Direkt cancer – stromal interaktion ökar fibroblastproliferation och förbättrar invasiva egenskaper hos scirrous-type magkarcinomceller | brittisk journal för cancer

Direkt cancer – stromal interaktion ökar fibroblastproliferation och förbättrar invasiva egenskaper hos scirrous-type magkarcinomceller | brittisk journal för cancer

Anonim

Den här artikeln har uppdaterats

Abstrakt

Bakgrund:

Maskcarcinom (Scirrhous-type) (SGC) uppvisar en omfattande submukosal fibros och extremt dålig patientprognos. Vi undersökte vikten av cancer-stromal interaktion i histogenesen av SGC.

metoder:

Gastriska fibroblaster NF-25 och intestinala fibroblaster NF-j2 samodlades med SGC-härledda (HSC-39) eller icke-SGC-härledda (HSC-57 och HSC-64) celler. För att identifiera gener som är upp- eller nedreglerade i NF-25 utfördes komplementär DNA (cDNA) mikroarrayanalys. Antikroppen mot vaskulärcelladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1) användes för celltillväxttest och immunohistokemi. Påverkan av interaktion med NF-25-fibroblaster på HSC-39-celler undersöktes dessutom med användning av Western blot och revers transkriptions-polymeras-kedjereaktion.

Resultat:

HSC-39-celler stimulerade tillväxt av NF-25 men inte NF-j2 när de samodlades. Induktion av VCAM-1 i NF-25-fibroblaster identifierades, vilket var specifikt när det samodlades med HSC-39 men inte med icke-SGC-härledda HSC-57- och HSC-64-celler. Neutraliserande antikropp mot VCAM-1 undertryckte NF-25-tillväxt på dosberoende sätt. I vävnadsprover var positiv immunreaktivitet för VCAM-1 i SGC-härledda fibroblaster betydligt högre än hos icke-SGC-härledda fibroblaster. Dessutom inducerade interaktion med NF-25-fibroblaster inte bara den epitelialt-mesenkymala övergångsliknande förändringen, utan också uttryck för matrismetalloproteinasrelaterade gener i HSC-39-celler.

Slutsats:

Direkt interaktion mellan SGC-celler och gastriska fibroblaster fastställer tumörens mikromiljö och förstärker aggressiviteten hos SGC.

Huvudsaklig

Skinnformig gastrisk karcinom (SGC), även kallad diffus gastrisk karcinom, eller linitis plastica, kännetecknas av diffus infiltration och snabb spridning av cancerceller åtföljd av omfattande submukosal fibros och resulterande fibrös förtjockning av väggen (Otsuji et al, 2004 ). Prognosen för patienter med SGC är extremt dålig, främst på grund av ofta förekomst av lymfkörtelmetastas och peritoneal spridning av cancerceller; därför har det blivit brådskande att förstå den molekylära mekanismen som ligger bakom dessa egenskaper hos SGC för utvecklingen av nya terapier (Ikeguchi et al, 2004; Nakamura et al, 2006).

I cancer erkänns stromförändring vid den invasiva fronten som ett "desmoplastiskt svar", vilket kan ge en betydande påverkan på cancercellernas spridning och invasivitet (De Wever och Mareel, 2003). De cancerassocierade fibroblasterna (CAF), som består av fibroblaster och myofibroblaster, bygger en cancer-stromal interaktion med två distinkta mekanismer, den efferenta vägen och den afferenta vägen (Hwang et al, 2008). I den efferenta vägen har olika autokrina och paracrine mediatorer hittats, inklusive tillväxtfaktorer, cytokiner och interleukiner. I synnerhet främjar transformering av tillväxtfaktor ß starkt inte bara kemotaxi av CAF: er (Postlethwaite et al, 1987), utan också omvandling av icke-invasiva lesioner till invasiva (Cui et al, 1996). Dessutom har flera faktorer som involverar keratinocyttillväxtfaktor (Nakazawa et al, 2003), hepatocyttillväxtfaktor (Tendo et al, 2005) och interleukin-1 ß (Yashiro et al, 2007) dokumenterats som viktiga mediatorer som aktiverar paracrin eller autokrin signalering mellan SGC-celler och CAF: er, vilket alla resulterar i främjande av tumörtillväxt och progression. I den afferenta vägen utlöser i sin tur direkt interaktion mellan cancerceller och CAF olika intracellulära signalvägar; till exempel tros celladhesionsmolekylen N-cadherin spela en viktig roll i regleringen av många intracellulära svar som aktiverar cancercells rörlighet och invasivitet (Hazan et al, 2000). Således är mikro-miljön för acceleration av cancercellinvasion och progression sammansatt komplicerat med interaktioner med CAF: er. Dessutom har betydelsen av organspecifika fibroblaster i spridningen och invasionen av bröstcancerceller föreslagits (Yashiro et al, 2005); emellertid är lite känt om rollen för gastriska fibroblaster som CAF under utvecklingen av SGC.

I allmänhet tros den epitelialt mesenkymala övergången (EMT) och nedbrytningen av den extracellulära matrisen (ECM) vara tidiga händelser under tumörinvasion och metastaser i flera steg. EMT är en morfogen process där celler tappar sina epiteliska egenskaper såsom cellpolaritet och cell-cellkontakt och får mesenkymala egenskaper såsom ökad rörlighet (Berx et al, 2007). Även om EMT ursprungligen har beskrivits i sina funktioner under embryogen utveckling (Duband et al, 1995; Shook och Keller, 2003), har ackumulerade bevis visat att det spelar en kritisk roll i tumörinvasion och metastaser, särskilt i processen för att lossna och migration av cancerceller från den primära tumören och etablering av metastatiska platser i avlägsna organ (Thompson et al, 2005). EMT för cancerceller induceras ofta av olika transkriptionsfaktorer såsom Snail, Twist och Slug (Lombaerts et al, 2006), vilket resulterar i nedreglering av epitelmarkörer såsom E-cadherin och uppreglering av mesenkymala markörer såsom vimentin. I SGC har rapporterats om behållen expression av de mesenkymliknande generna inducerade av igelkottstranskriptionsfaktor (Ohta et al, 2009). Å andra sidan bestämmer balansen mellan lokala produktionsnivåer av matrismetalloproteinaser (MMP) och vävnadshämmare av metalloproteinaser kapaciteten för nedbrytning av ECM. Förhöjda nivåer av MMP-uttryck har dokumenterats i olika mänskliga maligniteter (Liotta et al, 1991), och överuttryck av MMP2 och är nära korrelerat med hög förekomst av invasion och metastaser (Nomura et al, 1996), som aktiveras av membrantyp- 1-MMP (MT1-MMP) (Sato et al, 1994). Därför är diversifierade experimentella metoder nödvändiga för att förstå de biologiska, histopatologiska och kliniska egenskaperna hos SGC.

I denna studie försökte vi identifiera de nya specifika faktorer som kan förändras i gastriska fibroblaster när de saminkuberades med SGC-härledda celler. Gener som uttrycks differentiellt i gastriska fibroblaster i närvaro eller frånvaro av direkt samodling med SGC-celler undersöktes med användning av komplementär DNA (cDNA) mikroarrayanalys. Effekterna av cell-cellkontakt på de invasiva egenskaperna hos SGC-celler bedömdes också för att förstå den biologiska betydelsen av cancer-stromal interaktion i histogenesen av SGC.

Material och metoder

Cellinjer och celltillväxttest

Human SGC-cellinje HSC-39 (passage 20) och icke-SGC-cellinjer HSC-57 (passage 10) och HSC-64 (passage 10) tillhandahölls av Dr Yanagihara (National Cancer Institute Research Center, Tokyo, Japan). HSC-39-celler (klonal) härleddes från peritoneala ascites från en 54 år gammal manlig patient med SGC (signet-ringcellcancer; Yanagihara et al, 1991). HSC-57 (klonala) och HSC-64 (klonala) celler härrörde från ascites hos patienter med väl- och dåligt differentierade adenokarcinom i magen respektive (opublicerade data). NF-25 fibroblaster (heterogen, passage 4) upprättades från en 77 år gammal manlig patient med tidig gastrisk karcinom som hade en distal gastrektomi. Gastriska fibroblaster från den icke-tumörväggen odlades och isolerades. NF-j2-fibroblaster (heterogen, passage 4) isolerades också från jejunum hos en manlig patient med bukspottkörtelcancer. Patienten hade en pancreaticoduodenuctomy och fibroblaster erhölls från den cancerfria jejunalväggen. Celler upprätthölls rutinmässigt i RPMI-1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum. NF-25 och NF-j2 fibroblaster ympade med en densitet av 1, 0 x 105 celler brunn-1 i plattor med sex brunnar inkuberades i närvaro eller frånvaro av direkt saminkubation av samma antal HSC-39-celler. För indirekt inkubering med HSC-39-celler användes en 1 mikrometer Boyden Chamber (porstorlek) (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA). Vi räknade antalet celler med cellräknarkammaren. Dynabeads Epitelial Anrich-system (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norge) användes för att separera HSC-39-celler från saminkuberade NF-25 och NF-j2-fibroblaster. Antalet NF-25-fibroblaster räknades i närvaro eller frånvaro av neutraliserande antikroppar mot vaskulärcelladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1) (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA) och integrin- a 4 (Santa Cruz) .

immunofluorescens

24 timmar efter samodling fixerades HSC-39-celler och NF-25-fibroblaster i kammarglas med 4% formalin och inkuberades med en blockeringslösning innehållande 1% bovint serumalbumin. Celler inkuberades med antikroppar mot vimentin (1: 1000-utspädning; Dako, Glustrup, Danmark), cytokeratin (1: 1000-utspädning; Dako) och VCAM-1. Efter tvättning inkuberades sliderna med de sekundära antikropparna, en blandning av Cy2-konjugerad anti-mus och Cy3-konjugerad anti-kanin IgG-antikroppar (1: 10 000 utspädning).

cDNA-mikroarrayanalys

Totalt RNA extraherades från NF-25-fibroblaster (enskild kultur och samodlades med HSC-39) med användning av RNeasy-kitet (Qiagen, Hilden, Tyskland). En cDNA-mikroarray framställdes av IntelliGene HS Human Expression CHIP (Takara Bio, Otsu, Japan), innehållande sonder för 16 600 karakteriserade humana gener och uttryckta sekvensmärken. In vitro- transkription utfördes hybridisering och skanning av oligonukleotid-array enligt Takara Bio-instruktioner. I korthet syntetiserades dubbelsträngat cDNA från total RNA och märktes med RNA-fluorescensmärkningskärnsatsen (Takara Bio). Matriser skannades sedan med GeneArray-skannern (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) för att erhålla bild- och signalintensiteter. Efter datanormalisering utfördes signifikansanalys av mikroarray (SAM) plotanalys och signifikant förändrade gener identifierades i enlighet med tillverkningens instruktioner (//chem.agilent.com).

immunohistokemi

Totalt 37 formalin-fixerade och paraffin-inbäddade prover av sporadiska SGC och icke-SGC som kirurgiskt avlägsnades vid Kobe University Hospital (Kobe, Japan). Inget av dessa fall fick adjuvant kemoterapi eller strålbehandling före operationen. Informerat samtycke erhölls från alla patienter och studien godkändes av Kobe University Institutional Review Board. Histologisk undersökning utfördes enligt japansk klassificering av gastrisk karcinom (Japanese Gastric Cancer Association, 1999). En modifierad version av immunoglobulin-enzymbryggtekniken med LSAB-kitet (Dako) användes. I korthet autoklaverades deparaffiniserade och rehydratiserade 4- mikrometer för att återhämta antigenicitet. Efter blockering av endogent peroxidas och icke-specifika bindningsställen applicerades antikroppar mot VCAM-1 (1: 200-utspädning), E-cadherin (1: 200-utspädning; Dako) och Snail (1: 100-utspädning; Abcam, Cambrige, UK) till avsnitten. Sektioner inkuberades sedan med biotinylerad get-anti-mus eller anti-kanin IgG (1: 10 000 utspädning) och streptavidin konjugerad till pepparrotsperoxidas (HRP). Kromogen fixering utfördes genom nedsänkning av sektionerna i en lösning av 3, 3'-diaminobenzidin. Sektioner motverkades med Mayers hematoxylin. Graden av immunoreaktiviteter för varje molekyl graderades i enlighet med antalet färgade celler och färgningsintensiteten i individuella celler: (-), nästan inga positiva celler eller 30% av tumörceller som visade svag immunreaktivitet eller tumörceller som visade intensiv immunreaktivitet.

Western blotting

Cellerna lyserades i en buffert innehållande 50 m M Tris-HCl (pH 7, 4), 125 m M NaCl, 0, 1% Triton X-100 och 5 m M etylendiamintetraättiksyra innehållande 1% proteasinhibitcocktail (Sigma, St Louis, MO, USA). Proteiner (20 μg ) separerades med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores följt av elektrotransfer till Hybond C-membranet (Millipore, Bedford, MA, USA). Efter blotting med antikroppar mot VCAM-1 (1: 1000-utspädning), integrin- a 4 (1: 1000-utspädning), FAK (1: 1000-utspädning; Santa Cruz), paxillin (1: 1000-utspädning; BD Transduction, Lexington, KY, USA), E-cadherin (1: 1000 utspädning), vimentin (1: 1000 utspädning), snigel (1: 500 utspädning) och p -actin (1: 10000 utspädning; Sigma), HRP-konjugerad anti-mus eller anti -rabbit IgGs (1: 10000 spädning, GE Healthcare, Little Chalfont Buckinghamshire, UK) användes som sekundär antikropp. Signalerna visualiserades med förbättrad kemiluminescens.

RT-PCR

Omvänd transkription-polymeras-kedjereaktion (RT – PCR) utfördes med ett OneStep RT – PCR-analyssats (Qiagen). De primeruppsättningar som användes i den aktuella studien visades i tabell 1. Varje 25- mikroliter reaktionsblandning innehållande 10 ng totalt RNA amplifierades under 30 cykler med följande schema: omvänd transkription vid 50 ° C under 30 minuter; denaturering vid 94 ° C under 30 s; glödgning vid 58 ° C under 30 s och förlängning vid 72 ° C under 1 min. Produkterna genomgick elektrofores på 2% agarosgel.

Full storlek bord

Resultat

Effekterna av saminkubation med SGC-celler på spridning av fibroblaster

För att undersöka effekten av SGC-celler på den proliferativa aktiviteten hos gastriska fibroblaster räknades antalet NF-25 gastriska fibroblaster odlade i närvaro eller frånvaro av SGC-härledda HSC-39-celler. HSC-39-celler etablerades ursprungligen från ascites av en patient med SGC och cellerna uppvisar därför inte typisk form på vidhäftande celler utan bildar kolonier i frånvaro av NF-25-fibroblaster; ändå uppvisade HSC-39-cellerna direkt fästning och montering med NF-25-fibroblaster längst ner i odlingsskålen, även om ingen morfologisk förändring observerades i dessa linjer (figur 1A). Dessutom ökades antalet NF-25-fibroblaster dramatiskt när cellerna samodlades med HSC-39-celler ( P <0, 001; figur IB). För att undersöka den möjliga effekten av lösliga faktorer i odlingsmediet bibehölls NF-25-fibroblaster och HSC-39-celler separat med användning av en 1 mikrometer stor Boyden-kammarinsatser; emellertid detekterades ingen signifikant ökning av cellproliferation (figur IB).

Cell-cellkontakt med SGC-härledda HSC-39-celler uppreglerade NF-25 gastriska fibroblaster tillväxt. ( A ) Immunofluorescens av NF-25-fibroblaster samodlade med HSC-39-celler. NF-25-fibroblaster och HSC-39-celler färgades med vimentin (grönt) och cytokeratin (rött) (x 200). ( B ) Tillväxtkurvor för NF-25 gastriska fibroblaster och NF-j2-tarmfibrroblaster i närvaro eller frånvaro av saminkubation med HSC-39-celler. Innan antalet NF-25- och NF-j2-fibroblaster räknades utesluts HSC-39-celler som samodlades med separering genom en magnetisk pärlmetod. För att undersöka effekten av lösliga faktorer upprätthölls NF-25-fibroblaster och HSC-39-celler separat med användning av en 1 mikrometer Boyden Chamber-insatser i porstorlek. * <0, 01.

Bild i full storlek

Yanagihara et al (2004) rapporterade tidigare att ortotopimplantation av HSC-44PE SGC-celler orsakade ett xenograft att utvecklas i magen, vilket visade omfattande fibros med endast gles tumörcellinfiltration; emellertid observerades inte sådan spridning av fibroblaster på metastatiska ställen inklusive huden, lymfkörteln och lungan, vilket antyder att fenomenet är ortotopiskt. Således utvärderade vi därefter den proliferativa aktiviteten hos NF-j2-intestinala fibroblaster för att undersöka om effekten av samodling med HSC-39-celler är vävnadsspecifik eller inte. HSC-39-celler visade inte cell-cellkontakt med NF-j2-fibroblaster när de samodlades och flöt över NF-j2-fibroblaster. Det fanns ingen induktion av celltillväxt av NF-j2-fibroblaster (figur IB).

Uppreglering av VCAM-1-uttryck induceras specifikt av SGC-celler i gastriska fibroblaster

För att identifiera molekylerna specifikt upp- och nedreglerade i NF-25-fibroblaster utförde vi en cDNA-mikroarray-analys med användning av totala RNA från NF-25-fibroblaster odlade i närvaro eller frånvaro av HSC-39-celler (figur 2A). Förändringen i genuttrycksprofilen för NF-25-fibroblaster med saminkubation med HSC-39-celler jämfört med NF-25-fibroblaster utan samodling med HSC-39-celler involverade inte ett stort antal gener: efter normalisering och revision av rådata, 233 gener (> 2, 5-faldigt uppreglerat, 107 gener och <0, 4-faldigt nedreglerat, 126 gener) identifierades som visar statistiskt signifikanta skillnader (figur 2B). Noggrannheten i mikroarrayanalysen bekräftades genom realtids RT – PCR-analys av uttrycket av sex slumpvis utvalda differentiellt uttryckta gener, eftersom resultaten visade god överensstämmelse med mikroarray-data i termer av vikningsändring av genuttryck (data visas inte) . Bland de 13 vidhäftningsrelaterade generna som påverkades (uppreglerade, åtta gener och nedreglerade, fem gener; tabell 2) beslutade vi slutligen att fokusera på VCAM-1-gentranskript (GDB-anslutning nr NM_001078.2), som visade 4, 60- vik uppreglering i NF-25 fibroblaster samodlade med HSC-39-celler.

Identifiering av gener som uttrycks differentiellt i NF-25 gastriska fibroblaster i närvaro eller frånvaro av cell-cellkontakt med HSC-39-celler. ( A ) Illustration av strategin för cDNA-mikroarray. NF-25 fibroblaster (1 x 10 5 celler skål 1) hölls under 48 timmar i närvaro eller frånvaro av HSC-39 celler (1 x 105 celler skål 1). HSC-39-celler separerades med epitelcellsanrikning med magnetiska pärlor. ( B ) Resultat av SAM-plotanalys. Cy5-positiva (ljusblå) gener genererade upp i NF-25-fibroblaster samodlade med HSC-39-celler; Cy3-positiva (gröna) gener uppreglerade i NF-25 fibroblaster; positiva (blå), gener lika uttryckta och negativa (röda), gener som inte uttrycktes.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Därefter bekräftade vi om VCAM-1-induktion i NF-25-fibroblaster är en SGC-specifik händelse eller kan ses med icke-SGC-celler. Induktion av VCAM-1 vid både mRNA- och proteinnivåerna observerades dramatiskt när NF-25-fibroblasterna inkuberades med HSC-39-celler (figur 3A och B). I NF-25 fibroblaster uttrycks VCAM-1-protein vid cellmembranet med en distinkt spindelmorfologi (figur 3C). Emellertid hittades ingen induktion i nivåerna av VCAM-1-expression i NF-25-fibroblaster när de samodlades med HSC-57 och HSC-64-celler, som båda etablerades från patienter med icke-SGC.

Induktion av VCAM-1-expression i NF-25 gastriska fibroblaster induceras specifikt genom direkt interaktion med HSC-39-celler. NF-25-fibroblaster inkuberades tillsammans med HSC-39 (SGC-härledda), HSC-57 (icke-SGC-härledda) och HSC-64 (icke-SGC-härledda) celler under 48 timmar. Cancerceller separerades med epitelial anrikning av magnetiska pärlor. ( A ) Resultat av RT – PCR-analys. Nivåerna av p-aktinuttryck användes som kontroll. ( B ) Resultat av western blotting. Nivåerna av p- aktinuttryck användes som kontroll. ( C ) Immunofluorescens och morfologiska förändringar av NF-25-fibroblaster i närvaro eller frånvaro av samodling med HSC-39-celler (× 200). NF-25-fibroblaster visualiserades med antikroppar mot vimentin (rött) och VCAM-1 (grönt).

Bild i full storlek

Betydelsen av den integrerade α 4 – VCAM-1 signalvägen på gastrisk fibroblastproliferation

Effekten av den neutraliserande antikroppen mot VCAM-1 undersöktes för att bedöma om induktion av VCAM-1-uttryck genom samodling med HSC-39-celler kan främja tillväxtaktiviteten för NF-25-celler. Tillsats av anti-VCAM-1-antikropp till odlingsmediet undertryckte effektivt den tillväxtfrämjande effekten av cell-cellkontakt med HSC-39 på ett dosberoende sätt (figur 4A). Adhesionsmolekylintegrin- a 4 kan binda med VCAM-1 och aktiverar därefter den intracellulära signaleringen som främjar frigöring av cell-cell vidhäftning och ökad cellmigrationsaktivitet (Bogetto et al, 2000; Klemke et al, 2007). På liknande sätt minskades antalet NF-25-fibroblaster när cellerna samodlades med HSC-39-celler i media innehållande anti-integrin-a4-antikropp på ett dosberoende sätt (figur 4B).

Effekter av neutraliserande antikroppar mot VCAM-1 och integrin- a 4 på NF-25-fibroblaster växer i närvaro av samodling med HSC-39-celler. NF-25 fibroblaster (1 x 105 celler skål 1) hölls samtidigt med HSC-39 celler (1 x 105 celler skål 1) och de olika mängderna av varje antikropp tillsattes till mediet. Antalet NF-25-fibroblaster räknades 48 timmar efter tillsats av dessa neutraliserande antikroppar. ( A ) Effekter av anti-VCAM-1-antikropp (0–10 μg ml −1 ). ( B ) Effekter av anti-integrin- α 4-antikropp (0–10 μg ml −1 ). Icke-specifikt mus-IgG (5 μg ml −1 ) användes som negativ kontroll. Experimenten utfördes tre gånger.

Bild i full storlek

Enligt dessa resultat erhållna från in vitro- experimenten undersökte vi VCAM-1-uttryck i sporadiska SGC- och icke-SGC-fall. Resultaten av immunohistokemi sammanfattas i tabell 3, och representativa illustrationer visas i figur 5. Sammantaget detekterades VCAM-1-uttryck i CAF i 14 (38%) av 37 SGC och icke-SGC-fall som undersöktes. Expression av VCAM-1 detekterades i 11 (61%) av 18 SGC-fall där omfattande tillväxter av CAF: er omringade cancercellerna, och tre (15%) av 17 icke-SGC-fall där cancerceller hade en rörformad form med desmoplastisk ändring i CAF. Frekvenserna för VCAM-1-uttryck i CAF var signifikant olika i SGC-fall och icke-SGC-fall ( P = 0, 004).

Full storlek bord

Immunohistokemi av VCAM-1, snigel och E-cadherin-uttryck under VCAM-1-positivt SGC (signet-ringcellkarcinom) tillstånd och VCAM-1-negativt icke-SGC-tillstånd (måttligt differentierat tubulärt adenokarcinom). Histologisk undersökning utfördes genom färgning av hematoxylin och eosin (H&E). Originalförstoring: × 200.

Bild i full storlek

Cell-cellkontakt med gastriska fibroblaster främjar EMT-liknande förändring och inducerar MMP-produktion i SGC-celler

Förändrade egenskaper hos HSC-39-celler genom saminkubation med NF-25-fibroblaster analyserades. Proteinnivåerna för FAK och paxillin, VCAM-1-integrin-a4-signalvägsrelaterade molekyler (Liu och Ginsberg, 2000; Liu et al, 2002), uppreglerades i NF-25 fibroblaster när de samodlades med HSC- 39 celler; emellertid fanns det ingen signifikant förändring i integrin- a4- uttrycksnivåerna (figur 6). Å andra sidan, i HSC-39-celler hittades ingen förändring i nivåerna av dessa proteiner involverade i integrin- a 4 – VCAM-1 signalvägen. Intressant nog upptäcktes induktion av snigel, en EMT-relaterad transkriptionsfaktor, åtföljd av minskade nivåer av E-cadherinuttryck och ökade nivåer av vimentinuttryck (figur 6). I själva verket detekterades intensiv immunoreaktivitet för snigel i VCAM-1-positiva SGC-fall som åtföljdes av låg E-cadherinuttryck (figur 5).

Effekter av cell-cellkontakt på nedreglering av cellhäftningsmolekyler i NF-25-fibroblaster och induktion av EMT-liknande förändring i HSC-39-celler. Resultat av Western blot. 24 timmar efter inkubering av NF-25- och HSC-39-celler separerades cellerna med hjälp av magnetiska pärlemetoder. Nivåerna av p- aktinuttryck användes som kontroll.

Bild i full storlek

På liknande sätt undersökte vi ytterligare förändrade uttryck av MMP: er i HSC-39-celler, som fungerar för nedbrytning av ECM och tillåter cancerceller att invadera in i vävnader (Sato et al, 1994). MRNA-nivåerna av MMP-2 , MT1-MMP och MMP7 i HSC-39-celler visade sig öka signifikant (figur 7).

Effekter av cell-cellkontakt på uppreglering av MMP: er i HSC-39-celler. Resultat av RT – PCR. 24 timmar efter inkubation av NF-25-fibroblaster och HSC-39-celler separerades cellerna med hjälp av magnetiska pärlemetoder. Nivåerna av p-aktinuttryck användes som kontroll.

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie bedömde vi betydelsen av samodling av NF-25 gastriska fibroblaster och SGC-härledda HSC-39-celler som en ledtråd för att belysa patogenesen av SGC, typiskt åtföljd av extraordinär förtjockning av magsväggen, kliniskt snabb utveckling och resulterande dålig prognos för patienter. Genom att stödja dessa egenskaper hos SGC ökade saminkubation med SGC-härledda celler starkt tillväxten av gastriska fibroblaster och påverkade i sin tur den invasiva / metastatiska potentialen i själva SGC-cellerna. Dessutom fann vi att cell-cellkontaktmedierad induktion av VCAM-1 i NF-25-celler ökade dess proliferationsaktivitet och neutraliserande antikroppar mot VCAM-1 och integrin- a 4 minskade celltillväxten på ett dosberoende sätt . Detta är den första rapporten som visar den möjliga rollen för aktivering av VCAM-1-integrin- a 4-signalvägen för främjande av gastrisk fibroblastproliferation. Tidigare studier har visat att integrin- a4 uttryckt i leukocyter fungerar som en receptor för VCAM-1, vilket uttrycks i endotelceller och ECM-fibronektin (Chan och Aruffo, 1993; Postigo et al, 1993); därför antas VCAM-1 ha en avgörande roll för att stödja infångning och immobilisering av leukocyter i blodomloppet som ett byggnadsställning. Ändå upptäckte vi uttryck av VCAM-1 i en stor del av SGC-fall, vilket bekräftade medling av VCAM-1 vid utvecklingen av SGC. I humant T-lymfoblastiskt lymfom uttrycks VCAM-1 inte bara i lymfomceller utan också på både de apikala och de basolaterala ytorna på endotelceller, vilket följaktligen aktiverar den sekventiella transmigrationen och intravasationen av lymfomceller (Bogetto et al, 2000). På liknande sätt främjade den höga affinitetsinteraktionen mellan integrin-4 och VCAM-1 trans-endotelmigration i melanomceller (Klemke et al, 2007). Överflödigt VCAM-1-uttryck i CAF kan bidra till att främja aggressiviteten hos SGC-celler, och detta fenomen kan bidra till den snabba spridningen och vaskulär infiltrering av SGC-celler in vivo . Preoperativa serumkoncentrationer av en löslig form av VCAM-1 i sera hos gastriska cancerpatienter var signifikant högre jämfört med de hos friska kontroller; dessutom fanns det signifikanta föreningar mellan förhöjda VCAM-1-nivåer med sjukdomstadium, invasion av gastrisk vägg, lymfkörtel involvering och närvaro av avlägsna metastaser (Alexiou et al, 2002). Även om den möjliga funktionen av cirkulerande VCAM-1 vid utvecklingen av avlägsna metastastiska platser förblir okänd, tyder resultaten i att utvärdering av VCAM-1-nivåer i serum- eller biopsiprover kan vara en ny markör för att förutsäga en patients risk för karcinommetastas och återfall efter kirurgi. Vidare uttrycks VCAM-1 huvudsakligen från CAF: er i magkarcinomvävnader snarare än cancerceller. Förhöjning av VCAM-1-nivåer på cellytan hos gastriska fibroblaster och dess utsöndring till stroma kan ha en stor inverkan på spridningen och migrationen av SGC-celler.

Nyligen genomförda studier har dokumenterat att CAF: er är inblandade i viktiga aspekter av epitelial fast tumörbiologi, såsom cancerframsteg, tumörtillväxt, angiogenes och metastas genom långvarigt uttryck av stromal-härledd faktor-1 (SDF-1), även känd CXCL12 (Yang et al, 2008). I själva verket ökade SDF-1-utsöndring av benmorfogenetiskt protein-2 tubulär bildning av mikrovaskulära endotelceller och rekrytera endotelceller av stamceller (Orimo et al, 2005) och stimulerade tumörtillväxt direkt, verkande genom CXCR4, som uttrycks av karcinomceller. Således tros SDF-1 spela en central roll för att etablera en nisch för cancerframsteg och metastaser. I den nuvarande studien föreslogs emellertid ingen löslig faktor för att främja NF-25-fibroblasttillväxt när de separat odlades med HSC-39-celler, och ökade mRNA-nivåer av SDF-1- uttryck detekterades inte i NF-25-fibroblaster samodlade med HSC-39-celler genom cDNA-mikroarray-analys (data visas inte). Snarare fann vi att proliferation av NF-25-fibroblaster accelererades genom direkt samodling med HSC-39-celler, med signifikant induktion av VCAM-1-uttryck. Dessutom detekterades denna VCAM-1-induktion endast i NF-25 gastriska fibroblaster och inte i NF-j2-intestinala fibroblaster, vilket var en specifik effekt orsakad av interaktion med SGC-härledda celler. Dessa fynd antyder vikten av direkt interaktion mellan SGC och gastriska fibroblaster för konstruktionen av en nisch som kan främja fibros i magväggen och öka det maligna beteendet hos cancerceller. I denna studie uteslutte vi inte grundligt den möjliga medlingen av lösliga faktorer som utsöndrades från både HSC-39-celler och NF-25-fibroblaster genom direkt samodling. Ytterligare undersökning kommer att krävas för att klargöra deltagandet av sådana extracellulära stimuli under utvecklingen och etablering av avlägsen metastas hos patienter med SGC.

Många rapporter har undersökt effekterna av cancer-stromal interaktion i mänskliga maligniteter och har visat vikten av cell-cellkontakt för upprättandet av en tumörmikro-miljö som kan påverka cancercells rörlighet och invasivitet, EMT, angiogenes och avlägsen metastas (De Wever och Mareel, 2003). Visst definieras EMT i kliniska cancerprover som förlust av korsande E-cadherin; växla till andra cadheriner (t.ex. N-cadherin); nedbrytning av vidhäftning mellan celler; apikobasal polaritet och vävnadsarkitektur; pleiotropisk cellform; nukleär p-katenin , snigel eller snigeluttryck ; och annars oväntat uttryck av mesenkymala markörer såsom vimentin (Thompson et al, 2005). Vi använder emellertid inte termen "EMT" för de biologiska fenomen som observerats i denna studie eftersom störande differentiering, förlust av cellpolaritet och förlust av linjespecifika eller vävnadsspecifika cytologiska egenskaper definierar aspekter av karcinom förutom "så kallade" karcinosarkom. Tarin (2005) rekommenderade att inte använda ordet "EMT" i cancerceller, särskilt när man uttrycker spridd encellig infiltration genom diffus (eller signet-ringcell) karcinom i magen. Därför uttryckte vi denna reaktion av HSC-39-celler som 'EMT-liknande förändring' i SGC-celler. Enligt vårt experiment med samkultur av NF-25-fibroblaster och HSC-39-celler inducerade direkt interaktion med gastriska fibroblaster Snail-expression, och resulterande E-cadherin-undertryckning och vimentininduktion i HSC-39-celler. Vi antog hypotesen att nivåerna av vimentin och E-cadherin-uttryck i HSC-39-celler som undersöktes har modifierats av någon anledning, vilket följaktligen återställdes när cellerna samodlades med NF-25-fibroblaster. Emellertid uttrycker HSC-39-celler ursprungligen höga nivåer av E-cadherin (Oyama et al, 1994), och vi drog slutligen slutsatsen att EMT-liknande förändring inducerades i HSC-39-celler genom kontakt med NF-25 fibroblast. En tidigare studie undersökte differentiella genuttrycksprofiler av SGC med hjälp av en cDNA-mikroarray och fann att nedreglering av E-cadherin och integrin- p4- uttryck i SGC-härledda cellinjer var associerad med stor potential av metastaser till bukhinnan och lymfkörtlarna (Hippo et al, 2001), som också stöder den induktionen av EMT-liknande förändring genom att ha cell-cellkontakt med NF-25-fibroblaster kan främja cancer aggressivitet, vilket förmodligen förmedlas av induktionen av snigel. En ny studie av Ohta et al (2009) antydde att EMT kan ha en avgörande roll i utvecklingen och utvecklingen av SGC; därför är det nödvändigt att förstå mekanismen för denna EMT-liknande förändring i SGC-celler för att utveckla en ny kemoterapeutisk strategi mot SGC i framtiden.

Förändra historien

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NM_001078.2

INTRESSEKONFLIKT

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Kompletterande information åtföljer uppsatsen på webbplatsen British Journal of Cancer (//www.nature.com/bjc)