Tydlig prediktiv prestanda för rac1 och cdc42 vid cellmigrering | vetenskapliga rapporter

Tydlig prediktiv prestanda för rac1 och cdc42 vid cellmigrering | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Mobil rörlighet
  • Beräkningsmodeller
  • Bildbehandling
  • RHO signalering

Abstrakt

Vi föreslår ett nytt beräkningsbaserat tillvägagångssätt för att belysa hur signalmolekyler avkodas vid cellmigrering. I detta tillvägagångssätt utförde vi FRET time-lapse-avbildning av Rac1 och Cdc42, medlemmar av Rho GTPases som är ansvariga för cellmotilitet och identifierade kvantitativt svarfunktionerna som beskriver omvandlingen från molekylära aktiviteter till de morfologiska förändringarna. Baserat på de identifierade svarsfunktionerna klargjorde vi profilerna för hur morfologin spatiotemporalt förändras som svar på lokal och kortvarig aktivering av Rac1 och Cdc42, och fann att Rac1 och Cdc42-aktivering utlöser lateralt förökande membranutsprång. Svarfunktionerna var också utrustade med differentieringsegenskaper, vilket är fördelaktigt för att bibehålla känsligheten under anpassning till den genomsnittliga ingångsnivån. Med hjälp av svarfunktionen kunde vi förutsäga den morfologiska förändringen från molekylär aktivitet, och dess prediktiva prestanda ger ett nytt kvantitativt mått på hur mycket Rho GTPaserna deltar i cellmigreringen. Intressant nog upptäckte vi distinkta prediktiva prestanda för Rac1 och Cdc42 beroende på migreringslägen, vilket indikerar att Rac1 och Cdc42 bidrar till långvarig respektive slumpmässig migration. Således möjliggjorde vår föreslagna prediktiva strategi oss att avslöja de dolda reglerna för informationsbehandling av Rho GTPases i cellmigreringen.

Introduktion

Levande celler bearbetar extracellulär och intracellulär information med användning av biokemiskt reaktionsnätverk som vi kallar "signaltransduktion". Mycket av molekylkomponenter i signaltransduktion har i stor utsträckning identifierats. Emellertid förblir den intracellulära informationsbehandlingen dåligt förstått. Under det senaste decenniet har levande cellavbildningstekniker utvecklats för att visualisera dynamiken i molekylär aktivitet in situ med hjälp av biosensorer, till exempel baserat på principen om Förster (eller fluorescens) resonans energiöverföring (FRET) 1, 2, 3 . Således går vi in ​​i en ny era för att undersöka en fråga om hur molekylsignaler behandlas dynamiskt genom signaleringskaskad. För att undersöka denna fråga fokuserade vi på cellmigration som ett biologiskt modellsystem, eftersom både molekylär aktivitet (som insignal) och morfologiska förändringar (som utsignal) under cellmigrering kan övervakas genom FRET-avbildning.

Cellmigration spelar viktiga roller i olika biologiska funktioner, inklusive sårläkning, embryonal utveckling och cancerinvasion 4 . Denna process är mycket komplex och samordnad i rum och tid; utsprånget och tillbakadragningen av cellulära membran drivs främst av cytoskeletten, vars omorganisation regleras av intracellulär signalering 5, 6 . Många studier har utförligt undersökt de molekylära mekanismerna som är involverade i cellmigrering och har erkänt de Rho små GTPaserna som nyckelregulatorer för aktindynamiken 7, 8 . Rac1 och Cdc42 ansågs klassiskt inducera lamellipodia respektive filopodia, 7, 9, och deras nedströmsvägar har identifierats väl. Exempelvis aktiverar Rac1 WAVE-komplex och Arpin som respektive upp- och nedreglerar Arp2 / 3-komplexet för att inducera grenat nätverk av F-aktin i lamellipodia 10, medan Cdc42 aktiverar actinassocierade proteiner, inklusive fascin, formin (mDia2) och Ena / VASP, för att inducera F-aktinknippar i filopodia 11, 12 . Dessutom aktiverar Rac1 och Cdc42 överlappande samma samlingar av proteiner för att reglera F-aktin, mikrotubuli, vidhäftning och aktomyosinanordning 13 . Trots sådan ackumulerad kunskap om Rac1 och Cdc42 nedströmsvägar, är lite känt om de funktionella skillnaderna mellan Rac1 och Cdc42, i synnerhet hur dessa Rho GTPaser deltar i cellmigrering. Dessutom har en kvantifierad diskussion saknats: även om dessa molekyler är involverade i cellmigrering, hur mycket är de kvantitativt ansvariga för?

Baserat på dessa FRET-avbildningstekniker har vi tidigare undersökt förhållandet mellan aktiviteterna för Rho GTPases och morfologiska förändringar, som båda kvantifierades med hjälp av automatiserade bildbehandlingstekniker 14, 15 . I dessa studier avslöjade vår korskorrelationsanalys att lokal membranförlängning föregick Rac1- och Cdc42-aktiveringen med 30–60 sekunder, vilket sedan befanns vara förenligt med en annan studie 16 . Detta konstaterande var motsatt mot den vanliga idén att de intracellulära Rho GTPaserna reglerar morfologiska förändringar via cytoskeletalt omorganisering 17, 18 . Relaterade frågor har uppstått: Orsakar aktiviteterna Rac1 och Cdc42 verkligen cellulär morfodynamik och migration? Om det är de förmodade orsakerna, hur och hur reglerar dessa molekyler morfodynamik och migration?

En korskorrelationsanalys är inte lämplig att besvara dessa frågor eftersom den bara beskriver en en-till-en-relation mellan molekylaktiviteten vid tidpunkten t och morfologisk förändring vid en annan tidpunkt t '14, 15, 16 . Det kan finnas ett kausalt samband där den molekylära aktiviteten vid tidpunkten t har haft, snarare än omedelbar, effekter på framtida morfologiska förändringar. Med andra ord kan den morfologiska förändringen bestämmas av molekyläraktivitetens historia. Under ett sådant antagande bör ett flertal-till-ett-samband mellan tidsserien för molekylära aktiviteter tills t och morfologisk förändring vid t undersökas. En lösning för detta ändamål, utvecklad inom kontrollteorin, är att uppskatta en svarsfunktion 19, 20, 21, som definieras som ett spatiotemporal svar av morfologiska förändringar till omedelbar och lokal molekylär aktivering.

Vad är den fysiologiska betydelsen av responsfunktionen för Rho GTPases? Svarfunktionen kan ses som att den representerar intracellulär informationsbehandling som helhet, i motsats till att identifiera själva den detaljerade vägen. Om exempelvis Rho GTPas-signalen överförs till en nedströmsväg med inkoherent framåtriktad slinga där Rho GTPas snabbt och långsamt uppreglerar aktivatorer och hämmare för den morfologiska förändringen, respektive 22, blir svarfunktionen från positiv till negativ när tiden går . På samma sätt bestäms profilen för svarsfunktionen av kinetik för nedströmsvägen. Därför är identifiering av svarsfunktionsprofilen fysiologiskt viktig för att förstå nedströms kinetikbaserad informationsbearbetning.

En utmanande uppgift är att identifiera svarsfunktionen baserad på tidsförlopp FRET-avbildningsdata, vilket går utöver en enkel korrelationsanalys 23, 24 . En betydande korrelation mellan två cellfaktorer betyder inte en betydande orsakssamband mellan dem, eftersom de båda kan ha en gemensam orsak. Att identifiera svarsfunktionen kan ge meningsfull kunskap om huruvida molekylär aktivitet har en potentiell kausal länk för att förutsäga morfologiska förändringar med hjälp av svarsfunktionen 23, 24 . Sådan prediktiv prestanda ger ett nytt kvantitativt mått på hur mycket Rho GTPaserna bidrar till cellmigreringen.

I denna studie, för att belysa och kvantifiera de dolda reglerna för informationsbearbetning av intracellulär signalering i cellulär morfodynamik och migration med hjälp av FRET livecellsavbildning, föreslog vi en ny avkodningsbaserad prediktiv metod i kombination med bildbehandling och statistisk signalbehandling.

Resultat

Med hjälp av bildbehandling och en statistisk avkodningsteknik syftade denna studie till att identifiera processmekanismen genom vilken Rac1 och Cdc42 kontrollerar cellulär morfodynamik och migration. Aktiviteten av Rac1 och Cdc42 övervakades med användning av FRET time-lapse-avbildning i humana HT-1080 fibrosarcomceller som ett modellsystem för spontan slumpmässig migration (Fig. 1a; Kompletterande filmer 1-2) 1, 25 .

Image

(a) Snapshot-bilder som visar den spontana migrationen av HT-1080-celler som uttrycker biosensorerna Raichu – Cdc42 (vänster) och Raichu – Rac1 (höger). Se även kompletterande filmer 1, 2. FRET / CFP-förhållande intervall i intensitetsmodulerad visning (IMD) -läge, som associerar färgton med emissionskvotvärdet och intensiteten för varje nyans med källbildens ljusstyrka, visas till höger om varje bild. ( b ) Migrerande HT1080-celler spåras baserat på CFP-bilden. Olika färgade polygoner (anslutna markörer) indikerar tidsserien för spårade cellgränser (från cyan till röd). Hörnpunkterna (virtuella markörer) placeras på ett lika stort sätt längs omkretsen vid varje gång. Kantförskjutning kvantifieras baserat på längden på den anslutna länken mellan topparna vid seriella tidsramar. ( c, d ) Kvantifierad kantförskjutning (töjning / tillbakadragning) ( b ) och Cdc42-aktivitet, dvs FRET / CFP-förhållande-värdet (c) vid varje virtuell markör kartläggs på en tvådimensionell värmekarta bestående av tid (abscissa) och markörindex (ordinat). ( e ) Den spatiotemporala korskorrelationsfunktionen mellan kantförskjutningen och Cdc42-aktiviteten för en specifik cell (samma som i ( c, d )) är planerad. Abscissa och ordinat indikerar förändringarna i tid respektive markörindex. ( f ) De temporära tvärkorrelationsfunktionerna mellan kantförskjutning och Cdc42-aktivitet är ritade med tidsförskjutningen. Den blå linjen beräknades med ( c ) och (d) . I varje prov (en enda svart linje) föregås den lokala formförändringen före molekylär aktivitetsförändringen. Den röda linjen visar den genomsnittliga korskorrelationsfunktionen för alla cellerna (N = 11).

Bild i full storlek

Kvantifiering av Rho GTPase-aktivitet och kantförskjutning

Vi utvecklade en förbättrad bildbehandlingsalgoritm för att mer robust kvantifiera lokala förskjutningar, dvs. förlängningen och tillbakadragningen av lamellipodia, jämfört med tidigare algoritmer 14, 16 . Observera att HT-1080-celler uppvisade inga eller väldigt få tydliga filopodiala strukturer i vårt kulturtillstånd. Först placerades virtuella markörer på cellperiferin på ett likvidistant sätt för att spåra de morfologiska förändringarna under cellmigrering. Dessa virtuella markörer spårade de lokala förskjutningarna av den cellulära kanten så att summan av markörernas reseavstånd minimerades med begränsningen att de intilliggande markörerna förblev lika stora (se material och metoder). Med hjälp av denna metod kunde vi stabilt kvantifiera nivån på utsprång / tillbakadragning i det lokala membranet under en längre period (Fig. 1b). Därefter representerades de lokala morfologiska förändringarna i en värmekarta med abscissen och ordinaten mappad till respektive tids- och periferiläge (fig. 1c och kompletterande figur S1a). Vi kvantifierade också aktivitetsnivåerna för Rac1 och Cdc42 nära de virtuella markörerna (fig. 1d och kompletterande fig. S1b) (se material och metoder). Eftersom dessa värmekartor delade de gemensamma koordinaterna för tid och perifer position, kunde vi konsekvent beräkna en spatiotemporal korrelation mellan molekylära aktivitetsnivåer och de lokala morfologiska förändringarna (fig. 1e och kompletterande fig. S1c), som tydligt visade samma egenskaper som tidigare rapporterad; nämligen utsprång (tillbakadragning) föregick aktiveringen (inaktivering) av Rac1 och Cdc42 14, 15, 26 . Dessa egenskaper bevarades ganska väl bland olika HT1080-celler (11 celler för Cdc42 och 10 celler för Rac1) (fig. 1f och kompletterande fig. Sdd). Dessa resultat väckte ytterligare en fråga: Om de morfologiska förändringarna föregår förändringarna i Rac1 och Cdc42-aktivitet, hur reglerar dessa två Rho GTPaser cellulär morfodynamik och migration?

Förutsägelse av Edge Evolution med hjälp av Rho GTPase Activity

För att besvara denna fråga använde vi en avkodningsteknik för att identifiera svarfunktionerna för Rho GTPaserna för morfologisk förändring. Vi konstruerade en regressionsmodell där den lokala morfologiska förändringen av en specifik tidsram ges med hjälp av en viktad summering av det förflutna och molekylära aktiviteter i närheten:

Image

där d n , t och s n , t betecknar förskjutningen av cellkanten och molekylaktiviteten för antingen Cdc42 respektive Rac1 på den n: e virtuella markören vid tidpunkten t, w , j är en regressionsparameter för den rumsliga skift i och fördröjningstid j , och ε n, t är vitt gaussiskt brus . dn , t och s n , t är värden på ( n , t ) -te elementen i de två värmekartorna i fig. Ib, c, respektive. Med tanke på att effekten av molekylaktiviteten rumsligt utbreder sig längs cellkanten på ett symmetriskt sätt, applicerade vi en rumsligt symmetrisk karaktär på regressionsparametrarna: w k, j = w −k, j . Vi kallar uppsättningen regressionsparametrar w ij ( i = - N / 2,

.

N, 2; j = 0,

.

, T ) en svarsfunktion, där T och N är den maximala fördröjningstiden och antalet virtuella markörer (dvs. upplösningsnivån för hela cellperiferin). Observera att n är på en cirkulär koordinat: d n + N , t = d n , t och s n + N , t = s n , t . Denna regressionsmodell har en egenskap att om lokal och impulsmolekylär aktivering s n, t = 5 n, 0 5 t, 0 ( 8 , j är en Kronecks delta-funktion) kan det inducerade spatiotemporala svaret för kantförskjutning enkelt beskrivet av w n, t .

Därefter uppskattade vi svarsfunktionen så att den passar den första halvan av den experimentella tidsseriedatabasen, kallad ett träningsdatasätt, genom att tillämpa en kamregressionsteknik, som föredrar en smidig responsfunktion (se Material och metoder). Den uppskattade svarsfunktionen validerades sedan inte bara genom att rekonstruera den lokala kantförskjutningen i träningsdatasatsen utan också genom att förutsäga den lokala kantförskjutningen i den senare halvan av tidsserien, som kallas ett valideringsdatasats (Fig. 2a, b för Cdc42 ; Kompletterande figur S2a, b för Rac1). Statistiska test visade att vår responsfunktionsbaserade förutsägelse var betydligt bättre än den enkla förutsägelsen som inte använde molekyläraktivitetens historia (se Material och metoder). Dessutom fann vi att det förutsagda membranutsprånget (tillbakadragningen) föregick den molekylära aktiveringen (inaktivering) (Fig. 2c för Cdc42; Kompletterande Fig. S2c för Rac1), på samma sätt som den tidigare motintuitiva observationen 14, 15, 26 (Fig. 1f för Cdc42; Kompletterande figur S1d för Rac1).

Image

(a) Förutsägelse av den lokala morfologiska förändringen baserad på Cdc42-aktivitet. De övre och nedre panelerna visar den lokala kantförskjutningen (samma som fig. 1c) erhållna i ett experiment och den lokala kantförskjutningen rekonstruerad / förutsagd via resp. Funktion. Den vänstra sidan av den vertikala svarta linjen i den övre panelen användes som träningsdata för att uppskatta svarfunktionen, och följaktligen användes den högra sidan aldrig för träningen. För validering rekonstruerades de vänstra och högra sidorna i den nedre panelen och förutspåddes med hjälp av den uppskattade svarsfunktionen. ( b ) De rekonstruerade och förutspådda kantförskjutningarna korrelerades starkt med de observerade förskjutningarna. Varje prick representerar förhållandet mellan rekonstruktion / förutsägelse och en observation av varje kantförskjutning, och de röda och blå färgerna motsvarar respektive rekonstruktion och förutsägelse. ( c ) De temporära tvärkorrelationsfunktionerna mellan den förutsagda kantförskjutningen och Cdc42-aktiviteten plottas med tidsförskjutningen som i fig. 1f. ( d ) En svarsfunktion för Cdc42 planeras på ett tvådimensionellt plan (övre vänstra panelen) koordinerat med en rymdsskift och en tidsfördröjning. Varje färgad linje i de övre högra och nedre panelerna representerar ett tvärsnitt av den spatiotemporala svarfunktionen (övre vänstra panelen) längs den raka linjen med motsvarande färg.

Bild i full storlek

De identifierade svarsfunktionerna för Rac1 och Cdc42 är representerade i tids-rymddomänen (Fig. 2d för Cdc42; Kompletterande Fig. S2d för Rac1). Vi fann att Rac1 och Cdc42 delade liknande profiler av svarsfunktionerna; svarfunktionen vid ursprunget ( i = 0, j = 0) tar ett stort positivt värde men blir negativt när tiden och positionen avviker från ursprunget, vilket antyder att aktiviteterna Rac1 och Cdc42 övergående och lokalt inducerar membranutskjutning och att de lokala utsprång åtföljs av global tillbakadragning av den återstående regionen, möjligen på grund av massbevarande av cellvolymen. När tiden förlängs tar dessutom svarfunktionen en karakteristisk V-form, vilket antyder att membranutsprånget inducerat av Rac1 och Cdc42 förökas i sidled. Vi märkte också att svarfunktionen var utrustad med en differentierares egendom. den temporala aspekten av svarsfunktionen förändrades från ett stort positivt värde till ett negativt värde när tiden fortsatte (höger panel i Fig. 2d för Cdc42; Kompletterande Fig. S2d för Rac1), vilket indikerar att membranutskjutningen inducerades av ett temporärt derivat av aktiviteterna Rac1 och Cdc42, särskilt i den inledande fasen av aktivitetsökningen. Vi föreslår att den ovan nämnda motintuitiva observationen är en biverkning orsakad av nedströms signalering av Rho GTPaserna som fungerar som temporära differentierare (se Diskussion).

Intercellulär analys

För att validera konsistensen i vårt tillvägagångssätt undersökte vi likheten mellan svarsfunktionerna uppskattade från olika celler, dvs en korscellulär analys av svarsfunktionerna (se material och metoder) (Fig. 3a). Likhetsindex uppvisade höga värden över cellerna, vilket indikerar att väsentligen samma avkodningsmaskineri med de V-formade profilerna för svarfunktionen förvandlade Racl- och Cdc42-aktiviteter till cellmorfologier. Vi validerade dessutom tvärcellulär förutsägbarhet av svarsfunktionerna (fig. 3b); dvs de morfologiska förändringarna av en viss cell ('målcell') avkodades baserat på svarfunktionen uppskattad från en annan cell ('referenscell'). Intressant nog fann vi två kluster när det gäller förutsägbarhet mellan celler och celler (fig. 3b): "förutsägbara celler" och "oförutsägbara celler" (cellindex från 1 till 7 och från 8 till 10 i mellanpanelen för Rac1, respektive cellindex; från 1 till 7 och från 8 till 11 i höger panel för Cdc42, respektive). Variationen i förutsägelsefelet var betydligt mindre än molekylaktiviteten i de förutsägbara cellerna ( p <0, 01 för alla förutsägbara celler på Cdc42-avbildning och p <0, 01 för alla förutsägbara celler på Rac1-avbildning enligt F -testa). Men variansen i prediktionsfelet skilde sig inte signifikant från kanten förskjutningen i en del av de oförutsägbara cellerna.

Image

(a) Schematisk över likhetsanalysen av svarfunktionerna för Rac1 (mittpanelen) och Cdc42 (högerpanel) mellan olika celler. Både ordinaten och abscissen indikerar index för celler så att varje matriselement representerar kosinuslikheten i svarfunktionerna mellan parparet som specificeras av elementets index. ( b ) Förutsägbarhet av svarfunktioner för Rac1 (mittpanelen) och Cdc42 (högerpanel) mellan olika celler. Varje matriselement representerar korrelationen mellan den observerade kantförskjutningen i en specifik cell ('målcell') och den förutsagda kantförskjutningen i målcellen avkodad baserat på svarfunktionen för en annan cell ('referenscell'). Ordinaten och abscissen anger indexcellerna för målcellen respektive referenscellen. ( c ) Förhållandet mellan cellmigrationsläget och bidrag från Rac1 (mittpanelen) och Cdc42 (högerpanel) till den morfologiska förändringen. Bidragen från Rac1 och Cdc42 utvärderades via förutsägbarhet, vilket motsvarar de diagonala elementen i ( b ). Varje prick representerar en enda cell, där cellnummer med blå och röda prickar motsvarar de i ( b ), respektive. Migrationsläget utvärderades via sidoförskjutningshastigheten för kantförskjutningen, som kvantifierades baserat på hastigheten för vågutbredningen, vilket indikeras med en röd streckad linje i den spatiotemporala auto-korrelationsfunktionen (vänsterinsatser).

Bild i full storlek

Följaktligen avkodades de morfologiska förändringarna i de förutsägbara cellerna pålitligt via andra cellers svarfunktioner, medan förändringarna i de oförutsägbara cellerna avkodades minimalt inte bara via andra cellers svarfunktioner utan också via sina egna svarfunktioner (fig. 3b) ( diagonala komponenter indexerade från 6 till 11 i mittpanelen för Rac1; diagonala komponenter indexerade från 8 till 10 i höger panel för Cdc42). Dessa resultat, åtföljt av upptäckten att svarsfunktionerna var konstanta över olika celler (fig. 3a), innebär att vår statistiska analys tillförlitligt fångade karakteristiska svarfunktioner även för oförutsägbara celler och att de morfologiska förändringarna av de oförutsägbara cellerna kan störas av en annan väg.

Bidrag av Rac1 och Cdc42 till cellmigreringen

Vad är den primära skillnaden mellan "förutsägbara celler" och "oförutsägbara celler"? Mönstret för cellulär morfodynamik kan vara en nyckel till att besvara denna fråga. För att identifiera ett mönster i de morfologiska förändringarna beräknade vi den spatiotemporala auto-korrelationen (auto-korrelationskarta) av kantförskjutningarna för varje cell (se Material och metoder) (vänster två insatser i fig. 3c). Vi hittade två mönster av morfologiska förändringar; i cellerna som migrerar slumpmässigt på fram och tillbaka sätt, förökades det lokala utsprånget rumsligt i sidled i ett vågliknande mönster, medan det i cellerna som kontinuerligt migrerade i en enda riktning förblev det lokala utsprånget inom ett begränsat område. När utbredningshastigheten för det lokala utsprånet uppskattades från autokorrelationskartan, fann vi att förutsägbarheten för de morfologiska förändringarna som avkodades via svarfunktionerna för Rac1 och Cdc42 var negativt och positivt korrelerade med förökningshastigheten (fig. 3c ). Detta resultat antyder också att förutsägbarheten kan tolkas som bidrag från Rac1 och Cdc42 till cellmigrering. Sammantaget kan en balans mellan bidrag från Rac1 och Cdc42 bestämma migrationssättet.

Förutsäga det makroskopiska beteendet hos de migrerande cellerna

Efter att ha tagit upp rollerna Rac1 och Cdc42 i det mikroskopiska beteendet, dvs de lokala cellulära morfologiska förändringarna, fokuserade vi slutligen på det makroskopiska beteendet hos de migrerande cellerna. Även om migrerande celler anses vara polariserade så att deras molekylära sammansättning skiljer sig mellan framkanten och svansen 17, är det oklart om egenskaperna för de nedströms kaskaderna Rac1 och Cdc42 är rumsligt inhomogena på grund av denna polaritet. För att testa detta försökte vi förutsäga den makroskopiska hastigheten för cellmigrationen baserat på hypotesen att hastigheten bestäms direkt genom att integrera de mikroskopiska faktorerna som driver de lokala morfologiska förändringarna reglerade av Rac1 och Cdc42. Överraskande förutsagdes riktningen och hastigheten för migrationshastigheten direkt genom att drava de lokala aktiviteterna för Rac1 och Cdc42 med svarfunktionerna (se Material och metoder) (Fig. 4a, b för Rac1; Fig. 4c, d för Cdc42). Detta resultat stöder en "dragkamp" -modell där nedströms kaskaderna av Rac1 och Cdc42 homogent existerar oavsett cellens polaritet och de distribuerade lokala drivfaktorerna summerar för att reglera det makroskopiska migrationsbeteendet (se Diskussion).

Image

Makroskopisk cellmigration rekonstrueras / förutses från Rac1 ( a, b ) och Cdc42 ( c, d ) aktivitet. Migreringsriktningen ( a, c ) och migrationshastigheten ( b, d ) kvantifieras som rörelsen och hastigheten för rörelsen hos cellulär centroid. Tidsserien delades upp i två delar; den första halvan och sista hälften av data användes för att uppskatta responfunktionen respektive testa den. De blå och röda linjerna i varje panel visar observationer och rekonstruktioner (före den svarta prickade vertikala linjen, första hälften av data) respektive förutsägelser (efter den svarta prickade vertikala linjen, sista halvan av data). r är korrelationskoefficienten mellan observationer och rekonstruktioner / förutsägelser (se Material och metoder) över hela tidsserien.

Bild i full storlek

Diskussion

Vi föreslog ett prediktivt tillvägagångssätt för att identifiera hur signalerna från Rho GTPases behandlas i signaltransduktion under cellmigrering genom kombination av bildbehandling och statistisk analys. Vi klargjorde att de 'mikroskopiska' membranutskjutningarna och tillbakadragningarna av migrerande celler är väl förutsagda av aktiviteten hos Rho GTPases. Vi fann också att responsfunktionen fördjupad med egenskaperna hos en differentierare kan förklara den motintuitiva iakttagelsen att membranmorfologiska förändringar föregår aktiviteterna för Rho GTPaserna. Genom att analysera förhållandet mellan sådan förutsägbarhet och migreringslägen fann vi att Rac1 och Cdc42 bidragit till respektive respektive slumpmässiga migrationer. Dessutom föreslog vi en dragkampmodell där makroskopiska cellbeteenden såsom migrationsriktning och hastighet bestäms av integrationen av de distribuerade lokala drivfaktorerna baserade på signalmolekyler.

Till skillnad från den vanliga uppfattningen att Rac1 och Cdc42 positivt reglerar membranutsprång 7, har vi och andra tidigare rapporterat att membranutsprång (tillbakadragning) föregår aktivering (inaktivering) av Rac1 och Cdc42 med 30–60 sekunder 14, 15, 26 . Avkodningsanalysen som beskrivs i denna studie demonstrerade att lokala Rac1- och Cdc42-aktiviteter innehåller tillräcklig information för att förutsäga lokala morfologiska förändringar; därför är Rho GTPaserna belägna vid den unika och direkta uppströms förbindningen av cellulär morfodynamik i dessa celler. Dessutom klargjorde vi att svarfunktionerna fungerar som en differentierare (den högra insatsen i Fig. 2d för Cdc42; Kompletterande Fig. S2d för Rac1). Sedan föreslog vi att den motsäkra observationen ovan beror på en bieffekt av signalöverföringen representerad av svarsfunktionerna; membranutsprånget induceras av ett temporärt derivat av Racl- och Cdc42-aktiviteterna, särskilt i den initiala fasen av aktivitetsökningen (Fig. 5a). Å andra sidan har differentierarens egenskaper fysiologiska fördelar, eftersom det nedströms morfodynamiska systemet kan ha känslighet för insignalen, som tillhandahålls av vägledningsmolekyler, samtidigt som anpassningsförmågan bibehålls; faktiskt är rörliga celler kända för att vara okänsliga för den genomsnittliga nivån av ledningsmolekyler men känsliga för gradienten 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 .

Image

( a ) En modell för signalöverföring från Rho GTPases till kantförskjutning för att förklara Rho GTPases aktivering efter membranutsprång. Svarfunktionen (mittpanelen) bearbetar en insignal (Rac1 / Cdc42 i den vänstra panelen) och genererar en utgång (kantförskjutning i den högra panelen). De röda och blå kurvorna i mittpanelen motsvarar svarfunktionerna med läckande respektive differentierande egenskaper. Observera att de uppskattade svarsfunktionerna har den differentierande egenskapen (höger insatt i Fig. 2d). I den högra panelen följs utsignalen genom svarsfunktionen med differentierande egenskap indikerad av den röda linjen av insignal, som plottas av den tunna svarta kurvan för jämförelse. ( b ) En modell av migrationslägen beroende på balansen mellan aktiviteterna i Rac1 och Cdc42. I kontinuerligt och slumpmässigt migrerande celler har Rac1 och Cdc42 stora bidrag till cellmigrationen, vilket kan utvärderas i termer av förutsägbarhetsmåttet (Fig. 3c). ( c ) En dragkampmodell för makroskopisk cellmigration. Vinkeln och hastigheten på den cellulära migrationen som indikeras av den röda vektorn kan förutsägas genom summering som dragkamp för de distribuerade drivfaktorerna för det lokalt utsträckta membranet indikerat av de svarta pilarna (fig. 4). Drivfaktorerna förutsägs av Rac1 / Cdc42 genom svarfunktionen (fig. 2a).

Bild i full storlek

Dessutom kan den motintuitiva observationen möjligen vara resultatet av aktinförmedlad återkopplingseffekt på Rho GTPas 10, 35, 36, 37 ; Rho GTPas-inducerad aktinpolymerisation aktiverar också Rho GTPase. Rho GTPaserna skulle vidare aktiveras genom den positiva feedbacken efter membranutsprång. Det bör noteras att vår avkodningsanalys är giltig även om sådan feedback fanns eftersom aktiviteterna för Rho GTPases vi använde för avkodaren kunde ses som redan involverade dessa feedbackeffekter.

Vår regressionsanalys av Cdc42 och Rac1-aktiviteterna visade att svarfunktionerna spatiotemporally uppvisade V-formade profiler (fig. 2d och kompletterande fig. S2d); dvs den lokala och övergående aktiveringen av Racl och Cdc42-inducerat membranutsprång lokalt men också inducerat membranåterdrag i andra perimetrar, vilket kan förklaras genom volymbevarande. Ett annat viktigt fynd var att det lokala utsprånet förökades i sidled. Vad är den fysiologiska mekanismen för denna V-formade svarsfunktion som inducerar förlängningen av cellkanten? Det har rapporterats att aktinpolymerisation lokalt exciteras och rumsligt förökar 38, 39, 40 . Machacek et al . rapporterade också V-formad kantförlängning i rörliga celler 16 ; enligt deras modell, inducerar aktiv Rac1 aktinpolymerisation och därmed kantförlängning, som följs av tillbakadragning orsakad av utarmning av den kula aktinpölen. Under tiden sprider aktinpolymerisation sig lateralt via en positiv återkopplingssignal från utsprånget 10, 35, 36, 37, varigenom en V-formad kantförlängning induceras.

Svarsfunktionen som vi identifierade reproducerade den cellulära avkodaren från Rho GTPases för morfodynamik på ett sådant sätt att den återspeglar kinetiken i nedströmsvägen 9 . Denna kunskap hjälper till att identifiera komponenterna i nedströmsvägen 22 . Om vi ​​till exempel jämför profilerna för svarsfunktionerna mellan det nativa tillståndet och ett stört tillstånd (t.ex. konstitutive-aktiva eller dominerande-negativa molekyler, farmakologisk hämning av molekyler och varierade extracellulära matriskoncentrationer 41, 42 ), kan vi ytterligare information om det kvantitativa sättet på vilket dessa molekyler utövar dynamisk kontroll över cellulär morfologi. Även om vi försökte experiment med Rac1-hämmare (Rac1-hämmare V) 43 och Cdc42-hämmare (ML-141) 44, reducerade dessa hämmare inte väsentligt aktiviteterna för Rac1 och Cdc42 i vårt cellfall (data visas inte). Vår strategi har inte bara en stor potential att hjälpa till att förstå de teoretiska aspekterna av cellulär morfodynamik och migration utan ger också en systematisk metod för att aktivt driva rörliga celler genom optisk eller okodad kontroll av reglerande molekyler.

Genom den korscellulära förutsägbarhetsanalysen identifierade vi två kluster av celler, förutsägbara celler och oförutsägbara celler (fig. 3b). Överraskande nog var den V-formade karaktären av svarsfunktionerna konsekvent inte bara för förutsägbara celler utan också för oförutsägbara celler, vars morfodynamik inte förutsägs exakt även med användning av svarfunktionen uppskattad från själva data. Den relativt dåliga förutsägbarheten för de oförutsägbara cellerna innebär att en annan väg också kan reglera de morfologiska förändringarna i dessa celler, och den V-formade svarfunktionen antyder en konsekvent kontroll av Rho GTPaser oavsett rekrytering av en sådan förbikoppling.

Vi identifierade också distinkta bidrag från Rac1 och Cdc42 till de morfologiska förändringarna beroende på migreringsläget. Svarsfunktionen för Rac1 förutspådde noggrant migrerande celler noggrant, medan svarfunktionen för Cdc42 förutsagde exakt slumpmigrerande celler (fig. 3c). I överensstämmelse med vårt resultat har flera studier rapporterat att hämning av Rac1 orsakade förlust av cellmigrationens riktning i andra celltyper, såsom muskeratinocyt 45, endotelcell 46 hos människa naveln, och Dictyostelium 47 . Å andra sidan har det också rapporterats att ihållande migration är korrelerad med hämningen av Rac1 i fibroblaster 48, vilket verkar motsätta sig vårt resultat. Observera att deras experimentella tillstånd var tredimensionell kultur, medan experiment i denna studie och konsekventa tidigare rapporter 45, 46, 47 utfördes i tvådimensionell kultur. Sammantaget är vår studie den första rapporten som antyder att Rac1 och Cdc42 nativt fungerar tydligt i de långlivade respektive slumpmässiga migrationslägena (Fig. 5b).

Förutom Rac1 och Cdc42 är RhoA, en annan medlem av Rho GTPases, också en viktig regulator i cellmigrationen; RhoA reglerar aktomyosin-baserad membrankontraktion via aktivering av Rho kinase 49, 50 . På grund av ömsesidig hämning mellan RhoA och Rac1 upprättas motsatta polariserade aktiviteter av RhoA och Rac1 i cellpolarisation 51, 52, 53, och polariteten främjar en fortsatt migration. Tidigare studie med FRET-avbildning av time-lapse av RhoA rapporterade att låga och höga aktiviteter av RhoA observerades med slumpmässiga och ihållande migrationer, respektive 54 . På grund av ömsesidig hämning mellan RhoA och Rac1 kan hög (låg) aktivitet av Rac1 förknippas med slumpmässig (ihållande) migration, vilket inte överensstämmer med resultaten från vår studie (fig 3c och 5b).

Det kan ha hävdats att rörliga celler är strukturellt och funktionellt polariserade med en framkant och en tillbakadragande svans och att den cellulära migrationen styrs av denna polaritet. Vi visade emellertid i denna studie att "makroskopisk" cellmigration är ett resultat av summeringen av de "mikroskopiska" lokala morfologiska förändringarna som regleras av Rho GTPases; genom en analys som antar icke-polariserad, homogen rörlighet, kan migrationsriktningen och hastigheten förutsägas genom att integrera de lokala molekylära aktiviteterna längs den cellulära periferin (fig. 4). Detta fynd indikerar att det inte finns något kontrollcenter (åtminstone inte nedströms Rho GTPaserna) som bestämmer globalt cellbeteende; detta bevis stöder "dragkampmodell" där distribuerade lokala drivfaktorer dyker upp för att kontrollera den makroskopiska migrationen (Fig. 5c).

Vid intracellulär signalöverföring av cellmigrering mottas en hel del signaler genom många typer av receptorer, vidhäftningsmolekyler och jonkanaler 17 . Tvärtom konvergerar de olika signalerna till tre typer av Rho GTPaser, dvs Rac1, Cdc42 och RhoA 55, som tidigare antogs ha distinkta funktioner för att inducera olika subcellulära strukturer, lamellipodia, filopodia respektive stressfibrer, 7, 9 . Även om dessa subcellulära strukturer är viktiga för att inducera drivkraft för cellmigreringen, är hur de koordineras under cellmigreringen genom spatiotemporal reglering av Rho GTPases kvar som en öppen fråga. Denna fråga kan lösas genom det föreslagna prediktiva tillvägagångssättet i framtiden med identifiering av de multidimensionella svarfunktionerna hos Rho GTPases till koordinerade rörelser av lamellipodia, filopodia och stressfibrer.

Som påvisats i denna studie, är ett förutsägbart tillvägagångssätt för att extrahera dolda informationsbearbetningsmekanismer från avbildningsdata alltmer nödvändigt i en tid med biologiska experiment med hög kapacitet. Vi tror att ett sådant förutsägbart tillvägagångssätt tillhandahåller kraftfulla och i stort tillämpliga verktyg för att ytterligare förstå informationsbehandling i olika biologiska system.

Material och metoder

Celler, plasmider och reagenser

HT-1080-celler köptes från American Type Culture Collection eller Japan Cell Resource Bank och hölls i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Cellerna transfekterades med plasmiden som kodar för FRET-biosensorerna, Raichu-Racl / 1011x eller Raichu-Cdc42 / 1054 × 1 med Lipofectamine 2000-reagens enligt tillverkarens protokoll (Invitrogen, San Diego, CA).

Time-lapse FRET Imaging

FRET-avbildning av Racl- eller Cdc42-aktivitet i slumpmässigt migrerande HT-1080-celler utfördes såsom beskrivits tidigare 14, 56 . I korthet suspenderades HT-1080-celler som uttrycker FRET-biosensorer med användning av trypsin, pläterades på kollagenbelagda 35-mm glasbottnade skålar och odlades med fenol Rödfri DMEM / F12 (Invitrogen) innehållande 10% FBS under ungefär 1 timme. Före avbildning överlappades odlingsmediet med mineralolja för att förhindra avdunstning. Cellerna avbildades med ett inverterat mikroskop (IX81; Olympus, Tokyo, Japan) utrustat med en UPLANSAPO 60x olje-nedsänkning objektiv objektiv (Olympus), en kyld laddningskopplad enhet (CCD) kamera (Cool SNAP-K4; Roper Scientific), ett ljusemitterande diode (LED) -belysningssystem (CoolLED precisExcite, Molecular Devices), ett IX2-ZDC laserbaserat autofokuseringssystem (Olympus) med ett MDXY30100T-Meta automatiskt programmerbart XY-steg (Sigma Koki, Tokyo, Japan). Följande filter användes för bildstudier med dubbelemission: exciteringsfilter, 435/20 för cyan fluorescerande protein (CFP) och FRET (Olympus); dikroiska speglar, XF2034 (Omega); och utsläppsfilter, 480AF30 för CFP (Omega) och 535AF26 för FRET (Omega). Exponeringstiden var 200-400 millisekunder för CFP och FRET-bilderna när binning inställdes på 4 × 4. Efter bakgrundsubtraktion skapades bilderna av FRET / CFP-förhållandet med MetaMorph-programvaran (Universal Imaging, West Chester, PA) och representerades i det intensitetsmodulerade visningsläget. I det intensitetsmodulerade visningsläget användes åtta färger, från röd till blå, för att representera FRET / CFP-förhållandet, varvid intensiteten för varje färg indikerar den genomsnittliga intensiteten för FRET eller CFP.

Cellkantsdetektering

Den cellulära kanten extraherades från CFP-bilden. CFP-bilden tappades först av den blinda bilddekonvolutionen 57, i vilken originalbilden uppskattades med maximal sannolikhetsmetod utan uttrycklig kunskap om poängspridningsfunktionen i mikroskopin. Den otydliga CFP-bilden jämnades sedan ut med användning av ett Savitzky-Golay-filter 58, vilket gjorde vart och ett av de lokala bildplåstren (5 × 5) släta med en andra ordning av polynomutjämningskärnan. Denna förbehandling var fördelaktig för att förbättra noggrannheten för efterföljande cellulära detektering. De utjämnade CFP-bilderna binariserades sedan med en viss tröskel, som var avstämd så att intracellulära och extracellulära regioner tydligt segregerades (kompletterande fig. S3). Observera att eftersom Rac1 och Cdc42 inkluderar CAAX-motiv som är membraninriktningsignal, lokaliserades Raichu-Rac1 och Raichu-Cdc42 vid membranet både vid cellulär periferi och cortex (kompletterande figur S4). Varje pixel i CFP-bilden klassificerades i antingen en högintensiv eller lågintensiv pixel, vilket motsvarade de intra- och extracellulära regionerna. Tröskelvärdet ställdes till att vara vanligt över rymden och tidsförloppet för varje cell. De små hålliknande extracellulära regionerna omgiven av intracellulära regioner fylldes med de intracellulära regionerna. Slutligen erhölls den cellulära kanten som en sluten slinga i det intracellulära området.

Virtuell markörspårning

För att spåra cellkanten i processen med cellmigrering placerades N ( N var 100 i vår analys) markörer praktiskt taget längs hela cellperiferin i ett bildplan från första tidpunkten. I grunden sökte man minimala resvägar för de virtuella markörerna med begränsningarna att markörerna alltid måste vara på cellkanten och att angränsande markörer måste vara lika åtskilda. Dessa begränsningar var effektiva för att undvika ogynnsam korsning mellan vägarna och att konsekvent spåra markörerna under en längre observationsperiod. Denna spårning av de virtuella markörerna beskrivs med ett optimeringsproblem för att minimera följande kostnadsfunktion:

Image

med förbehåll för dist ( r n, t , r n ± 1 , t ; M t ) = L t / N , där R är uppsättningen av positionsvektorer för alla markörer, r n , tn, t = ( x n, t , y n, t ) T är den 2-dimensionella markörpositionen för den n: e markören vid tiden t ( n = 1,

.

, N ; t = 1,

.

, T ), F är antalet bildramar, och Lt är längden på cellgränsen vid tidpunkten t . Den | z | term betecknar den euklidiska normen för vektorn z . dist ( r n, t , r n ± 1 , t ; M t ) representerar (icke-euklidiskt) avståndet mellan r n, t och r n ± 1 , t längs cellkanten och beräknades baserat på M t , a uppsättning koordinater för de cellulära kantpixlarna vid tidpunkten t .

Detta begränsade optimeringsproblem löstes med användning av följande iterativa procedur. Först placerades alla markörer godtyckligt i avstånd från varandra i varje bildram. I varje iteration är positionerna för alla markörer i varje bildram t ( r 1 , t ,

.

R , t ) uppdaterades samtidigt med samma positionsskift längs cellkanten. Skiftet beräknades baserat på en genomsnittlig inre produkt mellan gradienten för ovanstående kostnadsfunktion med avseende på markörpositionen rn , t och en normaliserad tangentialvektor längs cellkanten:

Image

där η och τ indikerar en positiv konstant respektive iterationsnumret för gradientnedstigningen. Termen t n, t ( R τ ) indikerar enhetens tangentiella vektor för den lokala kanten.

Kvantifiering av lokal membranförlängning / -indragning

Efter markörspårningen kvantifierades förlängningen / tillbakadragningen av den lokala cellkanten på varje markör mellan på varandra följande bildramar. Om det euklidiska avståndet mättes mellan positioneringsvektorerna på den n: e markören vid tidpunkten t och vid tiden t + 1, | r n, t + 1 - r n, t |, det kan inkludera inte bara membranförlängningen / tillbakadragningen utan också förskjutningen av den cellulära centroiden på grund av migrationen. För att enbart kvantifiera membranförlängningen / tillbakadragningen på den n: e markören vid tidpunkten t , d n, t , beräknade vi den ortogonala komponenten av den rörliga vektorn hos den n: e markören mellan två tidsramar t och t + 1, r n, t + 1 - rn , t , till cellgränsen enligt följande:

Image

där e n , t betecknar enhetens normala vektor till den lokala kanten i ett visst fönster. Värmekartan över lokala morfologiska förändringar (fig. 1c) representerar d n, t .

Kvantifiering av Rac1 och Cdc42-aktivitet vid Cell Edge

Aktiviteten för Cdc42 och Rac1 vid cellkanten kvantifierades enligt följande: För att erhålla signalerna för CFP- och FRET-kanalerna applicerades en Gaussisk upplösningskärna på varje virtuell markör med en standardavvikelse på 3, 8 [pixlar] till bilderna på CFP- och FRET-kanaler. Denna standardavvikelse anges som ungefär en tredjedel av medelavståndet mellan angränsande markörer över uppsättningen bilder. Vidare erhölls aktiviteterna för Cdc42 och Rac1 som ett förhållande mellan FRET-signalen och CFP-signalen för varje virtuell markör. Även om den gaussiska kärnan ofta krökade de extracellulära pixlarna eliminerades en sådan ogynnsam effekt vid användning av förhållandet.

Korrelationsanalyser

De spatiotemporala kors- och autokorrelationsfunktionerna beräknades väsentligen såsom beskrivits tidigare 14, 59 . Tvärkorrelationen Ci , j mellan Yn , t och Zn , t definieras enligt följande:

Image

där operatören n, t betecknar medelvärdena över tid och utrymme. C0 , j representerar den temporära tvärkorrelationsfunktionen. Om Yn , t = Zn , t , Ci, blir j den automatiska korrelationen.

Regressionsanalyser

Regressionsvikterna w , j ( i = - N / 2 ,

.

N, 2 ; j = - T ,

.

, 0) i ekvation (1) uppskattades via kamregression. Kostnadsfunktionen som ska minimeras ges av följande:

Image

där λ är en positiv konstant som styr styrkan hos regleringstermin, dvs. den andra termen i ekvationen ovan. I vår regressionsanalys ställdes λ in för att minimera regressionsfelet (den första termen i ekvationen ovan) i träningsdatasystemet.

Statistiska test

Förutsägbarheten för den uppskattade regressionsmodellen undersöktes med två statistiska test. Först kontrollerade vi om förutsägelse av kantförskjutningen i valideringsdatasats förbättras med användning av Rac1- eller Cdc42-aktiviteten, jämfört med den enklaste förutsägelsen där kantförskjutningen i valideringsdatasatsen förutsägs som sitt genomsnitt i träningsdatasättet. Om förutsägelsen förbättrades med användning av Rac1 eller Cdc42-aktivitet, måste variansen för prediktionsfelet i den Rac1 / Cdc42-baserade förutsägelsen vara betydligt mindre än den i den enklaste förutsägelsen. Sedan bekräftade vi dess betydelse för alla förutsägbara celler genom F- testet ( p <0, 01 för Cdc42-avbildning (N = 7) och p <0, 01 för Rac1-avbildning (N = 7)).

För det andra kontrollerade vi också om förutsägelse av kantförskjutningen i valideringsdatasätet har förbättrats genom att använda historien om Rac1 eller Cdc42-aktiviteten med svarfunktionen, jämfört med den enkla förutsägelsen där kantförskjutningen enbart förutsäges av aktuell molekylär aktivitet. Om förutsägelsen förbättrades med användning av Rac1- eller Cdc42-aktivitetens historia måste korrelationskoefficienten mellan den förutsagda och observerade kantförskjutningen i den svarfunktionsbaserade förutsägelsen vara betydligt högre än den i den enkla förutsägelsen. Sedan utförde vi det statistiska t- testet efter Fishers z-transformation och bekräftade dess betydelse ( p <0, 01 för alla celler i Cdc42-avbildningen; p <0, 01 för 8 celler och p <0, 05 för 2 celler i Rac1-avbildningen). Dessa statistiska tester för förutsägelse gav starkt bevis på att dessa molekyler är ansvariga för lokal cellulär morfodynamik.

Likheten mellan svarsfunktioner

Likheten mellan svarsfunktionerna för två celler, k och k ' , gavs med kosinuslikhet definierad av följande:

Image

var

Image

indikerar en regressionsparameter för det rumsliga avståndet i och fördröjningstiden j uppskattad från k- cellens data.

Förutsägelser om cellmigrationshastigheten

Den makroskopiska cellmigrationen, dvs rörelse av cellulär centroid, förutsäges ytterligare genom att integrera de förutsagda kantförskjutningarna dn , t (nedre panelen i fig. 2a). Under en förenkling av att cellformen är rund beräknades hastigheten för cellmigrationen Vt som summan av alla markörer för töjning / tillbakadragning:

Image

där a är en förstärkningskonstant och beräknades tillmötesgå observationer. Observera att migrationshastigheten och riktningen erhölls som | V t | respektive solbränna -1 Vt .

ytterligare information

Hur man citerar denna artikel : Yamao, M. et al. Särskild prediktiv prestanda för Rac1 och Cdc42 vid cellmigrering. Sci. Rep. 5, 17527; doi: 10.1038 / srep17527 (2015).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande film S1

  2. 2.

    Kompletterande film S2

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.