Differentiellt utvecklingsbehov och perifer reglering för dermala VY4- och VY6T17-celler vid hälsa och inflammation | naturkommunikation

Differentiellt utvecklingsbehov och perifer reglering för dermala VY4- och VY6T17-celler vid hälsa och inflammation | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Gammadelta T-celler
  • Inflammation
  • interleukiner
  • Signaltransduktion
  • En rättelse till denna artikel publicerades den 11 april 2016

Abstrakt

Dermala IL-17-producerande γδT-celler har en kritisk roll i hudinflammation. Deras utveckling och perifera reglering har emellertid inte klargjorts till fullo. Här demonstrerar vi att dermala yTT-celler utvecklas från den embryonala tymusen och genomgår homeostatisk spridning efter födseln med diversifierad TCR-repertoar. Vy6T-celler är bona fide- bosatta, men föregångare till dermala Vy4T-celler kan kräva extratymisk miljö för att prägla hudhummaegenskaper. Tymiska Vy6T-celler är mer konkurrenskraftiga än Vy4 för dermal γδT-cellrekonstitution och TCRδ - / - möss rekonstituerade med Vy6 utvecklar psoriasisliknande inflammation efter IMQ-applikation. Även om både IL-23 och IL-1p främjar Vy4- och V66-spridning, är Vy4 den huvudsakliga källan för IL-17-produktion som kräver IL-1-signalering. Möss med brist på IL-1RI-signalering har avsevärt minskat hudinflammation. Dessa studier avslöjar ett differentiellt utvecklingsbehov och perifer regulering för dermala Vy6- och Vy4-yTT-celler, vilket innebär en ny mekanism som kan vara involverad i hudinflammation.

Introduktion

Huden har en unik sammansättning av immunceller. Förutom adaptiva aTT-celler, finns många medfödda immunceller inklusive dermala dendritiska celler och γδT-celler i huden för att etablera ett hudimmunätverk som har en kritisk roll i värdförsvar och vävnadsreparation 1 . Hos möss ligger Vy5Vδ1T-celler, benämnda dendritiska epidermala T-celler (DETC), unikt i överhuden under fosterutvecklingen 2 . Dessa celler har visat sig känna igen ett förmodat antigen (Ag) uttryckt på keratinocyter (KC) och är involverade i huden immunövervakning 3 . Nyligen har en ny undergrupp av yTT-celler identifierats i huden 4, 5, 6 . I jämförelse med DETC: er, ligger denna delmängd av yTT-celler huvudsakligen i dermis under ett stabilt tillstånd. De har olika V-användning och är de viktigaste interleukin (IL) -17-producenterna i huden efter IL-23 eller vägtullar-receptor-7/8-agonist imiquimod (IMQ) -stimulering 4, 7, 8 . Deras utveckling, handel och perifera regler är emellertid inte helt förstås.

Tidigare studier har visat att DETC: er härrör från tidiga fetala tymiska prekursorceller 9 . DETC: er är hem till huden mellan embryonala dagar 16 och 18 före födseln. Dessutom utvecklas IL-17-producerande yTT-celler (yTT17) i periferin, såsom lymfkörtlar (LN) i tymusen efter födseln genom en transformerande tillväxtfaktor-p-beroende mekanism 10 . Det verkar som att olika delmängder av yTT17-celler migrerar från tymusen in i periferin på ett funktionellt vågform 11 . På molekylnivå har en tymisk epitelcelldeterminant, Skint-1, en kritisk roll i utvecklingen av interferon (IFN) -y-producerande kontra IL-17-producerande yTT-celler 12 . Transkriptionsfaktor Sox13 är avgörande för all IL-17-engagerad Vy4 T-cellutveckling och funktion inklusive dermal Vy4 T-celler 13, 14 . Tidigare studier har också identifierat att scavengerreceptorn SCART2 uttrycks på ett unikt sätt i IL-17-producerande yTT-celler som ansluter till den perifera LN och dermis 15 . Vidare har studier visat att yTT-celler kan handla mellan LN och hud 13, 16, vilket ställer frågan om dermala yTT17-celler utvecklas på liknande sätt som andra perifera yTT-celler. Genom benmärgschimärer där BM-celler transplanterades i dödligt bestrålade värdmöss, visade det att 90% av dermala yTT-celler var från värdens ursprung, medan 10% av dermala yTT-celler var från givare BM 6, vilket antydde att BM-celler kan innehålla prekursorceller som ger upphov till dermala yTT-celler. Även om tidiga studier från Gray et al . 5 antydde att dermala yTT-celler inte kunde rekonstitueras av BM-celler, deras senare studier visade att IL-17-producerande Vy4T-celler kunde rekonstitueras av BM 13 . En ny studie visade emellertid att IL-17-producerande γδT-celler utvecklas före födelse och upprätthålls i vuxna möss som självförnyande celler 11, vilket därmed lämnar BM-rollen i genereringen av dermala yT-celler osäker. Dessutom saknas den detaljerade informationen för mogen dermal γδT-cellmigration till huden. Tidigare studier har visat att embryonal handel med DETC: er till hud kräver E / P-selinligander och CCR4 (ref. 17). CCR10 har också en kritisk roll i migrationen och platsen för DETC: er 18, 19 . När och där dermala yTT-celler utvecklas och migrerar in i huden förstås dåligt.

Här demonstrerar vi att dermala yTT-celler utvecklats från fostertymus och genomgår homeostatisk spridning efter födseln, med diversifierad TCR-repertoar. IL-17-producerande Vy6-T-celler är bona fide bosatta i dermis och rekonstitueras från fostertymus, medan tymiska Vy4-T-celler kan kräva extratymisk miljö för avtryckning av deras hudhemningsegenskaper. Chemokinreceptor CCR6 är kritisk för dermal Vy4 men inte för Vy6 T-cellmigration. Det verkar som att tymiska V66-T-celler är mer konkurrenskraftiga än Vy4 för dermal yTT-cellrekonstitution. Dessutom är V66-T-celler patogena och kan inducera hudinflammation, medan Vy4-T-celler företrädesvis expanderas och är de största IL-17-producenterna i IMQ-modellen för psoriasliknande hudinflammation. Även om IL-23 och IL-1p kan driva dermal Vy4- och Vy6-T-cellproliferation, produceras IL-17 huvudsakligen av Vy4, för vilken IL-1-signalering är väsentlig. Brist på signalväg IL-1-receptor (IL-1R) minskar signifikant både IL-23 och IMQ-inducerad hudinflammation. Dessa resultat visar vikten av IL-1p vid reglering av proliferation och IL-17-produktion genom olika undergrupper av dermala yTT-celler vid samspel med IL-23, vilket innebär en ny mekanism som kan vara involverad i hudinflammation.

Resultat

Dermal γδT-cellutveckling hos möss före och efter födseln

För att undersöka utvecklingen av dermala yTT-celler användes hudvävnader från embryonala eller nyfödda valpar för att spåra dermala yTT-cellers utseende. yTCTC hi epidermala yTT-celler sågs lätt på E20 och dag 1 (kompletterande fig. la och fig. la), i överensstämmelse med en tidigare rapport 9 . Däremot var yTCTC int dermala yTT-celler knappa på E20 eller dag 1. Dermala yTT-celler blev uppenbara på dag 3 och hade samma frekvens som vuxna möss på dag 14 (fig. La). Därefter undersökte vi TCR-repertoaren för att utveckla dermala yTT-celler. TCR-repertoar av dermala yTT-celler på dagarna 3-5 visade nästan exklusiv Vy6 (fig. 1b). Dermal Vy4 blev synlig på dag 7. Hos vuxna möss uttryckte dermala yTT-celler TCR: er som huvudsakligen innehöll V6 och Vy4 (fig. 1b). Däremot visade TCR-repertoar av tymiska yTT-celler på dagarna 1-3 att Vy1, Vy4 och Vy6 medan Vy6 gradvis minskade under tiden (Fig. 1b). Jämförelsestudier sida vid sida indikerade att V1 och Vy4 var de dominerande yTT-cellerna i BM. Ki-67-färgning antydde att både dermal Vy6- och Vy4-T-celler hade en signifikant mer homeostatisk proliferation vid tidiga dagar och sedan bibehöll lägre proliferationsgrad hos vuxna möss (fig. 1c). Dessutom kunde dermala yTT-celler producera IL-17 (fig. 1d). Vi undersökte också yTT-celler i lungan. Lung yTT-celler var synliga på E20 och innehöll både Vy6 och Vy4. I motsats till dermala yTT-celler var V66-T-celler mer än Vy4 i lungan även efter födseln och i vuxna möss (kompletterande figur Ib). Sammantaget antyder dessa resultat att dermala yTT-celler migrerar in i huden före födseln och expanderas ytterligare efter födseln med en mer diversifierad TCR-repertoar.

( a ) Suspension av hela hudceller framställda från C57Bl / 6 WT-möss vid olika dagar ( n = 3–5) efter födseln färgades med CD3 och yTCTCR, och frekvensen för yTTCR int dermala yTT-celler analyserades med flödescytometri. Flödesdiagram som är grindade på CD3 + -celler är representativa för tre oberoende experiment med liknande resultat. ( b ) Tymocyter (Thy), hela hudceller och BM-celler från olika dagar efter födseln färgades med CD3, yTCTCR och V (Vy 1, 4, 6) mAbs. Procentsatser av Vyl-, Vy4- och V66-yTT-celler analyserades med flödescytometri och sammanfattades i cirkeldiagram. ( c ) Procentandelar av Ki-67-expression på dermal Vy4- och V66-T-celler analyserades med flödescytometri. Cellerna gatedes på CD3 int yTTCR int Vy4 + eller Vy6 + celler. Data visas som medelvärde ± sem ( d ) Hela hudceller stimulerades med phorbol-myristatacetat (PMA) plus jonomycin under 5 timmar, och procenttalet av IL-17-producerande yTT-celler gated på CD3 int- yTCTC int- celler analyserades med flödescytometri. Data visas som medelvärde ± sem

Bild i full storlek

Fostertymus krävs för dermal yTT-cellutveckling

Därefter undersökte vi om utveckling av dermala yTT-celler begränsades till fostrets tymus. För detta ändamål transplanterade vi BM-celler eller BM-celler plus neonatala tymocyter från vildtyp (WT) C57Bl / 6-möss (CD45.2) i CD45.1-kongen SJL-möss. Möss transplanterade med BM-celler enbart hade signifikant lägre dermala yTT-celler jämfört med möss transplanterade med BM plus neonatala tymocyter (fig. 2a). Hos möss transplanterade med BM enbart var majoriteten av CCR6 + dermala yTT-celler värdinvesterande, medan ∼ 15% var givarens ursprung. Dermala yTT-celler från båda källorna kunde utsöndra IL-17 (fig. 2b). Däremot transplanterades möss med BM plus nyfödda tymocyter, nästan alla dermala yTT-celler var av givarurs ursprung (Fig. 2b). För att ytterligare bekräfta att BM-celler innehåller föregångare för dermala yTT-celler användes TCRδ-bristfälliga möss som värd för att ta emot BM-celler från SJL-möss. I själva verket kan dermala yTT-celler rekonstitueras från givar BM och kunde utsöndra IL-17 (fig. 2c). För att bestämma om tymusen krävs för dermal yTT-cellutveckling undersökte vi dermala yTT-celler i atymiska nakna möss. Som visas i tilläggsfiguren 2, saknade dermala yTT-celler i naken mushud. Dessutom var yTT-celler i BM knappast. Vi transplanterade sedan BM-celler från CD45.1 SJL-möss till CD45.2 nakna eller WT-möss. I överensstämmelse med fig. 2a rekonstituerades dermala yTT-celler i både WT- och nakna möss, och dessa celler kunde utsöndra IL-17 (fig. 2d). Dermala yTT-celler expanderades signifikant i nakna möss jämfört med dem i WT-mottagare (fig. 2d). Ytterligare TCR-användningsanalys indikerade att Vy4 och Vy1 var dominerande i WT-möss, medan nakna möss rekonstituerade med WT BM uteslutande hade Vy4. Ingen Vy6 observerades (Fig. 2d).

BM-celler eller BM-celler plus neonatala tymocyter (BM + neo Thy) från C57Bl / 6 WT-möss (CD45.2) transplanterades i dödligt bestrålade SJL-möss (CD45.1, n = 4-5). ( a ) Åtta veckor efter rekonstitution analyserades procenttal dermala yTT-celler gated på CD3 + -celler från mottagarmöss genom flödescytometri och total frekvens av dermala yTT-celler sammanfattades. Data visas som medelvärde ± sem * P <0, 05 (oparad studentens t- test). ( b ) Hela hudceller stimulerades med PMA plus ionomycin under 5 timmar. CCR6 + och IL-17 + CD3 int yTTCR int- celler analyserades med flödescytometri. Flödesplottar gatedes på CD3 int y -TCR int- celler. Procentsatser av dermala yTT-celler från givare visas som medelvärde ± sem * P <0, 05 (oparad Student's t- test). Graden av chimerism av CCR6 + och IL-17-producerande dermala yTT-celler visas också som öppna staplar (donator) och fyllda staplar (värd). Data är representativa för minst tre oberoende experiment med liknande resultat. ( c ) BM-celler från SJL-möss (CD45.1) transplanterades i dödligt bestrålade TCR 5 KO-möss (CD45.2). Efter 8 veckors rekonstitution analyserades CCR6 + och IL-17-producerande dermala yTT-celler med flödescytometri. Flödesdiagram som är grindade på CD3 + yδTCR + -celler är representativa för två oberoende experiment med liknande resultat. ( d ) BM-celler från SJL-möss (CD45.1) transplanterades i dödligt bestrålade C57Bl / 6 WT-möss eller nakna möss (CD45.2). Efter 8 veckors rekonstitution detekterades procenttal dermala yTT-celler gated på CD3 + -celler genom flödescytometri. Vidare analyserades CCR6-expression och Vy-användning (V1, 4, 6) av dermala y T-celler och intracellulär IL-17 med dermala yTT-celler efter PMA plus jonomycinstimulering med flödescytometri. Flödesplottar gatedes på CD3 int y -TCR int- celler. ( e, f ) Tymocyter från C57Bl / 6 WT neonatala ( e ) eller E18 ( f ) valpar plus BM-celler från TCRδ KO-möss transplanterades i dödligt bestrålade SJL-möss. Efter 8 veckors rekonstitution analyserades CCR6-expression och Vy-användning (Vy1, 4, 6) av dermala yTT-celler och intracellulär IL-17 efter PMA plus jonomycinstimulering med flödescytometri. Flödesplottar gatedes på CD3 int y -TCR int- celler.

Bild i full storlek

Eftersom dermala yTT-celler består av både Vy4- och Vy6 TCR-repertoar i vuxna möss, resonerade vi om dermala Vy6-T-celler var från fostertymus. För att utesluta prekursorer för dermala yTT-celler från BM blandades BM-celler från TCRδ-bristfälliga möss med neonatala tymocyter (fig. 2e). Dermala yTT-celler var nästan alla givars ursprung och uttryckte övervägande Vy6. Eftersom tidigare studie visade att IL-17-producerande yTT-celler utvecklas från embryonisk tymus 11, använde vi vidare E18-embryonala tymocyter för rekonstitution. Liknande som neonatala tymocyter, visade dermala yTT-celler från E18-tymocyter uteslutande givarens ursprung och var kapabla att producera IL-17 och uttryckte övervägande Vy6 (Fig. 2f). Dessa data antyder att IL-17-producerande dermala yTT-celler kan rekonstitueras från både fetal tymus och vuxen BM med olika TCR-repertoar, och tymus krävs absolut för dermal yTT-cellutveckling.

Thymic Vγ4 kräver extratymisk miljö för hudhemning

E18 och neonatala tymocyter innehåller både V4- och V66-uttryckande yTT-celler med liknande frekvens (Fig. 1b). Möss transplanterade med E18 eller fostertymocyter hade emellertid exklusiv Vy6-T-cellrekonstitution, medan majoriteten av Vy4T-celler rekonstituerades från BM (Fig. 2). För att ytterligare validera detta sorterade vi Vy4- eller Vy6-T-celler från neonatala tymocyter (CD45.2) och blandades med BM-celler (CD45.1) som en källa till BM Vy4. TCRδ-bristfälliga möss användes som mottagarmöss. Förhållandet Vy4 från båda källorna var ungefär 1: 1 såväl som Vy6 till Vy4 (fig. 3a). Såsom visas i fig. 3b hade möss transplanterade med Vy4 från neonatal tymus plus BM-celler dermala yTT-celler som uttryckte Vy4, främst från BM (> 80%). Däremot hade möss transplanterade med neonatal Vy6 plus BM-celler dermala yTT-celler som uttryckte V6, exklusivt från neonatal tymus (Fig. 3b). Både Vy4- och Vy6-T-celler kunde utsöndra IL-17 (fig. 3b). Dessa data antyder att V4- och V6-dermala yTT-celler kan ha ett differentiellt utvecklingsbehov.

( a, b ) Sorterade Vy4- eller V6-neonatala tymocyter (Thy) från C57Bl / 6 WT-möss (CD45.2) blandade med BM-celler från SJL-möss (CD45.1) överfördes till dödligt bestrålade TCRδ KO-möss ( n = 3– 5). Förhållandet mellan Vy4 från båda källorna var omkring 1: 1 såväl som Vy6 till Vy4 (baserat på Vy4-frekvensen i BM). Efter 8 veckors rekonstitution bestämdes totala dermala yTT-celler ( a ) och källorna för Vy4- eller V66T-celler såväl som intracellulär IL-17 med PMA plus jonomycin ( b ) med flödescytometri. Flödesplaner gatedes på CD3 + yCTCR + celler. ( c, d ) CD24 ( c ) och CCR6 ( d ) -uttryck med V4- eller V66-celler på neonatala Thy, vuxna Thy, BM-celler (Day16) och vuxna BM-celler bestämdes med flödescytometri. Flödesdiagram gated på CD3 + yδTCR + -celler är representativa för tre oberoende experiment med liknande resultat. ( e, f ) Hela hudceller ( e ) eller BM-celler ( f ) från C57Bl / 6 WT-möss eller CCR6KO-möss ( n = 3) färgades med CD3, yTCTCR, V4 och V6. Procentandelar av totala dermala yTT-celler samt dermala Vy4- och Vy6-celler eller BM Vy4-celler analyserades med flödescytometri. Data visas som medelvärde ± sem och är representativa för tre oberoende experiment med liknande resultat. * P <0, 05 (oparad studentens t- test).

Bild i full storlek

För att få insikt i denna skillnad undersökte vi mognadsstatus för Vy4- och Vy6-T-celler i tymus och BM. Såsom visas i fig. 3c hade nästan alla Vy6-T-celler i neonatal tymus mogen fenotyp (CD24 lo ). Däremot var de flesta Vy4 T-celler omogna (CD24 hi ) i neonatal eller vuxen tymus. Detta överensstämde med CD44 CD62L-färgningsmönster där majoriteten av Vy6-T-celler i E20 eller neonatalstadium var CD44 hi CD62L- lo medan de flesta Vy4-T-celler var CD44 lo (kompletterande fig. 3a). Påfallande var Vy4 T-celler från BM nästan alla mogna (CD24 lo ) (fig. 3c), vilket antyder att Vy4 T-celler kan kräva extratymisk miljö för mognad. För att utesluta möjligheten att Vy4 T-celler kan ha försenat mognad i tymusen som tidigare rapporterats 13, använde vi tymocyter från olika åldrar av möss som sträckte sig från dag 2 till 17 för dermala yTT-rekonstitutionsstudier. I överensstämmelse med tidigare resultat (Fig. 1b) minskade V6 gradvis i tymusen efter födseln och var knapp på dag 17 (Kompletterande Fig. 4a). Mogna Vy4 T-celler ökade verkligen med tiden och nådde en topp vid dag 5 och minskade sedan, vilket är förenligt med en tidigare studie 13 . Förhållandena mellan mognad Vy4 och Vy6 var 1: 5 på dag 2, 1: 1 på dag 4, 4: 1 på dag 5. På dag 17 hittades nästan ingen Vy6 i tymusen (kompletterande figur 4a). Efter 8 veckors rekonstitution undersökte vi γδT-cellkomposition. Dermala yTT-celler rekonstituerades fullständigt med tymocyter från dagarna 2–5 möss (kompletterande figur 4b). V66-T-celler var dominerande yTT-celler i huden, även om dermala Vy4-T-celler ökade med användning av tymocyter från möss dag 5. Detta var emellertid inte jämförbart med förhållandet mellan mogna Vy4 kontra V6 i tymus från dag 5-möss (4: 1). Både Vy4 och Vy6 var kapabla att producera IL-17 (kompletterande figur 4c). De obalanserade förhållandena mellan V6 och Vy4 visades också i lungan men mindre slående i perifert blod, LN och mjälte. Vy4 och Vy6 var nästan i förhållandet 1: 1 i perifert blod och LN med användning av tymocyter från möss från dag 5 (kompletterande figur 4d). Dermala yTT-celler rekonstituerades dåligt med användning av tymocyter från möss dag 17, som huvudsakligen utgjorde Vy4. Sammantaget antyder dessa data att tymiska Vy4-T-celler kan kräva en extratymisk miljö för att intrycka deras hud-homingegenskaper, och att tymiska Vy6-T-celler kan vara mer konkurrenskraftiga än Vy4 för dermala yTT-celler rekonstitution.

Vi undersökte också CCR6-expression på Vy4 T-celler eftersom dermala yTT-celler konstitutivt uttrycker CCR6 (ref. 4). Vy4 T-celler från neonatal tymus hade nästan inget CCR6-uttryck, medan Vy6 T-celler uttryckte en märkbar nivå av CCR6 (fig. 3d och kompletterande fig. 3b). Dessutom uttryckte 15% av Vy4-T-celler från BM CCR6 (fig. 3d), vilket antyder att BM Vy4-T-celler kan ha fått uttryck för hudhemande receptor. Längs denna linje var dermala Vy4-T-celler signifikant lägre i CCR6-bristande möss men inte i CCR10-bristfälliga möss jämfört med de från WT-möss (fig. 3e och kompletterande fig. 3c), även om den totala dermala yTT-cellfrekvensen inte förändrades. Dessutom förändrades inte andelen Vy4 T-celler i BM, LN eller mjälte signifikant mellan WT- och CCR6KO-möss (fig. 3f och kompletterande fig. 3d), vilket antyder att CCR6 inte är nödvändigt för handel med Vy4 T-celler från fostertymus till BM, LN eller mjälte men är avgörande för deras hem till huden.

Möss med dominerande Vy6-T-celler utvecklar hudinflammation

Vi har tidigare visat att dermala yTT-celler är kritiska för hudinflammation såsom psoriasis 4 . Möss som saknade Vy4 IL-17T-celler hade signifikant mindre epidermal förtjockning och neutrofil infiltration 13 . För att bestämma om Vγ6 T-celler också har en roll i hudinflammation, använde vi möss rekonstituerade med neonatala tymocyter plus BM-celler, som främst uttrycker Vy6 T-celler, för IMQ topisk behandling. Möss rekonstituerade med BM enbart innehållande huvudsakligen V4 användes som kontroll. I överensstämmelse med det föregående experimentet (Fig. 2a) hade möss rekonstituerade med neonatala tymocyter plus BM-celler tre gånger mer dermala yTT-celler än möss som rekonstituerats med BM enbart (Fig. 4a). Trots lägre frekvens av dermala yTT-celler i enbart rekonstituerade BM-möss, visade histologisk analys liknande nivåer av epidermal förtjockning (akantos) i båda grupperna (Fig. 4b). Daglig applicering av IMQ på rygghuden ökade signifikant neutrofilfiltrering och mRNA-nivåer av IL-17 och IL-22 i båda grupperna (Fig. 4c). Dessutom var frekvenserna för IL-17-producerande dermala yTT-celler också liknande (fig. 4d). För att specifikt demonstrera huruvida Vy6 T-celler kan inducera hudinflammation, sorterade vi V66 från neonatala tymocyter och överfördes tillsammans med BM-celler från TCRδ - / - möss till TCRδ - / - möss för att eliminera alla bosatta dermala yTT-celler eller γδT-celler från BM-celler (kompletterande figur 5a). De rekonstituerade mössa uttryckte exklusiv V6 och utvecklade svår hudinflammation vid topisk IMQ-behandling. Epidermal tjocklek och neutrofil infiltration ökades signifikant jämfört med TCRδ - / - möss (kompletterande figur 5b, c). Dessutom ökade mRNA-nivåerna av IL-17 och IL-22 också signifikant (kompletterande figur 5d). Sammantaget antyder dessa fynd att dermala Vy6-T-celler är patogena och kan inducera psoriasisliknande dermatit. Vy4 T-celler kan emellertid vara mer benägna att inducera hudinflammation eftersom rekonstituerade möss som uttrycker Vy4 utvecklar liknande sjukdomstorlek med signifikant färre totala dermala yTT-celler.

( a ) BM-celler eller BM-celler plus nyfödda tymocyter (BM + Thy) från C57Bl / 6 WT-möss (CD45.2) transplanterades i dödligt bestrålade SJL-möss (CD45.1, n = 5). Efter 8 veckors rekonstitution detekterades frekvensen av dermala yTT-celler genom flödescytometri. Möss som får BM-celler enbart huvudsakligen rekonstituerade Vy4, medan möss som fick BM plus nyfödda tymocyter främst rekonstituerade V6. ( b ) Rekonstituerade möss behandlades dagligen under 5 dagar med IMQ eller kontrollkräm (kontroll). Representativa H & E-färgade sektioner visas och epidermaltjockleken mättes på dag 5. Skalstång, 100 um. Data visas som medelvärde ± sem ** P <0, 01, *** P <0, 001 (oparad studentens t- test). ( c ) Procentandel av CD45 + Gr-1 + celler efter IMQ-behandling analyserades med flödescytometri. IL-17 och IL-22 mRNA-nivåer mättes med qPCR. Data visas som medelvärde ± sem * P <0, 05 (oparad studentens t- test). ( d ) Intracellulär IL-17-produktion av hud dermala yTT-celler från IMQ-behandlade eller kontrollmöss bestämdes med flödescytometri (utan stimulering). Flödesplaner gatedes på CD3 + -celler. Data visas som medelvärde ± sem * P <0, 05 (oparad studentens t- test). ( e ) C57Bl / 6 WT-möss ( n = 5-6) behandlades dagligen under 5 dagar med IMQ eller kontrollkräm (kontroll). Procentandelar av CD45 + Gr-1 + -celler, totala dermala yTT-celler, dermala Vy4- och Vy6-celler analyserades med flödescytometri. Data visas som medelvärde ± sem och är representativa för två oberoende experiment med liknande resultat. ** P <0, 01 (oparad studentens t- test). ( f, g ) Ki-67-expression ( f ) och intracellulär IL-17-produktion ( g ) med dermala Vy4- och Vy6-celler bestämdes med flödescytometri (utan stimulering). Flödesplottar gatedes på CD3 int y -TCR int- celler. Data visas som medelvärde ± sem och är representativa för två oberoende experiment med liknande resultat. * P <0, 05, ** P <0, 01 (oparad studentens t- test).

Bild i full storlek

Normala naiva möss har liknande frekvenser av dermala V6- och Vy4-T-celler. Vi försökte bestämma om dermala Vy4- och Vy6-T-celler svarar på IMQ på olika sätt hos naiva möss. Som förväntat utvecklade möss applicerade med IMQ-kräm massiv neutrofil infiltration (Fig. 4e). Totala dermala yTT-celler ökades också. Bland dem expanderades dermala Vy4-T-celler företrädesvis jämfört med Vy6 (fig. 4e). Ki-67-färgning indikerade att Vy4 hade signifikant mer spridning än Vy6 (fig. 4f). För att bedöma IL-17-produktion med dermala yTT-celler ex vivo digererades hudvävnader och färgades intracellulärt för IL-17. Både Vy4- och Vy6-dermala T-celler producerade IL-17. Emellertid producerade Vy4 T-celler signifikant mer IL-17 än Vy6 T-celler (fig. 4g). Således verkar dermala Vy4-T-celler ha en mer kritisk roll jämfört med Vy6-T-celler i IMQ-inducerad psoriasisliknande dermatit.

IL-23 och IL-1p reglerar på olika sätt dermal Vy4 och Vy6

Vi anför att skillnaderna på IMQ med dermal Vy4- och Vy6-T-celler kan bero på cytokinregler, eftersom den IMQ-inducerade psoriasisliknande dermatitmodellen är beroende av IL-23 / IL-17-vägen 20 . För att bestämma IL-23- och IL-lp-rollens roll i regleringen av dermala yTT-celler märktes hel-hudceller med karboxifluoresceinsuccinimidylester (CFSE) och stimulerades med IL-23, IL-1p eller IL-23 plus IL- 1β. IL-23 ensam eller IL-lp enbart kunde driva dermal yTT-cellproliferation (fig. 5a). Kombination av IL-23 och IL-1p ökade inte signifikant dermal yTT-cellproliferation. Däremot inducerades IL-17-produktion till stor del vid IL-23-stimulering av både prolifererade och oprolifererade dermala yTT-celler. IL-1p enbart inducerade minimal IL-17-produktion. Kombinerat IL-1p med IL-23 förbättrade IL-17-produktionen signifikant. Dessutom fann vi att antingen IL-23 eller IL-1β kunde stimulera Vy4- och Vy6-proliferation. Påfallande producerade dermala Vy4-T-celler signifikant mer IL-17 än V66-T-celler vid IL-23 eller IL-23 plus IL-lp-stimulering (fig. 5b).

( a, b ) Suspension av hela hudceller märktes med CFSE och stimulerades sedan med IL-23, IL-1p eller IL-23 plus IL-1P under 3 dagar. CFSE-utspädning och intracellulär IL-17-produktion med dermala yTT-celler ( a ) eller dermala Vy4- och Vy6-yTT-celler ( b ) bestämdes med flödescytometri. Flödesdiagram som är grindade på CD3- int- yRTCR- int- celler är representativa för minst tre oberoende experiment med liknande resultat. Data visas som medelvärde ± sem ( n = 10). ** P <0, 01, *** P <0, 001 (oparad studentens t- test). ( c ) Suspension av hela hudceller märktes med CFSE och stimulerades sedan med IL-23, IL-1p, IL-23 plus anti-mus IL-1p, IL-1p plus anti-mus IL-23 eller isotypkontroll-mAb i WT-möss i 3 dagar. CFSE-utspädning och intracellulär IL-17-produktion med dermala yTT-celler bestämdes med flödescytometri. Flödesdiagram som är grindade på CD3- int- yRTCR- int- celler är representativa för minst tre oberoende experiment med liknande resultat. Sammanfattade data ( n = 8–9) visas som medelvärde ± sem * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 (oparad studentens t- test). ( d, e ) Suspension av hela hudceller från IL-1RI KO-möss märkta med CFSE stimulerades med IL-23 under 3 dagar. CFSE-utspädning och intracellulär IL-17-produktion med dermala yTT-celler ( d ) eller dermal Vy4- och Vy6-yTT-celler ( e ) bestämdes med flödescytometri. Flödesdiagram som är grindade på CD3- int- yRTCR- int- celler är representativa för minst tre oberoende experiment med liknande resultat. Data visas som medelvärde ± sem ( n = 8-9). ** P <0, 01, *** P <0, 001 (oparad studentens t- test).

Bild i full storlek

Hela hudceller innehåller endogent IL-1β förmodligen producerat av hudresidenterade celler 21, 22 . Därefter bestämde vi om proliferationen av dermala yTT-celler inducerade av IL-23 är beroende av IL-1p och omvänt om IL-1p-inducerad yTT-cellproliferation är beroende av IL-23. Med användning av neutraliserande monoklonala antikroppar (mAbs) mot IL-23 och IL-1β och motsvarande isotypkontroll-mAbs, fann vi att proliferationen och IL-17-produktionen av dermala yTT-celler som svar på IL-23-stimulering minskade signifikant vid blockering av endogen IL- 1p (fig. 5c). Däremot påverkades inte IL-1P-inducerad dermal yTT-cellproliferation och IL-17-produktion inte signifikant av IL-23 (Fig. 5c). Således verkar IL-1P vara kritisk i både dermal yTT-cellproliferation och IL-17-produktion inducerad av IL-23.

Därefter använde vi IL-1RI knockout (KO) -möss för att undersöka den reglerande rollen för IL-1p i dermala yTT-celler. Det fanns en signifikant lägre basal nivå av prolifererade dermala yTT-celler i IL-1RI KO-möss jämfört med WT-möss (fig. 5d). Dermal yTT-cellproliferation observerades fortfarande vid IL-23-stimulering i IL-1RI KO-möss, även om den totala nivån var signifikant lägre än WT-möss (Fig. 5d). IL-17-produktion upphävdes fullständigt i IL-1RI KO-möss. Ytterligare dermala yTT-cellundersökningsstudier indikerade att dermal Vy6 men inte Vy4 T-celler hade IL-23-inducerad proliferation oberoende av IL-1p-signalering (fig. 5e). IL-17-produktion med dermal Vy4 och Vy6 krävde emellertid både IL-1R-signalering. Således har IL-23-inducerad dermal Vy6 T-cellproliferation både IL-lp-beroende och -beroende vägar. IL-1p-signalering är emellertid väsentlig för IL-23-inducerad dermal yTT-cell IL-17-produktion.

IL-1p stimulerar KC: er för kemokinproduktion

IL-1p har identifierats som ett viktigt inflammatoriskt cytokin i patogenesen av kutan inflammation inklusive psoriasis 23 . Förhöjda IL-1p-nivåer rapporterades i psoriatiska hudskador 24 . För att ytterligare avgränsa IL-1P: s roll vid KC-aktivering behandlade vi primära murina KC-celler med IL-1p och fann att mRNA-nivåerna av kemokiner inklusive CCL2, CCL5, CCL20, CXCL9 och CXCL10 ökades (fig. 6a), vilket antyder att IL-1p kan modulera dermal yTT-cellhandel. CCL20-CCR6-axeln har varit inblandad i dermal yTT-cellhandel och psoriasispatogenes 25, 26 . För att undersöka om γδT-celler kunde migrera från perifera lymfoida organ till dermis utöver redan etablerade bosatta γδT-celler, sorterade vi γδT-celler från mjälte och LN och överförde dem sedan adoptivt till SJL-möss. Såsom visas i fig. 6b migrerade yTT-celler till dermis och uttryckte CCR6. yTT-celler från möss med CCR6-brist hade signifikant lägre frekvens i dermis, vilket tyder på att CCR6 är kritisk vid perifera yTT-cellhandel med huden. Dessutom observerades ingen skillnad i andra anatomiska ställen (Fig. 6b).

( a ) Primärt murint KC stimulerades med IL-1p under 6 timmar. CCL2, CCL5, CCL20, CXCL9 och CXCL10 mRNA-nivåer mättes med qPCR. Figuren visar vikförändringar som är normaliserade för ß-MG mRNA kontra medium enbart. Data visas som medelvärde ± sem ( b ) Sorterade yTT-celler från mjälte och LN från C57Bl / 6 WT-möss eller CCR6KO-möss överfördes adoptivt till SJL-möss ( n = 4). Efter 5–7 dagar färgades celler från hud, perifert blod, LN och mjälte med CD3, γδ TCR och CCR6. Frekvensen för totala yTT-celler och CCR6 + yδT-celler från donator (CD45.2) bestämdes med flödescytometri. Flödesplottar gatedes på hud CD3 int y -TCR int- celler. Data visas som medelvärde ± sem ** P <0, 01, NS, inte signifikant (oparad studentens t- test).

Bild i full storlek

IL-1R-signalering är avgörande för hudinflammation

Därefter undersökte vi om IL-1ß är involverad i hudinflammation, såsom psoriasis. Såsom tidigare rapporterats inducerar både IL-23 dermal injektion och IMQ human psoriasisliknande hudinflammation och patologi 20, 27 . Epidermal hyperplasi och neutrofil infiltration inducerad av IMQ eller IL-23 minskade markant i IL-1RI KO-möss jämfört med WT-möss (fig. 7a och kompletterande fig. 6a). Dessutom minskade mRNA-nivåerna för IL-17 och IL-22 också signifikant i IL-1RI KO-möss (fig. 7b och kompletterande fig. 6b). Ytterligare analys av IL-17-producerande dermala yTT-celler från behandlade och obehandlade hudvävnader indikerade att basnivåerna för IL-17-producerande dermala yTT-celler var signifikant lägre i IL-1R KO-möss jämfört med de i WT-möss (fig. 7c och kompletterande figur 6c). Vid IL-23- eller IMQ-behandling utsöndrade dermala yTT-celler stora mängder IL-17 i WT-möss och IL-17-nivåer var signifikant mer i WT-möss jämfört med IL-1RI KO-möss (fig. 7c och kompletterande fig. 6c ). Sammantaget antyder dessa data att IL-1RI-uttryck är kritiskt för både IL-23 och IMQ-inducerad hudinflammation och akantos.

( a ) C57Bl / 6 WT och IL-1RI KO-möss ( n = 6-8) behandlades dagligen under 5 dagar med IMQ eller kontrollkräm (kontroll). Representativa H & E-färgade sektioner och frysta sektioner färgade med Gr-1 visas. Gr-1-positiva celler är bruna. Hudvävnader färgades också med CD45 och Gr-1 bedömdes med flödescytometri. Epidermal tjocklek och procentandel av CD45 + Gr-1 + celler mättes på dag 5. Skalstång, 100 um. Data visas som medelvärde ± sem ** P <0, 01, *** P <0, 001 (oparad studentens t- test). ( b ) IL-17, IL-22 och IL-6 mRNA-nivåer mättes med qPCR. Figuren visar vikförändringar normaliserade för ß-MG mRNA kontra kontrollhud från WT-möss. Data visas som medelvärde ± sem * P <0, 05, ** P <0, 01 (oparad studentens t- test). ( c ) Intracellulär IL-17-produktion med dermala yTT-celler med eller utan PMA plus jonomycinstimulering bestämdes med flödescytometri. Flödesplaner gatedes på CD3 + -celler. Data visas som medelvärde ± sem * P <0, 05, *** P <0, 001 (oparad studentens t- test).

Bild i full storlek

Diskussion

I denna studie undersöker vi dermal yTT-cellutveckling och upptäcker att dessa celler är knappa på E20- och nyfödda valpar men blir uppenbara vid dag 3. De uttrycker övervägande Vy6 TCR, vilket antyder att Vy6 T-celler är bona fide bosatta dermala yTT-celler. Efter födseln genomgår dermala yTT-celler hemostatisk spridning med diversifierad TCR-repertoar. Vγ4 T-celler ökar gradvis med tiden i dermis. Denna slående ontogeniprofil kan innebära differentiella funktioner för dermala yTT-celler med en distinkt TCR-repertoar. Detta står också i skarp kontrast med lunga-TT-celler, som förekommer på E20 och upprätthåller liknande förhållanden mellan V4 och V6 i olika åldrar av möss. Intressant nog förekommer konventionella aTT-celler på ett betydligt försenat sätt, vilket antyder att ett av de primära bidragen från dermala yTT-celler är neonatal hudskydd.

Tidigare studier antyder att DETC: er eller medfödda liknande CD27 - IL-17-producerande celler inte kan genereras från BM 28 . Det är emellertid inte definitivt om dermala yTT-celler kan rekonstitueras av BM-celler 5, 6, 11, 13 . Vår studie visar tydligt att dermala yTT-celler kan rekonstitueras från BM, även om tymus absolut krävs. Detta antyder att föregångarna till dermala yTT-celler i BM antagligen återcirkuleras från tymusen. Prekursorerna för dermala yTT-celler i BM innehåller huvudsakligen Vy4 och Vy1 men inte Vy6. Som visas i vår studie, kan Vy6 T-celler direkt rekonstitueras från fostertymus. Det verkar som att denna extra omväg för tymiska Vy4 T-celler är att få hudhummaegenskaper. Det är möjligt att överförda neonatala tymiska Vy4-T-celler kan kräva en längre tid för hudsådd jämfört med vuxen BM Vy4. Med användning av tymocyter från olika åldrar av möss visade vi att mogna Vy4-T-celler ökas signifikant och är mer än mogna Vy6-T-celler i tymusen från dag 5-möss. V66-T-celler är dock fortfarande de dominerande dermala yTT-cellerna i de rekonstituerade mössen. Detta skiljer sig från γδT-cellkompositionen i perifert blod och LN, vilket antyder att tymiska Vy4-T-celler behöver extratymisk miljö för att trycka in sina hudhemningsegenskaper, såsom att få en aktiverad status eller CCR6-uttryck som möjliggör dem hem till huden eller platser för inflammation. Det antyder också att tymiska V66-T-celler kan vara mer konkurrenskraftiga än Vy4 för dermal yTT-cellrekonstitution. Även om det är oklart vilken faktor (er) som stimulerar tymiska egressionade Vy4-T-celler för avtryck av deras hudförmåga, är det tänkbart att Ag-stimulering kan vara en av drivkrafterna för deras mognad och funktionella kompetens. En ny studie visade faktiskt att yTT-celler känner igen en mikrobiell kodad B-cell Ag för aktivering och IL-17-produktion 29 . Dessa distinkta utvecklingsbehov mellan dermala Vy4- och V66-T-celler stöds också av två nya studier som visar deras differentiella transkriptionsfaktorer för programmering såsom SOX4 respektive SOX13, 13, 14 . Det föreslås sålunda att dermala yTT-celler innehåller bona fide- bosatta Vy6-T-celler som är icke-migrerande, mogna yTT-celler med IL-17-producerande förmåga och är den viktigaste kraften i nätverket av neonatal hudimmunövervakning. Däremot är dermala Vy4-T-celler, som kräver extratymisk miljö för att trycka in sina hudhemningsegenskaper, troligen migrerande och de inducerbara IL-17-producerande cellerna. Vy4 T-celler kan vara Ag-specifika och producera stora mängder IL-17 i närvaro av TCR-ingrepp, varigenom försvarar IL-17-svaret i inflammation 30 .

Dermala Vy4- och Vy6-T-celler använder också differentiella kemokinreceptorer för deras hudhemning. Brist på CCR6 eller CCR10 enbart förändrar inte den dermala Vy6-T-cellmigrationen. Dermal Vy4-T-celler är emellertid signifikant lägre i möss med CCR6-brist men inte i möss med CCR10-brist. CCR6 är avgörande för Vy4 T-celler i BM som hyser huden men är inte nödvändig för Vy4 tymisk egress, eftersom frekvenserna för Vy4 T-celler i BM hos WT- eller CCR6 KO-möss är liknande. Även om V4- och V66-dermala yTT-celler har differentiellt utvecklingsbehov, verkar det som om båda delmängderna är funktionella kompetenta när det gäller IL-17-produktion och induktion av psoriasisliknande hudinflammation. Detta skiljer sig från tidigare studier med Sox13-bristande möss eller Sox13 spontana mutantmöss 13, 14 . Diskrepansen kan uppstå från den totala frekvensen för dermala yTT-celler. IL-17-producerande Vy4T-celler är selektivt bristfälliga i Sox13-muterade möss 13 och T-Sox4-bristfälliga möss 14, vilket leder till reducerad hudinflammation. I vår studie har möss transplanterade med fostertymus eller sorterade Vy6 från nyfödda tymocyter exklusivt IL-17-producerande Vy6 T-celler med den totala frekvensen som liknar WT-möss och utvecklar svår hudinflammation vid IMQ-behandling. Således verkar det som om de olika resultaten delvis kan bero på mängden totala IL-17-producerande yTT-celler i dermis. I naiva möss där både dermal Vy4- och Vy6-T-celler finns existerar emellertid Vy4-T-celler företrädesvis och är de största IL-17-producenterna vid IMQ-topisk behandling, vilket antyder att ett perifert regleringsprogram kan vara annorlunda för dermala Vy4- och Vy6-T-celler .

Även om yTT-celler betraktas som i förväg begagnade funktionella kompetenta celler, är dermala yTT-celler utsatta för perifer regulering. Vi fann att IL-1p och IL-23 båda är i stånd att stimulera Vy4 och Vy6 T-cellproliferation. IL-23-stimulerad dermal yTT-cellproliferation drivs till stor del av IL-1p-signalering men har också en IL-1-oberoende väg, huvudsakligen med Vy6. Det är möjligt att endogena nivåer av IL-18 skulle kunna påverka i samband med IL-23 för att stimulera minimal dermal yTT-cellproliferation i frånvaro av IL-1P, eftersom IL-18 är kritisk vid human y-T-cellutvidgning och är oberoende av IL- 1R signalering 31 . Vi fann också att dermala Vy4-celler är den största IL-17-producenten jämfört med dermal Vy6 vid IL-23 eller IL-23 plus IL-lp-stimulering. Denna in vitro- studie överensstämmer med in vivo IMQ-inducerad psoriasismodell i naiva möss där IL-17-producerande Vy4T-celler expanderas signifikant. Emellertid är den molekylära mekanismen som står för dessa skillnader mellan Vy4 och Vy6 för närvarande inte känd. Både dermal Vy4- och Vy6-T-celler är CD44 hi CD62L lo CD24 lo CD27 - och uttrycker konstitutivt CCR6 och RORyt (kompletterande figur 7). De uttrycker inte NK1.1 eftersom de flesta NK1.1 + γδT-celler producerar IFN-y 32 . IL-23R-expressionsnivån är också låg i båda delmängderna, vilket kan vara relaterat till deras aktiveringsstatus 33 . Tidigare studier identifierar också scavengerreceptor SCART2 uttrycks unikt i IL-17-producerande yTT-celler 15 . Ändå fann vi att IL-1p är väsentlig i både Vy4 och Vy6 T-cell IL-17-produktion. Således är IL-1p inte bara kritiskt vid reglering av dermal yTT-cellutvidgning under inflammatoriska tillstånd, utan är också väsentlig för dermal yTT-celleffektorfunktion.

IL-1p stimulerar också KC att utsöndra många kemokiner inklusive CCR6-ligand CCL20. Eftersom CCL20-uttryck är högre i hudinflammation, såsom psoriasis 34, ökar detta möjligheten att IL-1p-signalering kan vara involverad i dermal yTT-cellhandel via kemokinsekretion. Vi visar att perifera yTT-celler kan handlas in i huden på ett CCR6-beroende sätt. Tidigare studier visar att endast CCR6 + yδT-celler producerar IL-17 (ref. 32). CCR6 + yδT-celler finns också i cerebrospinalvätskan hos patienter med multipel skleros 35 och i andra inflammatoriska tillstånd 36 . CCR6 kan emellertid vara specifik för perifera handel med T4-celler i huden eftersom Vy6 T-celler är minimala i dränerande lymfkörtlar (DLN). Detta bekräftar en ny studie som visar två sätt på Vy4-dermal yTT-cellmigrering från hud till dränerande LN och tillbaka till inflammerad hud 13 . Detta kan också relateras till tidigare studier som visar att CCR6 KO-möss har minskat hudinflammation i en musporiasismodell 25, 37, 38 . IL-1p har också visat sig ha en viktig roll i loppet av kutan inflammation såsom psoriasis 39, 40 . Psoriatiska lesioner har visat sig ha ökat IL-1ß-mRNA-uttryck och caspase-1-aktivering, vilket är ansvarigt för att klyva den inaktiva föregångaren till IL-1p i aktiv form 24, 41 . I själva verket utvecklar möss med överdrivet IL-1p-uttryck eller bristen på IL-1R-antagonist ( Il1rn - / - ) en psoriasisliknande hudinflammation 42, 43, 44 . In contrast, neutrophil infiltration and epidermal thickness are significantly decreased in IL-1RI-deficient mice. This is consistent with the overall significantly decreased IL-17-producing γδT cells in the skin. In addition, mRNA levels of IL-17 and IL-22 in IL-1RI KO mice were significantly lower than WT mice. Although there is still controversy over the treatment of psoriasis patients with IL-1R antagonist, a promising therapeutic efficacy of targeting IL-1 pathway has been reported from a small clinical trial, indicating the importance of IL-1 signalling in the development of human psoriasis 45, 46 .

metoder

Möss

C57Bl/6 WT, B6.SJLWT, TCRd −/− , CCR6 −/− and Il1r1 −/− on C57Bl/6 background (female, 6–8 weeks old) were purchased from Jackson Laboratory. Nude mice (female, 6–8 weeks old) on C57Bl/6 background were purchased from Taconic. CCR10 KO mice were described previously 19 . All animals were housed and treated in accordance with institutional guidelines and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) at the University of Louisville.

Tissue preparation and cell stimulation

Whole-skin cells were prepared from mouse back skin 4 . In brief, skin tissues were digested with a buffer containing collagenase IV, hyaluronidase and DNase I. Skin cells were labelled with CFSE and stimulated with rIL- 23 (1 ng ml −1, eBioscience), rIL-1β (1 ng ml −1, eBioscience) or rIL-23 plus rIL-1β for 3 days. Cell proliferation and intracellular IL-17 were measured by flow cytometry. For blocking experiment, neutralizing mAbs for IL-1β (2 μg ml −1, eBioscience), IL-23 (12.5 μg ml −1, eBioscience) or matched isotype control mAbs were added. In addition, primary mouse KCs (Cellntec) were stimulated with IL-1β for 6 h and RNA were extracted for analysis of chemokine expression by real-time quantitative PCR (qPCR). For γδT cell development study, skin, thymus and BM were taken from pups before (E18 or E20) or after birth.

Flow cytometry analysis and intracellular cytokine staining

Fluorochrome-labelled mAbs including mouse γδTCR (GL3, 1:100), Vγ4 (UC3-10A6, 1:500), Vγ1 (2.11, 1:500), CD24 (M1/69, 1:500), CD27 (LG.3A10, 1:500), CD62L (MEL-14, 1:500) and IL-17A (TC11-18H10.1, 1:500, Biolegend), CD44 (IM7, 1:200), RORγt (AFKJS-9, 1:200), and Ki-67 (SolA15, 1:200, eBioscience), IL-23R (753317, 1:10) and CCR6 (140706, 1:50, R&D Systems) were used. Anti-mouse Vγ6 (17D1, 1:500) was kindly provided by Dr. Tigelaar (Department of Dermatology, Yale University). For intracellular cytokine staining, cells were first blocked with anti-CD16/32 and then stained with different cell surface antibodies (Abs). Cells were then fixed, permeabilized and stained intracellularly for IL-17, RORγt or Ki-67. The relevant isotype control mAbs were also used. Samples were harvested with BD FACS Calibur or Canto (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) and analysed with FlowJo software (TreeStar).

BM chimeras

The BM chimeras were generated as previously reported 5 . In brief, recipient mice were lethally irradiated with 950 cGy and then were intravenously transferred with 5-10 × 10 6 thymocytes. After 24 h, the recipient mice received 5–10 × 10 6 BM cells. In some experiments, the lethally irradiated WT, nude or TCRd −/− mice were transferred with BM cells alone. In addition, sorted Vγ4 or Vγ6 γδT cells from C57Bl/6 neonatal thymocytes mixed with BM cells from SJL mice were transferred into irradiated TCRd −/− mice. In some experiments, sorted Vγ6 cells from neonatal thymocytes plus BM cells from TCRd −/− mice were transferred into irradiated TCRd −/− mice. Neonatal thymocytes used in all experiments were taken from pups born within 48 h. All chimeric mice were allowed to reconstitute for at least 8 weeks before use in experiments.

Peripheral γδT cells trafficking

γδT cells were sorted from LN and spleens from C57Bl/6 or CCR6 −/− mice and then intravenously transferred to SJL mice. After 5–7 days, recipient mice were killed. Peripheral blood, skin, LN and spleen samples were collected for further analysis of the expression of γδT cells from donor by flow cytometry.

Establishment of psoriasis-like mouse models

IL-23-induced psoriasis-like mouse model was established as previously described 27 . In brief, IL-23 (1 μg) or vehicle control was daily intradermally injected on the back skin of WT or Il1r1 −/− mice for 4 days. For IMQ-induced psoriasis-like model 20, WT or Il1r1 −/− mice were applied daily with IMQ cream (5%; Aldara; 3M Pharmaceuticals) for 5 consecutive days. In some experiments, BM chimera mice were also applied with IMQ. Mice were killed and the skin samples were embedded and frozen in (optimal cutting temperature (OCT) for hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC) staining. Skin samples were also excised in TRIzol (Invitrogen) for RNA extraction. Skin cell suspensions were stained for Gr-1 expression and IL-17 production.

Skin histology and IHC staining

Skin sections were stained with H&E and the epidermal thickness was determined by measuring the average interfollicular distance under the microscope in a blinded manner. For IHC staining, skin cryosections were fixed, blocked and stained with rat-anti-mouse Gr-1 mAb (1:50) followed by goat-anti-rat IgG secondary Ab (1:200, Southern Biotech) 4 . Slides were developed with 3-amino-9-ethylcarbazole substrate solution (Vector Laboratories) and counterstained with hematoxylin. Images were acquired at × 200 magnification using Aperio ScanScope digital scanners.

RNA extraction and real-time qPCR

RNAs were isolated using a Qiagen RNeasy kit. After reverse transcription into cDNA, qPCR was performed on Bio-Rad MyiQ single colour real time (RT)–PCR detection system using SYBR Green Supermix (Bio-Rad) and gene-specific primers were listed as follows: all chemokines (Real Time Primers, LLC, Elkins Park, PA, USA); IL-17A (Mm_Il17a_SG, Qiagen); IL-22: 5′-ATACATCGTCAACCGCACCTTT-3′ (forward), 5′-AgCCGGACATCTGTGTTGTTAT-3′ (reverse); IL-6: 5′-GAGAAAAGAGTTCAATGGC-3′ (forward), 5′-CCA GTT TGG TAG CAT CCA TCA T-3′ (reverse). We normalized gene expression level to β-2 microglobulin (β-MG) housekeeping gene and represented data as fold differences by the 2 −ΔΔCt method, where Δ C t=Ct target gene − C t β-MG and ΔΔ C t=Δ C t induced −Δ C t reference .

Statistisk analys

All quantitative data are shown as mean±sem unless otherwise indicated. All samples were compared using two-tailed, unpaired Student's t -test. Ett P- värde <0, 05 ansågs vara signifikant. Statistical analysis was performed with GraphPad Prism software.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande figurer 1-7

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.