörer använts för att diagnostisera OSCC och dra mer och mer uppmärksamhet. Saliv som diagnosmedium erbjuder en enkel, billig, säker och icke-invasiv strategi 5 .

Saliv, icke-invasivt och stressfritt alternativ till blod, accepteras allmänt som ett potentiellt medium för klinisk diagnostik. Det innefattar utsöndringar av tre stora körtlar, nämligen parotidkörtlar, submandibular körtlar och sublingual körtlar och hundratals mindre salivkörtlar 6, 7 . Det är en av de mest komplexa, mångsidiga och viktiga kroppsvätskorna, som återspeglar ett stort antal fysiologiska behov och information 8 . Salivbiomarkörer som proteiner och DNA har använts för att upptäcka OSCC under de senaste decennierna 9, 10, 11 . Metabonomi som modern högeffektiv teknik har utvecklats snabbt och öppnar en dörr till upptäckten av biomarkörer 12 . Det är den systematiska studien av ämnen med små molekylvikter i celler, vävnader eller hela organismer som påverkas av flera faktorer 13, 14, 15 . Nyligen genomförd metabonomisk analys visar att den är användbar för diagnos och prognos för OSCC. Högpresterande vätskekromatografimasspektrometri (HPLC-MS) 16 och kärnmagnetisk resonans (NMR) 17- spektroskopi utfördes för att diskriminera OSCC-patienter från de friska kontrollerna. Metabonomisk analys genom att beakta den låga känsligheten och det begränsade dynamiska intervallet för NMR har HPLC-MS-baserad metabonomi-strategi framgångsrikt använts som ett verktyg för diagnos av sjukdomar med utmärkt reproducerbarhet och känslighet 18, 19, 20 . Nyligen har en snabbare metabonomisk analysteknik, ultrahög prestanda vätskekromatografi-masspektrometri (UPLC-MS) använts för att diagnostisera oral cancer 5, 21, diabetes 22, kolorektal cancer 23, hepatocellulärt karcinom 24 och kronisk njursvikt. Emellertid har en integrerad UPLC-MS-metod inklusive omvänd fas vätskekromatografi (RPLC) och hydrofil interaktionskromatografi (HILIC) baserad salivmetabonomisk analys av OSCC inte rapporterats hittills så vitt vi vet.

HILIC tillåter olika selektivitet och bättre retention av polära analyser som i allmänhet har dålig retention på RPLC. Det introducerades första gången av Alpert 1990 25 . I HILIC förbättras känsligheten hos masspektrometern på grund av det höga organiska innehållet i mobilfasen och förbättring av joniseringens effektivitet. Saliv innehåller cirka 99% vatten 26, därför förväntas många endogena metaboliter vara mycket polära. Det var mycket nödvändigt att kombinera RPLC- och HILIC-tekniker för en omfattande salivmetabonomisk analys för att upptäcka fler potentiella biomarkörer för tidig diagnos av OSCC.

I detta arbete undersöktes RRLC-MS och HILIC-MS-analys i positiva och negativa jonlägen för att undersöka salivprover från OSCC-patienter och friska frivilliga. Multivariat dataanalys utfördes för att belysa diskriminerade variabler (Metabonomics forskningsstrategi tillhandahölls i kompletterande figur 1). Efter förädling av modellen har de fjorton potentiella biomarkörerna identifierats för tidig diagnos av OSCC. Åtta biomarkörer uppreglerade hos OSCC-patienter jämförs med kontroller och sex nedreglerade. Syftet med denna studie är att utveckla en omfattande salivmetabonomisk analys för att identifiera potentiella biomarkörer för tidig diagnos av OSCC.

Resultat

Analys av salivsmetabolomik

Separationsbetingelserna för salivprover på båda kolumnerna optimerades. Med användning av RPLC som exempel visades typiska UPLC-TOF / MS bas toppintensitet (BPI) kromatogram av salivprover från kontrollgruppen och OSCC-gruppen i både positiva och negativa jon-lägen i figur 1. Från BPI-kromatogrammen, mer markerade variationer kan ses i patientgruppen än i kontrollgruppen. RPLC har bättre retention för svagt polära komponenter. Dessutom tillåter HILIC varierad selektivitet och bättre retention för polära analyser. Det integrerade utnyttjandet av två separationslägen kan förstora metabolitidentifieringen.

Image

(A) kontrollgruppen i positivt jon-läge (ESI +); (B) patientgruppen i ESI +; (C) kontrollgruppen i negativ-jon-läge (ESI−); (D) patientgruppen i ESI−; Massintervallet m / z 50–1000.

Bild i full storlek

Med användning av MarkerLynx-programvara för toppdetektering erhölls 8319 toppar av positiva joner och 6298 negativa joner i RPLC, 2379 toppar av positiva joner och 2269 negativa joner i HILIC. Även om färre toppar extraherades från HILIC-kolonnen, kan dessa toppar också användas som en omfattande salivmetabonomikprofilering samt RPLC. Variablerna exporterades till SIMCA-P 11.0 för multivariat dataanalys för att detektera någon inneboende trend inom datumet. Alla salivprover delades in i tre grupper: friska kontroller som grupp 1 (HC); tidigt stadium av OSCC inklusive steg I och II som grupp 2 (OSCC I – II); och avancerat stadium av OSCC inklusive steg III och IV som grupp 3 (OSCC III – IV). PCA-analys testades först i vår studie, men det finns inga uppenbara separationstrender observerade för grupper av OSCC I – II och OSCC III – IV. Av denna anledning tillämpades en övervakad metod, OPLS-DA 27, i dataanalysen. Som framgår av figur 2 observeras tillfredsställande klustertrender bland HC, OSCC I – II och OSCC III – IV i poängdiagram, vilket indikerar att möjligheten att använda salivmetabonomi för iscensättning av OSCC.

Image

(A) RPLC i positivt läge; (B) RPLC i negativt läge; (C) HILIC i positivt läge; (D) HILIC i negativt läge.

Bild i full storlek

I OPLS-DA, användes parametrar för R2Y (cum) och Q2 (cum) för utvärderingen av modellerna, vilket indikerar lämplighet och förutsägelseförmåga, respektive 1 . Q2 (cum)> 50% visar att läget är användbart; om Q2 (cum)> 90%, är läget utmärkt. I figur 2A resulterade klassificeringen i en prediktiv komponent och två ortogonala komponenter, med utmärkta modellering och förutsägbara förmågor (R2 (X) = 52, 7%, R2 (Y) = 97, 6%, Q2 (Y) = 95, 1%) för positiv- jonläge vid RPLC-separering. Andra parametrar inklusive R2X (cum), R2Y (cum) och Q2 (cum) värden erhållna från RPLC och HILIC-separering i både positiva och negativa jon-lägen sammanfattades i tabell 1. Från dessa resultat kan vi konstatera att OPLS -DA-modeller gällde för alla fyra lägen.

Full storlek bord

Tidig OSCC-biomarkörupptäckt

För att identifiera diskriminerande variabler som användes i det tidiga steget detektion av OSCC, användes en S- plot modell. VIP användes som en viktig parameter för att välja biomarkörer. Variabler med VIP-värde större än en betraktades som stort värde 28, 29 . Ett icke-parametriskt Mann-Whitney U- test utfördes i följd och variabler med signifikanta skillnader mellan OSCC-patienter och kontrollindivider (P <0, 05) bibehölls. Figur 3 är strategin för val av intressanta variabler för HC vs OSCC I – II i RP-kolumn med positivt jon-läge. S- diagram av HC vs OSCC I – II visades i figur 3B, som är ett spridningsdiagram som kombinerar samvariationen och korrelationen för modellvariablerna med avseende på modellkomponentpoäng. Åttiosju variabler lyfts fram i S- plot (VIP> 1 och P <0, 05). Därefter bekräftades variablerna av de råa datateckningarna. Två exempel på tendensen hos variabler i OSCC och kontroll visades i figur 3C och 3D. Slutligen valdes femtiofem variabler i RPLC med positivt jon-läge. Data som erhållits från andra lägen analyserades på motsvarande sätt med samma metod. Därför hittades femtiofem diskriminerande variabler som intressanta biomarkörkandidater i OSCC relativt kontrollgruppen för RPLC i positivt jon-läge, trettiotvå diskriminerande variabler av RPLC i negativ-jon-läge, tjugoåtta diskriminerande variabler av HILIC i positivt jon-läge och trettiosju diskriminerar variabler av HILIC i negativ-jon-läge.

Image

(A) Betygsättningar för OPLS-DA-modeller; (B) S- tomt; Tendensen för variabler (C) m / z 180, 0359 / 15, 16 min och (D) m / z 310, 3094 / 11, 61 min i OSCC och kontroll.

Bild i full storlek

Identifiering av potentiella biomarkörer

Elementkompositionen beräknades från den förvärvade MS-data med hög upplösning med användning av analysmjukvaran Masslynx 4.1. Spektra som rutinmässigt uppsamlas med 7000 massupplösning, ~ 0, 6 mDa precision och ~ 10 ppm toleranser är tillräckliga för att generera en initial lista med möjliga kemiska kompositioner. Elementgränserna inställdes på C, H, N, O och S. Vi tar jonen med m / z 89, 0226 / 2, 59 min i HILIC med negativ-jon-läge som ett exempel för att illustrera den detaljerade processen för identifiering av biomarkör. Baserat på mjukvaran för analys av elementskomposition (kompletterande figur 2) var det maximala antalet kemiska formler för m / z 89.0226 12. Bland dessa formler var valet av den bästa matchningen starkt beroende av dess i-FIT-värde, vilket är ett index för de avvikelser som observerats från de förutsagda massorna och intensiteterna av monoisotopiska toppar motsvarande en given kemisk formel. Elementkompositionen bestämdes vara C3H5O3 (beräknat 89.0239) baserat på det lägsta i-FIT-värdet. Efter att ha sökt i olika metabolomiska databaser med molekylformeln C3H5O3 och m / z 89.0226 ansågs mjölksyra som möjlig förening. Därefter bekräftades det slutligen genom jämförelse med standardprov. Så småningom identifierades fjorton metaboliter tentativt som potentiella biomarkörer för tidig diagnos av OSCC och listades i tabell 2. I fjorton potentiella biomarkörer kan sju salivbiomarkörer endast separeras med RPLC-teknik; Fyra salivbiomarkörer kan endast separeras med HILIC-teknik, medan tre andra salivbiomarkörer kan separeras både med RPLC- och HILIC-tekniker. Dessa resultat antydde att genom att kombinera RPLC- och HILIC-tekniker för en omfattande salivmetabonomisk analys utvidgade omfattningen av screening av biomarkörer för tidig diagnos av OSCC. Bland dessa metaboliter bekräftades fyra potentiella biomarkörer (mjölksyra, bärnstenssyra, ornitin och karnitin) med hjälp av standardprover. Andra strukturella uppdrag var emellertid ofullständiga och dessa strukturer kunde bekräftas i framtida studier.

Full storlek bord

Förklaring av förändringstrend och karakterisering av potentiella biomarkörer

I alla biomarkörer var åtta potentiella biomarkörer uppreglerade i saliv hos OSCC-patienter och sex potentiella biomarkörer var nedreglerade. För att ge en intuitiv jämförelse tillhandahålls ändringstrenderna (upp- eller nedreglerade) av sex representativa biomarkörer i OSCC I – II och OSCC III – IV jämfört med kontroller i ruta i diagram 4.

Image

(A) propionylkolin, (B) bärnstenssyra, (C) mjölksyra, (D) acetylfenylalanin, (E) karnitin, (F) fytosfingosin). Horisontella linjer representerar från botten till topp: minimum, 25: e, 50: e och 75: e percentilerna och det maximala.

Bild i full storlek

För att karakterisera dessa potentiella biomarkörer i ett tidigt stadium av OSCC utfördes ROC-analyser för mottagaroperativkarakteristik. De fjorton identifierade potentiella biomarkörerna delades upp i två grupper, åtta uppreglerade hos OSCC-patienter (figur 5A) och sex nedreglerade (figur 5B). Tabell 3 visar den detaljerade känsligheten, specificitetsnivåerna och 95% konfidensintervall för de fjorton identifierade potentiella salivbiomarkörerna för OSCC tidig förutsägelse. Som en enda biomarkör i saliv hade S-karboximetyl-L-cystein en känslighet av 84, 6% och en specificitet av 93, 3% för att tidigt förutsäga OSCC. De åtta uppreglerade metaboliterna, mjölksyra, hydroxifenylmjölksyra, N-nonanoylglycin, 5-hydroximetyluracil, bärnstenssyra, ornitin, hexanoylkarnitin och propionylkolin tillhandahöll områdena under kurvan (AUC) på 0.708, 0.710, 0.721, 0.718, 0.785, 0.710 0, 733 respektive 0, 946 i HC vs OSCC I – II-läge. De sex nedreglerade metaboliterna, dvs karnitin, 4-hydroxi-L-glutaminsyra, acetylfenylalanin, sfinganin, fytosfingosin och S-karboximetyl-L-cystein, gav AUC-värden 0, 700, 0, 669, 0, 838, 0, 818, 0, 910 och 0, 913, respektive i HC vs OSCC I – II-läge.

Image

(A) Åtta uppreglerade metaboliter av OSCC i OSCC I – II-läge; (B) Sex nedreglerade metaboliter av OSCC i OSCC I – II-läge; (C) Åtta uppreglerade metaboliter i OSCC i OSCC III – IV-läge; (D) Sex nedreglerade metaboliter av OSCC i OSCC III – IV-läge.

Bild i full storlek

Full storlek bord

ROC-kurvan planerades också för modellen av HC vs OSCC III – IV (figur 5C och 5D). De detaljerade parametrarna för potentiella salivbiomarkörer för OSCC III – IV-förutsägelse tillhandahölls i tabell 4. Jämfört med tabell 3 är AUC-värdet för varje potentiell biomarkör för HC vs OSCC I – II större än HC mot OSCC III – IV, förutom laktiskt syra och 4-hydroxi-L-glutaminsyra, indikerade att andra tolv biomarkörer har bättre förmåga att skilja OSCC I – II från kontrollerna.

Full storlek bord

För att demonstrera användbarheten av salivbiomarkörer i kombination för tidig diagnos av OSCC valdes fem metaboliter (AUC> 0, 8) innefattande propionylkolin, acetylfenylalanin, sfinganin, fytosfingosin och S-karboximetyl-L-cystein för att bilda en biomarkörgrupp. Dessa biomarkörer kombinerades först med en konventionell prediktionsmodell för binär logistisk regression (LR) och utsattes sedan för ROC-analys. Resultaten visade att den potentiella biomarkörgruppen tillhandahöll ett AUC-värde på 0, 997, med en känslighet på 100% och en specificitet av 96, 7% för att skilja OSCC I – II från kontroll. ROC-kurvan planerades också för LR-modellen av HC vs OSCC III – IV. Som ett resultat var AUC-värdet 0, 971 (känslighet 86, 7%; specificitet 94, 1%; 95% konfidensintervall = 0, 989–1, 006) för LR-modellen för OSCC III – IV. AUC-värdet för LR-läge i HC vs OSCC I – II är större än för HC vs OSCC III – IV, vilket indikerade att dessa fem biomarkörer i kombination har överlägsen prestanda vid diagnos av OSCC i steg I och II från kontroll.

Dessa resultat demonstrerade att fem salivbiomarkörer (propionylkolin, acetylfenylalanin, sfinganin, fytosfingosin och S-karboximetyl-L-cystein) i kombination kommer att förbättra känsligheten och specificiteten för OSCC: s tidiga upptäckt (steg I och II). Därför kan dessa salivbiomarkörer ha ett viktigt kliniskt värde för diagnosen OSCC i dess tidiga skede.

Diskussion

Salivtestning, ett icke-invasivt alternativ till serumtest, utvecklas snabbt de senaste åren. Dessutom är det billigt och enkelt att använda. Insamling av saliv kan minska obehag för patienter, särskilt om upprepad provtagning är nödvändig.

I vårt experiment inkluderade de erhållna metaboliterna sfingolipider (sfinganin och fytosfingosin), karnitiner (karnitin, hexanoylkarnitin), kolinderivat (propionylkolin), karboxylsyra (mjölksyra), karboxylsyra (bärnstenssyra), pyrimidin (5-hydroximetyluracil), alkoholderivat (hydroxifenylmjölksyra) och aminosyror och derivat (ornitin, N-nonanoylglycin, acetylfenylalanin, 4-hydroxi-L-glutaminsyra och S-karboximetyl-L-cystein), i enlighet med den definierade kemiska klasskategorin i Human Metabolome Database. Beskrivning för de utvalda biomarkörerna grupperades som uppreglerade och nedreglerade metaboliter.

För uppreglerade metaboliter spelar mjölksyra en roll i flera biokemiska processer och är en slutprodukt av glykolys. De flesta cancerceller är beroende av aerob glykolys snarare än oxidativ phophorylering för energiproduktion 30 . För att uppfylla tumörcellsbehov är den glykolytiska omkopplaren förknippad med förhöjt glukosupptag och mjölksyrafrisättning 31 . Jämfört med kontroll observerades en högre nivå av mjölksyra i det tidiga stadiet av OSCC-patienter. Den överdrivna spridningen av cancerceller kräver mer energi, och som ett resultat producerar tumörer ofta stora mängder mjölksyra genom att utföra glykolys även under aeroba förhållanden. Detta fenomen kallas 'Warburg-effekten' 32 . Mjölksyra också associerad med pyruvat metabolism. Ökad mjölksyra kan ha sambandet med det minskade pyruvat som träder in i tricarboxylic acidcykel (TCA) 21, vilket är en serie enzymkatalyserade kemiska reaktioner av central betydelse i alla levande celler. Bärnstenssyra är en dikarboxylsyra, som är den mellanliggande metaboliten i TCA-cykel 33 . I det tidiga stadiet av OSCC ökade bärnstenssyrainnehållet i saliv jämfört med de friska människorna, förmodligen på grund av att det ökade metaboliska användningen av TCA-cykeln i orala cancerceller. Vi fann att nivåerna av ornitin var markant högre hos patienter med OSCC än i friska kontroller. Överuttryck av ornitin har också rapporterats i andra undersökningar 34 . Ornitin är en aminosyra som produceras i ureacykeln genom uppdelning av urea från arginin 35 . Det är en central del av ureacykeln och är också en föregångare för citrulline och arginin 36 . En annan aminosyra och derivat, N-nonanoylglycin är normalt mindre metaboliter av fettsyror. Förhöjd nivå av acylglyciner förekommer i saliv för OSCC-patienter, antagligen på grund av oxidationsstörningar i olika fettsyror. Hexanoylcarnitine är en acylcarnitine. Ovanliga acylkarnitiner kan observeras vid störningar i energiproduktionen och i mellanliggande metabolism i organismen. Detektering av det kvalitativa mönstret av acylkarnitiner kan vara av diagnostisk och terapeutisk betydelse. Hexanoylkarnitininnehållet är förhöjt hos OSCC-patienter förmodligen för att energimetabolismen är uppreglerad i OSCC. Propionylkolin är ett kolinderivat, föregångare till acetylkolin, en viktig neurotransmitter och syntes. Acetylkolin är en kritisk substans i fosfolipidbiosyntes. Spaltpropionylkolininnehållet är högre jämfört med friska individer förmodligen på grund av det ökade uttrycket av processen med kolinfosforylering. Hydroxyfenyllaktisk syra är en tyrosinmetabolit, i vilken nivån är förhöjd med en brist på enzymet p- hydroxifenylpyruvatoxidas. Hos OSCC-patienterna är innehållet i salivhydroxyfenyllaktiksyra högre jämfört med friska personer. Detta kan vara relaterat till bristen på enzymet p- hydroxifenylpyruvatoxidas. I vår studie hittades en liknande tyrosinmetabolismstörning i OSCC som vid fenylketonuri och tyrosinemi 37 . 5-Hydroxymetyluracil, en oxidationsskadeprodukt, bildas när celler är under oxidativ stress. Hos OSCC-patienterna förhöjdes innehållet av 5-hydroximetyluracil förmodligen på grund av att redoxtillståndet i kroppen ändrades vilket resulterade i oxidativ stress hos cancerpatienter. Det finns olika skäl, såsom näringsintäktsstörningar och immunsystemaktivering hos OSCC-patienter. Liknande oxidativ stressstörning i OSCC hittades i andra undersökningar 38 .

För nedreglerade metaboliter avslöjar den uppenbara minskningen av acetylfenylalanin en onormal fenylalaninmetabolism hos OSCC-patienter. Acetylfenylalanin är en produkt av enzymfenylalanin N-acetyltransferas i vägen fenylalaninmetabolism 18 (kompletterande figur 3) vilket indikerar en störning av glycin N-acyltransferas i OSCC. Sfingolipidmetabolism ses således vara onormal hos OSCC-patienter jämfört med kontroller. Sphinganin och fytosfosfosin regleras ned i saliv hos OSCC-patienter, som alla är involverade i keramidsyntes (N-Acylsphingosine) och metabolism (kompletterande figur 4). Ceramid betraktas som viktiga cellulära signaler för att inducera apoptos. Därför har sfinganin och fytosfingosin väckt stort intresse. Sphinganin är en blockerare postlysosomal kolesteroltransport genom hämning av lågdensitet lipoproteininducerad förestring av kolesterol och orsakar att oesterifierat kolesterol samlas i perinuclear vesiklar 39 . Fytosfingosin liknar strukturellt samma som sfingosin. I OSCC regleras båda sfinganin och fytosfingosin med P-värde <0, 001. Dessa bioaktiva sfingolipidmetaboliter kan ha potential att fungera som biomarkörer för OSCC. Carnitineis är en väsentlig faktor i beta-oxidation av långkedjiga fettsyror och dess viktigaste kända metaboliska funktion är transporten av fett till mitokondrierna i muskelcellerna 40 . Karnitin syntetiseras från lysin och metionin 41 . Acetyl-CoA som alstras i beta-oxidation går in i TCA-cykeln, där den ytterligare oxideras till CO 2, vilket ger mer reducerade energibärare. Karnitininnehållet är lägre hos OSCC-patienter förmodligen på grund av att fettsyrametabolismen är nedreglerad i OSCC.

Separationsteknik spelar en avgörande roll i metabolomicsstudien. I vårt arbete har en integrerad separationsmetod genom att kombinera RPLC och HILIC med TOF-MS utvecklats för att utföra global metabolomics-analys i mänsklig saliv och identifierat fler potentiella biomarkörer för tidig diagnos av OSCC. Resultaten visade att olika separationsmetoder förstorade metabolitstäckningen. Totalt fjorton potentiella biomarkörer har en nära relation till det tidiga stadiet av OSCC. Åtta potentiella biomarkörer uppreglerades i saliv hos OSCC-patienter och sex potentiella biomarkörer nedreglerades. Fem salivbiomarkörer (propionylkolin, acetylfenylalanin, sfinganin, fytosfingosin och S-karboximetyl-L-cystein) i kombination gav tillfredsställande noggrannhet (AUC = 0, 997), känslighet (100%) och specificitet (96, 7%) för att skilja OSCC-patienter i steg I – II från kontrollen. I framtiden bör efterföljande forskning genomföras för att kliniskt validera dessa potentiella biomarkörer i stora patientkohorter innan de kan användas i verklig klinisk diagnostik.

metoder

Kemikalier

Acetonitril (HPLC-kvalitet) och metanol (HPLC-kvalitet) köptes från Fisher (USA). Destillerat vatten (18, 2 MΩ) renades "internt" med användning av ett ULUPURE-system (Chengdu Ultrapure Technology Co., Ltd, Chengdu, Kina). Ammoniumacetat och ammoniumformiat (Ke long Chemical Reagent Factory, Chengdu, Kina) användes i detta arbete. Myrsyra (HPLC-kvalitet), mjölksyra och karnitin köptes från J&K Chemical Ltd (Peking, Kina). Bärnstenssyra och ornitin köptes från Damas-beta (Shanghai, Kina).

Studiedeltagare

Trettio kineser diagnostiserade med OSCC rekryterades från West China Hospital of Stomatology, West China School of Stomatology, Sichuan University (25 män och 5 kvinnor, klinisk fas: 4 i stadium I, 9 i stadium II, 3 av stadium III och 14 i steg IV). Medelåldern var 55 år (intervall: 29–72). Alla OSCC-patienter diagnostiserades baserat på kliniska och histopatologiska kriterier. De detaljerade kliniska egenskaperna för salivprover som användes i denna studie tillhandahölls i den kompletterande tabellen 1. OSCC-steget upprättades i enlighet med tumörnoder Metastas (TNM) iscensättningssystem (baserat på en kombination av tumörstorlek eller djup (T), lymfknut) spridning (N), och närvaro eller frånvaro av metastaser (M)), utfärdad av American Joint Committee on Cancer (AJCC). Sjukdomstatus och iscensättning av OSCC-patienter erhölls från kliniska register. OSCC-patienter rekryterades alla utan historia av att få medicinering och kirurgisk operation och ingen hade behandlats med kemoterapi och strålbehandling innan provtagning. Kontrollgruppen innehöll trettio ålder könsmatchade cancerfria friska kinesiska frivilliga med 25 män och 5 kvinnor, vars medelålder var 47 år (intervall: 25–69).

Etik uttalande

Den etiska kommittén för West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, godkände protokollet. Alla frivilliga och patienter undertecknade ett etisk kommittés samtyckesformulär som samtycker till att fungera som salivgivare för experimenten. Metoderna genomfördes i ”överensstämmelse” med de godkända riktlinjerna.

Salivsamling och förberedelse

Alla givare ombads att avstå från att röka, äta, dricka eller orala hygienprocedurer under minst en timme före provtagningen och sedan sköljde munnen ordentligt med vatten. Salivprover samlades mellan 9:00 och 11:00 i ett privat rum med standardtekniker. Grovt tre milliliter ostimulerad hel saliv erhölls. Proverna, när de samlades in, centrifugerades vid 12 000 rpm under 20 minuter vid 4 ° C för att avlägsna olösliga material, cellskräp och matrester. Lika stora mängder supernatant (400 mikroliter) överfördes till färska rör och frystes vid -40 ° C tills laboratorieanalysen.

Före analysen tinades fryst saliv och löstes vid rumstemperatur. En blandning av acetonitril / metanol (75:25 volym / volym, 800 ul) sattes till saliv (400 ul) i ett 1, 5 ml Eppendorf-rör för att fälla ut proteiner. Blandningen fick stå under 10 minuter efter virvling i 60 s, och sedan centrifugerades proverna vid 12000 rpm under 20 minuter vid 4 ° C. Supernatanten filtrerades genom sprutfilter (0, 22 um, Jinteng) före UPLC-MS-analys.

UPLC-MS-analys

RPLC-separering utfördes på en ACQUITY UPLC ™ BEH C18-kolonn (50 mm x 2, 1 mm id, 1, 7 um, Waters, Milford, USA). HILIC-separering utfördes på ACQUITY UPLC ™ BEH Amide-kolonn (100 mm x 2, 1 mm id, 1, 7 um, Waters, Milford, USA). Kolonnen hölls vid 45 ° C. Den injicerade provvolymen var 10 mikroliter för varje körning i injektionsläget med full slinga. Flödeshastigheten för mobilfasen var 0, 2 ml / min. I RPLC-modus utfördes gradienteluering med följande lösningsmedelssystem: (A) 0, 1% myrsyra-vatten med 1 mM ammoniumformiat, (B) acetonitril (ACN). Gradienten började med 95% A och minskade till 50% A på 2 minuter, 50% ~ 5% A på 13 minuter, höll vid 5% A under 1 min, vände sig sedan till 95% A omedelbart och höll vid 95% A under 5 min. Isokratisk eluering utfördes i HILIC-läge med följande lösningsmedelssystem: (A) 95: 5 ACN-10 mM vattenhaltig ammoniumacetat, (B) 50:50 ACN-10 mM vattenhaltig ammoniumacetat; 65% A och 35% B under 19 minuter.

Masspektrometriexperiment utfördes på en ortogonal accelererad tid för flygmassespektrometer (Waters, Milford, USA) utrustad med en elektrosprayjonskälla. Data förvärvades i både positiv- och negativjon-V-geometri-läge för varje kromatografiseparationsteknik som genererade fyra separata UPLC-MS-analys. Kapillär- och konspänningarna inställdes på 2000 och 100 V, kongas 30 L / h, desolvationsgas 750 L / h, källtemperatur 110 ° C, desolvationstemperatur 300 ° C. Skanningsområdet var från m / z 50 till 1000 i fullt skanningsläge och data samlades in i centroid-läge. Oberoende referens Lock-massjoner via LockSpray ™ -gränssnittet användes för att säkerställa massnoggrannhet under datainsamling Leucine-Enkephalin (Sigma-Aldrich, [LE + H] +, m / z , 556, 2771) användes som referensförening. Lösningen av LE infunderades genom referensproben med en flödeshastighet av 0, 04 ml / min med hjälp av en andra LC-pump (Waters).

Datahantering och statistisk analys

UPLC-TOF / MS-data från salivprover från båda separationslägen analyserades för att identifiera potentiella diskriminerande biomarkörer. Datainsamling och hantering utfördes av Masslynx 4.1 (Waters). MarkerLynx applikationsansvarig (Waters, Manchester, Storbritannien) har använts för toppfyndning, filtrering och justering. Parametrarna som användes var retentionstiden 0–19 min; retentionstidsfönstret sattes till 0, 2 minuter; massområde 50–1000 Da. Efter en lämplig bearbetning exporterades den resulterande tredimensionella datamatrisen innehållande m / z- retentionstidspar, provnamn och deras normaliserade kromatografiska toppområden (variabler) till SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Sweden) för efterföljande behandling genom multivariat dataanalys inklusive principkomponentanalys (PCA) och ortogonal partiell minsta kvadratisk diskriminantanalys (OPLS-DA). Dessa statistiska metoder genomfördes på data för att identifiera diskriminerande metaboliter i saliv mellan OSCC-patienter och friska individer. De diskriminerande variablerna valdes enligt Variable Importance i Projection (VIP) -värdena och VIP> 1.0 anses vara relevant för gruppdiskriminering 28 . Det icke-parametriska Mann-Whitney U- testet tillämpades för att bedöma skillnaderna i dessa potentiella biomarkörer mellan OSCC och frisk kontrollgrupp. Results were considered significant at a 2-tailed P value of <0.05. The areas under curve (AUC) of receiver operating characteristic (ROC) curves were constructed to evaluate the diagnostic effectiveness of potential biomarkers using SPSS 16.0. The ROC curve procedure is a useful method for evaluating the performance of classification schemes that categorize cases into one of the two groups. AUC value is known to be a useful measure of overall predictor quality, with a value of 1.0 for a perfect predictor and 0.5 for a random predictor.

Metabolites were identified by searches of databases: Human Metabolome Database (//www.hmdb.ca/), MASS Bank (//www.massbank.jp/), KEGG (//www.genome.jp/kegg/ligand.html), and PubChem compound database (//www.ncbi.nlm.nih.gov) using exact molecular weights. Commercial standard reagents were used to support identification of metabolites.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Stödjande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.