Dj-1 modulerar uv-inducerad oxidativ stresssignal genom undertryckande av mekk1 och celldöd | celldöd & differentiering

Dj-1 modulerar uv-inducerad oxidativ stresssignal genom undertryckande av mekk1 och celldöd | celldöd & differentiering

Anonim

Abstrakt

DJ-1 är ett multifunktionellt protein som utför funktioner i transkriptionell reglering och oxidativ stress, och förlusten av dess funktion tros leda till att Parkinsons sjukdom (PD) börjar. I denna studie rapporterar vi att DJ-1 skyddar mot UV-inducerad celldöd genom att undertrycka JNK1-signalvägen. Resultaten från både bindnings- och kinasstudier har visat att MEKK1 är det direkta målet för DJ-1. C-terminalen av DJ-1 var avgörande för hämningen av MEKK1-kinasaktiviteten. Vildtyp DJ-1-sekwestrar MEKK1 inom cytoplasma och L166P-mutanten underlättar translokationen av MEKK1 till kärnan utan fysisk associering. Både DJ-1-knockdown och patogen L166P-mutant bestämdes vara mycket mottagliga för UV-inducerad aktivering av MEKK1-SEK1-JNK1 signalkaskad och celldöd. Sammantaget visar våra resultat att missense-mutation i DJ-1 sensibiliserar celler för stressinducerad celldöd genom MEKK1-SEK1-JNK1-signalvägen, en process som kan utlösa den tidiga början av PD.

Huvudsaklig

DJ-1 (SP22 / CAP-1 / RS / PARK7) har identifierats som ett nytt onkogent protein i transformerade NIH3T3-celler, som fungerar i samarbete med H-ras. 1 Tre andra grupper av klonad råttahomolog av DJ-1 / SP22 / CAP-1, som ett huvudprotein som förekommer vid reducerade nivåer av spermier efter exponering av råttor för infertilitetsinducerande toxiska ämnen, och även som en reglerande underenhet (RS) av ett RNA-bindande multiproteinkomplex, som stabiliserar mRNA som svar på cyklisk AMP. 2, 3, 4 DJ-1 har nyligen visat sig vara definitivt kausal i fall av familjär Parkinsons sjukdom (PD). Mutationer i DJ-1-genen har associerats med autosomal recessiv PD-tidigt; en homozygot genomisk deletion som omfattar exon 1–5, en homozygot L166P-missense-mutation och andra homozygota och heterozygota mutationer av DJ-1 har identifierats hos patienter med familj eller sporadisk PD. 5, 6, 7, 8, 9 Kristallstrukturen och jäst-tvåhybriddata indikerar att DJ-1 existerar som homodimer som har domäner som finns i både värmechockproteinchaperoner och ThiJ / PfpI-proteaser. 10, 11, 12 Som kontrast finns L166P-mutanten som en monomer, eftersom den destabiliserar dimer-gränssnittet. Flera bevislinjer tyder på att DJ-1 utför en funktion i oxidationsstressresponsen 13, 14, 15 och att dess uttryck induceras av oxidativa spänningar. 16, 17, 18 Den tvingade knockdownen av DJ-1-uttryck med kort störande RNA (siRNA) resulterar i mottaglighet för oxidativ stress, endoplasmatisk retikulum (ER) stress och proteasominhibering. 19, 20 L166P-mutanten, DJ-1, får celler att bli sensibiliserade för oxidativ stress, trots att det patogena L166P-mutanten DJ-1 är mycket instabilt och bryts ned av proteasomsystemet 20S / 26S. 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Hittills tycks flera rader med bevis tyder på att DJ-1 utför en funktion i celldöd. För det första resulterar överuttrycket av DJ-1 i PKB / AKT-hyperfosforylering och förbättrar cellöverlevnaden genom undertrycket av PTEN. 27, 28 För det andra DJ-1-sekvenser Daxx i kärnan och förhindrar den från att få tillgång till cytoplasma, vilket hindrar Daxx från att binda till och aktivera dess effektorkinas, apoptos-signalreglerande kinas 1 (ASK1). 29 För det tredje har DJ-1 i odlade däggdjursceller visat släcker reaktiva syrearter och skyddar därför mot reaktiv syre-arter-inducerad celldöd. 19, 29 Trots de många studier som gjorts beträffande ämnet förblir den fysiologiska rollen för DJ-1 i celldöd i stort sett okänd. Här har vi visat att DJ-1 modulerar JNK-signalvägen genom negativ reglering av funktionerna hos mitogen-aktiverat proteinkinas / extracellulär signalreglerat kinas-kinas-kinas 1 (MEKK1), genom fysisk interaktion.

Resultat

DJ-1 dämpar oxidativ stressinducerad JNK1-aktivering

För att bestämma den möjliga rollen av DJ-1 i regleringen av c-jun N-terminal Kinase (JNK1) signalväg, utsatte vi humana embryonala njuren 293 (HEK293) celler för övergående transfektion med en expressionsplasmid som kodar för Flagg-epitop-taggad DJ-1 (Flag-DJ-1) och utvärderade sedan den UV-inducerade aktiveringen av JNK1 i de transfekterade cellerna. Eftersom UV-tydligt inducerade JNK1-aktivering i kontrollceller inhiberades denna effekt markant i de DJ-1-transfekterade cellerna (figur 1a, kompletterande figur 1A). Vi utvärderade sedan den UV-inducerade aktiveringen av JNK1 i HEK293-celler som stabilt transfekterats med en expressionsvektor för Flag-epitop-märkt human DJ-1 (HEK293-DJ-1-celler), eller med motsvarande tom vektor (HEK293-neo celler). Den UV-inducerade aktiveringen av endogen JNK1, vilket var uppenbart i kontrollen HEK293-neo-celler, avskaffades i HEK293-DJ-1-cellerna (figur Ib, kompletterande figur IB). För att undersöka om uttrycket och modifieringen av DJ-1 förändras i UV-exponerade celler utförde vi tvådimensionellt gelelektrofores-experiment. Tidigare rapporter har beskrivit två huvudisoformer vid pI = 5, 8 och 6, 2. 15, 16, 17 Prover extraherades från celler transfekterade med flaggmärkt vildtyp DJ-1, antingen från obehandlade celler eller celler exponerade för UV. Vi fann att immunreaktiviteten i låg-pl-regionen hos UV-behandlade celler (figur 1c). Rollen av DJ-1 i JNK1-signalvägen utvärderades vidare genom knockdown av DJ-1 och L166P-mutantuttryck med användning av kort interferens DJ-1 (kompletterande figurer 3A och B). Till skillnad från vad som observerades i de korta interferensplasmidtransfekterade cellerna, innehöll cellerna som transfekterades med kort interferens DJ-1 låga nivåer av DJ-1 (figur 1d). Inhiberingen av endogen JNK1-aktivitet återställdes i enlighet med samuttrycket av kort interferens DJ-1 i HEK293-DJ-1-cellerna (figur 1d, kompletterande figur lC). Figur 1e indikerar också att endogen JNK1-enzymaktivitet, som stimulerades med UV, främjades genom nedreglering av DJ-1-uttryck (kompletterande figur 1D). Dessa resultat indikerar att nivån av DJ-1-uttryck resulterar i hämning av JNK1-signalvägen.

Image

DJ-1 dämpar oxidativ stressinducerad JNK1-aktivering. ( a ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pcDNA3-HA-JNK1 eller pcDNA3-Flag-DJ-1 såsom anges. Efter 48 timmars transfektion bestrålades cellerna med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och analyserades med avseende på JNK1-aktivitet genom immunkomplexkinasanalyser. ( b ) HEK293-neo- eller HEK293-DJ-1-celler exponerades för UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och analyserades för JNK1-aktivitet genom en immunkomplexkinasanalys. ( c ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pcDNA3-Flag-DJ-1. Efter 48 timmars transfektion bestrålades cellerna med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C. Celllysat underkastades tvådimensionell gelelektrofores följt av immunblotting med anti-Flag-antikropp. ( d ) HEK293-neo- eller HEK293-DJ-1-celler transfekterades med siRNA inriktat på DJ-1 eller kontroll-siRNA. Efter 48 timmars transfektion bestrålades cellerna med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och analyserades för JNK1-aktivitet genom en immunkomplexkinasanalys. ( e ) HEK293-celler transfekterades med siRNA-inriktning på DJ-1 (pSUPER-siDJ-1) eller kontroll-siRNA (pSUPER-siCon). Efter 48 timmars transfektion bestrålades cellerna med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och analyserades för JNK1-aktivitet genom en immunkomplexkinasanalys. Celllysat immunoblottades med anti-JNK och anti-DJ-1 monoklonala antikroppar. P- aktinuttryck analyserades med immunoblot med användning av en monoklonal anti- p- aktinantikropp som en belastningskontroll. Immunokomplex JNK1-kinasanalyser genomfördes med användning av GST-c-Jun som substrat. IB, immunblot

Bild i full storlek

DJ-1 hämmar uppströms och nedströms komponenter av JNK1

Vi försökte sedan avgöra om DJ-1 påverkar signalering uppströms om JNK1, inklusive SEK1- och MEKK1-vägen. 30, 31 Eftersom UV visade sig markant stimulera aktiviteterna för ektopiskt uttryckta SEK1 (data visas inte) och MEKK1 (data visas inte) i HEK293-cellerna minskades dessa effekter kraftigt i DJ-1-transfekterade HEK293-celler (data visade inte ). Vi bestämde sedan att UV-inducerad endogen SEK1 och MEKK1-aktivitet i HEK293-DJ-1 och HEK293-neo-celler. Den UV-inducerade stimuleringen av endogen SEK1 (figur 2a, kompletterande figur 2A) och MEKK1 (figur 2b, kompletterande figur 2B) aktiviteter minskades anmärkningsvärt i HEK293-DJ-1-celler, i jämförelse med HEK293-neo-kontrollceller. Dessa data visade att överuttryck av DJ-1 också blockerade UV-inducerad SEK1- och MEKK1-aktivitet.

Image

DJ-1 hämmar aktiviteterna SEK1 och MEKK1. ( a, b ) HEK293-neo- eller HEK293-DJ-1-celler exponerades för UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och analyserades för SEK1- eller MEKK1-aktivitet genom immunkomplexkinasanalyser med användning av GST-JNK1 (K55R) eller GST-SEK1 (K129R) som substrat. ( c ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pcDNA3-Flag- Δ MEKK1, pcDNA3-HA-JNK1 eller pcDNA3-His-DJ-1 såsom indikerats. ( d ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pcDNA3-Flag- Δ MEKK1, pEBG-GST-SEK1 eller pcDNA3-His-DJ-1 såsom indikerats. ( e ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pcDNA3-Flag- Δ MEKK1 eller pcDNA3-His-DJ-1 såsom indikerats. ( f ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pcDNA3-Flag- Δ MEKK1, pcDNA3-His-DJ-1, pSUPER-siCon eller pSUPER-siDJ-1 såsom indikerats. Efter 48 timmars transfektion analyserades cellerna med avseende på kinasaktivitet genom immunkomplex kinasanalyser. ( g ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pcDNA3-Flag- Δ MEKK1, pSUPER-siCon eller pSUPER-siDJ-1 såsom indikerats. Efter 48 timmars transfektion analyserades cellerna med avseende på kinasaktivitet genom immunkomplex kinasanalyser. ( h ) HEK293-celler transfekterades transient med plasmider som uttrycker pSUPER-siCon eller pSUPER-siDJ-1 såsom indikerats. Efter 48 timmars transfektion analyserades cellerna med avseende på kinasaktivitet genom immunkomplex kinasanalyser. ( a - h ) Celllysat immunoblottades med anti-SEK1, anti-MEKK1, anti-Flag, anti-His, anti-HA och anti-DJ-1 antikroppar. IB, immunblot

Bild i full storlek

I de tidigare rapporterna har det föreslagits att DJ-1 eliminerat väteperoxid in vitro genom att oxidera sig själv. 19 UV ökar också mängden intracellulär ROS, vilket är kritiskt med avseende på aktivering av JNK1-signalering. 32 Därför utvärderade vi rollen som DJ-1 i den ROS-oberoende aktiveringen av JNK1 med hjälp av en konstitutiv aktiv mutant av MEKK1 ( Δ MEKK1) (Kompletterande figur 4). Överraskande visade sig DJ-1 undertrycka JNK1 (figur 2c, kompletterande figur 2C) och SEK1 (figur 2d, kompletterande figur 2D) -aktivitet stimulerad av Δ MEKK1 i HEK293-cellerna. Dessa resultat indikerade att undertryckningen av JNK1-signalvägen med DJ-1 åtminstone delvis inte är ansluten till ROS-rensare. Vi bedömde sedan Δ MEKK1 autofosforyleringsaktiviteter i HEK293-cellerna. DJ-1-överuttryck förhindrar autofosforylering av Δ MEKK1 (figur 2e). Inhiberingen av Δ MEKK1-enzymaktivitet med DJ-1 återställdes enligt samuttrycket av kort interferens DJ-1 i HEK293-celler (figur 2f, kompletterande figur 2E). Figur 2g indikerar också att Δ MEKK1 enzymaktivitet främjades genom nedreglering av DJ-1-uttryck. Vidare avslöjade immunkomplex kinasanalys med endogen MEKK1 att UV-behandling ökade kinasaktiviteten för endogen MEKK1 i celler som uttrycker kort interferenskontrollvektor, och att dessa effekter förbättrades i celler som uttrycker kort interferens DJ-1 (figur 2h). Därför indikerar våra data att MEKK1 kan vara DJ-1's huvudmålprotein i MEKK1-SEK1-JNK1-signaleringskaskaden genom en viss mekanism.

Transkriptionsfaktorn c-juni är ett fysiologiskt mål för JNK1. 33 Således försökte vi bestämma om DJ-1 påverkar den JNK1 signalberoende ökningen i transaktiveringsaktiviteten för c-Jun genom en analys av luciferasreportergen. UV orsakade en ökning av c-jun-beroende luciferasaktivitet och c-Jun-fosforylering, och denna effekt hämmades av DJ-1 (figur 3a). I HEK293-celler fungerar överuttryckt Δ MEKK1 som en konstitutiv aktiv form av enzymet och förbättrar c-Jun-beroende luciferasaktivitet. Δ MEKK1 inducerade en transkriptionsstimulerande aktivitet av c-Jun, som blockerades av DJ-1 (figur 3b). Till skillnad från de korta interferensplasmidtransfekterade cellerna visade de korta störningar DJ-1-transfekterade cellerna en förhöjd basnivå av c-Jun (figur 3c) och Δ MEKK1-beroende c-Jun transaktiveringsaktivitet (figur 3c). Dessa resultat indikerar att DJ-1 hämmar den MEKK1-beroende transaktiveringsaktiviteten för c-Jun.

Image

DJ-1 hämmar transaktiverande aktivitet av c-Jun stimulerad av JNK-vägen. ( a ) HEK293-celler transfekterades transient med en luciferasreporterplasmid pFR-Luc, pFA2-c-Jun eller pcDNA3-flagga-DJ-1 tillsammans med pCMV- p- galaktosidas som anges. Efter 44 timmar exponerades transfektanterna för UV-ljus (60 J / m 2 ) och inkuberades under ytterligare 4 timmar vid 37 ° C. Celllysat immunoblottades med antifofo-c-Jun, anti-c-Jun och anti-Flag antikroppar. ( b, c ) HEK293-celler transfekterades transient med luciferasreporterplasmiderna pFR-Luc, pFA2-c-Jun, pFC-ΔMEKK1, pcDNA3-flagg-DJ-1 eller pSUPER-siDJ-1 tillsammans med pCMV- p- galaktosidas som indikerat. ( a - c ) Efter 48 timmar lyserades transfektanterna och analyserades med avseende på luciferasaktivitet. Luciferasaktiviteten för varje prov normaliserades med användning av p- galaktosidasaktiviteten mätt i samma prov. Data uttrycks som medel ± SD för triplikat från ett av två oberoende experiment. Alla dessa resultat är representativa för minst tre oberoende experiment. * ANOVA, P <0, 001. Celllysat immunblottades med anti-Flag-antikropp. IB, immunblot

Bild i full storlek

DJ-1 hämmar MEKK1-aktivitet, men inte SEK1 och JNK1-aktiviteter in vitro

Effekten av DJ-1 på MEKK1-aktivitet in vitro bedömdes för att bestämma om DJ-1 direkt riktar sig mot MEKK1. Jämfört med endogena och ektopiska uttryckta DJ-1 användes liknande nivå av renade DJ-1-proteiner i detta experiment (kompletterande figur 3C). En aktiv MEKK1 förvärvades genom immunutfällning av UV-exponerade HEK293-celler med användning av anti-MEKK1-antikropp. I in vitro -kinasanalysen resulterade förbehandlingen av aktiv MEKK1 med renat DJ-1-protein i en hämning av MEKK1-aktivitet (figur 4a). Som jämförelse hade DJ-1-förbehandling liten effekt på den enzymatiska aktiviteten för varken SEK1 (figur 4b) eller JNK1 (figur 4c) in vitro . DJ-1 inhiberade också den enzymatiska aktiviteten hos Δ MEKK1 (figur 4d). Dessutom påverkade förbehandling med DJ-1 inte direkt aktiviteterna för andra MAP3K: er in vitro , inklusive MLK3 och TAK1 (figur 4e). Ytterligare experiment visar att GST och BSA inte undertryckte enzymaktiviteten för MEKK1 (figur 4f). Således indikerar våra data att MEKK1 var det huvudsakliga målproteinet för DJ-1 i MEKK1-SEK1-JNK1-signaleringskaskaden. DJ-1 fosforylerades inte av MEKK1 (data visas inte).

Image

DJ-1 hämmar MEKK1-aktivitet, men inte SEK1 och JNK1-aktiviteter in vitro . ( a - c ) HEK293-celler bestrålades med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och utsattes sedan för immunutfällning med användning av anti-JNK1, anti-SEK1 eller anti-MEKK1 antikropp som indikerat. ( d ) DJ-1 hämmar den konstitutiva aktiva mutanten av MEKK1. HEK293-celler transfekterades transient med pcDNA3-flagga-MEKK1 och utsattes för immunutfällning med användning av anti-Flag-antikropp såsom anges. ( e ) DJ-1 har ingen effekt på MLK3 och TAK1. HEK293-celler transfekterades transient med pcDNA3-HA-MLK3 eller pcDNA3-HA-TAK1 och utsattes sedan för immunutfällning med användning av anti-Flag-antikropp såsom anges. ( a - e ) Immunopelleterna inkuberades med renat DJ-1-protein i 50 mikroliter HEPES-buffert vid ett pH av 7, 4 under 1 timme vid rumstemperatur, tvättades två gånger med HEPES-buffert, analyserades sedan för JNK1, SEK1 eller MEKK1-aktivitet med användning av GST-c-Jun, GST-JNK1 (K55R) eller GST-SEK1 (K129R) som substrat. Immunokomplex kinasanalyser för MLK3 och TAK genomfördes med användning av myelin basic protein (MBP) som ett universellt substrat. ( f ) HEK293-celler bestrålades med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och utsattes sedan för immunutfällning med användning av anti-MEKK1-antikropp såsom anges. Immunopelleterna inkuberades med renade 2 ug GST- eller BSA-proteiner och analyserades sedan med avseende på MEKK1-aktivitet med användning av GST-SEK1 (K129R) som ett substrat. Celllysat immunoblottades med anti-MEKK1, anti-SEK1, anti-JNK1 och anti-HA antikroppar. IB, immunblot

Bild i full storlek

DJ-1 interagerar fysiskt med MEKK1 i intakta celler

Vi utvärderade sedan de fysiska interaktioner som uppstod mellan DJ-1 och MEKK1. Coimmunoprecipitation-analys avslöjade att MEKK1 associerade fysiskt med DJ-1 (figur 5a). Vi försökte också karakterisera interaktionen mellan MEKK1 och den patogena L166P-mutanta formen av DJ-1. Vi transfekterade cellerna med en ökad mängd av L166P-kodningsvektorn för att uppnå en uttrycksnivå som är jämförbar med den för vildtyp DJ-1. Trots de liknande mängderna av vildtyp och DJ-1 (L166P) var interaktionen mellan MEKK1 och mutanten mycket svagare än med vildtyp-DJ-1 (figur 5a). Detta resultat antyder att den försämrade bindningen av DJ-1 (L166P) till MEKK1 inte kan hänföras till dess lägre expressionsnivå, utan snarare till en konformationell förändring som påförts av mutationen. Vi upptäckte också en direkt interaktion som inträffade mellan ektopiskt uttryckta vildtyp DJ-1 och endogen MEKK1, medan L166P-mutanten av DJ-1 inte detekterades i ett identiskt immunkomplex med endogent MEKK1 med användning av HEK293-neo, HEK293-DJ-1 och HEK293-L166P stabila cellinjer (figur 5b). Vi undersökte också om endogen DJ-1 och MEKK1 kunde interagera i intakta celler. Immunoblot-analys med användning av anti-DJ-1-antikropp från MEKK1-immunutfällningarna indikerade att den fysiska sammansättningen av två endogena DJ-1 och MEKK1 i intakta celler (figur 5c). Immunblotanalys med användning av anti-DJ-1-antikropp från MEKK1-immunutfällningarna indikerade att UV-behandling undertrycker den fysiska sammanslutningen av två endogena DJ-1 och MEKK1 i HEK293-celler. Emellertid kunde exponering av cellerna för UV inte förhindra den fysiska interaktionen mellan ektopiskt uttryckt DJ-1 och endogen MEKK1 (figur 5c). Dessutom kunde vi inte upptäcka någon associering mellan DJ-1 eller L166P-mutanten och JNK1 eller SEK1 genom efterföljande experiment (data visas inte).

Image

DJ-1 interagerar fysiskt med MEKK1 i intakta celler. ( a ) HEK293-celler transfekterades transient med 1 | g pcDNA3-HA-MEKK1, 1 | g pcDNA-Flag-DJ-1 eller 3 | g pcDNA-Flag-DJ-1 (L166P) för att uppnå ekvivalent uttryck nivåer. Celler lyserades och utsattes för immunutfällning med anti-Flag-antikropp såsom anges. Immunutfällningar immunoblottades med anti-HA-antikropp. Uttrycket av MEKK1, vildtyp DJ-1 eller L166P-mutanten DJ-1 analyserades genom immunoblot med användning av anti-HA respektive anti-Flag monoklonal antikropp. ( b ) HEK293-neo, HEK293-DJ-1 och HEK293-DJ-1 (L166P) celler lyserades och utsattes för immunutfällning med anti-Flag-antikropp såsom anges. Immunutfällningar immunoblottades med anti-MEKK1-antikropp. Celllysat immunblottades med anti-Flag och anti-MEKK1 antikroppar som en kontroll. ( c ) HEK293-celler transfekterades transient med pcDNA-Flag-DJ-1 såsom anges. Efter 48 timmars transfektion bestrålades cellerna med UV-ljus (60 J / m 2 ), ytterligare inkuberades under 1 timme vid 37 ° C. HEK293-celler lyserades och utsattes för immunutfällning med anti-MEKK1-antikroppar såsom indikerats. Immunutfällningar immunoblottades med anti-DJ-1-antikropp. Celllysat immunoblottades med anti-DJ-1 och anti-MEKK1 antikroppar som en kontroll. ( d ) HEK293-celler transfekterades transient med pSUPER-siCon eller pSUPER-siDJ-1 såsom anges. Efter 48 timmars transfektion bestrålades cellerna med UV-ljus (60 J / m 2 ), ytterligare inkuberades under 1 timme vid 37 ° C. HEK293-celler lyserades och utsattes för immunutfällning med anti-SEKl-antikroppar såsom indikerats. Immunutfällningar immunoblottades med anti-MEKK1-antikropp. Celllysat immunoblottades med anti-DJ-1, anti-SEK1 och anti-MEKK1 antikroppar som en kontroll. ( e ) HEK293-celler transfekterades med pcDNA-Flag-DJ-1 och därefter tillsattes cellextrakten till den rekombinanta GST-kontrollen, GST-MEKK1- eller GST-MEKK1-N1-N4-deletionsmutanterproteiner immobiliserade på GSH-agarospärlor. Bundna proteiner tvättades, eluerades, separerades genom SDS-PAGE och analyserades genom immunblotting med användning av anti-Flag monoklonal antikropp. ( f ) HEK293-celler transfekterades transient med pcDNA-Flag-DJ-1, pcDNA-Flag-DJ-1-N eller pcDNA-Flag-DJ-1-C såsom anges. Efter 48 timmars transfektion bestrålades cellerna med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades ytterligare under 1 timme vid 37 ° C och analyserades med avseende på MEKK1-aktivitet genom immunkomplex kinasanalys. Celllysat immunoblottades med anti-DJ-1 och anti-MEKK1 antikroppar som en kontroll. IB, immunblot

Bild i full storlek

Därefter undersökte vi effekten av DJ-1 på den fysiska interaktionen mellan två MEKK1- och SEK1-proteiner genom coimmunoprecipitation. Coimmunoprecipitationsanalys med endogen MEKK1 och SEK1 avslöjade att bindningen i celler som uttrycker kort interferenskontrollvektor, och att dessa effekter förbättrades i celler som uttrycker kort interferens DJ-1 (figur 5d). Således indikerar våra data att MEKK1 kan vara det huvudsakliga målproteinet för DJ-1 i MEKK1-SEK1-JNK1-signaleringskaskaden genom störning av bindning med nedströms substrat.

Vi försökte sedan ta reda på vilka av domänerna som kan vara involverade i interaktionen mellan MEKK1 och DJ-1. In vitro- bindningsanalys med GST-fusionerade MEKK1-deletionsmutanter visade att kinasdomänen i MEKK1 samverkade med DJ-1 (figur 5e). Efterföljande experiment avslöjade att karboxylterminalen (aminosyrorna 165–189) av DJ-1 förhindrade MEKK1-kinasaktivitet (figur 5f). Resultaten av denna studie indikerade att DJ-1 hämmar aktiveringen av MEKK1 utan dess släckningsförmåga mot reaktiva syrearter, men att fysisk interaktion är avgörande för DJ-1-funktionen.

DJ-1-sekwestrar MEKK1 i cytoplasma och L166P-mutant förbättrar kärnansamlingen av MEKK1

I ett försök att bestämma rollen för den patogena L166P-mutanta formen av DJ-1 i JNK1-signalvägen, genomförde vi en endogen JNK1-kinasanalys med användning av HEK293-neo och L166P-mutanta stabila uttryckande celler (HEK293-L166P). Den UV-inducerade aktiveringen av endogen JNK1, SEK1 och MEKK1 uppenbar i kontrollen HEK293-neo-celler förbättrades i större utsträckning i HEK293-L166P-cellerna (figur 6a). Vidare observerade vi att DJ-1-mutanterna (C46A, C53A) inducerade signifikant MEKK1-aktivering, medan C106A var ineffektiva i detta avseende (figur 6b). MEKK1 är lokaliserad huvudsakligen till cytoplasma i ostimulerade celler. Under signalutbredning translokeras MEKK1 till kärnan och reglerar därmed genuttryck. 34, 35 DJ-1 av vildtyp distribueras över både cytoplasma och kärna. L166P-mutanten har rapporterats vara lokaliserad, delvis i både mitokondrier och kärnor. 5 Vi bestämde att UV-stress inducerar kärnansamlingen av MEKK1 med hjälp av konfokalstudie (figur 6c) och cellfraktionering (kompletterande figur 5, figur 6e och f). För att karakterisera effekterna av vildtypen DJ-1 och L166P-mutanten på translokationen av MEKK1 från cytoplasman till kärnan, cotransfekterades cellerna med HA-MEKK1, Flag-DJ-1 och Flag-DJ-1 (L166P ). Uttrycket av vildtyp DJ-1 blockerade väsentligen den UV-inducerade translokationen av MEKK1 till kärnan (figur 6c och e). Den patogena mutanten av DJ-1 underlättar kärntranslokationen av MEKK1 (figur 6c och d). Kärnlokalisering av MEKK1 i närvaro av L166P-mutant bekräftades genom immunblotting av extrakt av kärnfraktionerna (figur 6e och f). Resultaten från detta experiment visar DJ-1's skyddande roll och visar också att den stimulerande rollen för den patogena mutanten av DJ-1 i JNK1-signalvägen kan vara associerad med regleringen av MEKK1 subcellulär lokalisering.

Image

DJ-1-sekwestrar MEKK1 i cytoplasma och L166P-mutanten förbättrar kärnansamlingen av MEKK1. ( a ) Den patogena L166P-mutanten underlättar aktiveringen av JNK1-signalvägen. HEK293-neo- eller HEK293-L166P-celler bestrålades med UV-ljus (60 J / m 2 ), inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C och analyserades med avseende på JNK1, SEK1 eller MEKK1-aktivitet genom immunkomplexkinasanalys. ( b ) HEK293-celler transfekterades med pcDNA3-Flag- Δ MEKK1, pcDNA3-V5 / His-DJ, pcDNA3-V5 / His-DJ-1 (L166P), pcDNA3-V5 / His-DJ-1 (C46A), pcDNA3 -V5 / His-DJ-1 (C53A) och pcDNA3-V5 / His-DJ-1 (C106A). Efter 48 timmars transfektion analyserades cellerna med avseende på kinasaktivitet genom immunkomplex kinasanalyser. ( c ) HEK293-celler transfekterades med pcDNA3-HA-MEKK1, pcDNA-Flag-DJ-1 eller pcDNA-Flag-DJ-1 (L166P). Efter 48 timmar exponerades cellerna för UV-ljus (60 J / m 2 ) och inkuberades under ytterligare 1 timme vid 37 ° C såsom anges. MEKK1 och DJ-1 färgades med rodamin (rött) och fluorescein (grönt). ( d ) Cellerna i vilka MEKK1 detekterades i kärnan räknades i 10 slumpmässigt utvalda fält bland de samtransfekterade cellerna. Data uttrycks som medel ± SD från ett av tre oberoende experiment. * ANOVA, P <0, 001. ( e, f ) HEK293-celler transfekterades med HA-MEKK1, Flag-DJ-1, Flag-DJ-1 (L166P) såsom anges. ( e ) Efter 48 timmar fraktionerades celler till cytosoliska fraktioner och kärnfraktioner. ( f ) Efter 48 timmar exponerades cellerna för UV-ljus (60 J / m 2 ) och inkuberades under ytterligare 45 minuter vid 37 ° C. ( e, f ) Celllysat utsattes också för immunblottinganalys med antikroppar mot HA och Flag. Lamin och p- aktin användes som kärn- och cytoplasmatisk fraktionsmarkör. IB, immunblot

Bild i full storlek

Olik roll av vildtyp och L166P-mutant DJ-1 mot UV-inducerad celldöd

Därefter utvärderade vi effekterna av DJ-1 på JNK1-beroende celldöd. UV-bestrålning inducerade inkrementell apoptotisk celldöd i HEK293-neo-celler, och denna celldöd kan förtryckas av vildtyp DJ-1 och icke-patogen R98Q-mutant av DJ-1 (figur 7a). Resultaten av en ny rapport har visat förlusten av den antiapoptotiska verksamheten hos DJ-1-mutanter. 19, 21 I vårt celldödsexperiment bestämde vi att den patogena M26I, D149A och L166P-mutanten av DJ-1 underlättar UV-inducerad celldöd (figur 7a). Vi bedömde sedan effekterna av vildtyp DJ-1 och L166P-mutanten av DJ-1 på Δ MEKK1-inducerad celldöd. Överuttrycket av MEKK1, en konstitutivt aktiv form av MEKK1, resulterade i en ökning av apoptotisk celldöd i HEK293-celler, och denna apoptotiska effekt kunde förtryckas av vildtyp DJ-1 (figur 7b). Emellertid fastställdes uttrycket av L166P-mutant DJ-1 i HEK293-celler att vara mer känslig för Δ MEKK1-inducerad celldöd än vad som var i vildtyp-DJ-1-uttryck, och denna funktion dämpades framgångsrikt av samuttryck med det dominerande form av SEK 1 (figur 7b). Dessa data indikerar således att den patogena L166P-mutanten av DJ-1 var mest känslig för UV-inducerad apoptotisk celldöd, och denna känslighet kan vara beroende av MEKK1-SEK1-JNK1-vägen. Dessutom befanns DJ-1 siRNA förbättra Δ MEKK1-inducerad apoptotisk celldöd (figur 7c). Vi testade sedan effekterna av DJ-1-deletionsmutanter på Δ MEKK1-inducerad celldöd i HEK293-celler transfekterade transient med plasmider som uttrycker Δ MEKK1 och DJ-1-proteinerna. Vårt resultat visar att Δ MEKK1-beroende celldöd förtrycktes av DJ-1 eller DJ-1-C i full längd, men inte av DJ-1-N (figur 7d). Sammantaget indikerar dessa data starkt att DJ-1, genom bindning till MEKK1, undertrycker UV-inducerad apoptos, och att den patogena L166P-mutanten av DJ-1 resulterade i celldöd.

Image

Olik roll av vildtyp och L166P-mutant DJ-1 mot UV-inducerad celldöd. ( a ) HEK293-celler transfekterades transient med pcDNA3-Flag-DJ-1, pcDNA3-Flag-DJ-1 (M26I), pcDNA3-Flag-DJ-1 (R98Q), pcDNA3-Flag-DJ-1 (D149A), och pcDNA3-Flag-DJ-1 (L166P). ( b ) HEK293-celler transfekterades transient med pcDNA3-Flag- Δ MEKK1, pcDNA3-SEK1-DN, pcDNA3-Flag-DJ-1 eller pcDNA3-Flag-DJ-1 (L166P). ( c ) HEK293-cellerna transfekterades transient med pcDNA3-Flag- 1 MEKK1, pSUPER-si-DJ-1 eller pSUPER-siCon. ( d ) HEK293-celler transfekterades transient med pcDNA3-Flag- Δ MEKK1, pcDNA-Flag-DJ-1, pcDNA-Flag-DJ1-N eller pcDNA-Flag-DJ1-C. ( a - d ) Efter 50 timmar analyserades cellerna för celldöd med användning av TUNEL-färgning. De transfekterade cellerna fixerades, permeabiliserades och inkuberades med terminal deoxynukleotidyltransferas och fluorescein-märkt dUTP. TUNEL-positiva celler undersöktes med ett fluorescensmikroskop. Data uttrycks som medel ± SD för triplikat från ett av två oberoende experiment. Alla resultat var representativa för minst tre oberoende experiment. * ANOVA, P <0, 001

Bild i full storlek

Diskussion

Vi har fastställt att DJ-1 fysiskt interagerar med MEKK1 och hämmar MEKK1-aktivering, vilket resulterar i undertryckandet av MEKK1-medierad celldöd. DJ-1 är en potent hämmare av den oxidativa stressinducerade celldödssignalvägen. Dessa observationer indikerar att hämningen av MEKK1 är en viktig mekanism genom vilken DJ-1 fungerar som en negativ regulator av JNK1-signalvägen.

DJ-1 förhindrar celldöd utlöst av olika apoptotiska stimuli, inklusive väteperoxid, dopamin, UV-bestrålning och MPP +. 19, 20, 21 DJ-1-uttryck fastställdes att induceras genom oxidativ stress. 16, 17, 18 Hittills har DJ-1 varit inblandad i moduleringen av flera signalprocesser associerade med regleringen av celldöd. En ny rapport har visat att väteperoxidkylningsförmågan hos DJ-1 kanske inte är tillräcklig för att redogöra för dess övergripande cytoprotektiva funktioner. 29 Våra resultat i denna studie representerar tvingande bevis på att vildtyp DJ-1 och den patogena L166P-mutanten av DJ-1 bevisar identiska väteperoxidkylningsförmågor. Vildtyp och L166P-mutant DJ-1 spelar emellertid olika roller i den oxidativa stressinducerade aktiveringen av JNK1-signalvägen och celldöd. Därför kan vi anta att väteperoxidkylningsförmågan hos DJ-1 inte är tillräcklig för att reglera oxidativ stressmedierad JNK1-aktivering och celldöd.

Mouradian-gruppen har föreslagit att DJ-1 kan interagera med Daxx, binda den i kärnan och förhindra den från att få tillgång till cytoplasma och därmed blockera Daxx-medierad ASK1-aktivering. 29 Flera studier har föreslagit att dopaminerg neuronal död ökas genom aktivering av JNK-signalvägen. 36, 37, 38, 39 Dessa iakttagelser indikerar att JNK kan ha en viktig effekt vid medling av dopaminerg neuronal död och att blockering av JNK-signalering genom specifika hämmare kan förhindra eller effektivt fördröja utvecklingen av PD och andra neurodegenerativa sjukdomar. Våra data avslöjar nu en ny mekanism: vildtyp DJ-1 interagerar direkt med och hämmar därmed MEKK1-aktivering, vilket resulterar i undertryckandet av MEKK1-medierad celldöd. Med tanke på att MEKK1 är en MAP3K som deltar i JNK-signaleringskaskaden, kan hämningen av MEKK1-aktivering av DJ-1 också vara en viktig mekanism genom vilken DJ-1 hämmar JNK-signalvägen i utvecklingen av PD.

Radering och punktmutationer av DJ-1 har nyligen varit inblandade i början av bekant PD. I både de tidigare rapporterna och i denna studie har resultaten från celldödsexperiment visat att DJ-1-gen-tystnad ökar känsligheten för oxidativ stress. Dessa resultat kan förklara varför borttagningen av DJ-1 framkallar den tidiga början av PD. Den patogena L166P-mutanten av DJ-1 verkar inte spela en avgörande roll i ASK1-Daxx-beroende celldöd. 29 Emellertid identifierades L166P-mutanten av DJ-1 som en JNK1-beroende celldödinducerare, eftersom det visade sig stimulera UV-bestrålningsinducerad celldöd. 21 Våra resultat tyder också på att L166P-mutanten av DJ-1 också kan delta i stimuleringen av MEKK1-SEK1-JNK1-kaskaden såväl som i UV- eller Δ MEKK1-inducerad celldöd, vilket därmed antyder att L166P kan spela en avgörande roll i JNK1-beroende celldöd. Vidare underlättar den patogena L166P-mutanten av DJ-1 oxidativ stressinducerad celldöd, trots dess relativt låga stabilitet. Resultaten av denna studie indikerar att DJ-1 kan spela en kritisk roll i kontrollen av denna dödsväg, en funktion som kan upphävas som ett resultat av en PD-orsakande mutation.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurer Legender

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1–5

Ordlista

PD

Parkinsons sjukdom

siRNA

kort störande RNA

MEKK1

mitogen-aktiverat proteinkinas / extracellulärt signalreglerat kinas-kinas-kinas 1

JNK1

c-juni N-terminal Kinase

Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen Cell Death and Differentiation (//www.nature.com/cdd)