Under akut experimentell infektion med den retikulotropa trypanosoma cruzi-stammen tulahuen il-22 induceras il-23-beroende men kan dispenseras för skydd | vetenskapliga rapporter

Under akut experimentell infektion med den retikulotropa trypanosoma cruzi-stammen tulahuen il-22 induceras il-23-beroende men kan dispenseras för skydd | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Parasitinfektion

Abstrakt

Skyddande immunitet mot Trypanosoma cruzi , det orsakande medlet för Chagas sjukdom, beror på aktiveringen av makrofager med IFN-y och IL-17A. Däremot förhindrar IL-10 immunopatologi. IL-22 tillhör cytokinfamiljen IL-10 och har pleiotropiska effekter under värdförsvar och immunopatologi, men dess roll i skydd och patologi under T. cruzi- infektion har ännu inte analyserats. Därför undersökte vi rollen för IL-22 i experimentell Chagas sjukdom med hjälp av den retikulotropa Tulahuen-stammen av T. cruzi . Under infektion utsöndras IL-22 av CD4-positiva celler på ett IL-23-beroende sätt. Infekterade IL-22 - / - möss uppvisade en ökad produktion av IFN-y och TNF och visade förbättrade antal aktiverade IFN-y-producerande T-celler i sina milar. Dessutom ökades produktionen av IL-10 i IL-22 - / - möss efter infektion. Makrofagaktivering och genom associering påverkades inte parasitemiaen i frånvaro av IL-22. Bortsett från en kortvarig ökning av kroppsviktförlusten visade infekterade IL-22 - / - möss inga tecken på en förändrad immunopatologi under de första fjorton dagarna av infektionen. Sammantaget verkar det, även om IL-22 uttrycks, spela en mindre roll i skydd och patologi under den akuta systemiska infektionen med den retikulotropa Tulahuen-stammen av T. cruzi .

Introduktion

Den obligatoriska intracellulära parasiten Trypanosoma cruzi är det orsakande medlet för Chagas sjukdom, som är vanligt i Central- och Sydamerika. Skyddande immunsvar mot T. cruzi baseras på frisättningen av interleukin (IL) -12 och IL-23 av T. cruzi- infekterade makrofager 1, 2, 3 . IL-12 inducerar interferon-gamma (IFN-y) -produktionen från naturlig mördare (NK) och T-celler 4 . IFN-y aktiverar kväveoxid-syntas (NOS) 2-uttryck och produktionen av reaktiva kväve-mellanprodukter (RNI) i makrofager, vilket är kritiskt för deras trypanocidal aktivitet 5, 6 . Följaktligen uppvisar IFN-y-receptor (R) -mangel ( - / - ) och NOS2 - / - möss en ökad känslighet under T. cruzi- infektion 7 . En annan IL-12-inducerad cytokin är tumörnekrosfaktor (TNF) som spelar en roll för att förstärka RNI-produktion av IFN-y-aktiverade makrofager och därmed bidrar till skyddet 8 . IL-6 produceras också under experimentell T. cruzi- infektion och bidrar till skydd 9, eventuellt genom att aktivera endotelceller för att uppreglera vidhäftningsmolekyler för lymfocytmigrering 10 . Bland andra kemokiner främjar kemokinerna CXC kemokinligand 9 (CXCL9) och CXCL10 skyddande immunsvar mot T. cruzi eftersom neutralisering av dessa kemokiner resulterade i en ökad parasitemi 11 . Inducerat av IL-23, IL-17A verkar också på makrofager och stimulerar deras fagocytiska aktivitet som leder till ett förbättrat dödande av intracellulära T. cruzi- parasiter 12 . Konsekvent är IL-17A - / - möss mycket mottagliga för T. cruzi- infektion som visar en ökad parasitemi samt en ökad dödlighet vid infektion 12, 13 . IL-17A-sekretion in vivo visade sig vara IL-23-beroende som IL-23p19 - / - möss producerade signifikant mindre IL-17A jämfört med C57BL / 6 vildtypsmöss 12 . Kontrollen av T. cruzi- replikation komprimeras anmärkningsvärt i IL-23p19 - / - möss och denna effekt tillskrivs den reducerade IL-17A-produktionen 12 . Eftersom produktionen av IL-22 också är beroende av IL-23 14, 15 kan detta cytokin också bidra till skydd eller patologi under experimentell T. cruzi- infektion.

IL-22 tillhör IL-10-familjen av cytokiner, som också innefattar IL-10, IL-19, IL-20, IL-24 och IL-26 16 . Dess uttryck är begränsat till en delmängd av aktiverade immunceller, inklusive T-celler, särskilt T-hjälpar (Th) 17-celler, och NK-celler 14, 17, 18 . IL-22 signalerar via en heterodimer receptor bestående av IL-10Rp och IL-22R. Medan IL-10Rp uttrycks allmänt, verkar IL-22R-uttryck vara begränsat till epitelceller, keratinocyter och fibroblaster 19 . Följaktligen spelar IL-22 en viktig roll i värdförsvaret mot patogener vid barriärytor, där det stöder barriärintegritet, reglerar sårreparation och stimulerar produktionen av antimikrobiella peptider 20, 21, 22, 23 . Till exempel skyddar IL-22 slemhinnans luftvägsyta mot infektion med den Gram-negativa bakterien Klebsiella pneumodiae 23 . IL-22 kan också minska vävnadsförstörelse i en icke-infektiös modell av conA-inducerad hepatit, där den skyddar levern genom att förbättra tillväxten och överlevnaden av hepatocyter 24 . I motsats till dess skyddande aktivitet kan IL-22 också främja patologisk inflammation, som att främja hudinflammation i en T-cellöverföringsmodell av psoriasisliknande inflammation 25 . När det gäller parasitinfektioner rapporterades att IL-22 bidrar till patogen inflammation i tarmen under oral Toxoplasma gondii- infektion 26 .

När det gäller de pleiotropiska rollerna hos IL-22 i värdförsvar, vävnadsreparation och patologisk inflammation, var vi intresserade av IL-22: s roll i akut experimentell T. cruzi- infektion. T. cruzi infekterar olika vävnader och orsakar patologi i olika organ, såsom hjärtat, mag-tarmkanalen, mjälten och levern. Parasitens genetiska variabilitet avgör vävnadstropism och resultatet av sjukdomen. Retikulotropa stammar föredrar att invadera fagocytiska mononukleära celler (t.ex. i mjälten och levern) medan myotropa stammar tenderar att invadera muskelceller (t.ex. i hjärtat). Eftersom IL-22 är känt för att vara involverat i skyddet av hepatocyter under hepatit 24, använde vi här den retikulotropa T. cruzi- stammen Tulahuen som huvudsakligen infekterar mjälte- och leverceller och inducerar splenomegali och leverpatologi 27, 28, 29, 30, 31 till analysera detta cytokins roll för skydd och / eller patologi under experimentell Chagas sjukdom.

Resultat

IL-23-beroende produktion av IL-22 under experimentell T. cruzi- infektion

Vi bestämde först om IL-22 inducerades under experimentell T. cruzi- infektion och analyserade Il22- genuttrycket i mjälte, lever, hjärta, tunntarmen, kolon och cecum av naiva C57BL / 6-möss och möss infekterade med 500 T. cruzi trypomastigoter ( Fig. 1A). Il22 mRNA inducerades i mjälten och i hjärtat dag 14 efter infektion, medan det inte var detekterbart i levern under infektionen (fig. 1A). Däremot uttrycktes Il22- mRNA redan i tarmstrukturer hos naiva möss och tycktes nedregleras som svar på T. cruzi- infektion i tunntarmen och kolon (fig. 1A). Dessutom observerade vi ökade nivåer av IL-22 i sera från C57BL / 6-möss efter 14 dagars infektion (fig. 1B). Därefter bestämde vi om produktionen beror på IL-23. Därför infekterade vi C57BL / 6 och IL-23p19 - / - möss ip med 500 T. cruzi trypomastigoter och analyserade Il22- genuttryck i milar av naiva och infekterade möss. Il22 mRNA uttrycktes i mjälten av C57BL / 6, men inte av IL-23p19 - / - möss, 14 dagar efter infektionen, vilket indikerar att IL-22 produceras under T. cruzi- infektion på ett IL-23-beroende sätt (Fig 1C). För att ytterligare karakterisera IL-22-producerande celler stimulerades mjältceller av naiva och infekterade C57BL / 6-möss med anti-CD3 / CD28 eller med T. cruzi- antigen och analyserades med flödescytometri. Efter uteslutning av dubbletter (CD90.2 mot SSC-W och FSC-A mot FSC-H) och autofluorescerande celler, gatedes celler på CD90.2 + CD4 + eller CD90.2 + CD8 + celler respektive analyserad för IL-22- och IFN-y-produktion (Fig. 1D). Medan både CD4 + och CD8 + T-celler producerade IFN-y under T. cruzi- infektion, var endast CD4 + T-celler positiva för IL-22 på dagen 14 efter infektion efter ospecifik eller antigen-specifik stimulering (Fig. 1D, E).

Image

C57BL / 6-möss infekterades ip med 500 T. cruzi trypomastigoter. ( A ) Il22- mRNA-uttryck i mjälten, levern, hjärtat, tunntarmen, tjocktarmen och cecum kvantifierades genom realtids-PCR. ( B ) Koncentrationen av IL-22 i sera bestämdes med cytometrisk pärlgrupp. ( C ) möss C57BL / 6 och IL-23p19 - / - möss infekterades ip med 500 T. cruzi trypomastigoter och Il22 mRNA-uttrycket i mjälten kvantifierades med realtids-PCR vid den angivna tidpunkten efter infektion. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser för 4-5 möss per grupp. ( D ) Den intracellulära IL-22- och IFN-y-produktionen av C57BL / 6-mjältceller analyserades genom flödescytometri efter anti-CD3 / CD28-stimulering eller specifik stimulering med T. cruzi- antigen. Cellerna gatedes på CD90.2 + CD4 + respektive CD90.2 + CD8 + T-celler. Som visas är representativa prickdiagram från 5 möss per grupp. ( E ) Procentandelar av IL-22-producerande celler ur CD90.2 + CD4 + T-celler efter anti-CD3 / CD28-stimulering eller efter antigenspecifik stimulering (såsom visas i ( D )). Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser för 5 möss per grupp. och detekteras inte; ni inte smittad.

Bild i full storlek

Ökad T-cellaktivering och förbättrad utsöndring av pro- och antiinflammatoriska cytokiner i T. cruzi- infekterade IL-22 - / - möss

Därefter bedömde vi om IL-22-brist påverkade cytokin- och kemokinproduktion under T. cruzi- infektion (fig. 2). Medan utsöndringen av IL-6 från mjältceller påverkades inte av bristen på IL-22, ökades mjältproduktionen av IFN-y, TNF och IL-10 i IL-22 - / - möss jämfört med vildtypsmöss vid dag 14 efter infektion. IL-17A var nästan odetekterbar i båda musgrupperna under infektionen (fig. 2A). Eftersom rekombinant IL-22 tidigare visades minska Cxcl9- uttryck under lungfibros 32, analyserade vi också CXCL9-utsöndring med mjältceller från infekterade C57BL / 6 och IL-22 - / - möss. Vi fann emellertid en oförändrad CXCL9 kemokinproduktion vid IL-22-brist (Fig. 2A). För att bestämma, om IL-22-bristen påverkar rekryteringen av T-celler under T. cruzi- infektion, undersökte vi milt-T-cellpopulationer med flödescytometri. I jämförelse med C57BL / 6-djur visade IL-22 - / - möss förbättrade procentsatser av aktiverade (CD44 + CD62L - ) CD4 + och CD8 + T-celler i mjälten (Fig. 2B). Dessutom avslöjade flödescytometriska analyser förbättrade procentsatser av IFN-y-utsöndrande milt CD4 + och CD8 + T-celler i T. cruzi- infekterade IL-22 - / - möss över C57BL / 6-möss (fig. 2C). Vi analyserade också om procentsatserna av regulatoriska T-celler (T- regs ) påverkades av frånvaron av IL-22. Medan effektor T-celler expanderar under T. cruzi- infektion i C57BL / 6-möss, uppvisar Foxp3 + T- regs en minskad proliferationsgrad och förhållandet mellan T- regs och effektor-T-celler minskar under infektionen 33 . Denna effekt observerades också i C57BL / 6 och i IL-22 - / - möss, där procentandelarna av Foxp3 + CD25 + T-celler av totala CD4 + mjältceller minskade under infektionsförloppet (fig. 2D). Det fanns emellertid ingen skillnad i procentandelen T- regs mellan C57BL / 6 och IL-22 - / - möss (fig. 2D), vilket antydde att IL-22 inte påverkar utvecklingen av T- regs hos icke-infekterade möss och under T. cruzi- infektion. Sammantaget observerade vi en ökad sekretion av TNF, IFN-y, IL-10 såväl som ett förbättrat antal IFN-y-producerande T-celler i mjälten hos infekterade IL-22 - / - möss.

Image

C57BL / 6-möss och IL-22 - / - möss infekterades ip med 500 T. cruzi trypomastigoter. ( A ) Enkelcellsuspensioner av mjältceller odlades under 24 timmar och utsöndringen av olika cytokiner och kemokiner i supernatanten bestämdes med cytometrisk pärlgrupp. ( B ) Mjältceller analyserades med flödescytometri vid de angivna tidpunkterna efter infektion. Visad är procenttalet av aktiverade (CD44 + CD62L - ) celler av CD90.2 + CD4 + respektive CD90.2 + CD8 + mjältceller. ( C ) Mjältceller stimulerades med anti-CD3 / CD28 eller lämnades ostimulerade och analyserades för intracellulär IFN-y-produktion. Visad är procenttalet av IFN-y-producerande celler av CD90.2 + CD4 + respektive CD90.2 + CD8 + mjältceller. ( D ) Procentandelen Foxp3 + CD25 + T- register från CD4 + T-celler analyserades med flödescytometri. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser för 5 möss per grupp. * och ** indikerar statistisk signifikans (p <0, 05 respektive p <0, 01) jämfört med C57BL / 6 vildtypsmöss.

Bild i full storlek

IL-22 påverkar inte makrofagaktivering under T. cruzi- infektion

Makrofager representerar en viktig plats för T. cruzi- replikation i den akuta infektionsfasen, särskilt för retikulotropa T. cruzi- stammar, såsom Tulahuen-stammen. IFN-y-aktiverade makrofager är emellertid de viktigaste effektorcellerna som kontrollerar T. cruzi- replikering genom produktion av RNI, som dödar intracellulära parasiter genom kemisk modifiering av de strukturella egenskaperna för T. cruzi- makromolekyler. Dessutom är det IFN-y-inducerbara p47GTPas LRG-47 direkt involverat i dödandet av parasiter av makrofager 34 . Eftersom vi hittade ett ökat antal IFN-y-producerande celler i mjälterna från IL-22 - / - möss, analyserade vi nästa makrofagaktivering av T. cruzi- infekterade C57BL / 6 och IL-22 - / - möss. Flödescytometrisk analys avslöjade att antalet makrofager (CD90.2-, CD11b +, CD11c +, Gr1-, MHCII + ) påverkades inte på IL-22-brist (C57BL / 6-möss, 0, 98 × 10 6 ± 0, 47 × 106 ; IL-22 - / - möss, 1, 14 × 10 6 ± 0, 46 × 106 på dag 14 efter infektion). Vidare uppvisade makrofager från IL-22 - / - möss ett oförändrat MHCII-uttryck jämfört med vildtypsmakrofager under infektion (Fig. 3A). Genuttrycket för Nos2 och Lrg47 , som kodar huvudproteinerna med trypanocidal aktiviteter NOS2 och LRG-47, skilde sig inte heller mellan vildtyp och IL-22 - / - möss (Fig. 3B). Genuttryck av Argl som kodar för ARG1, som främjar intracellulär tillväxt av T. cruzi- parasiter 35, 36 var också identisk i infekterade IL-22 - / - och C57BL / 6-möss (fig. 3B). Följaktligen avslöjade histologisk analys oförändrat NOS2-uttryck i mjältar, levern och hjärtan (fig. 3C, E, F) såväl som ett liknande ARG1-uttryck i mjälten (fig. 3D) i båda musgrupperna, medan ARG1 inte uttrycktes i hjärtsektioner. (data visas inte). Således förändrar IL-22-brist inte MHC-II, NOS2 och ARG1-expression under T. cruzi- infektion in vivo .

Image

C57BL / 6-möss och IL-22 - / - möss infekterades ip med 500 T. cruzi trypomastigoter. ( A ) Medel fluorescerande intensitet (MFI) för MHCII (IA / IE) -uttryck på miltmakrofager (CD90.2 -, CD11b +, CD11c +, Gr1 -, MHCII + ) detekterades med flödescytometri. ( B ) mRNA-expression av Nos2 , Lrg47 och Arg1 i mjälten analyserades genom realtids-PCR vid den angivna tidpunkten efter infektion. Liknande resultat erhölls i två oberoende experiment. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser för 5 möss per grupp (2–5 oinfekterade möss per grupp). ( C ) Orgelsektioner av mjälte ( C, D ), lever ( E ) och hjärta ( F ) färgades för NOS2 ( C, E, F ) och för ARG1 ( D ) och räknades med hematoxylin. Representativa sektioner från fem möss per grupp (2 oinfekterade möss per grupp) visas. Förstoring: mjälte, lever 100x; hjärta 200x.

Bild i full storlek

IL-22 har ingen effekt på parasitdödande av in vitro- infekterade makrofager

Som vi har publicerat tidigare stimulerar IL-17A parasitdödning i makrofager utan att inducera Nos2 eller Lrg47 uttryck 12 . Det stimulerar snarare den fagocytiska aktiviteten hos makrofager. Således bedömde vi därefter om IL-22 bidrar till parasitdödande genom att påverka det intracellulära ödet av T. cruzi i makrofager. I linje med detta visades IL-22 förbättra fagolysosomal fusion i Mycobacterium tuberculosis- infekterade humana makrofager och hämma mycobacterial tillväxt 37 . För att testa den direkta effekten av IL-22 på makrofager, stimulerade vi BMDM med rekombinant IL-22, IFN-y som kontroll eller båda cytokiner under 2 timmar och infekterade dem med T. cruzi- kultur trypomastigoter (fig. 4). Extracellulära parasiter avlägsnades 2 timmar efter infektion och cellerna inkuberades åter i närvaro av respektive cytokiner. 48 timmar efter infektion bestämde vi det endocytiska indexet, vilket motsvarar procentandelen infekterade celler multiplicerat med det genomsnittliga antalet intracellulära amastigoter. Ostimulerade BMDM uppvisade ett högt endocytiskt index, vilket antydde att parasiterna överlevde och replikerades i dessa celler. Däremot kunde IFN-y-stimulerade BMDM uppenbarligen döda parasiter, eftersom det endocytiska indexet tydligt reducerades. IL-22 påverkade emellertid varken det endocytiska indexet för ostimulerade eller IFN-y-stimulerade makrofager. Därför drog vi slutsatsen att IL-22 inte direkt förstärker parasitdödning i ostimulerade eller stimulerade makrofager.

Image

BMDM behandlades med rekombinant IL-22, IFN-y eller båda cytokiner under 2 timmar och infekterades därefter med T. cruzi- kultur trypomastigoter. Extracellulära parasiter avlägsnades 2 timmar efter infektion och cellerna inkuberades åter i närvaro av respektive cytokiner. 48 timmar efter infektion bestämdes det endocytiska indexet (procent av infekterade celler multiplicerat med det genomsnittliga antalet intracellulära amastigoter) efter Hemacolor-färgning. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser för triplikatkulturer.

Bild i full storlek

Kontroll av T. cruzi- infektion påverkas inte av frånvaron av IL-22

Därefter bedömde vi resultatet av akut T. cruzi- infektion i C57BL / 6 och IL-22 - / - möss. För att analysera parasitemi, vävnadsbelastningar, dödlighet och kroppsviktförändringar injicerade vi antingen 50 parasiter ip, vilket motsvarar en dos under den 50% dödliga dosen på 75 parasiter (Fig. 5A – D) eller en högre dos på 500 blod- trypomastigoter, respektive (Fig. 5E – H). Parasitemin skilde sig inte mellan C57BL / 6 och IL-22 - / - möss under lågdosinfektion (fig. 5A). IL-22 - / - möss tycktes emellertid vara mer effektiva för att rensa parasiterna eftersom inga trypomastigoter var detekterbara dag 27 efter infektion i IL-22 - / - möss, medan C57BL / 6-möss uppvisade detekterbara antal parasiter fram till dag 43 efter infektion. Följaktligen minskade parasitbelastningarna i mjältar, lever och hjärtan dag 28 efter infektion i frånvaro av IL-22 (Fig. 5B). IL-22 - / - möss visade en signifikant ökad kroppsviktförlust under tidig infektion (Fig. 5C), vilket kan vara ett tecken på patologi. Den ökade kroppsviktförlusten hos infekterade IL-22 - / - möss var emellertid endast övergående och påverkade inte dödligheten (Fig. 5D). Samma effekter sågs också under en infektion med 500 parasiter. IL-22 - / - möss kunde kontrollera T. cruzi- infektion (Fig. 5E), men de uppvisade också en ökning av kroppsviktförlust (Fig. 5F). Analysen av vävnadsbelastningar under tidig infektion med 500 parasiter avslöjade en oförändrad parasitbörda i mjältarna och tunntarmen och ökade bördor i levern hos IL-22 - / - möss (Fig. 5G). Detta är i överensstämmelse med parasitemiaen, som verkar vara oförändrad eller till och med något ökad hos IL-22 - / - möss under tidig infektion. Mikroskopisk analys av hematoxylin / eosin (H&E) -stained hjärtsektioner avslöjade att detekterbara parasitbo var mycket sällsynta (endast närvarande i en av fem möss i båda grupperna) och liknande i båda musgrupperna (fig. 5H).

Image

I ( A – D ) infekterades C57BL / 6 och IL-22 - / - möss ip med en sublethal dos av 50 T. cruzi blod trypomastigoter. Parasitemi ( A ), vävnadsparasitbördar ( B ) kroppsviktförändringar ( C ) och överlevnad ( D ) bedömdes under den akuta infektionen. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser på 10 möss per grupp. Ett av tre oberoende experiment med jämförbara resultat visas. I ( E – H ) infekterades C57BL / 6 och IL-22 - / - möss ip med en hög dos av 500 T. cruzi blod-trypomastigoter. Parasitemi ( E ), kroppsviktförändringar ( F ) och vävnadsparasitbelastningar ( G ) bedömdes under den akuta infektionen. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser för 5 möss per grupp (2 oinfekterade möss per grupp). ( H ) H & E-färgade hjärtsektioner analyserades med avseende på närvaro av parasit bon (pilar). 5 möss per grupp analyserades. Förstoring 400x. * och ** indikerar statistisk signifikans (p <0, 05 respektive p <0, 01) jämfört med C57BL / 6 vildtypsmöss.

Bild i full storlek

Eftersom NOS2, LRG-47 och ARG1-uttryck av makrofager var oförändrade in vivo i IL-22 - / - möss och IL-22 påverkade inte parasitdödning av makrofager in vitro , var det faktum att parasitemiaen inte påverkades av frånvaron av IL- 22 var inte förvånande. Den förbättrade kroppsviktförlusten hos IL-22 - / - möss indikerade emellertid en roll av detta cytokin i att reglera utvecklingen av immunopatologi under den akuta infektionen.

Oförändrad immunopatologi av IL-22 - / - möss under akut T. cruzi- infektion

T. cruzi infekterar flera organ under den akuta infektionen och orsakar organpatologi. Speciellt inducerar den retikulotropa Tulahuen-stammen leverpatologi och splenomegali under den akuta fasen av experimentell Chagas sjukdom 27, 28, 29, 30, 31 . Eftersom IL-22 är känt för att vara involverad i vävnadsreparation, sårläkning och skydd mot hepatit 24, antagde vi att den T. cruzi Tulahuen-inducerade patologin kan förändras i frånvaro av IL-22. För att ta itu med detta problem analyserade vi mjälte-, lever- och hjärtsektioner mikroskopiskt efter högdosinfektion med 500 T. cruzi- blodtrypomastigoter (Fig. 6A – C). Vi observerade en förstörelse av den miltiska arkitekturen efter 14 dagar av infektion, vilket var jämförbart i båda musgrupperna (Fig. 6A). Inflammatorisk cellinfiltration i levern och hjärtat som observerades dag 14 efter infektion var liknande i C57BL / 6 och IL-22 - / - möss (Fig. 6B, C). Eftersom T. cruzi- parasiter också hittades i tarmstrukturer (fig. 5G), analyserade vi också H & E-färgade delar av tjocktarmen (fig. 6D), tunntarmen och cecum (data visas inte) för patologiska förändringar, t.ex. döda celler i lumen, förändringar av ytepitel (sår, desquamation), i slemhinnan (inflammatorisk infiltration) och submukosa (ödem). Emellertid visade inte kolon (fig. 6D) såväl som tunntarmen eller cecum (data visas inte) några tecken på patologi. För att ytterligare utvärdera patologiska förändringar analyserade vi kollagenavlagring i de olika organen. En azan-trikromfärg avslöjade endast dålig kollagenavsättning i mjälte, lever, hjärta och kolon, vilket inte påverkades av bristen på IL-22 (Fig. 6E – H). I överensstämmelse med vår mikroskopiska analys ökade serumnivåerna av aspartattransaminas (AST) och alanintransaminas (ALT) (vilket indikerar leverförstörelse) under infektionsförloppet med en topp dag 14 efter infektion, men var likartade i båda musgrupperna ( Fig. 6I). I överensstämmelse med den retikulotropa kännetecknen för Tulahuen-stammen observerade vi inte en induktion av serumkreatinkinasnivåer (CK) i båda musgrupperna under de första 24 dagarna efter infektionen, vilket skulle vara en indikator på skador på hjärta och skelettmuskel 38, 39 . Sammantaget har IL-22 ingen signifikant inverkan på T. cruzi- inducerad akut immunopatologi.

Image

C57BL / 6-möss och IL-22 - / - möss infekterades ip med 500 T. cruzi trypomastigoter. Vävnadssektioner av mjälte ( A, E ), lever ( B, F ), hjärta ( C, G ) och kolon ( D, H ) färgades med H&E ( A - D ) eller med azantrikrom ( E - H ). Representativa sektioner från fem möss per grupp (2 oinfekterade möss per grupp) visas. Förstoring: mjälte, lever, kolon 100x; hjärta 200x. Lever-härledda enzymer ALT och AST ( I ) och CK ( J ) kvantifierades i sera vid de angivna tidpunkterna efter infektion. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelser för 5 möss per grupp (2–5 oinfekterade möss per grupp). Liknande resultat erhölls i två oberoende experiment.

Bild i full storlek

Diskussion

Det antiinflammatoriska cytokinet IL-10 spelar en viktig roll under experimentell T. cruzi- infektion genom att reglera överskott av pro-inflammatoriska immunsvar och förhindra immunopatologi 29, 40 . Rollen för den nära besläktade cytokinet IL-22 under T. cruzi- infektion undersöktes emellertid inte tidigare. IL-22 är ett pleiotropiskt cytokin som å ena sidan stöder värdresistens och vävnadsreparation, men å andra sidan också är involverat i patologisk inflammation 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 . Vi visar här att IL-22 produceras under T. cruzi- infektion och analyserade resultatet av akut systemisk T. cruzi- infektion i IL-22 - / - möss med användning av den retikulotropa Tulahuen-stammen av T. cruzi .

IL-22-brist åtföljdes av en ökad produktion av de pro-inflammatoriska cytokinerna TNF och IFN-y under T. cruzi- infektion. Chemokinet CXCL9 är viktigt för migrering av Th1-celler och har visat sig främja skyddande immunsvar under experimentell T. cruzi- infektion 11 . En tidigare studie visade att rekombinant IL-22 kan minska Cxcl9- uttrycket 32, kanske genom att verka på epitelceller som har IL-22-receptorn. I den studien skyddar IL-22 mot lungfibros genom att undertrycka den CXCL9-beroende rekryteringen av CD4 + T-celler i lungan. Under T. cruzi- infektion kontrollerar IL-22 också rekryteringen av T-celler i mjältar eftersom vi observerade ökat antal aktiverade T-celler, såväl som förbättrade procenttal av IFN-y-utsöndrande T-celler i mjälterna vid IL-22-brist. Detta verkar emellertid vara oberoende av CXCL9, eftersom vi fann en oförändrad CXCL9-utsöndring av bristen på IL-22 under infektion.

Icke desto mindre förstärktes inte bara utsöndringen av proinflammatoriska cytokiner, utan också produktionen av det antiinflammatoriska cytokinet IL-10 ökade i IL-22 - / - möss under T. cruzi- infektion. IL-10 kan direkt verka på makrofager och hämma det IFN-y-inducerade uttrycket av NOS2 och därigenom hämma parasitdödande 41 . Detta kan vara anledningen till att vi observerade ett oförminskat NOS2- och LRG-47-uttryck i infekterade IL-22 - / - möss trots ökad produktion av IFN-y.

Dessutom observerade vi inte direkta effekter av rekombinant IL-22 på parasitdödning av makrofager in vitro , som vi tidigare har visat för IL-17A 12 . Följaktligen avslöjar våra data att IL-22 är fördelbar för kontroll av T. cruzi- tillväxt in vivo .

T. cruzi infekterar flera olika organ och orsakar organpatologi. Medan myotropa T. cruzi- stammar företrädesvis infekterar kardiomyocyter och orsakar hjärtpatologi, finns reticulotropa T. cruzi- stammar, såsom Tulahuen-stammen som vi använde, mer i mjälten och levern, där de kan inducera svår leverpatologi och splenomegali. IL-22 är direkt involverad i vävnadsombyggnad och skyddar till exempel hepatocyter under conA-inducerad hepatit 42 . Liksom IL-10 kan IL-22 också reglera översvämning av pro-inflammatoriska immunsvar och skyddar härmed från patologi. När vi observerade en tillfällig ökad viktminskning under infektionen antog vi att den akuta immunopatologin kan förändras i frånvaro av IL-22.

I överensstämmelse med den retikulotropa karaktären hos Tulahuen-stammen såg vi en förstörelse av miltarkitekturen och inflammatorisk cellinfiltration i levern samt ökade AST- och ALAT-nivåer i båda musgrupperna under infektionsförloppet Men vi hittade inga skillnader mellan infekterade C57BL / 6 och IL-22 - / - möss. I överensstämmelse med upptäckten att den ökade kroppsviktförlusten endast är övergående och mössen återhämtar börjar AST- och ALT-nivåerna att minska igen vid infektion dag 24 efter infektion. Eftersom vi inte observerade Il22- mRNA-uttryck i levern, produceras IL-22 uppenbarligen inte som svar på T. cruzi- infektion för att skydda hepatocyter från T. cruzi- inducerad leverpatologi. Men när vi observerade en induktion av Il22 mRNA-uttryck i hjärtat under infektion, analyserade vi också akut hjärtspatologi. Till skillnad från myotropa T. cruzi- stammar, som inducerar en omfattande skada på hjärtmuskeln och en ökning av CK-serumnivåer 38, lyckades Tulahuen-stammen som vi använde här inte inducera histopatologiska förändringar i hjärtat och en ökning av CK-nivåer under de första 24 dagar med infektion. Eftersom kroppsviktförlusten bara var övergående och mössen återhämtade antar vi att möss inte kommer att utveckla svår hjärtspatologi vid senare tidpunkter. Eftersom IL-22 är involverad i tarminflammation dag 8 efter T. gondii- infektion 26, 43, analyserade vi också tarmstrukturer i T. cruzi- infekterade möss. Även om T. cruzi- parasiter var närvarande i tarmstrukturer såsom visas med PCR i realtid (fig. 5G), visade dessa strukturer inga tecken på patologi i båda musgrupperna (fig. 6D, H).

Sammantaget hittade vi inga skillnader i patologi mellan IL-22 - / - och vildtypsmöss. Emellertid kan bristen på IL-22 kompenseras av en ökad IL-10-produktion, ett cytokin som är känt för att förbättra immunopatologin under T. cruzi- infektion 29, 40 . Anledningen till att IL-22 - / - möss uppvisade en ökad kroppsviktförlust under infektion, men inte en ökad patologi i kompensation till möss av vildtyp är oklart. Eftersom den ökade kroppsviktförlusten endast är tillfällig och IL-22 - / - mössen återhämtat sig kan skillnader i patologin vara så glesa att det inte kan upptäckas med våra metoder. En patologi, som är detekterbar med histologi, skulle förmodligen inte leda till återhämtning och överlevnad av möss.

I enlighet med en oförändrad patologi påverkades överlevnadshastigheter inte av frånvaron av IL-22 efter infektion med 50 parasiter. På grund av det faktum att parasitemiaen och patologin också var oförändrad mellan båda musgrupperna efter infektion med 500 parasiter, kan vi också förvänta oss en oförändrad dödlighet hos möss infekterade med denna högre dos.

IL-22 medierar snarare sina skyddande effekter på barriärytor och verkar spela en mindre roll under systemiska infektioner. Konsekvent har det rapporterats att IL-22 - / - möss är resistenta mot systemisk T. gondii- infektion, men är mottagliga efter oral infektion med denna parasit 26 . I detta avseende, även om IL-22 verkade vara fördelaktigt för utvecklingen av immunitet mot systemisk T. cruzi- infektion, kan det spela en roll när möss infekteras på andra vägar. Intag av parasitförorenad mat via oral väg är ett viktigt sätt att överföras till människor i vissa områden 44 . Därför kommer det att vara intressant att analysera skydd och patologi för IL-22 - / - möss under oral T. cruzi- infektion i framtiden. När det gäller patologi förmedlar IL-22 skydd i mag-tarmkanalen vid inflammatorisk tarmsjukdom 22, men inducerar skadliga immunsvar under oral T. gondii- infektion som leder till patologi 26 . Således kan IL-22 under T. cruzi- infektion inducera antingen skadliga eller användbara inflammatoriska svar. När det gäller skydd är det tänkbart att IL-22-inducerad produktion av antimikrobiella peptider i tarmstrukturer kan skydda från oral T. cruzi- infektion. Även om det inte är klart om T. cruzi är mottagligt för antimikrobiella peptider från mus, har det tydligt visats att vissa antimikrobiella peptider från däggdjur, såsom den svin-antimikrobiella peptiden NK-lysin 45 och det humana defensinet a-1 46, kan orsaka T. cruzi förstörelse genom störning av ytmembranintegriteten.

Dessutom inkluderade vår studie inte experiment för att bestämma IL-22: s roll under kronisk T. cruzi- infektion. Antiinflammatoriska cytokiner, särskilt IL-10, är ​​kända för att mediera skyddande effekter under den kroniska fasen av sjukdomen, till exempel visades det att patienter, som förblir asymptomatiska, uppvisar ett ökat IL-10-uttryck jämfört med patienter med hjärtsjukdom och har förmåga att nedmodulera immunsvar på ett sätt som begränsar patologin 47 . Således kommer det att vara intressant att analysera IL-22, en medlem av IL-10-familjen, i en musmodell av kronisk hjärtsjukdom som använder myotropa T. cruzi- stammar i framtiden.

Sammantaget, även om IL-22 uttrycks under T. cruzi- infektion, spelar det en mindre roll i skydd och patologi under den akuta fasen av experimentell infektion med Tulahuen-stammen.

metoder

Möss och parasiter

IL-23p19 - / - 48 och IL-22 - / - 49 avelspar tillhandahöll vänligt av Nico Ghilardi (Genentech, South San Francisco, CA USA) och Jean-Christophe Renauld (Ludwig Institute for Cancer Research, Bryssel, Belgien), respektive. Båda stammarna var på en C57BL / 6-bakgrund. Mutanta möss och C57BL / 6 vildtypsmöss uppföddes under specifika patogenfria förhållanden i djuranläggningen i Research Center Borstel. För infektionsförsök användes T. cruzi- stammen Tulahuen (WHO-referensstam M / HOM / CH / 00 / Tulahuen C2). För att undvika genetiska modifieringar av parasitstammen genom seriella passager hos möss lagrades ett stamlager av blodtrypomastigoter erhållna från infekterade immundefekta djur. Detta tillvägagångssätt tillät oss att bevara en stabil virulens av stammen fortfarande med en LD50 av 75 parasiter. För att erhålla ett stort antal T. cruzi- blodform trypomastigoter för infektionsförsök och för att förhindra överföring av lymfocyter och antikroppar infekterades SCID-möss (köpt från Charles River, Sulzfeld, Tyskland) ip med alikvoter av dessa kryokonserverade T. cruzi- stabiliserade. På dag 12 efter infektion uppsamlades blod från infekterade SCID-möss, blandade med heparin, och parasiter berikades i plasma genom differentiell centrifugering. Parasiter återsuspenderades i PBS / 0, 5% glukos och användes för ip-infektion av kvinnliga möss i åldern 8 till 12 veckor. En infektionsdos på 500 blodtrypomastigoter användes för att inducera påvisbara inflammatoriska cytokinsvar och patologi. För bestämning av parasitemi och mortalitet användes en dos under den 50% dödliga dosen på 75 parasiter. Under infektionsförsök hölls möss under barriärförhållanden i BSL 3-anläggningen vid Research Center Borstel i individuellt ventilerade burar. Alla experiment genomfördes enligt de tyska lagarna om djurskydd och godkändes av djurforskningens etiknämnd vid miljöministeriet, Kiel, Tyskland. För in vitro- experiment odlades T. cruzi- parasiter in vitro genom vecka inokulering av semiconfluent LLC-MK2-celler med trypomastigoter som dragits från supernatanter från tidigare infekterade celler. Trypomastigoter från T. cruzi- kultur odlades från LLC-MK2-celler, resuspenderades i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (Biochrom), kompletterat med 2 mM L-glutamin, 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (Gibco), penicillin och streptomycin (100 U / ml respektive 100 μg / ml; Biochrom) och användes direkt för in vitro- experiment.

Bestämning av parasitemi

Blodparasitemi bestämdes i 3 ul halvvenblod som löstes i 27 pl NH4Cl (0, 87% [vikt / vol]) och livskraftiga parasiter räknades i en hemocytometer som beskrivits tidigare 50 . Parasitemi bestämdes och stirrade på infektion dag 7 efter varannan till fyra dagar.

Kvantifiering av vävnadsparasitbelastningar med kvantitativ PCR i realtid

Vi använde hela hjärtan och 50 mg mjälte-, lever- och tarmvävnad för genomisk DNA-extraktion och analyserade vävnadsparasitbelastningarna i dessa organ med kvantitativ PCR i realtid. En 70 bp sekvens av 140/116-kDa antigengenen från T. cruzi (accessionsnummer U15616) amplifierades med den främre primern 5'-ACT CAT CGG GTT TGA AGC AT-3 ', den omvända primern 5'-GCC AGG GTC TAG TAC TCT TTG CT-3 ′ och den interna sonden 5′-CAG CAG GC-3 ′. En 107 bp-sträcka av den murina hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferasgen ( Hprt ) -gen , som användes för kvantifiering av värd-DNA, förstärktes med den främre primern 5'-GTG GCC CTC TGT GTG CTC-3 ', den omvända primern 5'-TCT ACA GTC ATA GGA ATG GAT CTA TCA-3 ′, och den interna sonden 5′-ACC TGC TG-3 ′. Kvantitativ PCR utfördes på en Light Cycler 480 (Roche Diagnostics). Data analyserades med användning av "Second Derivative Maximum Method" och "Standard Curve Method".

Histologi

För histologi fixerades organ (hälften av mjälten, hela hjärtan, vänster leverlober och 1 cm tarmstrukturer) i 4% formalin / PBS, sattes i paraffinblock och delades (2 mikrometer). Histopatologiska analyser utfördes med användning av standardprotokoll för H & E-färgning. För NOS2-färgning färgades vävnadssektioner med en kanin-anti-mus iNOS / NOS II-antikropp (Merck Millipore), en sekundär biotinmärkt getantikropp för getter (Dianova), Vectastain Elite ABC-kit Standard (Vector Laboratories) och DAB-peroxidasunderlagssats (Vector Laboratoties). För ARG1-färgning färgades sektioner med användning av en get-anti-mus-arginas-1-antikropp (Santa Cruz), en sekundär biotin-märkt kanin-anti-get-antikropp (Dianova), Vectastain Elite ABC-kit Standard (Vector Laboratories) och DAB-peroxidas-substratet kit (Vector Laboratoties). NOS2- och ARG1-färgade sektioner motverkades med hematoxylin. För att demonstrera kollagenavsättning färgades olika organ med azantrikrom och analyserades mikroskopiskt.

AST, ALT och CK-analys

Serum framställdes med användning av BD Microtainer SST Tubes (BD Pharmingen). AST-, ALT- och CK-aktivitet bestämdes i en volym av 32 ul serum med användning av Reflotron® System of Diagnosis (Roche Diagnostics).

Kvantifiering av mRNA-expression av immunrelaterade gener med kvantitativ PCR i realtid

50 mg organ (mjälte, lever, hjärta, tunntarmen, kolon och cecum) homogeniserades i 4 M guanidinium-isotiocyanatbuffert och totalt RNA extraherades genom sur fenolekstraktion. cDNA erhölls med användning av RevertAid H Minus M-MuLV omvänt transkriptas (Fermentas) och slumpmässig hexamer (Fermentas) som en primer. Kvantitativ PCR utfördes på ett Light Cycler® 480 instrument (Roche Diagnostics). Data analyserades med användning av "Second Derivative Maximum Method" och "Standard Curve Method" med användning av Hprt som en hushållningsgen för att beräkna nivån på genuttryck i förhållande till Hprt . Följande primer- och sonduppsättningar användes: Arg1 : sens 5′-CCT GGA ACT GAA AGG AAA G-3 ′, antisense 5′-TTG GCA GAT ATG CAG GGA GT-3 ′, sonden 5′-TTC TTC TG-3 '; Hprt : sense 5′-TCC TCC TCA GAC CGC TTT T-3 ′, antisense 5′-CCT GGT TCA TCA TCG CTA ATC-3 ′, sond 5′-AGT CCA G-3 ′; Il22 : sense 5′-TTT CCT GAC CAA ACT CAG CA-3 ′, antisense 5′-TCT GGA TGT TCT GGT CGT CA-3 ′, sond 5′-CAG CTC CT-3 ′; Lrg47 : sense 5′-AAG GCC ACT AAC ATC GAA TCA-3 ′, antisense 5′-TGC CTT ATC TCA CTT AAT ACT CCT CA-3 ′, sond 5′-CTC CTC TG-3 ′; Nos2 : sense 5′-CTT TGC CAC GGA CGA GAC-3 ′, antisense 5′-TCA TTG TAC TCT GAG GGC TGA C-3 ′, sond 5′-AGG CAG AG-3 ′.

Flödescytometri

Enkelcellsuspensioner av mjälten framställdes vid de angivna tidpunkterna efter infektion och ytmarkörer färgades med optimala koncentrationer av anti-CD4-V500, anti-CD8-V450, anti-CD62L-APC, anti-CD11c-FITC, anti-CD11b -PE (alla från BD Bioscience), anti-CD44-FITC, anti-Gr1-APC (båda från BioLegend), anti-CD90.2-APC-eFlour780 eller anti-CD90.2-PE-Cy7 och anti-MHCII ( IA / IE) -APC-eFlour780 (allt från eBioscience). T- regs färgades med användning av musreglerande T- cellfärgningssats (eBioscience). För intracellulär cytokinfärgning stimulerades 1 x 106 celler med plattbundet anti-CD3 / anti-CD28 (vardera 5 μg / ml, BD Bioscience) under 4 timmar eller med T. cruzi- antigen under 12 timmar i närvaro av GolgiPlug ™ (BD Biosciences). Cell färgades med optimala koncentrationer av anti-CD4-V500, anti-CD8-V450 (båda från BD Biosciences) och anti-CD90.2-APC-eFlour780 (eBioscience). Därefter fixerades celler och permeabiliserades med Cytofix / Cytoperm ™ (BD Biosciences). Intracellulära ackumulerade cytokiner färgades med anti-IFN-y-APC (Biolegend), anti-IL-22-PE (FoU-system) eller isotypkontrollråttan IgG2a-PE (FoU-system). Data förvärvades på en FACSCanto TM II (BD Bioscience) och analyserades med FCS Express 4 Flow Cytometry-programvaran (DeNovo TM Software). T. cruzi- antigen genererades genom upprepad frysning och upptining av 1 x 108 T. cruzi- parasiter i 1 ml PBS.

Kvantifiering av cytokinproduktion

För analys av IL-22-koncentrationen i sera från naiva och infekterade möss bereddes serum med användning av BD Microtainer SST Tubes (BD Pharmingen) och IL-22-koncentrationen bestämdes med cytometrisk pärlgrupp enligt tillverkarens instruktioner (Biolegend ).

För att analysera cytokinsekretionen av mjältceller bereddes enstaka cell-suspensioner vid de angivna tidpunkterna efter infektion och 1 × 106 celler inkuberades i 300 ul Iscoves medium (Biochrom), kompletterat med 2 mM L-glutamin, 10% värme- inaktiverat fetalt kalvserum (Biochrom), penicillin och streptomycin (100 U / ml respektive 100 μg / ml; Biochrom) under 24 timmar. Koncentrationen av de indikerade cytokinerna i supernatanten bestämdes med cytometrisk pärlgrupp enligt tillverkarens instruktioner (BD Bioscience). Cytokinkoncentrationer analyserades med användning av FCS Filter och FCAP Array-mjukvara (Soft Flow).

In vitro- dödande av parasiter av makrofager

För att generera benmärgs-härledda makrofager (BMDM) spolades benmärgsceller från musens femura från C57BL / 6-möss och odlades i L-929 konditionerat medium som källa för M-CSF-aktivitet under 11 dagar såsom beskrivits tidigare 7 . Celler odlades i kammarglas (Nalge Nunc international; 1 × 105 / brunn) över natt i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (Biochrom), kompletterat med 10% värmeinaktiverat fosterkalvserum (Biochrom) och stimulerades under 2 timmar med olika cytokiner i en total volym av 400 ul (IL-22: 100 ng / ml, FoU-system, IFN-y: 100 U / ml, BD Biosciences). Därefter infekterades celler med 50 ul T. cruzi- kultur-trypomastigoter (2 × 105 / brunn) som skördades från supernatanter från infekterade LLC-MK2-celler. Extracellulära parasiter avlägsnades 2 timmar efter infektion och cellerna inkuberades åter i närvaro av respektive cytokiner. 48 timmar efter infektion tvättades cellerna 3 gånger med PBS och färgades med Hemacolor (Merck). Procentandelen infekterade makrofager och antalet intracellulära parasiter per 200–400 celler räknades i tredubbla kulturer.

Statistisk analys

Kvantifierbara data uttrycks som medel för individuella bestämningar och standardfel. För analys av parasitemi, överlevnad och förändring av kroppsvikt hos möss infekterade med 50 parasiter användes 10 möss per grupp. För analys av immunsvar och patologi hos möss infekterade med 500 parasiter användes 5 möss per grupp. 2–5 oinfekterade möss per grupp användes som anges i legenderna. Statistisk analys utfördes med användning av Mann-Whitney U-testet som definierade olika felsannolikheter (* p <0, 05; ** p <0, 01; *** p <0, 001).

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Erdmann, H. et al. Under akut experimentell infektion med den retikulotropa Trypanosoma cruzi- stammen induceras Tulahuen IL-22 IL-23-beroende men kan dispenseras för skydd. Sci. Rep. 6, 32927; doi: 10.1038 / srep32927 (2016).

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.