Design, syntes och biologisk utvärdering av n-fenylalkylsubstituerade tramadolderivat som nya μ opioidreceptorligander | acta Pharmacologica sinica

Design, syntes och biologisk utvärdering av n-fenylalkylsubstituerade tramadolderivat som nya μ opioidreceptorligander | acta Pharmacologica sinica

Anonim

Abstrakt

Syfte:

Tramadol är en atypisk opioid smärtstillande medel med låg potential för tolerans och beroende. Emellertid är dess opioidaktivitet mycket lägre än klassiska opiater som morfin. Att utveckla nya smärtstillande medel och vidareutforska strukturaktivitetsförhållandet (SAR) för tramadolskelett.

metoder:

Baserat på en tredimensionell (3D) struktursuperimposition och molekylär dockningsstudie fann vi att M1 (den aktiva metabolitten av tramadol) och morfin har vanliga farmakoforeegenskaper och liknande bindningssätt vid μ opioidreceptorn i vilken substituenterna på kväveatomen av båda föreningarna inför en gemensam hydrofob ficka bildad av Trp2936.48 och Tyr3267.43. I denna studie anbringades N-fenetylnormorfin till μ-opioidreceptorn. Det visade sig att den N-substituerade gruppen av N-fenetylnormorfin sträckte sig till en hydrofob ficka bildad av Trp2936.48 och Tyr3267.43. Denna hydrofoba interaktion kan bidra till förbättring av dess opioidaktiviteter jämfört med morfin. Bindningsmoden för M1, morfin och N-fenetylnormorfin överlappade varandra, vilket indikerar att substituenten på kväveatomerna i de tre föreningarna kan anta gemensamma orienteringar. En serie N-fenylalkylderivat från tramadolställningen designades, syntetiserades och analyserades för att generera en ny typ av smärtstillande medel.

Resultat:

Som ett resultat identifierades förening 5b som en aktiv kandidat från dessa föreningar. Vidare studerades bindningssätten för 5b och morfinderivat i μ opioidreceptorn jämförelsevis.

Slutsats:

Till skillnad från morfin-härledda strukturer där skrymmande N-substitution är förknippad med förbättrade opioidliknande aktiviteter, verkar det finnas en annan historia för tramadol, vilket antyder den potentiella skillnaden mellan SAR mellan dessa föreningar. En ny typ av interaktionsmekanism i tramadolanalog ( 5b ) upptäcktes, vilket kommer att hjälpa till att främja potent tramadolbaserad smärtstillande design.

Introduktion

Opioider är narkotiska smärtstillande medel som är allmänt förskrivna för att lindra måttlig till svår smärta och de flesta av dessa medel utövar sina opioidliknande effekter genom opioidreceptorer ( t.ex. μ, δ, κ och ORL1 receptorer). De flesta kliniskt använda smärtstillande medel är dock begränsade till μ opioidagonister, som är förknippade med andningsdepression, förstoppning, beroende, fysiskt beroende och andra ökända negativa effekter. Tramadol, som lanserades 1977, är en fulsyntetisk opioid smärtläkemedel som används för att behandla måttlig till svår smärta, både akut och kronisk 1 . Dessutom har det också använts för att behandla depression, postherpetisk neuralgi, diabetisk neuropati för tidig utlösning 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 . Tramadol uppvisar några svaga biverkningar, inklusive illamående, yrsel, matsmältningsbesvär och buksmärta hos enskilda patienter 9, 10 . Det identifierades vara en atypisk opioid, både strukturellt och farmakologiskt. Det fungerar som en svag μ opioidreceptoragonist och serotoninåterupptag och norepinefrinåterupptagshämmare 11, 12 . Dess O- desmetylmetabolit ( M1 ) är mycket mer potent på opioidreceptorn 13 (figur 1). Emellertid utfördes få studier på struktur och aktivitetsförhållande för tramadolanaloger och bindningssättet mellan tramadolanaloger och μ opioidreceptor. I denna studie designade vi en serie N-fenylalkylsubstituerade tramadolderivat för att undersöka deras strukturaktivitetsförhållande för att utveckla nya opioidanalgetika och diskuterade jämfört skillnaden i bindningssätt för dessa föreningar och morfinderivat.

Struktur för (±) -tramadol 1, metabolit (±) -M1, kodin och morfin.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Material och metoder

Experimentellt avsnitt

Alla kemikalier och lösningsmedel tillhandahölls av Tansoole och användes utan ytterligare rening. 1 H och 3C NMR-spektra registrerades på ett Bruker AMX-400 instrument. Proton-kopplingsmönster beskrivs som singlett, dublett, triplett, kvartett, multiplett och bred. Masspektra genererades med elektrisk jonisering (ESI) producerad av en analytisk masspektrometer med HP5973N. Högupplösta massspektrometri (HRMS) spektra registrerades med ett AB 5600+ Q TOF-instrument.

Allmänt förfarande för synteser av N- metyl- N- fenylalkylaminometyl-cyklohexanoner (3a – 3d)

En blandning av cyklohexanon (1 g, 1, 06 mmol), N- metylfenylalkylamin (1, 06 mmol) och 1/5 av paraformaldehyd (2 mmol) i isopropanol (20 ml) omrördes och koncentrerad HCl tillsattes droppvis för att justera lösning till pH 4. Reaktionsblandningen upphettades sedan i ett oljebad vid 90-95 ° C under 30 minuter under omröring. De andra fyra delarna av paraformaldehyd tillsattes med 15 minuters intervall. Reaktionsblandningen återloppskokades under 4 timmar och lösningsmedlet avdestillerades. Återstoden tvättades med hexan, justerades till ett alkaliskt pH med en natriumbikarbonatlösning och extraherades med etylacetat. Kombinerade organiska extrakt torkades över Na2S04 och destillerades för att ge Mannich-baserna ( 3a – 3d ) i gott utbyte.

Allmänt förfarande för Grignard-reaktionen för framställning av 4a – 4d

En 100 ml, trehalsad, rundbottnad kolv utrustad med en magnetisk omrörningsstång, dropptratt och återflödeskondensor laddades med magnesiumspån (5 mmol) och jod (5 mg) under argon. Vattenfri tetrahydrofuran (THF, 15 ml) tillsattes till reaktionen med en spruta. När blandningen upphettades till 70 ° C tillsattes droppvis 3-bromoanisol (5 mmol) i vattenfri THF till blandningen. Efter att alla magnesiumchips hade löst kyldes reaktionen till rumstemperatur. Därefter tillsattes droppvis Mannich-basen ( 3a – 3d ) (1 mmol) i vattenfri THF till reaktionen. Efter omrörning i 3 timmar stoppades reaktionen med en mättad vattenlösning av NH4CI. Blandningen utspäddes med vatten och extraherades med CHCI3 (3 x 15 ml). Kombinerade organiska extrakt torkades över vattenfritt natriumsulfat, filtrerades och indunstades under reducerat tryck. Återstoden renades med kolonnkromatografi på silikagel med användning av CH2CI2 / MeOH (20: 1) för att ge ett gult fast ämne ( 4a-4d ). Basen ( 4a – 4d ) transformerades till hydroklorider i dietyleter genom tillsats av HCl i dietyleter.

Allmänt förfarande för beredning av (5a – 5d)

En lösning av ( 4a-4d ) (0, 59 mmol) i vattenfri DCM (15 ml) kyldes till -40 ° C. Bor-tri-bromid i DCM (1, 5 mmol) tillsattes droppvis i lösningen. Efter omrörning i 1 timme tilläts reaktionsblandningen att justeras till rumstemperatur. Reaktionsblandningen släcktes genom tillsats av droppar iskallt vatten. Efter utspädning med vatten extraherades den råa produkten med CHCI3 (3 x 15 ml). Kombinerade organiska extrakt torkades över vattenfritt natriumsulfat, filtrerades och indunstades under reducerat tryck. Råprodukten renades genom kolonnkromatografi över kiseldioxid med användning av CH2CI2 / MeOH (20: 1) för att ge gul olja ( 5a – 5d ). Basen ( 5a – 5d ) transformerades till hydroklorider i dietyleter genom tillsats av HCl i dietyleter.

2 - {[bensyl (metyl) amino] metyl} -1- (3-metoxifenyl) cyklohexanol-HCl (4a)

Vitt pulver, 55 mg 47% 'H NMR (400 MHz, d6-DMSO) 5 10, 18 (s, IH), 7, 62–7, 53 (m, 1H), 7, 47–7, 19 (m, 5H), 7, 04 (d, J) = 7, 9 Hz, 2H), 6, 86–6, 72 (m, IH), 5, 06 (d, J = 46, 2 Hz, IH), 4, 20 (ddd, J = 31, 9, 13, 0, 3, 6 Hz, 1H), 3, 93 (ddd, J = 18, 3, 13, 0, 6, 1 Hz, IH), 3, 76 (d, J = 7, 1 Hz, 3H), 2, 84-2, 61 (m, IH), 2, 47-2, 27 (m, 4H), 2, 25-2, 02 (m, 2H), 1, 89 –1, 07 (m, 7H) ppm. 13C NMR (151 MHz, DMSO) 5 159, 61, 150, 36, 131, 85, 131, 61, 130, 79, 129, 81, 129, 53, 129, 11, 128, 95, 117, 71, 112, 04, 74, 44, 60, 26, 57, 57, 56, 78, 55, 46, 42, 23, 26, 64, 24, 89, 21, 55. ESI-MS m / z 340, 2 [M + H] + HRMS m / z beräknat för C22H30NO2 [M + H] +, 340, 2271; observerade 340.2281.

2 - {[metyl (fenetyl) amino] metyl} -1- (3-metoxifenyl) -cyklohexanol-HCl (4b)

Vitt pulver 27 mg 36% 1H NMR (400 MHz, DMSO) 5 10, 14 (d, J = 32, 5 Hz, IH), 7, 37-7, 04 (m, 8H), 6, 78 (t, J = 6, 4 Hz, 1H), 5, 12 (s, IH), 3, 73 (d, J = 18, 1 Hz, 3H), 3, 15-2, 74 (m, 4H), 2, 74-2, 53 (m, 3H), 2, 44 (dd, J = 18, 4, 8, 9 Hz, 2H), 2, 35–2, 07 (m, 2H), 1, 92–1, 35 (m, 7H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) 5 159, 64, 150, 44, 137, 50, 137, 19, 129, 56, 129, 14, 129, 00, 127, 22, 127, 15, 117, 80, 112, 04, 74, 54, 58, 22, 55, 45, 54, 26, 42, 54, 30, 01, 28, 58, 27, 05, 25, 02, 21, 66. ESI-MS m / z 354, 3 [M + H] + HRMS m / z beräknat för C23H32NO2 [M + H] +, 354, 2428; observerat 354, 2438.

1- (3-metoxifenyl) -2 - {[metyl (3-fenylpropyl) amino] metyl} cyklohexanol-HCl (4c)

Vitt pulver 100 mg 60% 1H NMR (400 MHz, DMSO) 5 10, 07 (d, J = 57, 6 Hz, IH), 7, 36–7, 01 (m, 8H), 6, 85–6, 66 (m, 1H), 5, 10 (s, IH), 3, 74 (d, J = 7, 2 Hz, 3H), 2, 84 (t, J = 10, 9 Hz, 2H), 2, 68 (m, IH), 2, 54 (d, J = 4, 7 Hz, 2H), 2, 49-2, 43 ( m, 2H), 2, 43–2, 31 (m, 2H), 2, 29–2, 02 (m, 2H), 1, 89–1, 27 (m, 9H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) 5 159, 64, 150, 41, 140, 94, 129, 58, 128, 82, 128, 72, 128, 49, 126, 88, 126, 56, 117, 76, 111, 72, 74, 52, 57, 10, 55, 46, 52, 56, 42, 35, 32, 16, 27, 01, 25, 56, 24, 99, 23, 73, 21, 59. ESI-MS m / z 368, 3 [M + H] + HRMS m / z beräknat för C24H34NO2 [M + H] +, 368, 2584; observerat, 368, 2593.

1- (3-metoxifenyl) -2 - {[metyl (4-fenylbutyl) amino] metyl} cyklohexanol-HCl (4d)

Vitt pulver 78 mg 67% 'H NMR (400 MHz, DMSO) 5 9, 86 (d, J = 74, 2 Hz, IH), 7, 34–7, 14 (m, 6H), 7, 07 (dd, J = 17, 0, 9, 9 Hz, 2H) 6, 89-6, 77 (m, IH), 5, 14 (dd, J = 25, 6, 7, 9 Hz, IH), 3, 76 (d, J = 1, 9 Hz, 3H), 2, 91-2, 76 (m, 2H), 2, 68 (dt, J = 17, 4, 11, 8 Hz, IH), 2, 58–2, 52 (m, 3H), 2, 49–2, 30 (m, 3H), 2, 30–2, 01 (m, 2H), 1, 86–0, 95 (m, 11H). 13C NMR (151 MHz, DMSO) 5 159, 65, 150, 43, 142, 08, 140, 32, 129, 58, 128, 77, 128, 66, 126, 88, 126, 33, 117, 87, 112, 04, 74, 43, 57, 65, 57, 09, 55, 46, 52, 73, 42, 27, 34, 93, 28, 39, 27, 12, 27, 12, 24, 98, 23, 47, 21, 63. ESI-MS m / z 382, 3 [M + H] + HRMS m / z beräknat för C25H36N02 [M + H] +, 382, 2741; observerat, 382, 2742.

3- {2 - {[bensyl (metyl) amino] metyl} -1-hydroxicyklohexyl} fenol-HCl (5a)

Vitt pulver 98 mg 49% 'H NMR (400 MHz, DMSO) 5 9, 69 (s, IH), 9, 36 (d, J = 13, 1 Hz, 1H), 7, 56–7, 19 (m, 5H), 7, 13 (dt, J = 11, 0, 7, 9 Hz, IH), 6, 99-6, 80 (m, 2H), 6, 64 (ddd, J = 18, 3, 8, 0, 2, 1 Hz, IH), 4, 98 (d, J = 43, 5 Hz, 1H), 4, 31–4, 12 (m (IH), 3, 95 (ddd, J = 18, 5, 12, 9, 6, 0 Hz, IH), 2, 85-2, 54 (m, 2H), 2, 47-2, 22 (m, 4H), 2, 13-1, 13 (m, 9H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) 5 157, 64, 150, 10, 131, 55, 129, 90, 129, 42, 129, 19, 129, 04, 115, 99, 113, 69, 112, 80, 74, 27, 60, 37, 57, 07, 56, 60, 42, 10, 29, 47, 26, 49, 24, 95, 21, 52. ESI-MS m / z 326, 2 [M + H] + HRMS m / z beräknat för C21H28NO2 [M + H] +, 326.2115; observerat, 326.2118.

3- {1-hydroxi-2 - {[metyl (fenetyl) amino] metyl} cyklohexyl} fenol-HCl (5b)

Vitt pulver 118 mg 57% 'H NMR (400 MHz, DMSO) 5 9, 32 (s, IH), 8, 80 (d, J = 58, 1 Hz, IH), 7, 40-7, 07 (m, 6H), 6, 94 (d, J = 12, 7 Hz, 2H), 6, 62 (d, J = 7, 2 Hz, IH), 5, 06 (s, IH), 3, 23–2, 53 (m, 8H), 2, 16 (s, IH), 1, 94-1, 32 (m, 9H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) 5 157, 30, 151, 79, 140, 91, 129, 05, 128, 97, 128, 60, 126, 16, 116, 02, 112, 93, 112, 69, 74, 84, 59, 90, 58, 52, 43, 81, 43, 26, 41, 50, 33, 09, 26, 88, 26, 16, 22, 23. ESI-MS m / z 340, 3 HRMS m / z beräknat för C22H30NO2 [M + H] +, 340, 2271; observerade 340.2282.

3- {1-hydroxi-2 - {[metyl (3-fenylpropyl) amino] metyl} cyklohexyl} fenol-HCl (5c)

Vitt pulver 120 mg 66% 1H NMR (400 MHz, DMSO) 5 9, 59 (d, IH), 9, 38 (d, IH), 7, 36–7, 26 (m, 2H), 7, 15 (ddt, J = 15, 8, 10, 2, 7, 6 Hz, 4H), 6, 99-6, 79 (m, 2H), 6, 63 (d, J = 7, 9 Hz, IH), 5, 01 (s, IH), 2, 85 (dd, J = 13, 8, 8, 8 Hz, 2H), 2, 77-2, 60 (m, IH), 2, 57 (d, J = 4, 6 Hz, 2H), 2, 48 (d, J = 6, 9 Hz, 2H), 2, 41 (d, J = 4, 7 Hz, 2H), 2, 17-1, 29 (m, 11H) . 13C NMR (101 MHz, DMSO) 5 157, 67, 150, 12, 140, 97, 129, 43, 128, 84, 128, 69, 126, 56, 116, 02, 113, 74, 112, 84, 74, 19, 57, 61, 57, 11, 52, 55, 42, 32, 32, 39, 27, 02, 25, 65, 25, 07, 23, 83, 21, 58. ESI-MS m / z 354, 3 [M + H] + HRMS m / z beräknat för C23H32NO2 [M + H] +, 354, 2427; observerat, 354, 2435.

3- {1-hydroxi-2 - {[metyl (4-fenylbutyl) amino] metyl} cyklohexyl} fenol-HCl (5d)

Vitt pulver 80 mg 68% 1H NMR (400 MHz, DMSO) 5 9, 15 (s, 1H), 7, 32–7, 23 (m, 2H), 7, 16 (d, J = 10, 0, 4, 0 Hz, 3H), 7, 06 (t, J = 7, 8 Hz, IH), 6, 90 (s, IH), 6, 82 (d, J = 7, 6 Hz, IH), 6, 55 (dd, J = 7, 9, 2, 0 Hz, IH), 4, 83 (s, IH), 2, 54 ( d, J = 7, 7 Hz, 2H), 2, 26– 2, 04 (m, 2H), 2, 02-1, 84 (m, 4H), 1, 83-1, 18 (m, 14H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) 5 156, 79, 151, 29, 142, 27, 128, 44, 128, 19, 125, 56, 115, 50, 112, 41, 112, 19, 74, 38, 58, 44, 57, 44, 43, 26, 42, 65, 41, 03, 34, 96, 28, 67, 26, 46, 26, 15, 25, 70, 21, 75. ESI-MS m / z 368, 3 [M + H] + HRMS m / z beräknat för C24H34NO2 [M + H] +, 368, 2584; observerat, 368, 2588.

Radioligand bindande analys

Kinesiska hamster-ovarieceller (CHO) -celler stabilt transfekterade med den humana k-opioidreceptorn och 5-opioidreceptorn erhölls från SRI International (Palo Alto, CA, USA), och de transfekterade med μ-opioidreceptorn erhölls från George Uh1 (NIDA Intramural Program, Bethesda, MD, USA). Cellerna odlades i 100 mm skålar i Dulbeccos modifierade Eagle's media (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin-streptomycin (10 000 U / ml) vid 37 ° C under 5% CO2-atmosfär. Affiniteten och selektiviteten hos föreningarna för multipla opioidreceptorer bestämdes genom att inkubera membranen med radiomärkta ligander och 12 olika koncentrationer av föreningarna vid 25 ° C i en slutvolym av 1 ml 50 mmol / L Tris-HCl, pH 7, 5. Inkubationstider på 60 min användes för den μ-selektiva peptiden [3H] DAMGO, den K-selektiva liganden [3H] U69593 och den 5-selektiva antagonisten [3H] DPDPE.

[35S] GTP-y-S-funktionell analys

I en slutlig volym av 0, 5 ml inkuberades olika koncentrationer av varje testad förening med 7, 5 mg CHO-cellmembran som stabilt uttryckte den humana μ-opioidreceptorn. Analysbufferten bestod av 50 mmol / L Tris-HCl, pH 7, 4, 3 mmol / L MgCl2, 0, 2 mmol / L EGTA, 3 mmol / L BNP och 100 mmol / L NaCl. Den slutliga koncentrationen av [35S] GTP-y-S var 0, 08 nmol / L. Ospecifik bindning mättes genom inkludering av 10 mmol / L GTP-y-S. Bindning initierades genom tillsats av membranen. Efter en inkubation av 60 min vid 30 ° C avslutades reaktionerna genom snabb filtrering och radioaktivitet bestämdes genom vätskescintillationsräkning.

Molekylär simulering

3D-strukturen för tramadol, M1, morfin och kodin byggdes med SYBYL6.9-programmet och optimerades av ett Gauss-program med samma metod som användes i en tidigare studie 14 . Föreningarnas 3D-strukturer överlagrades också med användning av mjukvarupaketen i SYBYL6.9.

Molekylär dockning utfördes med användning av GOLD 5.0.1 15 . Bindningsstället definierades att inkludera alla rester inom en 15, 0 Å radie av den konserverade D3.32Cy kolatomen. En vätebindningsbegränsning sattes mellan den protonerade kväveatomen (N1) av ligand och D3.32 sidokedja. Tio konformationer producerades för varje ligand och Gold-Score användes som poängfunktion. Andra parametrar ställdes in som standard. Högpoängkomplex inspekterades visuellt för att välja den mest rimliga lösningen.

Resultat

Designrationalitet

I tidigare studier under de senaste åren anses tramadol vanligtvis vara strukturellt relaterat till kodin 16, 17, 18 . I vår första studie överlagrades de tredimensionella strukturerna av tramadol och kodin (figur 2). Det visade sig att kväveatomerna och 3-metoxylfenylgrupperna i båda föreningarna lokaliserades i samma position, vilket visade att tramadol och kodin innehöll vanliga farmakoforeegenskaper. Eftersom tramadol uppvisar μ opioidaktivitet främst genom sin O- desmetylmetabolit ( M1 ), är morfin också en mer potent O- desmetylmetabolit av kodin. 3D-strukturen för M1 och morfin överlagrades också (figur 2), vilket indikerade att de två föreningarna innehåller samma farmakoforeegenskaper. Därefter dockades M1 och morfin till en kristallstruktur av μ-opioidreceptorn (PDB-kod 4DKL) med användning av programmet GOLD 5.0.1. Det visade sig att protonerade kväveatomer i båda föreningarna bildade en saltbro med Asp147 3, 32, medan fenolgrupperna för de två föreningarna bildade vätebindande interaktioner med vattenmolekyler (figur 3A, 3B). Dessa bindningssätt bestod av morfinans bindningssätt i kristallstrukturen hos opioidreceptorer 19, 20, 21 . M1 upprätthöll de klassiska interaktionerna mellan morfinanter med μ opioidreceptorn. Överlagringen och dockningsstudierna visade att M1 och morfin har samma farmakoforeegenskaper och liknande bindningssätt vid μ opioidreceptorn.

Överlagrad 3D-struktur av tramadol och kodin; M1 och morfin.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Ligandbindningssätt vid μ opioidreceptorn. (A) Bindningsmoden för M1 vid μ opioidreceptorn visas med grönt; (B) Morfins bindningssätt vid μ opioidreceptor visas i gult; (C) Bindningsmoden för N- fenetylnormorfin vid μ opioidreceptor visas i blått; (D) Överlagring av bindningssätten för M1 (grön), morfin (gul) och N- fenetylnormorfin (blå); (E) Överlagring av bindningssätten för M1 (grön), morfin (gul) och N- fenetylnormorfin (blå), där μ opioidreceptorn presenteras av dess potentiella yta.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Vid noggrant undersökning av bindningssätten för M1 och morfin var det värt att notera att substituenten på kväveatomen i båda föreningarna mötte en gemensam hydrofob ficka bildad av Trp293 6.48 och Tyr326 7.43. Det är välkänt att introduktionen av N- arylalkylsubstituenter, såsom en N- fenyletylgrupp, är förknippad med signifikant förbättring av opioidliknande aktiviteter för klassiska morfinanter. Introduktion av en N- fenyletylsubstituent på morfin ökar signifikant aktiviteten av morfin vid μ-opioidreceptorn. Bindningsmoden för N- fenetylnormorfin undersöktes också genom molekylär dockning (figur 3C). N- fenetylnormorfinen bibehöll de vanliga bindningsinteraktionerna av M1 och morfin, medan N- fenyletylpartiet sträckte sig in i den hydrofoba fickan bildad av Trp293 6.48 och Tyr326 7.43. Denna ytterligare interaktion kan bidra till förbättring av N- fenetylnormorfin opioidaktivitet jämfört med morfin. När bindningssätten för M1, morfin och N- fenetylnormorfin överlagrades, fann vi att protonerade kväveatomer i de tre föreningarna bildade saltbroar med Asp147 3.32, medan deras fenolgrupper bildade vätebindande interaktioner med vattenmolekyler och His297 6.52 (figur 3D) . N- substitutionen av de tre föreningarna mötte också samma hydrofoba ficka (figur 3D, 3E). Eftersom N- fenyletylsubstitution kan förbättra morfins opioidaktivitet, föreslog vi att införandet av en fenylalkylgrupp, såsom fenyletyl, till kväveatomen i M1 kan förbättra bindningsaffiniteten vid μ opioidstället som det gör till morfin. Således designade vi en serie N- fenylalkylderivat av tramadol (figur 4) och M1 för att undersöka om denna modifiering skulle kunna förbättra aktiviteten för μ-opioidreceptorn i syfte att utveckla en ny klass av opioidligander.

Designade N -arylalkylaminometylenecyklohexananaloger.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Syntes

Syntesen av 4a – 5d beskrevs i schema 1. Cyklohexanon kondenserades med paraformaldehyd och N- metylalkylfenylamin för att ge aminometylhexanoner 3a-3d, som vidare reagerade med Grignard-reagenset framställt från 3-bromoanisol för att ge 4a-4d . Specifikt gav tillsats av Grignard-reagenset till ketoner 3a – 3d4a – 4d som blandningar av diastereomerer (76% cis för 4a – 4d ) 16 . Överflödet av cis- isomeren kan förbättras till 95% genom snabbkromatografi (DCM / MeOH, 20: 1). O- metylderivat framställdes genom avlägsnande av O- metylgruppen av 5a – 5d .

Reagens och betingelser: (a) paraformaldehyd, HCl, isopropanol, 90 ° C; (b) 3-bromoanisol, Mg, vattenfri THF, rumstemperatur (RT); (c) BBr 3, vattenfri DCM, -40 ° C.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Bindande affinitet och funktionell aktivitet

I likhet med tramadol uppvisade inte alla metoxylderivat, 4a – 4d, bindningsaffiniteter för opioidreceptorer, medan fenolhydroxylderivaten, 5a – 5d, uppvisade högre affiniteter och selektivitet gentemot μ-opioidreceptorn. Bindningsaffiniteterna 5a – 5d varierade från 99, 7 nmol / L till 1297 nmol / L (tabell 1). Vi fann att μ opioidbindande affiniteter av 5a – 5d var associerade med längden på länken (antalet kolatomer mellan kväveatomen och den införda fenylgruppen). När länkarens längd var 2, uppvisade motsvarande målförening 5b den högsta bindningsaffiniteten vid μ opioidreceptorn (Ki = 99 nmol / L) bland alla aminometylencyklohexananaloger. Bindningsaffiniteten för 5b var något svagare än för M1 (Ki = 13 nmol / L), men bibehöll agonistisk aktivitet (EC50 = 258 nmol / L) (figur 5) lika med M1 (EC50 = 244, 7 nmol / L) såsom visas i [35S] GTP-y-S-bindningsanalyser (tabell 2). När längden på länken ökade till 3 och 4 minskade de agonistiska aktiviteterna 1 gånger jämfört med 5b .

Full storlek bord

Plottet för GTPyS-bindningsanalys av 5b vid μ opioidreceptorn.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

Full storlek bord

Diskussion

I denna studie uppvisade målföreningarna liknande struktur- och aktivitetsförhållanden med tramadol och att fenolhydroxylsubstituerade föreningar var mycket kraftigare än metoxylsubstituerade föreningar. För N- substitution hade längden på länken mellan kväveatomen och den införda fenylgruppen en väsentlig påverkan på opioidaktivitet. Det fenyletylsubstituerade derivatet 5b var den mest potenta föreningen och uppvisade agonistaktivitet lika med M1 .

Morfin och tramadol har samma pharmocophore-modell och bindningssätt (figur 6A); frågan kvarstår dock om deras derivat har liknande egenskaper? För att besvara denna fråga jämfördes bindningssätten för N- fenyletyl-substituerad förening 5b och N- fenyletylmorfin (figur 6B och 6C). När det gäller bindningsmoden för morfin och dess analoger, bibehöll N- fenyletylmorfin bindningsmoden för morfin (figur 6B). Emellertid förändrade N- fenyletyltramadol 5b bindningsorienteringen för tramadol (figur 6C). De katjoniska aminerna av 5b bildade fortfarande en saltbro med karboxylgruppen i Asp147 3.32, men den relativa positionen för katjoniska aminer skiftades till nackdelen av karboxylgruppen i Asp147 3.32 . N- fenyletylgruppen i 5b sträckte sig inte in i den hydrofoba bindningsfickan bildad av Trp293 6.48 och Tyr326 7.43, såsom observerades för fenylgruppen av N- fenetylnormorfin. Istället förlängdes den till en ny ficka bildad av resterna Ile144 3.29, Val143 3.28 och Leu219 i den andra extracellulära slingan (ECL2). Denna nya interaktion resulterade i nedsättningen av liganden och fenolgruppen i 5b misslyckades med att bilda vätebindningsnätet bestående av två vattenmolekyler och His297 6.52 (figur 6C och 6D). Resultaten visade att införandet av en N- fenyletylgrupp förändrade den ursprungliga bindningsorienteringen av tramadol och morfin; aktiviteten för N- fenyletyltramadol 5b minskade 8 gånger, men bibehöll liknande agonistisk aktivitet (EC50 = 258 nmol / L och 244 nmol / L för 5b respektive M1 ). På grund av nedåtrörelsen av 5b på det aktiva stället, försvann den viktiga vattenmedierade interaktionen mellan fenolgruppen i M1 och His297 6.52 i μ-opioidreceptorn och ett utrymme skapades. Införandet av en ny vätebindningsdonator i fenolgruppen 5b kan återställa vätebindningsnätet som består av två vattenmolekyler och His297 6.52 och öka dess aktivitet med μ-receptorn.

Ligandbindningssätt vid μ opioidreceptorn. (A) Överlagrade bindningssätt för M1 (grön) och morfin (gul) vid μ-opioidreceptorn; (B) Överlagrade bindningssätt för morfin (gult) och N- fenetylnormorfin (blått) vid μ opioidreceptorn; (C) Överlagrade bindningslägen för M1 (grön) och 5b (rosa) vid μ opioidreceptorn. (D) Bindningsmoden för 5b visas i rosa färg.

Bild i full storlek

  • Ladda ner PowerPoint-bilden

I denna studie fann vi att tramadolaktiv metabolit M1 och morfin hade vanliga farmakoforeegenskaper och liknande bindningssätt vid μ opioidreceptorn med användning av 3D-struktursuperimposition och en molekylär dockningsteknik. Fästningen av N- fenyletyl till morfin introducerade hydrofoba interaktioner med Trp293 6.48 och Tyr326 7.43 och förbättrade dess opioidaktivitet. Sedan designades, syntetiserades en serie N- fenylalkylsubstituerade derivat av tramadol och utvärderades med avseende på opioidaktivitet. Den N-fenyletylsubstituerade föreningen 5b uppvisade ekvivalent aktivitet i funktionella analyser jämfört med M1. Vidare identifierade en molekylär dockningsstudie med 5b att 5b antog en ny bindningsorientering, till skillnad från N- fenyletylmorfin, där N- fenyletylgruppen av 5b sträckte sig till en annan hydrofob ficka bildad av resterna Ile144 3.29, Val143 3.28 och Leu219 i ECL2 . Vår studie visade att införandet av en ny vätebindningsdonator i fenolgruppen 5b kan återställa det ursprungliga vätebindningsnätet för vattenbrygga och öka dess aktivitet med μ-receptorn.

Författares bidrag

Wei FU, Wei LI och Qing SHEN designade forskningen; Qing SHEN och Yuan-yuan QIAN syntetiserade föreningarna; Xue-jun XU och Jing-gen LIU utförde den farmakologiska analysen; och Qing SHEN och Wei FU skrev uppsatsen.