Dna-analys av en 30 000 år gammal urocitellus glacialis från nordöstra Sibirien avslöjer fylogenetiska förhållanden mellan forntida och nutida arktiska markekorrar | vetenskapliga rapporter

Dna-analys av en 30 000 år gammal urocitellus glacialis från nordöstra Sibirien avslöjer fylogenetiska förhållanden mellan forntida och nutida arktiska markekorrar | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Evolutionär biologi
  • Phylogenetics
  • Zoologi

Abstrakt

I motsats till den rikliga fossila registreringen av arktiska markekorrar, Urocitellus parryii , från östra Beringia, är endast ett begränsat antal fossil känt från dess västra del. År 1946 upptäckte de namngivna GULAG-fångarna ett bo med tre mumifierade slaktkroppar av arktiska markekorrar i permafrostsedimenten i El'ga-floden, Yakutia, Ryssland, som senare tillskrivs en ny art, Citellus (Urocitellus) glacialis Vinogr. För att verifiera detta uppdrag och för att utforska fylogenetiska förhållanden mellan gamla och nutida arktiska markekorrar, utförde vi 14 C-dateringar och forntida DNA-analyser av en av El'ga-mumierna och fyra samtida fossil från Duvanny Yar, nordöstra Yakutia. Filogenetiska rekonstruktioner, baserade på fullständiga cytokrom b- gensekvenser av fem sent pleistocena arktiska markekorrar och de från moderna U. parryii från 21 platser över västra Beringia, gav inget stöd för tidigare förslag om att forntida arktiska markekorrar från Sibirien utgör en distinkt art. I själva verket observerade vi genetisk kontinuitet för glacialis mitokondriell DNA-avstamning i modern U. parryii på Kamchatka-halvön. När de ses i ett bredare geografiskt perspektiv ger våra fynd nya insikter i U. parryii's genetiska historia i sent Pleistocen Beringia.

Introduktion

Läsare av ”The Gulag Archipelago” av Aleksandr I. Solzhenitsyn kanske kanske kommer ihåg hur boken börjar: ”1949 kom några vänner och jag på en anmärkningsvärd nyhet i Nature , en tidskrift för Academy of Sciences. Den rapporterade i liten typ att under utgrävningarna på Kolyma-floden hade en underjordisk islins upptäckts som faktiskt var en frusen bäck - och i den hittades frysta exemplar av förhistorisk fauna som var några tiotusentals år gamla. ” ix ) 1 . Samma nyhetsartikel i Nature ('Priroda' ) fortsatte med att rapportera vad Solzhenitsyn inte gjorde: att i maj 1946 återkallade icke namngivna fångar i GULAG ett bo med tre fullständiga mumifierade slaktkroppar av arktiska markekorrar på ett djup av 12, 5 meter av permafrostsedimenten. av El'ga-floden (det övre Indigirka-flodområdet, Yakutia) 2, 3 . Slaktkropparna var extremt välbevarade och "luktade fukt omedelbart efter återhämtning men förlorade lukten efter att ha lufttorkat och förblev i ett stabilt skick som liknade mumierna" (s. 76) 3 (Fig. 1). Det föreslogs att de hade legat i permafrosten i minst 10–12 tusen år 3 .

14 C- och DNA-analyser utfördes på U. glacialis , paralektotyp, ZIN-34046. Båda, lektotypen och paralektotypen, lagras för närvarande på Zoological Institute of the Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Ryssland (ZIN RAS). Återges med tillstånd från ZIN RAS.

Bild i full storlek

Två av slaktkropparna undersöktes först av BS Vinogradov som tilldelade dem en ny art, Citellus (Urocitellus) glacialis Vinogr., Baserat på ett antal distinkta morfologiska drag som diskriminerade dessa forntida arktiska markekorrar från de i dagens nordöstra Sibirien. 4 . Det är anmärkningsvärt att BS Vinogradov själv såväl som andra senare 5 ifrågasatte detta uppdrag på grund av vissa likheter i storleken och morfologin i El'ga-exemplen med vissa nordamerikanska, särskilt äldre, arktiska markekorrar. Efter en ny generisk revision av markekorrens släktet Spermophilus 6, hänvisar vi här till arktiska markekorrar som Urocitellus parryii .

Mitokondriella DNA-baserade (mtDNA) studier på moderna arktiska markekorrar stöder ett scenario enligt vilket alla större divergenshändelser i sen pleistocen inträffade i Nordamerika 7, 8 . En detaljerad undersökning av mtDNA-variation i arktiska markekorrar i hela Alaska och det angränsande Yukon-territoriet avslöjade fyra icke-överlappande geografiska kladerna – Arktis, Beringia, Sydöstra och sydvästra, eventuellt daterade till mellersta Pleistocen 9 . Detta och två senare studier 10, 11 indikerade att sydvästra Alaska-populationer, som finns söder och väster om Alaska Range, var starkt differentierade från alla andra arktiska markekorrar i nordvästra Nordamerika. Senast visade en studie av ett stort mtDNA-datasätt av släktet Urocitellus , inklusive taxonprovtagning på underarten för U. parryii , att det finns två distinkta U. parryii mtDNA-clades ("Northern Beringia" och "Southern Beringia") som har för närvarande amfiberisk distribution 12 . Det är anmärkningsvärt att två prover av U. p. stejnegeri från Kamchatka-halvön som ingår i denna studie placerades inom den sydvästra clade. Författarna föreslog att flera koloniseringshändelser hade inträffat i släktens historia; deras antal och timing var dock osäker.

Det har visats att för en exakt rekonstruktion av befolkningshistoria krävs både modern och forntida DNA (aDNA) data 13 . Att kombinera genetiska fynd med direkt radiokolonnatering av fossiler förbättrar avsevärt vår förståelse för befolkningens dynamik över tid. Detta omfattande tillvägagångssätt har använts för att undersöka klimat- och antropogena effekter på den demografiska historien hos storfödda däggdjur under den sena kvartära perioden och avslöjade att olika arter svarar olika på dessa effekter 14 . På liknande sätt har krage lemming och den smala skallen vole, två viktiga rovgnagare i det arktiska ekosystemet, visat sig reagera mycket olika på klimatförändring 15 . Fortfarande har majoriteten av dessa studier fokuserat på stora och medelstora däggdjur (steppbison 16, grottbjörn 17, ull mammut 18, vildhäst 19, grottlejon 20, varg 21 etc.) medan små däggdjur förblir underrepresenterade.

I syfte att verifiera det tidigare uppdraget av U. glacialis som en distinkt art och att utforska fylogenetiska förhållanden mellan gamla och moderna arktiska markekorrar, utförde vi direkt 14 C-datering och bedömde mtDNA ( cytokrom b- gen) variation i gamla arktiska markekorrar från nordöstra Sibirien i jämförelse med det i moderna U. parryii . Det finns rikliga och långvariga fossila bevis på arktiska markekorrar i nordvästra Nordamerika 22, med mycket av det förhistoriska utbudet som är förknippat med mammutstegens ekosystem 23, 24, bara några fossila är kända från nordöstra Asien 25 .

Denna studie inkluderade fem arktiska markekorrar som härstammar från två permafrostplatser i nordöstra Sibirien: El'ga-floden, en vänstra biflod för övre Indigirka-floden (N = 1) och Duvanny Yar (N = 4) belägen på höger bredd av den nedre Kolyma-floden, Yakutia, och separerade från den förra med ~ 1000 km. Dessutom valdes museiprover av modern U. parryii från 21 platser i nordöstra Sibirien och Kamchatka-halvön för att få ett geografiskt representativt prov över deras nuvarande livsmiljö i västra Beringia (fig. 2 och tilläggstabell S1). Vi utsåg våra prover till Gla (forntida), BerR (Beringia, Ryssland) och Kam (Kamchatka-halvön).

( a ) Karta över provtagningsplatser; ( b ) MJ-nätverk med 55 cyt b- haplotyper i subarktiska U. parryii . Prover som undersöktes i denna studie är numrerade från 1 till 23 och färgade i rött (Gla), terra cotta (Kam) och lila (BerR). Lokalitetsnummer korsreferens Tilläggstabell S1. Prover från tidigare studier 9, 11 visas i lila (Ber), brun (SW), blå (SE) och grön (Arc). Kartan skapades med hjälp av programvaran Inkscape 0.48.4 (//inkscape.org). Nätverket skapades med hjälp av programvaran PopART v.1.7 (//popart.otago.ac.nz). Områdena i cirklarna är proportionella mot haplotypfrekvenserna. Antal kläckmärken motsvarar antalet mutationssteg. Svarta cirklar visar haplotyper som inte observerats i provet.

Bild i full storlek

Resultat och diskussion

Radiokarbon-datering

En direkt 14 C ålder på 29 450 ± 925 okal. år BP bestämdes med acceleratormasspektrometri (AMS) på ett leverprov av U. glacialis (Gla1, RTK 6386) (fig. 3 och kompletterande information). De kalibrerade områdena ± 1σ och ± 2σ uppskattades till 33 990-31 990 (68, 2% sannolikhet) respektive 34 920-31 250 (95, 4% sannolikhet) år BP, respektive. Radiokarbon är från Duvanny Yar, 31 800 ± 310 okal. år BP, var tidigare tillgängliga baserat på innehållet i gnagarehålor 26 .

Bild i full storlek

Spåra glacialis mtDNA-avstamning i dagens U. parryii

Vi hämtade och analyserade kompletta cytokrom b- gensekvenser ( cyt b , 1140 bp) för var och en av de fem forntida arktiska markekorrarna. DNA från U. glacialis extraherades från 3-5 mg vävnad (ben, hud, lever) med användning av en något modifierad kiseldioxidbaserad procedur 27, 28 (se avsnittet Metoder för detaljer). Sekvenserna erhållna för U. glacialis (Gla1) replikerades oberoende av två laboratorier för att utesluta forntida DNA-nedbrytning som en möjlig orsak till de observerade polymorfa nukleotidpositionerna. DNA-extraktion från fyra fossila arktiska markekorrar från Duvanny Yar genomfördes från 10–20 mg benpulver med användning av ett fenol / kloroformprotokoll efter förbehandling över natten med proteinas K vid 37 ° C. Arton korta, som sträckte sig över 96–140 bp, överlappande sekvenser av mitokondriell cyt b- gen riktades av PCR med användning av nydesignade primrar baserade på sekvensen för modern U. parryii från Atka, Magadanskaya oblast (GenBank-anslutningsnummer AF157896) (kompletterande tabell S2) DNA från museet torra och etanol-konserverade prover extraherades med användning av ett standard fenol / kloroformprotokoll och amplifierades antingen i fyra (312–421 bp, museumtorrprover) eller i två (866 och 908 bp, etanol-konserverade prover) överlappande fragment med användning av nydesignade primrar (tilläggstabell S2). Varje uppsättning experiment åtföljdes av lämpliga tomma kontroller.

Gla1-sekvensen och de från Duvanny Yar-proverna (Gla2a, b, c och d) var mycket lika varandra men skilde sig signifikant från de från moderna arktiska markekorrar från 17 geografiska orter i nordöstra Sibirien som genererades i denna studie. De delade emellertid 28 unika nukleotidpositioner och definierade glacialis mtDNA-avstamning med dem från Kamchatka-halvön (kompletterande tabell 3). Resten av exemplen av moderna U. parryii som undersöktes i denna studie befanns höra till Beringia clade, tidigare rapporterad från nordvästra Nordamerika 9, 11 . Vi utvidgade sedan vår analys till att inkludera publicerade data om populationer från Alaska och Kanada och använde U. richardsonii och U. columbianus som utgrupper (se avsnittet Metoder för GenBank-anslutningsnummer för sekvenserna inkluderade). För uppföljning accepterade vi tidigare använt geografisk clade-beteckning, nämligen Arctic (Arc), Beringia (Ber), Southwest (SW), Southeast (SE) 11 . Det är anmärkningsvärt att 20 av 28 unika nukleotidpositioner, som är karakteristiska för glacialis mtDNA-linjen, observerades i SW-clade från nordvästra Nordamerika.

Vi uppskattade att 71, 89% av den totala genetiska variansen resulterade från skillnader mellan grupperna och 28, 11% inom grupperna (P <0, 001). Haplotype-mångfalden ( h ) var stor både i de forntida och moderna proverna från nordöstra Sibirien och Kamchatka-halvön (från 0, 964 ± 0, 023 till 1.000 ± 0, 052) 29 . De genomsnittliga interspecifika p- avstånden mellan arktiska markekorrar av sent pleistocen och de som bor i nordöstra Sibirien för närvarande varierade från 1, 3 ± 0, 3% i Gla-Kam till 3, 4 ± 0, 5% i Gla-Ber-par. De västra (Asien) och östra (Nordamerika) U. parryii av Ber clade uppvisade den lägsta medelvisa parvisa p- avståndet på 0, 9 ± 0, 2%, vilket återspeglade deras nära genetiska förhållande och den senaste tidens divergens efter det slutgiltiga försvinnandet av Bering Land Bridge.

För att ytterligare undersöka de fylogenetiska förhållandena mellan de samplade platserna konstruerade vi ett medianförenande nätverk av de observerade cyt b- haplotyperna med hjälp av PopART v.1.7-programvara 30 . Figur 2b visar MJ-nätverket för de 55 haplotyperna som representerar 65 subarktiska U. parryii . MJ-nätverket avslöjade fyra distinkta kluster: Gla + Kam, SW, SE och Ber + BerR. Enligt MJ-släktforskningen är sent pleistocena arktiska markekorrar förfäder till de som för närvarande bebor Kamchatka-halvön. Ber + BerR-gruppen representeras av två sublinjer som vardera inkluderar västra och östra Beringia-prover blandade med varandra. Två sublinjer som ses i SW-klustret representerar fastlandet Alaska respektive angränsande öar.

Vi observerade samma mönster av genetiska affiniteter i en maximal sannolikhetsträd (ML) -träd konstruerat av 27 nyligen erhållna kompletta cyt b- gensekvenser och 45 tidigare publicerade (Fig. 4). Två stora kladder var närvarande i subarktiska U. parryii : Gla / Kam / SW och Ber / SE, som var och en innehöll två välunderstödda subklader. De forntida proverna grenades tillsammans med moderna U. parryii från Kamchatka-halvön, och bredvid dem från Alaska-halvön, men inte med U. parryii som för närvarande bor i nordöstra Sibirien.

Bootstrap-värden visas bredvid noden. U. columbianus och U. richardsonii användes som utgrupper. Namn och färger korsreferenser Tilläggstabell S1 respektive fig 2.

Bild i full storlek

Definiera diversifieringens tidslinje för arktiska markekorrar i sent Pleistocen

Vi använde en Bayesiansk fylogeografisk strategi för att dra slutsatsen om tidpunkten för spridningar för forntida arktiska markekorrar i östra och västra Beringia (Fig. 5). Det ursprungliga datasättet undersöktes med användning av TipDatingBeast 31 och visade sig vara informativt för tips-dateringsanalys med BEAST (Kompletterande Fig. S1). För spetskalibrering användes åldersbestämda radiokolfålder: ett medelvärde på 33, 075 år BP för U. glacialis och 31 800 år BP för exemplen från Duvanny Yar 26 . Medelvärden och 95% HPD-värden för TMRCA för noderna ges i tilläggstabell S4.

Huvudnodvärden anges i kyr BP. Bayesiska bakre sannolikheter anges med kursiv stil ovanför raden. Namn och färger korsreferenser Tilläggstabell S1 respektive fig 2.

Bild i full storlek

Resultaten av tip-kalibrerad BEAST-analys tillät oss att föreslå ett troligt scenario för diversifiering av subarktiska markekorrar i sent Pleistocen Beringia och att tillhandahålla en definierad tidsplan för dessa händelser. Vi uppskattade att för 123 kyr sedan, under Kazantsevo interglacial, ungefär motsvarande Pelukian överträdelsen (marin isotopsteg 5e (MIS 5e), 125–115 kyr BP) 32, subarktiska U. parryii hade separerats från Arc / U. richardsoni grupp som återstod norr om Brooks Range. De subarktiska U. parryii- populationerna hade delat en senast gemensam förfader (MRCA) för 104 kyr sedan, och som antyddes av våra fynd, sedan några av dem kanske har korsat Bering Land Bridge västerut till nordöstra Sibirien. Efter den simpsoniska överträdelsen (88–70 kyr BP) 32 isolerades de från förfädernas pool i östra Beringia. Som ett resultat sprickade förfäderna till Glacialis- familjen och moderna U. parryii från Kamchatka och Alaska-halvöarna, med MRCA-daterat till 65 kyr BP, vidare i nordöstra Sibirien så långt som till den övre Indigirka-floden i väster och i nedre Kolyma-floden i norr, medan förfäderna till arktiska markekorrar, som för närvarande finns på båda sidor av Beringsundet och i sydöstra Alaska (Ber- och SE-kladerna), förblev på den nordamerikanska kontinenten.

Karginsky / Middle Wisconsinan interglacial (55–25 kyr BP, MIS 3 [ref. 32]), som inkluderade två kylning (ca. 40–45 och 30–35 kyr BP) och tre uppvärmningshändelser 33 orsakade en ytterligare fragmentering av naturliga livsmiljöer för arktiska markekorrar. Efter början av Last Glacial Maximum (LGM) etablerade sig SW-befolkningen på Alaska-halvön och angränsande öar, strax efter att U. glacialis i Yakutia hade försvunnit. Glacialis- familjen överlevde utrotningen i en av LGM-refugierna i västra Beringia, Kamchatka-halvön. Dessa fynd ger inget stöd för tidigare förslag om att antika arktiska markekorrar från nordöstra Sibirien utgjorde en distinkt art. Tvärtom, den observerade genetiska kontinuiteten för glacialis mtDNA-linjen i modern U. parryii tillåter oss att hänvisa till den som en underart, U. parryii glacialis .

När det gäller östra Beringia var våra data kompatibla med ett Alaskans ursprungscentrum för Ber / SE-gruppen, med en uppskattad tid för MRCA på 44 kyr BP, och visade att Ber / BerR-gruppen hade expanderat sitt livsmiljö till nordöstra Sibirien 29 kyr sedan, motsvarande i tid till början av LGM havsnivå lågstand (26–19 kyr BP) 34 . Även om två subklader inom Ber / BerR-gruppen identifierades i denna studie, daterad till 25 respektive 20 kyr BP, inkluderade var och en av individer från både västra och östra Beringia, vilket återspeglade ett kontinuerligt genflöde under Sartan / Late Wisconsinan (MIS 2, 25–15 kyr BP) 32, som avbröts av Holocene havsnivåökning som återöppnade Beringsundet.

Samtidigt som man erkänner begränsningarna i en enkelgenstrategi bör man notera att (1) nära genetiska affiniteter mellan Gla / Kam- och SW-kladerna som identifierats här är i överensstämmelse med den morfologiska likheten mellan U. glacialis och några av Nordamerikanska U. parryii registrerade tidigare 4, 5 ; (2) moderna mtDNA-baserade studier av U. parryii i nordvästra Nordamerika har framhävt särdragen i sydvästra Alaska-befolkningen 9, 10, 11, 12 ; och (3) viktiga geografiska mönster av mitokondriell och kärn-DNA-struktur har rapporterats vara överensstämmande för U. parryii i östra Beringia, med undantag för förhållandet mellan Ber- och SW-grupperna 11 . Våra resultat gör det möjligt för oss att lösa det senare avviket genom att tillhandahålla "iskallt" bevis på nära genetiska förhållanden mellan Glacialis- familjen från Yakutia och sydvästra Alaska-befolkningen och föreslå ett eventuellt sibiriskt ursprung för den senare följt av en östutvidgning.

Tidigare DNA-baserade studier hävdade att den genetiska strukturen hos moderna arktiska markekorrar resulterade från diversifiering in situ (dvs. östra Beringia) i senpleistocen 11, 12 . Dessa studier, till stor del begränsade till nordvästra Nordamerikaprover, har visat att två av de fyra stora mtDNA-linjerna som hittills identifierats (Ber och SW) finns på båda sidor av Beringsundet 12 . Med hjälp av tip-kalibrerad BEAST-analys visar vi att diversifiering av arktiska markekorrar faller väl inom den sena pleistocenperioden, som föreslagits tidigare, och ger en definierad tidslinje för dessa händelser. För första gången avslöjar vi en tidig skillnad mellan Gla / Kam / SW och Ber / SE-grupperna av subarktiska U. parryii som går tillbaka till 104 kyr BP. Vi visar vidare att Ber clade, som har sitt ursprung i Alaska, nu är utbredd över hela västra Beringia, med undantag av Kamchatka-halvön. Vi beskriver en ny mtDNA-avstamning (Gla-Kam) i arktiska markekorrar i västra Beringia. Denna avstamning verkar vara en systerklåda för den moderna subarktiska markekorrarna från sydvästra Alaska och delar med den senare en MRCA som levde för 65 tusen år sedan. Även om Gla-Kam-SW-gruppen kan ha utvecklats i östra Beringia, stöds närvaron av glacialis mtDNA-linjen för 30 tusen år sedan i nordöstra Sibirien genom direkt radiokolldatering och antyder att början av koloniseringen av västra Beringia av subarktiska U. parryii från nordvästra Nordamerika var tidigare än tidigare trott.

För att verifiera denna hypotes skulle ytterligare DNA-studier baserade på ett större antal fossiler från västra och östra Beringia, provtagna om de är tillgängliga vid kritiska tidpunkter som bestämts här, behövas.

metoder

prover

Fem forntida arktiska markekorrar från två permafrostplatser i nordöstra Sibirien, Ryssland, undersöktes: El'ga-floden, en vänstra biflod för den övre Indigirka-floden (ZIN-34046) och Duvanny Yar belägen på den nedre högra stranden Kolyma-floden. Tre fossila arktiska ekorrar från Duvanny Yar (IGDPM-6391, P-1311 och P-1322) utvanns från hålor 25, 26 medan prov P-Up4 inte hittades på plats men samlades upp från utsatta sediment på stranden av nedre Kolyma floden, i den övre regionen av Duvanny Yar. Data om morfologi och morfometrik av proverna och om tillhörande paleokologiska fynd finns tillgängliga någon annanstans 4, 25, 26 . Museprover av moderna U. parryii provades från 21 platser över nordöstra Sibirien och Kamchatka-halvön från två källor: torra (ben och tänder, N = 19) och etanolbevarade prover (lever, N = 2) (fig. 2 och Kompletterande tabell S1).

Radiokarbon-datering

Efter förbehandling 35 extraherades kollagen från ett leverprov av U. glacialis och analyserades med användning av Fourier Transform Infrared (FTIR) spektrometri (MIDAC Corporation, Costa Mesa, CA, USA). 14C-bestämning utfördes med acceleratormasspektrometri (AMS). Radiokolldatum rapporterades i konventionellt 14 C år BP, korrigerat för isotopfraktionering baserat på det stabila kolisotopförhållandet (8 13 C-värde). Kalibrerade åldrar under kalenderår erhölls med användning av den jordbaserade kalibreringsmodellen IntCal13 36 med hjälp av OxCal v. 4.2.4 [ref. 37 och 38] (Fig. 3 och kompletterande information).

DNA-extraktion och amplifiering

Laboratorierna 1 och 2: Tre prover av U. glacialis (ZIN-34046) - ben, hud och lever, var tillgängliga för DNA-analys. Analyserna utfördes oberoende av två laboratorier i anläggningar som strikt dedikerats till forntida DNA (aDNA) -forskning (Jerusalem och Rehovot) och separerades fysiskt från post-PCR och modernt DNA-arbetsområde. Dessutom var det första gången som Jerusalem-laboratoriet hanterar djurprover. Eftersom vävnadsproverna hade transporterats i 70% etanol, lufttorkades de vid rumstemperatur och ett delprov avlägsnades och malades till ett fint pulver. DNA extraherades med användning av en modifierad kiseldioxidbaserad metod 27, 28 enligt följande. Två till fem milligram av varje prov uppsamlades i ett 1, 5 ml Eppendorf-rör innehållande 500 pl GuSCN-lösning (4 M GuSCN; 0, 1 M Tris-HCl, pH 6, 4; 0, 002 M EDTA, pH 8, 0; 1, 3% Triton) och inkuberades med mild omrörning vid 56 ° C över natten. DNA isolerades genom att binda till 10 ul av en egengjord kiselsuspension i närvaro av 1 ml 6 M NaI på is under en timme, tvättades två gånger med 0, 5 ml iskall 70% etanol, lufttorkades i en timme och eluerades sedan i 100 ul sterilt PCR-vatten vid 56 ° C under en timme. DNA från U. glacialis förstärktes med användning av 18 uppsättningar av primrar som sträcker sig över korta amplikoner av 96–140 bp (kompletterande tabell S2), vilka konstruerades baserat på den fullständiga cytochtome b- sekvensen för en modern U. parryii från Atka, Magadanskaya oblast (GenBank-anslutning nummer AF157896). Två till fem mikroliter av den slutliga volymen av varje aDNA-extrakt utsattes för varmstart PCR-amplifiering i en 25 pl reaktion innehållande 1 x buffert, 10 pmol av varje primer, 0, 2 mM av varje dNTP, 1, 5 mM MgCl2 och 1 enhet av AmpliTaq Gold DNA-polymeras (Applied Biosystems, USA). PCR utfördes under 45 cykler enligt följande: 94 ° C – 30 sek, 50 ° C – 30 sek, 72 ° C – 30 sek. För att avlägsna hämmarna och att koncentrera aDNA-extrakt sattes bovint serumalbumin (BSA) till varje rör vid en slutlig koncentration av 0, 8 mg / ml och / eller Microcon YM-100 (Millipore Corporation, MA, USA) applicerades efter tillverkarens riktlinjer. PCR-produkter verifierades på 2% agarosgeler färgade med etidiumbromid. Innan sekvensering 5 mikroliter av PCR-produkterna rengjordes med användning av Exonuclease Shrimp Alkaline Phosphatase (Exo-Sap IT, Pharmacia) enligt tillverkarens instruktioner. Sekvensreaktioner på både de tunga och lätta trådarna utfördes vid Center for Genomic Technologies, det hebreiska universitetet i Jerusalem, Israel, med användning av DNA-analysatorn ABI 3500 (Applied Biosystems, USA).

Laboratorium 3 (Moskva): DNA extraherades från 20-30 mg benpulver från vart och ett av proverna från Duvanny Yar med användning av ett fenol / kloroformprotokoll efter inkubation över natten med proteinas K vid 37 ° C. PCR-amplifiering utfördes med användning av samma 18 grundpar som för U. glacialis under 45 cykler enligt följande: 94 ° C – 30 sek, 50 ° C – 45 sek, 72 ° C – 45 sek. PCR-produkter analyserades med användning av elektrofores i 6% PAAG med efterföljande färgning med etidiumbromid och visualisering i UV-ljuset. PCR-fragment renades för sekvensering genom elektrofores i 6% PAAG- och Wizard-kolumner (Promega, USA).

Laboratorium 4 (Penza): Prover som undersöktes här erhölls (1) från museumssamlingar och representerades av torr hud och tänder och (2) från etanolbevarade leverprover (tilläggstabell S1). Cirka 10–20 mg eller 3–4 mm3 vävnad delprovades från varje prov för DNA-analys. För att minimera skadorna på destruktivt provtagning i museiprövprover togs prov av orala falanger på fjärde fingern på huden och huden användes för att extrahera DNA. Vävnadsprover homogeniserades genom slipning i ett 1, 5 ml rör, inkuberades i 0, 5 ml STE-buffert under 30 till 60 minuter och centrifugerades sedan. DNA isolerades från pelleten med användning av en standardprocedur som inkluderade behandling över natten med natriumdodecylsulfat och proteinas K vid 50 ° C och efterföljande fenolekstraktion. Ett 1316-bp mtDNA-fragment som täcker cyt b- genen i full storlek flankerad av generna för tRNA amplifierades med användning av primrar specifika för Family Marmotinae , utformade från den sekvenserade mtDNA-genen för tRNA av de tre arterna ( Sciurus vulgaris, Glis glis och Spermophilus citellus ). PCR genomfördes i en slutvolym av 25 ul, innehållande 50 mM Tris-HCl (pH 8, 9); 20 mM ammoniumsulfat, 20 mikrometer EDTA; 150 μg / ml bovint serumalbumin; dNTP: er (200 μM av vardera); 2 mM MgCl2, 15 pmol av varje primer (kompletterande tabell S2); 2 enheter Taq- polymeras; och 0, 1–0, 2 μg DNA. Amplifiering utfördes enligt följande: 94 ° C under 1 min, 61 ° C under 1 min, 72 ° C under 3 minuter (30 cykler) för paret av primrar L-Glu-Sc / H-Pro-Sc. Vid användning av de interna primrarna (L-Glu-Sc / H830-Sfe och H830-Sfe / L397-Sp) var de genomsnittliga reaktionsbetingelserna: 94 ° C under 1 min; 59 ° C under 1 min; och 72 ° C under 2 minuter (under 30 cykler). PCR-produkter analyserades med användning av elektrofores i 6% PAAG med efterföljande färgning med etidiumbromid och visualisering i UV-ljuset. PCR-fragment renades för sekvensering genom elektrofores i 6% PAAG- och Wizard-kolumner (Promega, USA).

Sekvensering av Duvanny Yar och museumsprover utfördes vid Genome Common Use Center vid Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences med användning av BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit på ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer.

Sekvensinriktningar och mångfaldsåtgärder

Sekvenserna kontrollerades manuellt och validerades med användning av programvaran Sequencher 5.0 (Genecodes, USA) för oklarheter och fel. Godkända sekvenser justerades med användning av Geneious Pro 5.6.6 (BioMatters, Nya Zeeland). Vi använde DnaSP v.5.10 för att beräkna haplotypdiversitet ( h ) och medelövergripande p- avstånd för U. parryii- datauppsättningar 29 .

Filogenetiska analyser

Hela datasatsen inkluderade 27 sekvenser erhållna i den aktuella studien tillsammans med 45 tidigare publicerade. Det sistnämnda anslutningsnumret för Genbank är följande: Arc clade: 1 – JF314404, 2 – JF314409, 3 – JF314414, 4 – JF314416, 5 – AY427983, 6 – AY427988, 7 – JF314423; Ber clade: 8 – JF314428, 9 – JF314430, 10 – JF314431, 11 – JF314432, 12 – JF314436, 13 – JF314441, 14 – JF314446, 15 – AY427998, 16 – JF314451, 17 – JF314456, 18 – JF314442, 19 – A, 20 – JF314466, 21 – JF314471; SW clade: 22 – HM204709, 23 – AY427977, 24 – GU220824, 25 – AY428000, 26 – GU220833, 27 – GU220843, 28 – GU220828, 29 – AY427990; 30 – GU220849, 31 – GU220868, 32 – GU220854, 33 – AY427982, 34 – AY427981, 35 – GU220859; SE clade: 36 – JF314478, 37 – AY428018, 38 – AY428012, 39 – AY428008, 40 – JF314487, 41 – JF314492, 42 – AY428017, 43 – JF314500, 44 – AY428015, 45 – AY428009. U. richardsonii (JF314507) och U. columbianus (JF314509) användes som utgrupp.

Ett medianföreningsnätverk med 55 cyt b- haplotyper konstruerades med PopART v.1.7-programvara 30 . En maximal sannolikhet (ML) rekonstruktion av fylogeny utfördes med användning av PhyML 3.0-mjukvara 39 med 100 bootstrap-körningar, baserat på den fullständiga cyt b- sekvensen. Den optimala modellen för datasatsen (Hasegawa-Kishino-Yano-modellen, Gamma distribuerad (HKY + G) bestämdes via jModelTest v.2.0 40. Samma datasats undersöktes med användning av Bayesian Evolutionary Analysis by Sampling Trees (BEAST) v1.8.0 [ref 41]. Här utfördes analysen med användning av Hasegawa-, Kishino- och Yano-nukleotidsubstitutionsmodellen, Gamma distribuerad, med fyra kategorier under en strikt molekylärklockamodell och en Bayesian skyline-plotmodell, varvid den senare möjliggör mer flexibilitet i tidigare befolkningsdynamik och att använda en slumpmässig startträdmodell och normala tidigare. För att fästa en tidsskala till den fylogenetiska uppskattningen, använde vi radiokolldomarna i de antika proverna som oberoende kalibreringsinformation. För MCMC (Markov-kedjan Monte Carlo) analys, använde vi standardinställningar i BEAUti (Bayseian Evolutionary Analysis Utility) som inkluderade en total provtagningsperiod på 30 000 000 steg, med prover som dras var 1 000 steg. Prestandan för BEAST-körningarna (konvergens och ESS-val u överlägsen den kritiska tröskeln på 200) testades med användning av Tracer v1.5 [ref. 42]. De resulterande träden analyserades med hjälp av TreeAnnotator (del av paketet BEAST v1.8.0) för att beräkna ett maximalt troligt träd med en inbränning på 10% och en bakre sannolikhetsgräns på 0, 5. Trädet visades i FigTree v1.4. TipDatingBeast R-paketet användes för att underlätta implementeringen av fylogenetiska tip-dateringstest med BEAST 30 .

ytterligare information

Anslutningskoder: Sekvenser som genererats i denna studie har deponerats i GenBank (//www.ncbi.nlm.nih.gov) med anslutningsnummer KX646799-KX646825.

Hur man citerar den här artikeln : Faerman, M. et al . DNA-analys av en 30 000 år gammal Urocitellus glacialis från nordöstra Sibirien avslöjer fylogenetiska förhållanden mellan antika och nutida arktiska markekorrar. Sci. Rep 7, 42639; doi: 10.1038 / srep42639 (2017).

Förlagets anmärkning: Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.