Avkryptering och modulering av g-proteinsignalering i c. elegans med den fruktansvärda tekniken | vetenskapliga rapporter

Avkryptering och modulering av g-proteinsignalering i c. elegans med den fruktansvärda tekniken | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biokemi
  • Cellbiologi

Abstrakt

G-protein signalering är ett evolutionärt konserverat koncept som belyser dess grundläggande inverkan på utvecklings- och funktionella processer. Studier av effekterna av G-proteinsignaler på vävnader såväl som en hel organisme genomförs ofta i Caenorhabditis elegans. För att förstå och kontrollera dynamik och kinetik för de involverade processerna skulle farmakologisk modulering av specifika G-proteinvägar vara fördelaktigt, men är svårt på grund av brist på tillgänglighet och reglering. För att erbjuda detta alternativ designade vi G-proteinkopplade receptorbaserade designerreceptorer (DREADDs) för C. elegans . Ursprungligen beskrivna i däggdjursystem aktiveras dessa modifierade muskarinacetylkolinreceptorer av det inerta läkemedlet clozapin-N-oxid, men inte av deras endogena agonister. Vi rapporterar en ny C. elegans- specifik DREADD, funktionellt uttryckt och specifikt aktiverar G q- protein signalering in vitro och in vivo som vi använde för att modulera parningsbeteende. Därför visar denna nya designerreceptor möjligheten att farmakologiskt kontrollera fysiologiska funktioner i C. elegans .

Introduktion

Designerreceptorer som uteslutande aktiverats av designerläkemedel (DREADDs) har utvecklats som ett verktyg för att studera och specifikt manipulera G-proteinsignalering in vivo 1, 2 . Denna teknik för selektiv kontroll av signaleringskaskader har visat sig vara ovärderlig, inte bara för att undersöka effekterna av specifik G-proteinsignalering på distinkta fysiologiska processer utan också för att kontrollera cellfunktioner på ett celltypspecifikt sätt. Förutom DREADD: er som farmakogenetiska verktyg har också optogenetiska metoder genererats. Båda metoderna är icke-invasiva och baserade på modifierade receptorer som specifikt kan aktiveras - DREADDs uteslutande av syntetiska ligander och optogenetiska verktyg endast med ljus.

Den första generationen av DREADD: er baserades på muskarinacetylkolinreceptorer som har förändrats av tvåpunktsmutationer inom transmembrandomäner 3 och 5 för att hämma aktivering av den endogena agonistenacetylkolin (ACh) men möjliggör stimulering av den inerta föreningen clozapin-N-oxid (CNO) ) 1 . Ytterligare modifiering tillåtet för specifik aktivering av Gq-, Gs- eller Gi-signalvägar, respektive 2 . Dessa DREADD: er kallas rM3Dq, rM3Ds och hM4Di enligt konvention 3 . De har i stor utsträckning farmakologiskt karakteriserats 4 och använts i stor utsträckning för att specifikt aktivera och inaktivera till exempel neuronpopulationer in vivo genom att använda Gq- respektive Gi-specifika DREADD: er 5 . DREADDs har också varit involverade för att studera neuronal påverkan på rädselminne, Parkinsons sjukdom, Downs syndrom och glialcells roll in vivo 6, 7, 8, 9 . I periferin har DREADD-tekniken använts för att studera metaboliska funktioner i ö-ß-celler och hepatocyter 2, 10 .

Trots kraften och enkelheten i användningen av DREADD: er är många fysiologiska processer och funktioner associerade med specifika signaleringskaskader inte lätt att avgränsa hos däggdjur på grund av organismernas komplexitet. Tillämpningen i mindre komplexa system skulle vara mycket fördelaktig för att övervinna dessa begränsningar. Nyligen överfördes DREADD-tekniken till Drosophila melangoster som visar att däggdjurs DREADDs effektivt kan uttryckas i fruktflugan och modulera fysiologiska funktioner kopplade till G-proteinvägar 11 . Användningen av däggdjurs DREADDs i andra organismer väcker också den intressanta frågan om organismspecifika DREADDs också kan genereras. Nematoden Caenorhabditis elegans , en mycket enkel modellorganism som ofta används för utredning av olika biologiska frågor, är mycket lämplig för dissekering av effekterna av signaleringskaskader. Hittills har endast optogenetik framgångsrikt använts som ett verktyg för manipulering av vissa signaleringskaskader i nematoden 12, 13, 14 . G-proteinsignaleringsvägar behandlas emellertid inte väl av icke-genetiska verktyg.

Här visar vi att DREADD-tekniken kan tillämpas i C. elegans med hjälp av en nyutformad DREADD baserad på nematoden muskarinreceptor GAR-3b. Fördjupad farmakologisk karakterisering in vitro avslöjade att DREADD specifikt aktiverar G q- signalering. I nematoden kan DREADD modulera fysiologiska funktioner vid stimulering med CNO in vivo .

Resultat

DREADD från däggdjur är inte aktiva i C. elegans

En förutsättning för användning av DREADDs i C. elegans är att den syntetiska liganden CNO som används för att aktivera dessa receptorer inte har några negativa effekter på nematoder. För att belysa det inflytande som föreningen har på C. elegans fertilitet, utveckling, livskraft och neuronala systemet samt vissa aspekter av beteende behandlade vi vildtyps nematoder i flytande kultur med varierande koncentrationer av CNO och analyserad stamstorlek, individer som når vuxen ålder, livslängd, rörelse, svalgpumpar, äggläggning och känslighet för aldicarb. Ingen av parametrarna påverkades emellertid (kompletterande figur 1) vilket indikerar att föreningen inte har några större biverkningar på C. elegans .

Eftersom däggdjur DREADD har visats vara ett användbart verktyg för analyser i Drosophila , vilket tyder på att de kan aktivera distinkta G-proteinkaskader i ryggradsdjur och ryggradslösa djur 11, testade vi dessa receptorer i C. elegans . För att undersöka funktionaliteten hos däggdjur DREADDs i nematoden krävs system i vilka de fysiologiska implikationerna av Gs, Gq respektive G i proteinmedierade vägar är väl förståda. Protektion av kopulatoriska spikuler från svansen hos den manliga nematoden är beroende av en Gq- signaleringskaskad 15, 16 och erbjuder således en lämplig avläsning. Spikulutdragning inträffar under parning när spikulen sätts in i hermafrodites vulva (Fig. 1 A ) 15, 17 . C. elegans- homologen av muskarinacetylkolinreceptorn M 3, GAR-3, är en G-proteinkopplad receptor (GPCR) som är involverad i att kontrollera denna process. GAR-3 har visat sig aktivera en G q- kaskad liknande dess däggdjurshomolog 18, 19, 20 och till och med utlöser G-proteinsignalering i däggdjursceller 20 vilket indikerar att denna receptor / G q- protein-kaskad är evolutionärt väl bevarad. Således spekulerade vi att DREADD (rM3Dq) som är baserad på råtta M3-receptorn (rM3R) kan aktivera G q- signalering i nematoden. C. elegans- stammen noll för gar-3 , gar-3 ( gk305 ) uppvisade en spikulär utdragningsdefekt (fig. 1C, E kompletterande tab. 1A) som var i överensstämmelse med tidigare studier 16 . Det har visats att karbachol (CCh) och oxotremorin M (Oxo M) aktiverar GAR-3 16, 21 och därmed inducerad spikulprotraktion hos hanar av vildtyp (Oxo M 82, 5 ± 3, 3%; CCh 84, 7 ± 7, 8%), oberoende av en hermafrodit som är närvarande (fig. IB, E). Konsekvent observerade vi inte denna effekt i gar-3 ( gk305 ) mutanter (Oxo M 10, 6 ± 4, 7%; CCh 12, 8 ± 2, 4%) (Fig. 1C, E, kompletterande tab. 1A). Vi testade om G q- signalering inducerad av rM3Dq-signalering räddar denna defekt genom att uttrycka DREADD rM3Dq under kontroll av gar-3- promotorn i gar-3- nollbakgrunden och stimulera nematoderna med CNO. Men vi kunde inte få någon räddning (15, 1 ± 5, 1%) (Fig. 1E, tilläggsflik 1A). Samma effekt sågs i transgena linjer med användning av den omodifierade rM3R som drivs av gar-3- promotorn (Oxo M 14, 0 ± 4, 0%; CCh 13, 2 ± 5, 4%) (fig. 1E, kompletterande tab. 1A). På grund av denna brist på funktionalitet undersökte vi expression av de yfp- taggade receptorerna med hjälp av fluorescerande avbildningstekniker. Vi kunde emellertid inte upptäcka något protein (kompletterande fig. 2) trots att vi erhöll flera transgena linjer innehållande receptor-DNA (kompletterande tab. 2). På samma sätt observerades inget uttryck för de andra två däggdjurs DREADD: erna för Gs-protein signalering (rM3Ds) och för Gi-protein signalering (hM4Di) (data visas inte).

( A – D ) Schematisk framställning av spiculeutdragning och teoretisk modell av GAR-3 och DREADD-aktivering i detta sammanhang, som alla DREADD-karaktäriseringar bygger på (se fig 1E och 4F). ( A ) GAR-3 förmedlar en G q- proteinsignal som är involverad i spikulens protektion av den manliga nematoden under parning som kulminerar med införandet av spikulen i hermafrodites vulva. ( B ) GAR-3 kan aktiveras av Oxo M och CCh för att inducera spikulprotraktion involverande Gq-proteinsignaleringskaskaden. Denna effekt är oberoende av närvaron av en hermafrodit. ( C ) I frånvaro av GAR-3 utlöser varken Oxo M eller CCh spikulär utsprång. ( D ) DREADDs som aktiverar Gq-proteinsignaleringskaskaden utlöser specifikt spikulprotraktion vid stimulering med CNO, men inte med Oxo M eller CCh. Sådana DREADD: er kan vara rM3Dq eller en C. elegans- specifik DREADD (cegar-3Dq) hos gar-3- bristfälliga män. ( E ) Protraktionshastighet i manliga nematoder som innehåller DREADD-konstruktioner från däggdjur. Hanar inkuberades med 100 mM Oxo M, 10 mM CCh, 2 mM CNO eller H20 som negativ kontroll. Därefter poängsattes spikulär utsprång och utdragningshastigheterna beräknades med avseende på det totala antalet manliga. Vildtypsmaskar ( pha-1 ( e2123 ) ; him-5 ( e1490 )) , gar-3 ( pha-1 ( e2123 ) ; him-5 ( e1490 ) gar-3 ( gk305 )) och transgen gar-3; Ex [ gar-3 (+)] män fungerade som kontroller. Data visas som medelvärde ± SD. *** p <0, 001; n ≥ 250. Anges under varje kolumnuppsättning är den schematiska modellen relaterad till respektive data.

Bild i full storlek

Därför drar vi slutsatsen att bristen på aktivitet hos däggdjurs DREADDs i C. elegans sannolikt beror på svårigheter att korrekt uttrycka eller bearbeta receptorerna.

Generering av en C. elegans- specifik DREADD

Eftersom däggdjurs DREADD inte verkade uttryckas ordentligt i C. elegans , avsåg vi att generera en nematodspecifik DREADD för modulering av G-proteinsignaleringsvägar i masken. Vi försökte basera denna modifierade receptor på en muskarinacetylkolinreceptor som liknar DREADD: s däggdjur. Tre G-proteinkopplade acetylkolinreceptorgener är kända i C. elegans ( gar-1, gar-2, gar-3 ) med GAR-2 som beskrivs för att binda G i / G o- proteiner och GAR-3 är en G q - kopplingsreceptor 21, 22 . GAR-1 och GAR-2 skiljer sig emellertid i sina farmakologiska egenskaper från däggdjursmuskarinacetylkolinreceptorer 21, 23, 24, medan GAR-3 är farmakologiskt mycket lik däggdjur M3R och aktiverar Gq-signaleringskaskaden vid stimulering med ACh eller CCh 19 20, 21 . Justeringsanalyser avslöjade vidare en total aminosyrasekvensidentitet för GAR-3 till rM3R på 32, 8%. Två skarvvarianter, GAR-3a och GAR-3b, har beskrivits med GAR-3b som den främst förekommande formen. De två isoformerna skiljer sig endast i 26 aminosyralängd inom den tredje intracellulära slingan (ICL) 25 . Även aminosyror Y3.33 och A5.46 (universellt aminosyranummeringssystem 26 ), som är allmänt konserverade bland muskarinacetylkolinreceptorer, finns också i C. elegans GAR-3b (Fig. 2A), men endast Y3. 33 bevaras i C. elegans GAR-2 (fig. 2B). Därför valde vi GAR-3b för generering av en C. elegans- specifik DREADD och - analogt med däggdjurs DREADD: er - muterade aminosyror Y3.33 (Y146C) och A5.46 (A237G). DREADD-märkningen var N-terminalt med en HA-epitop för att möjliggöra detektering med användning av kommersiellt tillgängliga antikroppar.

( A ) Sekvenser av mAChR typ 3 från 13 olika arter hämtades från offentligt tillgängliga databaser, såsom NCBI / GenBank. Justering utfördes med Clustal W-inriktning 48 . Visad är aminosyrasekvensen för transmembrandomän 3 och 5. Konserverade rester är skuggade i blått. Röd markerad är den mycket konserverade tyrosinen Y3.33 (Y146) och alanin A5.46 (A237) som är muterade i däggdjurs DREADD. ( B ) Analogt utfördes anpassning av mAChR typ 2. Medan Y3.33 också konserveras i C. elegans GAR-2, skiljer sig aminosyran 5.46 från andra muskariniska ortologer.

Bild i full storlek

Farmakologisk karaktärisering av ceGAR-3Dq

Den modifierade GAR-3b karakteriserades farmakologiskt med avseende på agonist- och kopplingsspecificitet. På grund av den höga konserveringen av de tre huvudsakliga G-proteinerna kan G q, G och G bland metazoan artanalyser av funktionell G-proteinkoppling av receptorer från C. elegans eller andra ryggradslösa arter utföras med användning av däggdjursystem 27, 28, 29 där resultaten kan överföras till det ursprungliga systemet. Således använde vi transient transfekterade COS-7-celler, eftersom DREADD-cellytuttryck var högst jämfört med CHO-K1- och HEK-293GT-celler (kompletterande figur 3A). Genom att använda etikettfri dynamisk massfördelningsexperiment (DMR) -experiment demonstrerade vi att GAR-3b endast aktiveras av CCh (fig. 3A) medan receptormutanten (ceGAR-3Dq) verkligen är en DREADD enbart aktiverad av det inerta läkemedlet CNO men inte av den muskariniska agonisten CCh (fig. 3B). CNO aktiverade DREADD på ett koncentrationsberoende sätt med ett EC 50- värde på 3, 5 μM, medan muskarinagonisten CCh inte hade någon effekt på receptoraktiviteten (Fig. 3C). För att analysera kopplingsspecificiteten involverade ytterligare experiment detektion av andra budbärare såsom inositolfosfat (IP) som en avläsning för receptoraktivering. I överensstämmelse med DMR-mätningarna visade IP-ackumuleringsanalyser en ökning i IP-bildning vid CCh-stimulering av GAR-3b men inte vid CNO-behandling (fig. 3D). Däremot sker DREADD-medierad IP-bildning först efter stimulering med CNO. Vidare visar mätning av kalciumfrisättning också den koncentrationsberoende aktiveringen av DREADD-receptorn vid CNO-behandling (fig. 3E), medan GAR-3b endast aktiveras av CCh (fig. 3F). Ingen av dessa föreningar har någon effekt på håliga transfekterade celler som visar receptorspecificiteten (kompletterande fig. 3B).

Agonistspecificitet bestämdes med användning av dynamisk massfördelning. ( A ) GAR-3b stimuleras av 100 μM CCh, medan 10 μM CNO inte stimulerar receptorn. ( B ) 100 μM CCh kan inte stimulera ceCAR-3b, men DREADD stimuleras av 10 μM CNO. ( C ) DREADD-agonisten CNO aktiverar ceGAR-3Dq på ett koncentrationsberoende sätt medan den muskariniska agonisten CCh inte har någon effekt på receptoraktiviteten. Givet är ett av tre representativa experiment utförda i triplikat. ( D ) Andra messenger-analyser avslöjar G q- proteinkoppling av GAR-3b och ceGAR-3Dq. Transfekterade celler inkuberades med media (icke-stimulerad), 100 mikrometer CCh eller 10 mikrometer CNO. CCh-stimulering av GAR-3b leder till en kraftig ökning av IP-bildning, men ceGAR-3Dq aktiveras endast av CNO. Givet är medelvärdet ± SD för tre till fyra oberoende experiment utförda i triplikat. ( E ) Kalciumfrisättning mättes i ceGAR-3Dq-transfekterade celler efter stimulering med CCh och CNO. Även om CCh inte utlöser kalciumfrisättning, resulterar CNO i en koncentrationsberoende kalciumfrisättning. ( F ) GAR-3b-transfekterade celler frisätter kalcium efter stimulering med CCh men inte CNO. Givet är medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment utförda i duplikat.

Bild i full storlek

Detta överensstämmer med tidigare studier där GAR-3-transfekterade CHO-K1-celler visades ackumulera inositolfosfater och frisätta Ca2 + vid CCh-behandling 19, 21, 25, 30 . Vidare har dessa förhöjda Ca2 + -nivåer visat sig stimulera cAMP-produktion oberoende av Gs proteinsignalering 20 . Det demonstrerades också att GAR-3 är kopplad till G i- proteinkoppling i cellkulturförsök 20, 25 . Således testade vi för potentiell Gs - eller G i- proteinkoppling. För det första använde vi andra messenger-analyser för att mäta cAMP-ackumulering med och utan förinkubation av adenylylcyklasstimulatorn forskolin. Varken stimulering av GAR-3b eller ceGAR-3Dq resulterade i en förändring av cAMP-ackumulering (kompletterande fig. 4A, B). Det måste emellertid noteras att expressionsnivåerna för GAR-3b och ceGAR-3Dq var ganska låga. Därför kan bristen på att identifiera Ca2 + -medierad cAMP-bildning bero på en brist på känslighet. I en mer känslig CRE-baserad reportergenanalys observerades faktiskt en ökning av cAMP (kompletterande fig. 4C, D). EC 50- värdena liknar de som erhålls i DMR-mätningar (CNO vid ceCAR-3Dq: 1, 6 μM; CCh vid GAR-3b: 4, 9 μM) (tilläggsflik 3). För ytterligare validering av G-proteinkopplingsegenskaperna hos GAR-3b utfördes DMR-mätningar med kikhoste och koleratoxin för att testa för koppling till andra G-proteinsignaleringsvägar. Varken koleratoxin eller pertussintoxin, en stark hämmare av G i- proteinsignalering 31, förändrade signaler på CCh-stimulerade GAR-3b-transfekterade celler vilket tyder på inget deltagande av toxinkänsliga Gs - eller G i- proteinvägar (Kompletterande Fig. 4F, G). Dessa resultat indikerar exklusiv Gq – protein-koppling av DREADD och enligt den föreslagna nomenklaturen fick DREADD därför namnet ceGAR-3Dq 3 .

G q- proteinsignalering utlöst av ceGAR-3Dq modulerar spikulets utdragningsbeteende hos manliga nematoder

Därefter testade vi användbarheten av den GAR-3-baserade DREADD ceGAR-3Dq in vivo . För att säkerställa att receptorn är funktionell bedömde vi först uttryck av ceGAR-3Dq :: yfp baserat på genomisk gar-3 som drivs av gar-3- promotorn som inte kan skiljas från gar-3 :: yfp , även om det verkar vara allmänt svagare (Fig 4A – E). Därefter undersöktes DREADD: s förmåga att aktivera en Gq- proteinsignaleringskaskad när den stimulerades med CNO genom att kvantifiera spikulärutdragningsrörelser (se fig. 1D). Transgen gar-3 ( gk305 ) ; Ex [ cegar-3Dq ] nematoder visade ingen spikulprotraktion vid behandling med Oxo M eller CCh (Oxo M 17, 9 ± 11, 5%; CCh 13, 6 ± 4, 8%) liknande effekten som ses hos obehandlade män (16, 8 ± 2, 1%) (Fig. 1B – D och 4F, kompletterande tab. 1B), vilket indikerar att DREADD inte aktiveras av GAR-3 muskarinagonister. Emellertid triggades spikulprotraktion vid stimulering med den syntetiska DREADD-agonisten CNO (37, 4 ± 6, 3%) (fig. 1D och 4F, kompletterande tab. IB). Dessa data överensstämmer med de farmakologiska analyserna in vitro som visar att ceGAR-3Dq är en DREADD. För att optimera den observerade effekten av ceGAR-3Dq-aktiverad Gq-proteinsignalering vid spikulprotraktion genomfördes en dosresponskurva med ökande koncentrationer av CNO (fig. 4G). På grund av föreningens begränsade löslighet testades emellertid en maximal koncentration av 2 mM CNO. Tyvärr nådde stimuleringen inte mättnad och därför kunde vi inte bestämma ett EC 50- värde. Cirka 40% av män utdragade sina spikuler vid denna koncentration. Aktivering av DREADD och därmed spikulationsprotektion upptäcktes redan 2 minuter efter start av CNO-behandling. Behandlingens varaktighet påverkade inte graden av spikulär utsprång (Fig. 4H).

( A – D ) Expression och proteinlokalisering av cegar-3Dq :: yfp kan inte skiljas från gar-3 :: yfp , båda drivs av gar-3- promotorn. Uttryck detekterades i svalget (A, B; 1./3. Rad: DIC, 2./4. Rad: fluorescerande bild) och i hanens svans (C, D; 1./3. Rad: DIC, 2 ./4 rad: fluorescerande bild). Lokaliseringen av DREADD verkar likna den i GAR-3. Skalstänger = 10 mikrometer. ( E ) Analyser av expressionsnivåer genom kvantifiering av intensiteter avslöjar att cegar-3Dq :: yfp- uttryck är signifikant svagare än gar-3- uttryck. För kvantifiering togs och analyserades bilder av svelget från olika cegar-3Dq :: yfp- uttryckande stammar i jämförelse med bilder från nematoder som bär gar-3 :: yfp . ( F ) Protraktionshastighet i manliga nematoder innehållande cegar-3Dq- konstruktionen. Hanar stimulerades med 100 mM Oxo M, 10 mM CCh, 2 mM CNO eller H20 som negativ kontroll. Därefter poängsattes spikulär utsprång. Vildtypsmaskar ( pha-1 ( e2123 ) ; him-5 ( e1490 )) , gar-3 ( pha-1 ( e2123 ) ; him-5 ( e1490 ) gar-3 ( gk305 )) och transgen gar-3; Ex [ gar-3 (+)] män fungerade som kontroller. Data visas som medelvärde ± SD. ns inte signifikant; ** p <0, 01; *** p <0, 001; n ≥ 300. ( G ) Spikulets utdragningshastigheter är beroende av koncentrationen av CNO. Manliga nematoder inkuberades med de angivna koncentrationerna av CNO och spikulprotraktion bedömdes därefter. Nematoder bristfälliga för gar-3 ( pha-1 ( e2123 ) ; him-5 ( e1490 ) gar-3 ( gk305 )) tjänade som negativ kontroll. Data visas som medelvärde ± SD, ** p <0, 01; *** p <0, 001; n ≥ 200. Anges under varje kolumnuppsättning är den schematiska modellen relaterad till respektive data. ( H ) Behandlingens varaktighet påverkar inte spikulans utbredningshastighet efter 3 minuter. Manliga nematoder inkuberades med 2 mM CNO och spikulprotraktion fick poäng. Som negativ kontroll användes nematoder som var bristfälliga för gar-3 ( pha-1 ( e2123 ) ; him-5 ( e1490 ) gar-3 ( gk305 )). Data visas som medelvärde ± SD, ** p <0, 01; *** p <0, 001; n ≥ 200. ( I ) Effekten av DREADD-aktivering är reversibel. Transgen gar-3; Ex [ gar-3 (+)] män stimulerades med 2 mM CNO. Efter 3 minuter bestämdes spikulens utdragningshastighet (tidpunkten benämnd "0 minuter efter CNO-borttagning") och nematoder drogs ut från läkemedlet genom att överföra dem till M9. Därefter mättes spikulär utsprång vid distinkta tidpunkter. Data visas som medelvärde ± SD, n ≥ 150.

Bild i full storlek

Nästa frågade vi om DREADD-aktivering kan kontrolleras tillfälligt. Vid avlägsnande av gar-3 ( gk305 ) ; Ex [ cegar-3Dq ] nematoder från CNO minskade spikulets utdragningshastighet över tiden (Fig. 4I). Cirka 30 minuter efter läkemedelsavlägsnande av spikulär utsprång nådde samma nivå som observerades i obehandlade kontroller, vilket antyder att DREADD-aktivering är reversibel. Dessa resultat indikerar att ceGAR-3Dq specifikt kan aktiveras av CNO in vivo och kan förmedla en G q- protein-signaleringskaskad. Denna aktivering kan kontrolleras tillfälligt.

Diskussion

GPCR: er är den största familjen av cellyteceptorer och signalerna som de förmedlar är involverade i nästan alla fysiologiska funktioner 32 . Således har man fått en fördjupad förståelse av deras signaleringslägen och förmågan att specifikt modulera signalvägarna har studerats intensivt. Att bestämma påverkan av en enda typ av receptor och dess signalvägar i en distinkt celltyp eller vävnad är emellertid praktiskt taget omöjligt eftersom en enda receptor vanligtvis finns i mer än en celltyp och endogena agonister aktiverar mer än en receptor 33 . Av samma skäl är det problematiskt att modulera distinkta signaleringskaskader i en specifik celltyp för att ändra eller kontrollera cellfunktioner. För att övervinna dessa begränsningar har farmakogenetiska tekniker i form av designerreceptorer utvecklats 1 . Dessa så kallade DREADD: er aktiveras endast av den inerta föreningen CNO men inte av den endogena liganden ACh och är således ett värdefullt verktyg för att specifikt aktivera G-proteinsignaleringsvägar in vivo . Att kombinera denna teknik med användning av enkla modellorganismer skulle göra ett kraftfullt verktyg för utredning och kontroll av celltypspecifik signalering.

I den aktuella studien genererade vi en DREADD för nematoden C. elegans baserad på den G-proteinkopplade acetylkolinreceptorn gar-3 . Denna DREADD kopplas till Gq-proteinsignaleringskaskaden liknande GAR-3 21 och aktiveras uteslutande av CNO. Som ett principbevis tillhandahåller vi funktionella data om att DREADD kan användas för spatiotemporal kontroll av signalering i nematoden.

DREADD-tekniken är mycket lämplig för användning i modellen organism C. elegans och genetiskt mottaglig så att DREADD-konstruktioner lätt kan introduceras. Vidare har vi visat att den syntetiska föreningen CNO som aktiverar DREADD kan administreras genom matning eller blötläggning av nematoder utan att ha några större skadliga effekter.

Även om uttryck av utvalda GPCR: er från däggdjur i C. elegans har visat sig vara allmänt möjligt för vissa receptorer 34, gav introduktion av däggdjur DREADDs rM3Dq, rM3Ds och hM4Di samt rM3R i nematoden inga funktionella receptorer, trots deras höga sekvens och funktionell bevarande av olika arter. Våra data indikerar att dessa receptorer kanske inte uttrycks ordentligt i C. elegans . Flera faktorer kan bidra till detta. När transgena linjer innehållande receptorerna erhölls kan en potentiell toxisk effekt av konstruktionerna eller deras genprodukter uteslutas. Emellertid kan bearbetning eller membraninriktning av däggdjursproteiner vara ett problem. Alternativt kan det tänkas att vissa samfaktorer eller interaktionspartner som krävs för funktionellt uttryck inte finns i C. elegans . Även om kodonema för däggdjurs-cDNA-sekvenserna granskades före konstruktionen och inga överdrivet problematiska identifierades, kan det inte uteslutas att icke-optimal kodonanvändning kan stå för denna effekt. Det är emellertid tänkbart att dessa receptorer transkriberas men inte behandlas korrekt i nematodceller.

Eftersom tekniken för däggdjurs DREADDs inte lätt kunde överföras till C. elegans , försökte vi att generera en nematodspecifik teknik och har valt M3R-homolog GAR-3. Medan ceGAR-3Dq-transgenen som användes för in vivo- studierna är baserad på det genomiska lokuset för gar-3, användes cDNA från den övervägande förekomna GAR-3b-isoformen för dess initiala farmakologiska karakterisering. Denna isoform skiljer sig inte från GAR-3a i sina farmakologiska egenskaper, som också liknar råtta M3R där stora delar av den tredje intracellulära slingan kan tas bort utan att ändra receptorfunktionalitet 35 . I båda fallen infogade vi tvåpunktsmutationer enligt däggdjurs DREADDs i transmembran domäner 3 och 5 av receptorn (Y146C / A237G i GAR-3) för generering av den nya DREADD. DMR-mätningar visade att den modifierade GAR-3b verkligen är en DREADD, endast aktiverad av CNO men inte av den muskariniska agonisten CCh (fig. 3). EC50-värdet för CNO-aktivering bestämt i DMR-mätningar är 3, 5 μM (pEC50: 5, 46 ± 0, 43), vilket är ungefär 100 gånger högre än för däggdjurets DREADD rM3Dq bestämd i jäst- eller cellkulturförsök 1, 2, 4, 36 .

Denna lägre styrka av CNO vid C. elegans DREADD beror troligen på den lägre styrkan hos agonister vid GAR-3b jämfört med rM3R (kompletterande tab. 3). In vitro- analyser av kopplingsegenskaperna hos GAR-3b och ceGAR-3Dq avslöjade en robust G q- medierad signalering med en Ca 2 + -beroende ökning av cAMP 37 . Liknande resultat har erhållits i tidigare studier 19 .

Även om det inte lätt kan bevisas att den GAR-3-baserade DREADD uteslutande aktiverar G q- signaleringskaskader, särskilt eftersom det finns 21 Ga-subenheter i C. elegans med 17 som inte är karakteriserade med avseende på deras signalförmåga eftersom det inte finns några tydliga homologer 38, 39, våra funktionella analyser pekar mot att ceGAR-3Dq aktiverar främst G q- signalering.

In vivo- analyser avslöjade att GAR-3b-härledd DREADD ceGAR-3Dq kan mediera en Gq-protein-signaleringskaskad vid stimulering specifikt med CNO men inte med CCh eller Oxo M. Aktivering av ceGAR-3Dq ledde till spikulär protektion hos män saknar gar-3 som visar att DREADD kan komplettera GAR-3-signaleringskaskaden när den är aktiverad. Den detekterade effekten är ungefär 40% medan 80% uppnås vid återinförande av den gmo-3- genomiska sekvensen i gar-3- bristfälliga nematoder och aktivering av receptorn med CCh eller Oxo M.. Flera faktorer kan bero på denna minskade effektivitet. För det första sker aktivering av båda receptorerna vid stimulering med olika föreningar. Även om EC 50- värdena för båda ligger inom ett liknande område in vitro , inkuberades nematoder i lägre koncentrationer av CNO jämfört med Oxo M eller CCh på grund av dess begränsade löslighet. Dessutom är det väl möjligt att olika läkemedelsupptagningsnivåer eller begränsad läkemedeltillgänglighet för CNO kan förklara de observerade skillnaderna in vivo . Uppenbarligen måste denna potentiella begränsning i läkemedlets tillgänglighet komma ihåg när man använder DREADD för applikationer i olika vävnadstyper i C. elegans . För det andra kan lägre expressionsnivåer för DREADD jämfört med gar-3 (fig. 3) också bidra till att ceGAR-3Dq har en mindre effekt på spikulens utdragningshastighet än GAR-3. Trots dessa uppenbara begränsningar är emellertid ceGAR-3Dq användbar för att modulera G q- protein-signalering i C. elegans för vissa applikationer.

Användningen av denna nya ceGAR-3Dq i synnerhet och DREADDs i allmänhet i modellorganismen C. elegans är mycket fördelaktig för olika tillämpningar. Det kan användas för att studera påverkan av G-proteinvägar i distinkta celltyper eller organ på hela organismen, en metod för vilken däggdjursystem ibland är för komplicerade. Många cellspecifika promotorer har beskrivits och erbjuder en plattform för att uttrycka DREADDs i specifika vävnader. Vidare är det mycket lämpligt att manipulera aktiviteten hos vissa celltyper med neurovetenskap som ett potentiellt användningsområde. Det neuronala nätverket av C. elegans erbjuder ett idealiskt system för studier på neuronala nätverk och connectomes eftersom det är väl karakteriserat. En hermafrodit innehåller 302 neuroner, som bildar cirka 7 000 kemiska synapser 40 . Att undersöka specifika populationer av nervceller och stimulera eller hämma deras aktivitet hjälper till att förstå neuronala nätverk och därefter, till exempel djurens beteende. Hittills har optogenetiska verktyg använts för att ta itu med dessa ämnen 12, 13 . DREADD: er är ett kraftfullt alternativ till denna teknik eftersom de möjliggör en dosberoende modulering av signalaktiviteten.

Sammanfattningsvis visar våra resultat att DREADD: er är ett funktionellt verktyg i nematoden C. elegans . Den nydesignade nematodspecifika DREADD ceGAR-3Dq baserad på den G-proteinkopplade acetylkolinreceptorn GAR-3 aktiverar en G q proteinsignaleringskaskad och kan modulera relaterade vägar in vivo . Denna receptor stimuleras uteslutande av den inerta föreningen CNO och stör därför inte några fysiologiska receptorer. Denna farmakogenetiska verktygslåda som nu är etablerad i C. elegans erbjuder en mängd tillämpningsområden. För att fullständigt utforska hela experimentella potentialen för DREADDs i C. elegans kommer framtida analyser att behöva fokusera på utformningen av nematod DREADDs specifika för att aktivera andra G-proteinkaskader, såsom Gs och G i proteinsignaleringsvägar.

metoder

material

Karbamylkolinklorid (karbachol, CCh), Oxotremorin M (Oxo M), forskolin, 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), aldikarb och standardkemikalier köptes från Sigma Aldrich. Clozapine-N-Oxide (CNO) erhölls från National Institute of Health (Bethesda, MD) som en del av programmet för snabb tillgång till undersökande läkemedel som finansierades av National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Ämnen som applicerades löstes i media eller buffert enligt det experiment som genomfördes i.

Generering av plasmider och transgener

GAR-3b-konstruktioner för in vitro- analyser genererades genom kloning av gar-3b- cDNA i däggdjursuttrycksvektorn pcDNA5FRT och innehöll en N-terminal HA-tagg som inte förändrar funktionella egenskaper hos GPCR: er (pSP109) 41 . cegar-3Dq konstruerades genom att introducera de två punktmutationerna Y146C / A237G i pSP109 (pSP112). För generering av konstruktioner för in vivo- analyser användes rekombinering 42, 43 . g ar-3 :: yfp (genomisk) insatt bakom gar-3- promotorn (pYL9) 16 var en snäll gåva från Dr. Rene Garcia, Texas A&M University. Konstruktet innehållande C. elegans- specifik DREADD cegar-3Dq nedströms gar-3- promotorn (pSP110) genererades genom att införa tvåpunktsmutationerna (Y146C / A237G) i den genomiska sekvensen av gar-3 i vektorn pYL9 (god gåva från Dr. Rene Garcia, Texas A&M University) 16 . Konstruktioner innefattande gar-3- promotorstyrd däggdjurs DREADDs (pSP106, pSP108, pSP114) och råtta M3R (pSP104) klonades genom utbyte av gar-3 för cDNA för respektive receptor i pYL9. Mer information finns i tilläggsmetoder.

Cell kultur

CHO-K1- och COS-7-celler köptes från Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Culture GmbH (CHO-K1: No. ACC 110, COS-7: No. ACC 60), HEK-GT-celler erhölls från ThermoFisher Scientific (GripTite 293 MSR Cell Line, nr R79507). Alla celler odlades i F12-media eller Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin och 100 ug / ml streptomycin vid 37 ° C i en fuktig inkubator med 7% CO2. Lipofectamine 2000 (Life Technologies) användes för övergående transfektion enligt tillverkarens rekommendationer.

Dynamisk massfördelning

Dynamiska massfördelningsmätningar är ett etikettfritt analyssystem för att studera GPCR-egenskaper i levande celler 44 . Således ympades COS-7-celler i T25-kolven 16 till 24 timmar före transfektion med 3 ug plasmid-DNA och 7, 5 pl Lipofectamin. Nästa dag delades 6 000 celler upp i en brunn i en Epic 384-brunns fibronektinbelagd mikroplatta (Corning, Kaiserslautern, Tyskland). DMR-mätningar utfördes vid en Corning Epic märkningsfri detektionsplattform. CCh och CNO löstes i HBSS-buffert vid olika koncentrationer. För jämvikt, inkuberades celler med HBSS-buffert under 2 timmar, följt av en baslinjeinspelning i 5 minuter. Efter tillsats av CCh och CNO inspelades DMR i upp till 75 minuter. För att bestämma G-proteinkopplingsspecificitet inkuberades celler antingen med kikhoste (100 ng / ml) eller koleratoxin (1 ug / ml) över natten före DMR-inspelningar.

IP-ackumuleringsanalys

För att mäta inositolfosfat (IP) -bildning delades COS-7-celler upp i plattor med 12 brunnar (1, 5 x 105 celler / brunn) och transfekterades med en total mängd av 0, 5 μg plasmid-DNA och 1, 5 μl Lipofectamin per brunn. Därefter inkuberades cellerna med 2 uCi / ml myo-3H-inositol (18, 6 Ci / mmol, Perkin Elmer) under 18 timmar. Därefter tvättades cellerna en gång med serumfritt DMEM innehållande 10 mM LiCl följt av inkubering med testföreningar under 30 minuter vid 37 ° C. Intracellulära IP-nivåer bestämdes genom anjonbyteskromatografi såsom beskrivits tidigare 45 .

Fluorometriska kalciummätningar

COS-7-celler delades upp i T25-kolvar (1, 2 x 106) och transfekterades med 3 ug plasmid-DNA och 7, 5 pl Lipofectamin nästa dag. 48 timmar efter transfektion, togs cellerna bort med användning av Versene och märktes i DMEM med 4 mikrometer Fluo-4 AM (molekylära prober) under 30 minuter vid 37 ° C. Fritt färgämne avlägsnades genom centrifugering, och cellsuspensioner suspenderades på nytt i HBS-buffert (132 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM KCl, 5, 5 mM glukos och 1 mM MgCl2, justerad till pH 7, 4 med NaOH). Cellsuspensionen fördelades i svarta, klara botten 384 mikrowellplattor (Corning, Kaiserslautern, Tyskland) med 45.000 celler per brunn. Fluorescensmätningar utfördes i ett tvåstegsprotokoll med användning av en fluorescensavbildningsplattläsare och en robotvätskebehandlingsstation (Freedom Evo 150, Tecan, Männedorf, Schweiz). Fluorescensintensitet korrigerades för bakgrunden och normaliserades till de initiala intensiteterna (F / FO).

C. elegans- stammar

C. elegans- stammar odlades och manipulerades enligt standardprotokoll 46 . Vilda maskar var C. elegans variation Bristol, N2 och odlades vid 22 ° C. Allele gar-3 ( gk305 ) genererades av C. elegans gen-knockout-konsortiet. Stammen pha-1 ( e2123 ) ; him-5 ( e1490 ) gar-3 ( gk305 ) beskrevs tidigare (vänlig present från Dr. Rene Garcia, Texas A&M University) 16 och hölls vid 15 ° C. Transgenerna aprEx183 [ gar-3 :: yfp ( pYL9 ) pha-1 (+) pBSK ] , aprEx184 [ cegar-3Dq :: yfp ( pSP110 ) pha-1 (+) pBSK ] , aprEx186 [ rM3R :: yfp ( pSP104 ) pha-1 (+) pBSK ], aprEx187 [ rM3Dq :: yfp ( pSP106 ) pha-1 (+) pBSK ] aprEx188 [ rM3Ds :: yfp ( pSP108 ) pha-1 (+) pBSK ] och aprEx189 [ hM4Di :: yfp ( pSP114 ) pha-1 (+) pBSK ] genererades för denna studie (för detaljer se kompletterande metoder) och odlades vid 25 ° C.

Spikuleringsutdragningsanalys

24 timmar före genomförandet av analysen placerades hanarna av vildtyp L4 separat på NGM-agarplattor innehållande Escherichia coli OP50. Därefter monterades män på en 2% agarosdyna och en 100 ul av 2 mM CNO, 100 mM Oxo M, 10 mM CCh respektive H20 applicerades. Hanar poängsattes för spikulär utsprång med användning av ett Leica M165FC-mikroskop.

Nematoder med spikuler delvis eller fullständigt utdragna fick positiva resultat. Protraktionsgraden beräknades i förhållande till det totala antalet undersökta män.

Mikroskopi

För analys av transgenuttryck monterades vuxna män i M9 innehållande 250 um levamisol på en 2% agarosdyna. Differentiell interferenskontrast (DIC) och konfokala lysrörsbilder samlades in med en Olympus Fluoview FV1000-installation. Fluorescenssignaler kvantifierades genom intensitetsanalys med användning av ImageJ-programvara 47 .

Statistiska analyser

Statistisk signifikans av analysdata från spikulärutdragningsanalyser bestämdes med användning av en Fishers exakta test för varje genotyp och tillstånd. För statistiska analyser av stamstorlek, individer som nått vuxen ålder, livslängd, rörelse, svalgpumpning, äggläggning, känslighet för aldicarb och fluorescerande intensitetsberäkningar utfördes en student's t-test.

ytterligare information

Hur man citerar denna artikel : Prömel, S. et al. Avkryptering och modulering av G-proteinsignalering i C. elegans med hjälp av DREADD-tekniken. Sci. Rep. 6, 28901; doi: 10.1038 / srep28901 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.