Nedreglering av mir-21 hämmar egfr-vägen och undertrycker tillväxten av humana glioblastomceller oberoende av ptenstatus | laboratorieundersökning

Nedreglering av mir-21 hämmar egfr-vägen och undertrycker tillväxten av humana glioblastomceller oberoende av ptenstatus | laboratorieundersökning

Anonim

ämnen

  • apoptos
  • cancer
  • Cell signalering
  • Genreglering

Abstrakt

MicroRNA (miRNA) är en klass av endogena små icke-kodande RNA som reglerar genuttryck efter transkription. Avvikande uttryck av miRNA har visats vara involverat i tumörigenes. Vi visade att miR-21 var en av de oftast överuttryckta miRNA i humana glioblastom (GBM) cellinjer. För att undersöka om miR-21 kan fungera som ett terapeutiskt mål för glioblastom, nedreglerade vi miR-21 med en specifik antisense-oligonukleotid och fann att apoptos inducerades och cellcykelprogression hämmades in vitro i U251 (PTEN-mutant) och LN229 (PTEN vildtyp) GBM-celler; xenograftumörer från antisense-behandlade U251-celler undertrycktes in vivo . Antisense-miR-21-behandlade celler visade ett minskat uttryck av EGFR, aktiverad Akt, cyklin D och Bcl-2. Även om miR-21 är känt för att reglera PTEN och nedreglering av miR-21 ledde till ökat PTEN-uttryck både endogent och i en reportergenanalys, är GBM-undertryckseffekten av antisense-miR-21 troligen oberoende av PTEN-reglering eftersom U251 har mutant PTEN. Microarray-analys visade att knockdownen av miR-21 signifikant förändrade uttrycket av 169 gener involverade i nio cellcykel- och signalvägar. Sammantaget ger våra studier bevis på att miR-21 kan fungera som ett nytt terapeutiskt mål för maligna gliomas oberoende av PTEN-status.

Huvudsaklig

Maligna gliomas är de vanligaste primära hjärntumörerna med hög dödlighet och morbiditet. Prognosen för maligna gliomas har inte signifikant förbättrats under de senaste fyra decennierna. En ny metaanalys av 12 randomiserade kliniska studier visade att den totala överlevnadsnivån för högklassiga gliomas var 40% 1 år efter kirurgiskt avlägsnande och endast något högre, 46%, efter kombinerad strålbehandling och kemoterapi. 1 För att utveckla mer optimerade och effektiva behandlingsstrategier för maligna gliomer är det viktigt att få en djupare förståelse för de molekylära mekanismerna som ligger bakom gliomagenes och att identifiera mål för terapeutisk intervention.

MikroRNA: er (miRNA) är en klass av mycket konserverade små icke-kodande RNA, ungefär 22 nukleotider i längd, som kontrollerar genuttryck genom bindning till frösekvensen vid 3'-UTR (otranslaterad region) av mål-mRNA, vilket resulterar i translationell repression eller mRNA-nedbrytning. 2 Denna regleringsmekanism visades först i utvecklingsprocesserna i maskar, flugor och växter. 3, 4, 5 Därefter har miRNA visats ha viktiga roller i många fysiologiska processer hos däggdjursystem genom att påverka cellapoptos, spridning, differentiering, utveckling och metabolism genom reglering av kritiska signalmolekyler inklusive cytokiner, tillväxtfaktorer, transkriptionsfaktorer, och pro-apoptotiska och anti-apoptotiska proteiner. 6, 7, 8 Ökande antal miRNA har identifierats i det mänskliga genomet och de kallas kollektivt miRNome. 9 Ackumulering av bevis visar på potentiellt deltagande av förändrad reglering av miRNA vid initiering och progression i ett brett spektrum av humana cancer. Förändrade uttrycksprofiler av miRNA är associerade med genetiska och epigenetiska förändringar inklusive deletion, amplifiering, punktmutation och avvikande DNA-metylering. 10 MiRNA-klustret miR-15a – 16 , inklusive miR-15a och miR-16–1 , ligger nära 13q14, en region som kännetecknas av en hög frekvens för borttagning av kroniskt lymfocytiskt lymfom. 11 Uttrycket av miR-15a och miR-16–1 var omvänt korrelerat med det anti-apoptotiska Bcl-2-genuttrycket i kronisk lymfocytisk leukemi och båda miRNA: erna negativt reglerade Bcl-2 på post-transkriptionell nivå, vilket resulterade i förstärkning av det normala apoptotiska svaret. 12 I en musmodell av lymfom påskyndade ökat uttryck av miR-17–92-klustret starkt lymfomagenesen och var det första funktionella beviset för ett miRNA som fungerade som ett däggdjurens onkogen. 13 Ett annat exempel på onkogena miRNA är mi-29. Tvingad miR-29 reducerade expressionsnivån för Mcl-1, en anti-apoptotisk faktor, för att underlätta onkogenes av kolangiokarcinom. 14 Vissa miRNA fungerar som tumörundertryckningsgener. Let-7 rapporterades negativt reglera Ras och c-Myc-uttryck efter det att let-7a-1- prekursorkonstruktionen transfekterades till humana kolontumörcellinjer och expression av miR-34a inducerade apoptos i neuroblastomceller. 15, 16, 17

Nya rapporter antydde att miR-21 fungerar som en onkogen i humana cancer. Ciafrè et al. 18 profilerade uttrycket av 245 miRNA i 10 glioblastom (GBM) cellinjer och nio nyligen resekterade GBM-prover och observerade att miR-21 var överuttryckt i humana hjärntumörer. 18 Det visades att när miR-21 dämpades observerades celltillväxtinhibering och kaspasberoende apoptos i cellerna A172, U87, LN229 och LN308. 19 flera målgener av miR-21 har rapporterats. Det har visats att miR-21 modulerar bröstcancercellförankringsoberoende tillväxt genom att undertrycka TMP1-uttryck. 20 I humant kolorektal, bröstcancer och njurcellscarcinom bidrar miR-21 till invasion och metastascell genom att hämma Pdcd4 mRNA på posttranskriptionsnivån. 21, 22, 23 En ny studie visade att miR-21 riktar sig mot PTEN-genen genom ett bindningsställe på 3′-UTR i hepatocellulärt karcinom. 24 PTEN har visat sig vara en kritisk tumörundertryckningsgen som vanligtvis inaktiveras i GBM genom deletion, mutation eller dämpat uttryck. 25 Således kan ökat uttryck av miR-21 bidra till det försvagade uttrycket av PTEN i GBM.

För att ytterligare karakterisera potentialen hos miR-21 som ett mål för att behandla GBM och för att klargöra PTENs roll i svaret, använde vi både in vitro- och in vivo- system för att studera effekten av undertryckning av miR-21 i vildtypen PTEN (LN229) och PTEN-mutant (U251) GBM-cellinjer. 26 Vi fann för första gången att nedreglering av miR-21 hämmade EGFR- och Akt-vägarna och anti-GBM-effekten var oberoende av PTEN-status, vilket tyder på att miR-21 är ett bredare terapeutiskt mål för GBM.

RESULTAT

MiR-21 överuttrycktes i humana glioblastomcellinjer

Vi profilerade först miRNA-uttryck i fem glioblastomcellinjer, en astrocytomcellinje och en normal hjärnvävnad. Vår analys visade att 8 av de 435 humana miRNA (1, 84%) var överuttryckta med en större än tvåfaldig ökning och 18 av 453 (3, 68%) visade en större än tvåfaldig reduktion i alla gliomcellinjer (figur 1a och b). Bland de ökade miRNA: erna visade miR-21 den mest signifikanta ökningen i förhållande till normal hjärnvävnad (7, 0 gånger). Andra ökade miRNA inkluderar miR-221, miR-222 och miR-23a. Uttryckningsresultaten från miR-21 från mikroarrayer bekräftades med kvantitativa RT-PCR-analyser (figur 1c). MiR-21 valdes för vidare studie eftersom det var den mest framträdande överuttryckta miRNA vid gliom.

miR-21 är överuttryckt i gliomceller. ( a ) Klusteranalys av miRNA-uttrycksprofil över humana glioblastomcellinjer. Gliomcellinjer presenterades i kolumner, miRNA i rader. ( b ) De 26 mest uppreglerade (höger) och nedreglerade (vänster) miRNA: erna i sex humana gliom- och globlastomcellinjer med avseende på Ambion normalt hjärnans totala RNA. Det relativa uttrycket av miRNA-nivåer finns i log2 transformerad för varje glioblastomcellinje. ( c ) RTR i realtid PCR visar miR21-överuttryck i gliomcellinjer. U6 snRNA användes som en lastkontroll.

Bild i full storlek

Antisense-miR-21Supprimerad U251 Gliomcellsproliferation och inducerad apoptos

För att utvärdera betydelsen av överuttryck av miR-21 i gliomceller, använde vi ett antisense-tillvägagångssätt. En As-miR-21-oligonukleotid (ODN) användes för att slå ner miR-21-expression i U251- och LN229-celler. RTR-realtids-PCR-resultat bestämde att den relativa expressionsnivån för miR-21 i As-miR-21 ODN-behandlad U251-cell var 6, 25% ( P <0, 01) och 12, 5% för LN229-celler ( P <0, 01) jämfört med deras kontrollceller, respektive (figur 2a). Dessutom visade LNA-baserad in situ- hybridisering att transfektion av en förvrängd ODN inte hade någon effekt på miR-21-expression. Däremot var den röda cy3-fluorescenssignalen i As-miR-21-transfekterade U251-celler lägre (figur 2b). Dessa data antydde att As-miR-21 specifikt kan inhibera det endogena uttrycket miR-21 i U251- och LN229-celler.

Effekten av miR-21-knockdown på U251 och LN229 GBM-cellproliferation. ( a ) miR-21-uttryck undertrycktes i U251 och LN229-celler med användning av RT-realtid PCR. ( b ) Undersökning in situ av expression av miR-21 i U251-celler. Pilar markerar miR-21 in situ- uttryck i U251-celler. Bar = 20 μm . ( c ) MTT-cellproliferationsanalys. miR-21 knockdown i U251 och LN229 GBM hämmar cellproliferation. ( d ) Cellcykelprofiler efter PI-färgning. miR-21 knockdown inducerade G1-arrestering i både U251 och LN229 GBM-celler. ( e ) Grafisk representation av cellcykelprofilerna i ( d ). Som-miR-21 och förvrängda ODN-transfekterade U251- och LN229 GBM-celler analyserades med användning av FCM för att bestämma cellcykelstatus. Test 2 test utfördes. ** P <0, 01. ( f ) Analys av apoptos med användning av Annexin V-färgning. MiR-21-knockdown ledde till U251 och LN229 GBM-celloptoptos. ( g ) Grafisk representation av ( f ). Som-miR-21 och förvrängda ODN-transfekterade U251- och LN229 GBM-celler analyserades med användning av FCM för att bestämma cellapoptos. Envägs ANOVA utfördes. ** P <0, 01.

Bild i full storlek

Cellviabilitet mättes i ODN-transfekterade celler på upp till 4 dagar efter behandlingen. Som-miR-21 ODN-behandlade celler uppvisade en signifikant minskning i livskraft jämfört med kontroll-ODN-behandlade celler eller obehandlade celler (figur 2c). Vi fann att den tillväxtinhiberande effekten av minskad miR-21 nådde maximalt 3 dagar efter transfektion. Den lägsta överlevnadshastigheten var 57 ± 16% för U251-celler och 49 ± 9% för LN229-celler.

För att ytterligare analysera om minskad livskraft var ett resultat av cellcykelstopp analyserades cellcykelfördelningen med användning av FCM. 72 timmar efter transfektion visade FCM-analys en 20% ökning av G1-fasceller och en 25% minskning av S-fasceller i As-miR-21-behandlade U251-celler (χ2 = 14.160, P <0.01). I miR-21 slog ner LN229-celler ökade populationen av G-fasen 30% jämfört med kontroll- och förvrängning av ODN-behandlade celler (χ2 = 35.677, P <0.01). Det fanns ingen statistisk skillnad i G2 / M-faspopulationen bland de tre grupperna för båda cellinjerna (figur 2d och e). Dessa resultat tyder på att överuttryckt miR-21 krävs för att reglera G1-till-S-fasövergången i olika GBM-cellinjer. Våra studier överensstämmer med en tidigare observation som visade en 21–25% ökning i G1-fasen i U251-cellinjen genom miR-21 knockdown. 30

Vi analyserade också effekten av minskad miR-21 på apoptos genom att utföra Annexin V och PI dubbelfärgning. Annexin V-positiva apoptotiska celler i tidig fas ökades signifikant i celler transfekterade med AS-miR-21 (11, 88% för U251-celler och 18, 74% för LN229-celler) jämfört med förälderceller och celler transfekterade med förvrängd ODN (2, 62% för U251-kontroll och 3, 91% för LN229-cell; P <0, 01; figur 4f och g). Apoptotiska kärnor var nästan 7% högre i LN229-cellinjen jämfört med U251-celler. Det fanns emellertid ingen signifikant skillnad i PI-positiva celler, vilket är förenligt med bristen på förändring i sub-G1-fasceller i vår FCM-analys.

As-miR-21 Blockerade EGFR och Akt-aktivering och undertryckt STAT3-uttryck

Beräkningsanalys förutsäger att PTEN är en målgen för miR-21 24, 31 och Akt-vägen regleras av PTEN. 29 PTEN-inaktivering och EGFR- och Akt-aktivering sker ofta i glioblastomas. 32 Således kan en potentiell funktion av förhöjd miR-21 vara att nedreglera PTEN-tumörsuppressorgenen. Men vår analys ovan visade att blockering av miR-21 inhiberade både U251-celler som har mutanta PTEN- och LN229-celler som har vildtyp PTEN. En tidigare studie visade att minskning av miR-21 också undertryckte U87-celler som inte har något PTEN-uttryck. 19 Således undersökte vi först om As-miR-21 hade någon effekt på uttrycket av en uppsättning proteiner som är viktiga för gliomproliferation och överlevnad. Både Western blotting och immunofluorescensanalyser användes. Nivån av endogent PTEN-protein ökade och fosforylerat Akt minskade i både U251 och i LN229 GBM-celler efter hämning av miR-21. Dessutom minskades EGFR, cyklin Dl och Bcl-2, i överensstämmelse med blockerad G1 / S-övergång och tidig apoptos (figur 3a och b). Vidare observerade vi också en minskning av STAT3-protein i både LN229 och U251 GBM-celler.

As-miR-21 blockerade EGFR och Akt-aktivering och undertryckte STAT3-uttryck. ( a ) Western blot som visade att PTEN-uttrycket ökades i U251 och LN229 GBM-celler. pAkt, AKT-2, EGFR, cyclin Dl, Bcl-2 och STAT3 uttryck undertrycktes samtidigt. ( b ) Immunofluorescensfärgningsanalys: PTEN-uttryck ökades i U251 GBM-celler. pAkt, AKT-2, EGFR, cyclin Dl och Bcl-2 uttryck undertrycktes samtidigt. Bar = 30 μm .

Bild i full storlek

Observationen att endogen mutant PTEN ökades i de As-miR-21-behandlade U251-cellerna och vildtyp PTEN ökades i de As-miR-21-behandlade LN229-cellerna gav bevis på att miR-21 verkligen reglerar sitt mål PTEN-mRNA i gliomceller. För att ytterligare testa denna hypotese genererade vi en reportergenkonstruktion pGL3-PTEN-3-UTR som innehåller det förmodade bindningsstället miR-21. 24, 31, 33 PGL3-PTEN-3′-UTR-konstruktionen och pGL-3-kontrollplasmiden samtransfekterades separat med AS-miR-21 eller kontroll-ODN till U251, A172 (PTEN utplånad) och H4 (PTEN-status var inte klart) gliomceller följt av mätning av luciferasaktivitet i de transfekterade cellerna 3 dagar efter transfektion. Resultaten visade att AS-miR-21 orsakade en fyra till sexfaldig minskning av luciferasaktiviteten i pGL3-PTEN-3′-UTR-transfekterade celler (figur 4a och b). Således är miR-21-bindningsstället i 3'-UTR av PTEN-genen funktionellt.

mIR-21 hämmar PTEN 3′-UTR. ( a ) Schematisk representation av miR-21-målplatsen som börjar vid nukleotid 23 i PTEN-3′-UTR. ( b ) Luciferasaktivitet ökades signifikant genom miR-21-knockdown i U251, LN229 och A172 GBM-celler. T- testet utfördes. ** P <0, 01.

Bild i full storlek

Minskning av miR-21 med AS-miR-21 förändrade cellulära banvägar i U251-celler

Medan inhiberingen av genuttryck med mikroRNA är väl förstått, är mekanismen för ökad genuttryck av mikroRNA mindre känd, även om vissa mikroRNA har visat sig fungera som förstärkare. För att förstå effekten av miR-21 på EGFR-, cyklin D- och Bcl-2-uttryck utförde vi en mikroarray-analys och KEGG-bananalys för att få insikt i skillnaderna i genuttryck före och efter miR-21-knockdown i U251-celler. KEGG-analys som jämförde differentiellt uttryckta gener i miR-21 knockdown U251-celler visade att nedreglering av miR-21 påverkade ett antal vägar inklusive 'cellcykel ( P = 0, 000)', 'Ubiquitin-medierad proteolys ( P = 0, 000)', 'Aminoacyl -tRNA-biosyntes ( P = 0, 000) ', ' Litencells lungcancer ( P = 0, 010) ', ' Insulinsignaleringsväg ( P = 0, 024) ', ' Adherens-korsning ( P = 0, 037) ', ' Njurcellscancer ( P = 0, 045) ', ' p53 signalväg ( P = 0, 049) 'och' MAPK signalväg ( P = 0, 049) '. Bland dessa var BID, FAS, PRS6, PTEN och SOCS4 uppreglerade gener med miR-21-hämning. Ändring av ubiquitin-medierad proteolys kan förklara ökat uttryck av vissa onkogena proteiner, såsom EGFR, med miR-21.

As-miR-21-behandling dämpar Glioblastoma-tillväxt i Xenograft-modell

Experimenten in vitro antyder att miR-21 är ett potentiellt mål för terapi i GBM. För att ytterligare bekräfta detta utförde vi ett bevis-av-princip-experiment med användning av en U251 gliom xenograftmodell och en lipofektamin-medierad genterapimetod. Subkutana tumörer, ungefär 5–6 mm långa, etablerades i högra ljumsken på 30 möss. Sammantaget utmanades 10 möss genom in situ- injektion av PBS som kontrollgrupp, 10 möss behandlades med lipofektamin-medierad förvrängd oligonukleotid som den andra kontrollgruppen, och 10 möss behandlades med lipofektamin-medierad AS-miR-21 som behandlingen grupp. I början av behandlingen var den genomsnittliga tumörvolymen för mössen i kontroll-, förvrängnings- och behandlade grupper 82, 90 respektive 85 mm3, utan någon statistiskt signifikant skillnad mellan dessa tre grupper. Mössen övervakades var tredje dag i 3 veckor, och tumörvolymen av möss i varje grupp mättes och jämfördes. Betydande minskning av tumörvolym observerades endast i behandlingsgruppen As-miR-21 (figur 5a).

U251 GBM-cellxenotransplantatumörförsök. ( a ) Tillväxt av U251 GBM-cell xenografts. Inhibering av miR-21 genom lipofektamin-medierad As-miR-21-tillförsel inhiberade tumörtillväxt. ( b ) Apoptos i xenograftumörer efter behandling med As-miR-21. Hämning av miR-21, såsom visas genom hybridisering in situ (röd färgning), ökade apoptos såsom bestämdes av TUNEL-positiva celler (grön färgning). Gul pil indikerar miR-21 in situ- expression i U251 xenograft tumörceller. Vit pil indikerar apoptotiska U251 GBM xenotransplantatceller. ( c ) Immunohistokemi analys av U251 xenograft tumörer. PTEN-uttrycket ökades i U251 xenograft-tumörer. pAkt, AKT-2, EGFR, cyclin Dl och Bcl-2 uttryck undertrycktes samtidigt. Bar = 100 μm .

Bild i full storlek

Vi samlade tumörerna och utvärderade expression av miR-21 genom hybridisering in situ och cellulär apoptos med TUNEL-analys. Medan miR-21 uttrycktes starkt i kontroll- och förvrängningsbehandlade U251 xenograft-tumörer, hittades inga apoptotiska kärnor. I kontrast, i de As-miR-21-behandlade xenograft-tumörerna minskade uttrycket miR-21 markant och rikliga apoptotiska kärnor observerades (figur 5b). Dessutom avslöjade tumörer härrörande från kontroll- och förvrängningsbehandlade celler ökade antalet mikrokärl och djupare kromatinfärgning jämfört med de As-miR-21-behandlade cellerna, bestämd med användning av HE-färgning (figur 5c). I överensstämmelse med in vitro- resultaten observerade vi i As-miR-21-behandlade tumörer minskat uttryck av fosforylerad Akt såväl som EGFR, AKT-2, Ki67, Bcl-2 och cyclin D1 (figur 5c).

DISKUSSION

MiR-21 är överuttryckt i mänskliga GBM-cellinjer

MiR-21 har identifierats som ett av de mest överuttryckta mikroRNA: erna i ett antal medelstora och storskaliga profileringsexperiment utformade för att detektera miRNA-dysreglerade i humana cancer. 22, 23, 24, 25 Den första indikationen på det avvikande uttrycket av miR-21 kom från miRNA-profilen av humant glioblastom. 18 Jämfört med normal hjärnvävnad var det relativa uttrycket miR-21 7- till 11-faldigt i astrocytom med låg kvalitet, anaplastiska astrocytom och GBM. 34 Föreliggande profildata bekräftade ytterligare ökat uttryck av miR-21 över GBM- och astrocytomcellinjer. MiR-21-uttrycksstatus validerades ytterligare med användning av RT-realtid PCR i alla sex cellinjer. Även om GBM-cellinjer har extremt mångfaldig genetisk bakgrund, indikerar universellt överuttryck av miR-21 i Ciafrés studie och GBM-cellinjerna (TJ899, TJ866 och TJ905) etablerade i vårt laboratorium starkt att miR-21 har en robust roll i gliacellcancer omvandling. 2, 18

MiR-21 undertrycker GBM-celltillväxt oberoende av PTEN-status

Det finns bara partiell komplementaritet mellan miRNA och deras mål i djurceller, och flera beräkningsalgoritmer förutsäger hundratals mRNA som möjliga mål för miR-21; 35 men relativt få har validerats experimentellt i GBM. Post-transkriptionell nedreglering av tumörsuppressor PDCD4 med miR-21 stimulerade T98G GBM-celltillväxt och anti-apoptotisk effekt. 36 MiR-21 reglerade också RECK- och TIMP-3-genen för att främja mänsklig cancercell (A172, U87, LN229 GBM-celler, Hela human cervixcarcinomcell, och MCF-7 bröstcancercell) anti-apoptos, migration och invasiv effekt genom aktiverande matrismetalloproteinaser (MMP). 37 Vidare bidrar miR-21 efter transkriptionsinhiberande leucinrikt repeterande interaktivt protein 1 (LRRFIP1) till VM-26-resistens i U373 MG-cell. 2, 38

PTEN-tumörsuppressorgen har validerats som ett miR-21-mål i humant kolangiokarcinom och hepatocellulära karcinomceller. 24, 33 Detta är särskilt intressant eftersom upp till 80% av GBM: er har en PTEN-brist, och prognosen för GBM kan förutsägas baserat på nivåerna för uttryck av PTEN. 39, 40 Förlust av funktionell PTEN leder till ökad aktivitet av Akt och däggdjursmålet för rapamycin (mTOR) kinasvägar, vilket kan främja både tumörcells överlevnad och spridning genom fosforylering och aktivering av flera nedströms mediatorer. 41 Således antagde vi initialt att GBM-celler med vildtyp PTEN borde ha ett bättre svar på As-miR-21-behandling jämfört med PTEN-mutant eller raderade GBM-celler. Överraskande observerade vi liknande tillväxtinhiberande effekter i både U251 och LN229-celler med MTT-analys, vilket antydde att vissa av effekterna av miR-21-hämning kan vara oberoende av PTEN.

För att korrelera de tillväxtinhiberande effekterna med anti-tumöreffekter av As-miR-21, använde vi en U251 GBM xenograftmodell. Framgångsrik hämning av miR-21 inhiberade U251 xenograft tumörproliferation och inducerade apoptos i tumören. Dessa in vivo- resultat kan indikera att miR-21-inriktningsterapi har stor klinisk användningspotential oberoende av PTEN-status. Det rapporterades också att kombinerad miR-21-hämning med S-TRAIL ledde till synergetisk cytotoxicitet för att undertrycka A172 och U87 GBM-celltillväxt in vitro och U87 intrakraniella tumörer in vivo . 42

I överensstämmelse med effekterna av xenograftumörer främjade As-miR-21-behandling apoptos i både U251 och LN229-cellinjer. Minskade nivåer av den anti-apoptotiska Bcl-2 observerades, vilket tyder på att inriktning på miR-21 kunde undertrycka celltillväxt genom mitokondriell apoptosväg. 43 MRNA-expressionsprofilscanningsdata från As-miR-21-behandlade U251-celler indikerade starkt att BID-, FAS-, PRS6- och SOCS4-tumörsuppressorgener uppreglerades. FAS-genen har en central roll i programmerad celldöd genom sekventiell aktivering av caspase-8 och caspase-3 i både normala och cancerceller. 44 Dessutom, i kombination med PIDD, kunde FAS stärka BID-uttryck för att reglera cytokrom c genom mitokondriell väg för att utlösa den klassiska kaskad av apoptos. 44 Nivåerna av apoptos var emellertid ungefär 7% högre i PTEN-vildtyp LN229-celler än i U251-celler, vilket antyder att det apoptotiska svaret förblir delvis beroende av PTEN. Avvikande uttryckt miR-21 i U251 och U87 GBM-celler visade sig reglera p53, TGF-p och apoptosvägen. 30 Dessa data överensstämde med cellulära mekanismer som kontrollerar cellcykelstopp och cancercell apoptos och indikerade att miR-21 kunde modulera gennätverket som associerades med de observerade fenotypförändringarna.

Ytterligare undersökning av nedströmsvägarna avslöjade en annan intressant observation. Trots icke-funktionell PTEN i U251-celler hämmades nivåerna av EGFR och aktiverad Akt genom As-miR-21-behandling, liknande effekterna som observerades i LN229-celler innehållande vildtyp PTEN. EGFR har rapporterats vara reglerat av Stat3 i en Stat3Bcl-3EGFRStat3-positiv signaleringsslinga i EB-virusmediterad human cervical carcinoma transformation. 45 Transkriptionsfaktorn Stat3 dämpades i denna studie, i överensstämmelse med att den förutses vara miR-21-mål av matematisk algoritm. 46 Den mänskliga miR-21-promotorn behåller Stat3-bindande platser, och dess höga bevarande av ryggradsdjur tyder på att mycket bevarade transkriptionella regleringsmekanismer fungerar på promotorn. Stat3-beroende miR-21-transkription visades i IL-6-stimulerade XG-1 och INA-6 myelom- och HepG2-hepatocellulära karcinomceller. 47 Ytterligare analys krävs för att avgöra om ett liknande förhållande existerar i gliomas.

Sammanfattningsvis validerade vi att nedreglering av miR-21 inhiberade tillväxten av GBM-cellinjer och inducerade apoptos. Dessa effekter var endast delvis beroende av PTEN, vilket belyser förekomsten av flera, och kanske ännu okända, mål för miR-21. Hämning av miR-21 undertryckte också EGFR och Akt-aktivitet. Dessa observationer bekräftades i xenograft-experiment in vivo som visade den potentiella kliniska relevansen av miR-21-målsökande medel. En ny rapport presenterade några små molekylföreningar som skulle kunna undertrycka expression av miR-21 i cancerceller. 48 Inriktning av miR-21 med antisense- eller småmolekylföreningar kan representera nya målinriktade terapeutiska strategier för humana cancer, inklusive gliomas.

Avslöjande / intressekonflikt

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.