E2a-znf384 och nol1-e2a fusion skapad av en kryptisk t (12; 19) (p13.3; p13.3) vid akut leukemi | leukemi

E2a-znf384 och nol1-e2a fusion skapad av en kryptisk t (12; 19) (p13.3; p13.3) vid akut leukemi | leukemi

Anonim

Abstrakt

En 5-årig pojke som ursprungligen presenterade ALL och återfaller 4 månader senare med AML befanns ha ett tillägg (19) i leukemicellerna. FISH avslöjade att tillägget (19) verkligen var en kryptisk t (l2; l9) (p13.3; p13.3) som avbröt E2A ( TCF3 ). Nukleotidsekvenser av klonade genomiska fragment med E2A- omarrangemang avslöjade att der (12) innehöll E2A förenat med en intron av NOLI ( p120 ) -genen. Omvänt transkriptas (RT) –PCR för patientens lymfoblast-RNA visade uttryck av fusions-cDNA-in-frame bestående av de flesta av NOL1 smält till 3'- delen av E2A som kodade en del av den andra transkriptionella aktiveringsdomänen och DNA-bindnings- och proteindimeriseringsmotiv. Den ömsesidiga der (19) E2A genomiska omarrangemangen inkluderade 5 ′ regioner av E2A förenade med en intron av ZNF384 ( NMP4 , CIZ ) genen, lokaliserad ungefär 450 kb centromerisk till NOL1 på kromosom 12. RT – PCR visade uttryck av in-frame E2A -ZNF384 fusions- cDNA. Så vitt vi vet är detta den andra rapporten om en kromosomtranslokation i leukemi vilket resulterar i två olika genfusioner. Detta är den första rapporten om expression av E2A-fusionsprotein som inkluderar DNA-bindnings- och proteindimeriseringsdomäner på grund av en mer proximal brytning i E2A jämfört med de som beskrivits tidigare.

Introduktion

Kromosomen 19p13.3 genen E2A ( TCF3 ) är ett vanligt mål för kromosomtranslokation vid akut lymfoblastisk leukemi (ALL). 1 T (1; 19) (q23; p13), som förekommer hos cirka 5% av barn och vuxna med ALLA, skapar en E2A - PBX1- fusionsgen på der (19). 2, 3 En sällsynt t (17; 19) (q21; p13) detekteras i mindre än 1% av ALLA fall och säkrar E2A till HLF . 4, 5 De genomiska brytpunkterna för dessa translokationer förekommer i ett begränsat område av E2A- genen och skapar E2A-PBX1 och E2A-HLF chimära transkriptionsfaktorer som har transformerande egenskaper i fibroblast och transgena musanalyser. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 E2A avbryts också av en kryptisk inversion av kromosom 19 och / eller vid (19; 19) som smälter E2A till 19q13.4-genen FB1 , även om de funktionella konsekvenserna av detta kromosomavvikelser förstås inte helt. 13

Här beskriver vi kloning av två nya E2A- fusionsgener skapade av en kryptisk t (12; 19) (p13.3; p13.3) hos ett barn som initialt presenterade ALL och en komplex karyotyp och hade tidigt återfall med släktbrytare till akut myeloid leukemi (AML).

Resultat

Upptäckten av en ny E2A-omlokalisering

För att ytterligare karakterisera add (19) (p13.3) som finns i huvudklonen och alla mindre subkloner vid både ALL diagnos och AML-återfall, utförde vi FISH med en tvåfärgad split E2A-sondcocktail som vi utvecklade (figur 2c) . 16 Interfas FISH visade en smält signal och delade gröna och röda signaler som indikerar en balanserad omlokalisering inom ∼ 35 kb-området som separerar sondcocktails och innehåller huvuddelen av E2A- genen. Metafas FISH visade att de centromera kosmiderna bibehölls på der (19) medan de telomera kosmiderna omlokaliserades till den korta (p) armen i den onormala kromosomen 12 benämnd en del (12) (p12p13) i karyotypen. Således innehåller denna leukemi en kryptisk t (12; 19) (p13.3; p13.3) som avbryter E2A . För att oberoende bekräfta att denna translokation avbröt E2A utförde vi metafas FISH med kosmiden R23667, som är belägen mellan telomera och centromera sondcocktails och innehåller större delen av E2A . Dessa studier visade signaler på de normala 19, der (19) och der (12) som indikerade att denna translokation skedde i den centrala delen av R23667 och avbröt E2A (figur 2d). E2A-genarrangemang detekterades i EcoRI och BamHI-digererat DNA med både 3 'och 5' E2A cDNA-prober, vilket bekräftade en translokation inom E2A och närvaron av både der (19) och der (12) kromosomer (data visas inte). De onormala fynden från E2A FISH och Southern blot var närvarande vid tidpunkten för initial diagnos med ALL och vid efterföljande återfall med AML.

Ytterligare FISH-experiment utfördes med användning av en kommersiellt beredd TEL- AML1-sondcocktail och en 12p-underselometer (data visas inte). TEL- genen kvarhålls på der (12) vilket indikerar att kromosom 12-brytpunkten är belägen telomer mot TEL och de flankerande sekvenserna som finns i FISH-sonden. Däremot omplacerades 12 pTel-sonden till der (19), vilket ytterligare bekräftade den ömsesidiga karaktären av translokationen.

Kloning av genomisk fusion av NOL1-E2A

För att ytterligare karakterisera E2A- omarrangemangen konstruerade vi ett genomiskt bibliotek med användning av EcoRI-digererat patient-DNA och screenade det med en 3 ' E2A cDNA-sond (pE47M). Lambda-kloner renades innehållande skär som motsvarade i storlek till de omarrangerade fragmenten. Ändarna på skäret sekvenserades och visade sig motsvara E2A genomiska sekvenser i ena änden och kromosom 12 genomiska sekvenser i den andra änden. Kromosom 12-sekvenserna lokaliserades inom en gen benämnd NOL1 (nukleolärt protein 1; även terme d pl20) . 19 Detaljerad sekvensanalys (GenBank-anslutning nr. EU159435) visade att det fanns ett avbrott i NOL1- intron 14 och E2A- intron 9, vilket förutsade ett chimärt protein med de första 14 (av 15) exonerna av NOL1 smält till C-terminalen av E2A med början med exon 10 (figur 3a). Denna E2A- brytpunkt förekommer mer än 5 ′ än andra E2A- brytpunkter som beskrivits tidigare. RT – PCR-primrar designades och användes för att förstärka NOL1 - E2A-fusionsutskrifter från RNA isolerat från patienten (figur 3b). Sekvensering av PCR-produkter (GenBank-anslutning nr EU155120) visade att de härrörde från NOL1 - E2A-fusionsutskrifter (figur 3c) som förutsägas att koda ett chimärt protein med förening av NOL1 till E2A (figur 3d).

Schematisk representation av NOL1-E2A-fusionsgenen och proteinet. ( a ) Schematiskt diagram över klonat genomiskt DNA som visar fusion i intronet efter NOL1- exon 14 och intronet före E2A- exon 10. ( b ) Omvänd transkriptas (RT) –PCR för patient-RNA förstärker NOL1 - E2A chimära transkript (spår 1 markör, fil 2-RT-PCR-produkt för fil 2). ( c ) cDNA-nukleotidsekvenser av vildtyp NOL1 , E2A och amplifierade NOL1 - E2A fusionsutskrifter . ( d ) Aminosyrasekvenser av vildtyp NOL1, E2A och förutspådd NOL1-E2A chimärt protein. Pilarna anger brytpunkterna.

Bild i full storlek

Deret (19) innehåller E2A smält till en andra kromosom 12-gen, ZNF384

Flera försök att förstärka E2A - NOL1 fusionsutskrifter förutsagda härledda från den ömsesidiga der (19) kromosomen var inte framgångsrika. Vi blev förvånade över dessa fynd eftersom der (19) E2A-fusionsutskrifter uttrycks i alla andra E2A- translokationer och våra FISH och Southern blot-resultat indikerade att der (19) bibehölls. För att undersöka detta ytterligare screenade vi det genomiska biblioteket konstruerat från patient-DNA med en 5 ' E2A- sond (figur 4a). Kloner identifierades, renades och ändarna sekvenserades (GenBank anslutning nr EU159436). Dessa visade fusion av E2A till kromosom 12 med ett avbrott i den förutsagda regionen av E2A men kromosom 12-brytpunkten lokaliserades ungefär 450 kb centromeriskt till NOL1 inom en gen benämnd ZNF384 (zink-fingerprotein 394) benämndes också kärnmatrisproteinisoform 4 ( NMP4 ) eller cas-interagerande zink- fingerprotein ( CIZ ) (figur 4b). 20, 21 RT – PCR för patient-RNA visade amplifiering av transkript av den förutsagda storleken (figur 4c). Sekvensering av PCR-produkter (GenBank-anslutningsnr. EU155119) visade att de härrörde från E2A-ZNF384-fusionsutskrifter (figur 4d) som förutses koda ett chimärt protein med in-frame-fusion av E2A till hela ZNF384: s öppna läsram (figur 4e).

Förutspådd struktur för NOL1-E2A och E2A-ZNF384

Den förutsagda strukturen av kända E2A-fusionsproteiner och de nyligen upptäckta NOL1-E2A och E2A-ZNF384 visas i figur 5. E2A-ZNF384 är strukturellt lik den tidigare beskrivna E2A-PBX1 och E2A-HLF men innehåller mindre av den andra E2A-transkriptionella aktiveringen domän (AD2). Däremot inkluderar NOL1-E2A det mesta av NOL1 smält i ram till C-änden av E2A, inklusive en del av AD2 och bas-helix-loop-helix (bHLH) DNA-bindning och proteindimeriseringsdomän. Denna region av E2A uttrycks inte i något av de tidigare beskrivna E2A-fusionsproteinerna genererade av kromosomtranslokationer.

E2A-chimärer och förutsagda NOL1-E2A- och E2A-ZNF384-proteiner. AD1, AD2, transkriptionella aktiveringsdomäner; bHLH, basic-helix – loop-helix – domän; bZIP, bas-leucin-blixtlås-domän; HD, homeodomain; HCM, HOX samarbetsmotiv. Pilarna indikerar brytpunkter.

Bild i full storlek

Diskussion

Leukemin som vi beskriver var mycket ovanlig och kliniskt aggressiv, med lymfoid morfologi och fenotyp vid initial diagnos. Remission erhölls, men återfall med släktväxel till AML inträffade mindre än 4 månader efter diagnos. De cytogenetiska och molekylära studierna visar tydligt att samma klon var närvarande vid ALL diagnos och AML-återfall. Den mycket komplicerade karyotypen och den låga nivån närvaron av en Ph + subklon vid initial diagnos illustrerar ytterligare den genomiska instabiliteten hos denna leukemi.

FISH-studier avslöjade att en onormal kromosom 19 som observerades i karyotypen hela tiden under den kliniska kursen hos denna patient verkligen var en kryptisk t (12; 19) (p13.3; p13.3). Vi klonade NOL1 - E2A och E2A - ZNF384 DNA-omarrangemang och bekräftade uttryck av fusionsutskrifter som förutses koda kimära proteiner i ramen.

NOL1 är ett starkt konserverat 120 kDa, nukleolärt specifikt, RNA-bindande protein uttryckt av celler tidigt i G1-fasen i cellcykeln och toppar under S-fasen. 19 En stor mängd maligna tumörer uttrycker högre nivåer av NOL1 jämfört med normala, vilande celler. 19, 22, 23 Överuttryck av NOL1 rapporterades transformera NIH3T3-celler, som kunde växa snabbt i nakna möss. 24 Direkt involvering av NOL1 i mänsklig cancer har emellertid inte rapporterats tidigare.

ZNF384 identifierades oberoende som en ny ligand för p130cas-dockningsproteinet, en viktig komponent i integrinreceptorsignaleringsvägen och som en kärnmatrisarkitektonisk transkriptionsfaktor. 21, 25 Flera olika ZNF384-isoformer uttrycks som kodar proteiner som innehåller fem till åtta zinkfingrar. 21, 26 Denna gen visades först vara involverad i human cancer när det upptäcktes att t (12; 17) (p13; q11) och t (12; 22) (p13; q12) -translokationer fusionerade ZNF384 till den relaterade EWSR1 (kromosom 22) eller TAF15 (kromosom 17) gener i akuta leukemier. 27 Både TAF15-ZNF384 och EWSR1-ZNF384 transformerade NIH 3T3-celler, även om transformation inte var beroende av förändrat uttryck av kända ZNF384-målgener. 27 Parallellt med den observationen rapporterade vi E2A - ZNF384- fusion i abstrakt form. 28 Baserat på vår beskrivning, Corveleyn et al. 29 genererade E2A-ZNF384-konstruktioner, visade att de kunde transformera 3T3-celler och föreslog att det viktigaste bidraget från E2A till fusionsproteinet var dess transaktiveringsdomän. Denna hypotes understöddes genom att konstatera att en konstgjord konstruktion bestående av VP16-transaktiveringsdomänen smält till ZNF384 hade liknande transformerande egenskaper. 29

Nyligen har det funnits flera andra rapporter om fusion av E2A - ZNF384 i leukemi. La Starza et al. 30 demonstrerade E2A - ZNF384- fusion via FISH hos en 21-årig hane med ALL förknippade med vad som ursprungligen beskrivs som en del (12) (p13). Barber et al. 32 använde en kommersiell E2A split-signal FISH-sond 31 för att analysera prov från 161 icke-utvalda barn med ALLA. De upptäckte ett fall med en kryptisk t (12; 19) som involverade E2A och lokaliserade brytpunkten 12p13 till en 122 kb-region som inkluderar ZNF384 tillsammans med två andra gener. 32 Följaktligen är E2A - ZNF384- fusion en återkommande abnormalitet vid leukemi; emellertid, ingen av dessa rapporter beskrev de molekylära konsekvenserna av E2A - ZNF384- fusion, och inte heller identifierade NOL1 - E2A- fusion, såsom beskrivs i detalj i denna studie.

Så vitt vi vet är detta bara det andra rapporterade fallet av en kromosomtranslokation som smälter olika delar av en enda gen till två olika gener i leukemi. I ett fall av AML visade sig en insats (10; 11) (p12; q23q12) smälta 5'-delen av 11q23-genen MLL till 3'-delen av 10p12-genen AF10 , medan 5'-delen av AF10 var smält till HEAB vid 11q12. 33 Denna omlokalisering som vi beskriver är också unik eftersom den leder till uttryck av NOL1 - E2A cDNA som inkluderar 3'- änden av E2A , som kodar för bHLH-DNA-bindningen och proteindimeriseringsmotivet. Denna del av E2A uttrycks inte i de andra E2A-translokationerna som hittills har karakteriserats.

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • EU155119
  • EU155120
  • EU159435
  • EU159436