Deacetylering av foxo3 av sirt1 eller sirt2 leder till skp2-medierad foxo3 ubiquitination och nedbrytning | onkogen

Deacetylering av foxo3 av sirt1 eller sirt2 leder till skp2-medierad foxo3 ubiquitination och nedbrytning | onkogen

Anonim

Abstrakt

Sirtuin deacetylaser och FOXO (Forkhead box, klass O) transkriptionsfaktorer har viktiga roller i många biologiska vägar, inklusive cancerutveckling. SIRT1 och SIRT2 deacetylat FOXO-faktorer för att reglera FOXO-funktionen. Eftersom acetylering och ubiquitination båda modifierar ɛ-aminogruppen av lysinrester, undersökte vi om FOXO3 deacetylering med SIRT1 eller SIRT2 underlättar FOXO3 ubikvitering och efterföljande proteasomal nedbrytning. Vi fann att SIRT1 och SIRT2 främjar FOXO3 poly-ubiquitination och nedbrytning. Proteasominhibitorbehandling förhindrade sirtuininducerad FOXO3-nedbrytning, vilket indikerar att denna process är proteasomberoende. Dessutom visade vi att E3 ubiquitin ligas subenhet Skp2 binder föredraget till deacetylerad FOXO3. Överuttryck av Skp2 orsakade poly-ubikvitination av FOXO3 och nedbrytning, medan knockdown av Skp2 ökade mängden FOXO3-protein. Vi presenterar också bevis för att SCF-Skp2 ubikvitinerar FOXO3 direkt in vitro . Vidare resulterade mutering av fyra kända acetylerade lysinrester (K242, K259, K290 och K569) av FOXO3 i argininer för att efterlikna deacetylerad FOXO3 i förbättrad Skp2-bindning men med hämning av FOXO3-ubikvitering; detta antyder att några eller alla dessa fyra lysinrester troligen är platserna för ubikvitering. I lever av möss som saknar SIRT1 upptäckte vi ökat uttryck av FOXO3, vilket indikerar att SIRT1 reglerar FOXO3-proteinnivåer in vivo . Vidare fann vi att förhöjningen av SIRT1- och Skp2-uttryck i malig PC3- och DU145-prostataceller är ansvarig för nedregleringen av FOXO3-proteinnivåer i dessa celler. Sammantaget stöder våra data uppfattningen att deacetylering av FOXO3 med SIRT1 eller SIRT2 underlättar Skp2-medierad FOXO3-poly-ubiquitination och proteasomal nedbrytning.

Introduktion

Sirtuin-familjen av NAD + -beroende deacetylaser har viktiga roller i regleringen av många cellfunktioner (Haigis och Guarente, 2006; Schwer och Verdin, 2008). Rapporter tyder på att de kan förmedla åtgärden av kaloribegränsning i kosten på förlängning av livslängd (Tissenbaum och Guarente, 2001; Libina et al., 2003; Lamming et al., 2005), även om det finns rapporter om konflikter (Kaeberlein et al., 2004, 2005, 2005) ). Forskning i jäst fann att Sir2 och dess homolog, Hst2, medierar livslängdsförlängningseffekten av kaloribegränsning på ett komplementärt sätt (Lamming et al., 2005). I Caenorhabditis elegans förlänger Sir2-homologen Sir2.1 livslängden genom transkriptionsfaktorn DAF-16, som är en nyckelaktör i C. elegans ' livslängdsbestämning (Tissenbaum och Guarente, 2001; Libina et al., 2003). Sir2-, Hst2- och DAF-16- gener bevaras evolutionärt. Däggdjursortologerna i Sir2 och Hst2 är SIRT1 respektive SIRT2, medan FOXO (Forkhead box, klass O) subfamiljtranskriptionsfaktorer, såsom FOXO1, FOXO3, FOXO4 och FOXO6, är däggdjurshomologerna från DAF-16. Kalorisk begränsning stimulerar uttrycket av både SIRT1 och SIRT2 (Cohen et al., 2004; Wang et al., 2007). SIRT1 reglerar många cellulära processer genom deacetylering av olika substrat (Verdin, 2007), inklusive FOXO1, FOXO3 och FOXO4 (Brunet et al., 2004; Daitoku et al., 2004; Motta et al., 2004; van der Horst et al., 2004; Yang et al., 2005). Dysreguleringen av SIRT1-uttryck och aktivitet är nära besläktad med tumörigenes (Kabra et al., 2009; Liu et al., 2009; Sung et al., 2010). Vi har funnit att SIRT2 också deacetylerar FOXO3 för att öka uttrycket av dess målgener, såsom p27 , MnSOD och Bim , vilket således reglerar cellproliferation, antioxidation och apoptos (Wang et al., 2007). Dessutom hämmar SIRT2 adipocytdifferentiering genom deacetylering av FOXO1 (Jing et al., 2007; Wang och Tong, 2009). Vidare befanns SIRT2 vara nedreglerad i gliomas och tvingat uttryck av SIRT2 i gliomceller, vilket orsakade tillväxtstopp och apoptos (Hiratsuka et al., 2003).

FOXO-transkriptionsfaktorer har kritiska roller i utveckling, tumörundertryckning och metabolisk reglering (Arden, 2008; Fu och Tindall, 2008; Gross et al., 2008). De fungerar i cellcykelstopp, differentiering och anti-oxidationsrespons (Arden, 2008; Ho et al., 2008; Sedding, 2008). FOXO3 undertrycker östrogenberoende bröstcancercelleproliferation och tumörgenes (Zou et al., 2008). Triple deletion av FOXO1, FOXO3 och FOXO4 i somatiska celler resulterade i bildandet av lymfom (Paik et al., 2007). FOXOs regleras i stor utsträckning av modifieringar efter translation, inklusive fosforylering, acetylering och ubikvitering (Obsil och Obsilova, 2008). Till exempel inducerar insulin fosforylering av FOXO1, FOXO3 och FOXO4 genom Akt / proteinkinas B, vilket leder till uteslutning av FOXO från kärnan och hämning av FOXO-transkriptionsaktiviteter (Biggs et al., 1999; Brunet et al., 1999) ; Kops et al., 1999; Rena et al., 1999; Takaishi et al., 1999). Å andra sidan, som svar på stress, fosforylerar FOXO-faktorer på olika platser, vilket resulterar i kärntranslokation och transaktivering. Liknande resultat observerades också hos C. elegans , genom att DAF-16 fosforyleras av JNK som svar på värmechock och främjar omlokalisering av DAF-16 till kärnan (Oh et al., 2005). Acetylering på lysinresten neutraliserar den positiva laddningen och minskar FOXO-DNA-bindande affinitet (Matsuzaki et al., 2005). Emellertid kan sirtuin deacetylering av FOXO-faktorer uppvisa motsatta funktionella konsekvenser. Det finns bevis på att SIRT1 deacetylering av FOXO leder till uppreglering av den transkriptionella aktiviteten hos FOXO (Daitoku et al., 2004; van der Horst et al., 2004). Rapporter visar också att SIRT1 har en negativ inverkan på FOXO-målgenuttryck (Motta et al., 2004; Yang et al., 2005). Dessa skillnader innebär att det finns ytterligare mekanismer, som reglerar FOXO-proteinfunktion genom acetylering / deacetylering.

Ubiquitin kan fästas kovalent till lysinresterna av målproteiner av E3 ubiquitin ligas (Sun, 2006) och i sig kan också ubikvitineras vid Lys48 eller Lys63 för att bilda poly-ubiquitinkedjor (Ravid och Hochstrasser, 2007; Yang et al., 2009 ). Målproteiner märkta med Lys48 poly-ubiquitinationskedjor känns vanligtvis igen och nedbryts av proteasomsystemet (Pickart, 2001). FOXO-proteiner kan vara mono-ubikvitinerade eller poly-ubikvitinerade. Mono-ubiquitination av FOXO4 visade sig aktivera dess transkriptionella aktivitet (van der Horst et al., 2006). Det finns också bevis på att fosforylering av Akt / proteinkinas B främjar FOXO1 och FOXO3 poly-ubikvitinering och proteasomal nedbrytning (Matsuzaki et al., 2003; Plas och Thompson, 2003). Dessutom fosforylerar IKB-kinas och extracellulärt signalreglerat kinas FOXO3 på olika ställen, vilket inducerar FOXO3-nedbrytning genom poly-ubiquitinering och proteasomal nedbrytning (Hu et al., 2004; Yang et al., 2008). Eftersom både modifiering av acetylering och ubikvitering är på ɛ-aminogruppen i lysinresten, kan deacetylering göra lysinresterna öppna för ubikitinering. I denna studie undersökte vi effekterna av deacetylering av SIRT1 och SIRT2 av FOXO3 på FOXO3-poly-ubikvitering och proteasomal nedbrytning. Vi undersökte vidare den roll som Skp2, en underenhet av E3 ubiquitin ligas, har i FOXO3 nedbrytning. Dessutom har vi bestämt bidraget från fyra kända acetylerade lysinrester av FOXO3 till Skp2-bindning och FOXO3-ubikvitinering.

Resultat

SIRT1 och SIRT2 främjar FOXO3-poly-ubiquitination

Eftersom acetylering och ubiquitination båda modifierar ɛ-aminogruppen av lysinrester av ett protein, och vi och andra har tidigare visat att SIRT1 och SIRT2 deacetylat FOXO3, beslutade vi att testa om SIRT1 eller SIRT2 reglerar FOXO3 poly-ubiquitination. För detta ändamål transfekterade vi HEK293T-celler med flaggmärkt FOXO3, tillsammans med SIRT1, SIRT1-H363Y deacetylas-mutant (Wang och Chen, 2010), SIRT2 eller SIRT2-H187A deacetylas-mutant (Finnin et al., 2001; Borra et al., 2002). Flaggmärkt FOXO3-protein immunutfälls med anti-Flag agarospärlor och dess ubikvitationsnivå detekterades med användning av anti-ubiquitin-antikropp. Vi fann att både SIRT1 och SIRT2-befordrad FOXO3-poly-ubikvitering (figur 1a), vilket tyder på att deacetylering av FOXO3 genom SIRT1 eller SIRT2 underlättar FOXO3-poly-ubikvitering. Dessutom hade uttrycket av SIRT1 deacetylas-mutanten (SIRT2-H363Y) eller SIRT2 deacetylas-mutanten (SIRT2-H187A) inte denna effekt och gjorde inte heller någon annan SIRT2 deacetylas-mutant (SIRT2-N168A) (kompletterande figur 1), vilket antydde att deacyl aktivitet, men inte speciell mutation, är kritisk för SIRT1 och SIRT2 för att främja FOXO3-poly-ubikvitinering (figur 1a).

SIRT1 och SIRT2 främjar FOXO3-poly-ubikvitination för att minska FOXO3-proteinstabiliteten. ( a ) HEK293T-celler transfekterades med pCDNA3, SIRT1 (S1), SIRT1-H363Y-mutant, SIRT2 (S2) eller SIRT2H187A-mutant (HA), tillsammans med Flag-FOXO3. 24 timmar efter transfektion behandlades cellerna med 20 μM MG-132 och 1 μM TSA i 4 timmar före skörd. Flag-FOXO3 immunutfälldes med agarospärlor mot flaggan. Ubiquitination av proteinerna detekterades genom western blotting med användning av anti-ubiquitin antikropp. Ntc, negativ kontroll. ( b ) Endogena FOXO3-nivåer i NIH3T3-celler med retroviralt medierat stabilt uttryck av SIRT1, SIRT2 och SIRT2-N168A-mutant (NA) detekterades genom Western blot-analys. ( c ) HEK293T-celler transfekterades med 1 ug SIRT1. Cellerna behandlades med 20 μg / ml cykloheximid (CH) och 20 μM emetin (EM) under antingen 2 eller 4 timmar före skörd, och endogena FOXO3-proteinnivåer detekterades genom western blotting. ( d ) SIRT1 slogs ner i HEK293T-celler med övergående transfektion av pRS-shSIRT1. Cellerna behandlades med 25 μM EM under 4 timmar. Endogena FOXO3-proteinnivåer detekterades genom western blotting. ( e ) SIRT2 slogs stabilt ner i NIH3T3-celler med användning av lentivirus som uttrycker SIRT2-målriktat shRNA. FOXO3-proteinstabilitet bestämdes genom Western blot-analys efter behandling med 25 | ig / ml CH och 20 | imM. NSB, icke-specifikt band. ( f ) Protein extraherades från levern från 3-månaders gamla SIRT1-knockout-möss och vildtypskontroller. FOXO3-proteinnivåer detekterades genom western blotting. * P <0, 05, ** P <0, 01.

Bild i full storlek

SIRT1 och SIRT2 minskar FOXO3-proteinstabiliteten

Eftersom poly-ubikvitination av ett protein vanligtvis riktar sig mot proteasomal nedbrytning undersökte vi därefter om FOXO3-proteinmängden minskas i närvaro av SIRT1 och SIRT2. NIH3T3-celler med stabilt överuttryck av SIRT2, SIRT2-N168A-mutant eller SIRT1 undersöktes med avseende på endogen FOXO3-proteinnivå genom Western blot-analys. Som visas i figur Ib, var FOXO3-proteinnivåerna i stabil tillstånd lägre i närvaro av överuttryck av vildtyp SIRT1 och SIRT2. SIRT2-N168A-mutation störde denna effekt. För att ytterligare undersöka effekten av SIRT1 eller SIRT2 på FOXO3-proteinstabilitet. HEK293T-celler transfekterades transient med antingen en SIRT1-uttryckande plasmid eller en kontrollvektor. FOXO3-proteinnivån i steady-state nedreglerades också när SIRT1 transient transienterades (kompletterande figur 2a). Efter transfektion behandlades celler med proteinsyntesinhibitorer, och överflödet av FOXO3-protein övervakades genom Western blot-analys. Såsom visas i figur 1c minskade uttrycket av SIRT1 FOXO3-proteinhalveringstiden. Å andra sidan, medan SIRT1 slogs ner med små hårnål-RNA i HEK293T-celler, minskades FOXO3-nedbrytningshastigheten (figur 1d). Vi följde sedan FOXO3-proteinstabilitet i celler transfekterade med SIRT2 eller SIRT2-N168A deacetylas-mutant. På liknande sätt påskyndade uttrycket av vildtyp SIRT2, men inte SIRT2 deacetylas-mutant FOXO3-proteinnedbrytningen (kompletterande figur 2b). För att testa huruvida att SIRT2 förstärker FOXO3-proteinstabilitet utnyttjade vi NIH3T3-celler med lentiviralt baserat stabilt SIRT2-kort hårnål-RNA (shRNA) knockdown (Wang et al., 2007). Som visas i figur 1e ökade nedslagning av SIRT2 signifikant FOXO3-proteinstabilitet. För att testa om SIRT1 reglerar FOXO3-proteinmängden in vivo , upptäckte vi FOXO3-proteinnivåer i levern av SIRT1-knockout-möss (Cheng et al., 2003). Såsom visas i figur 1f ökade ablationen av SIRT1 mängden FOXO3 i levern.

Sirtuin-befordrad FOXO3-nedbrytning medieras av proteasomerna

För att undersöka involvering av proteasom i SIRT1- eller SIRT2-medierad FOXO3-proteinnedbrytning, använde vi proteasomal hämmare MG-132 för att behandla NIH3T3-celler med stabilt retroviralt uttryck av SIRT1, SIRT2 eller en SIRT2 deacetylas-mutant (SIRT2-H187A) (Wang et al. ., 2007). De cellulära proteinnivåerna av FOXO3 detekterades genom Western blot-analys. Såsom visas i figur 2a minskade FOXO3-proteinnivåerna vid stabilitet i SIRT1- eller SIRT2-överuttryckande celler, medan SIRT2 deacetylas-mutanten saknade denna effekt. Behandling med proteasomal hämmare MG-132 under 8 timmar ökade mängden FOXO3-protein i SIRT1- eller SIRT2-överuttryckande celler till nivåer som är jämförbara med celler som uttrycker vektorkontroll eller SIRT2-H187A-mutant; detta indikerar att FOXO3-proteinerna bryts ned genom proteasomer. Omvänt hittade vi att stabil knockdown av SIRT2 i NIH3T3-celler ökade FOXO3-proteinmängden i stabil tillstånd (figur 2b). Dessutom orsakade hämning av proteasomnedbrytning med MG-132 under 4 timmar en ökning av FOXO3-proteininnehållet i både kontroll- och SIRT2-knockdownceller. Förlängd MG-132-behandling under 8 timmar ökade det cellulära FOXO3-proteinet i kontrollcellerna till en nivå vid vilken SIRT2-nedslagning gav ingen ytterligare ökning; detta stöder återigen idén att FOXO3-nedbrytning orsakad av SIRT2 är proteasom medierad.

SIRT1 och SIRT2 främjar FOXO3-proteinnedbrytning genom proteasom. ( a ) NIH3T3-celler med retroviralt medierat stabilt uttryck av SIRT1 (S1), SIRT2 (S2) och SIRT2H187A-mutant (HA) behandlades med 10 μM MG-132 under 8 timmar. Cellulära FOXO3-nivåer detekterades genom Western blot-analys. ( b ) NIH3T3-celler med stabil nedslagning av SIRT2 behandlades med 10 mikrometer MG-132 under 4 eller 8 timmar. Cellulära FOXO3-proteinnivåer detekterades genom western blotting. V, vektorkontroll; Ri, SIRT2 shRNA knockdownceller. ( c ) HEK293T-celler behandlades med 20 mikrometer emetin tillsammans med följande läkemedel såsom anges i figuren: 5 m M nicotinamid (N), 1 mikrometer TSA (T), 1 mikrometer epoxomicin (E) under 3 timmar och FOXO3 proteinnivåer detekterades genom Western blot-analys.

Bild i full storlek

För att undersöka om acetyleringsstatus påverkar FOXO3-stabiliteten, behandlade vi också HEK293T-celler med klass I / II histondeacetylas (HDAC) -inhibitor trikostatin A (TSA, 1 μM) eller klass III HDAC (sirtuin) -inhibitor nikotinamid (5 m M), som det har visats att FOXO3 deacetyleras av både klass I / II HDAC och sirtuiner, och att behandling med TSA och nikotinamid ökade FOXO3-acetyleringsnivåer (Brunet et al., 2004; Motta et al., 2004). Som väntat, höjde behandling av antingen TSA eller nikotinamid proteinnivåerna för FOXO3 (figur 2c), i överensstämmelse med uppfattningen att blockering av deacetylering uppreglerar FOXO3-proteinstabilitet. Genom att kombinera nikotinamid och TSA ökade FOXO3-mängden ytterligare och närmade sig en nivå som uppnåddes av proteasominhibitorepoxomicin. Att kombinera TSA och nikotinamid tillsammans med epoxomicin ökade inte FOXO3-nivåerna ytterligare, vilket indikerar att de alla fungerar genom samma väg.

E3 ubiquitin ligas subenhet Skp2 nedreglerar FOXO3 proteinmängd

Därefter undersökte vi de enzymer som var ansvariga för ubiquitinering av FOXO3 vid FOXO3 deacetylering. Huang et al. (2005) har rapporterat att E3 ubiquitin ligas subenhet Skp2 binder till och ubiquitinates FOXO1. Huruvida Skp2 också är involverad i FOXO3-ubiquitinering är inte klart. Vi fann att både FOXO3- och FOXO1-proteinnivåerna var förhöjda när Skp2 slogs ned med användning av shRNA i antingen DU149- eller HeLa-celler (figur 3a). Ett liknande resultat erhölls i HEK293T-celler transfekterade med en konstruktion innehållande shRNA mot Skp2. FOXO3-proteiner var mer stabila i Skp2-knockdownceller än i kontrollcellerna (figur 3b). Vidare, i HeLa-celler transfekterade med ökande mängder av en Skp2-uttryckande konstruktion, minskades de endogena FOXO3-nivåerna gradvis (figur 3c). Dessa resultat antyder att Skp2 kan ha en roll i FOXO3-nedbrytning. Minskningen av FOXO3-proteinmängden med Skp2 leder till en nedreglering av FOXO3-medierad transaktivering. En FOXO3-svarande luciferas-konstruktion transfekterades in i HEK293T-celler, tillsammans med Skp2-överuttryckande konstruktion eller Skp2-knockdown-konstruktion. Skp2-överuttryck minskade FOXO3-medierad transkription, medan Skp2-knockdown ökade FOXO3-transaktivering (figurerna 3d och e). Vidare fann vi att Skp2-knockdown resulterade i ett ökat uttryck av en FOXO3-målgen, tumornekrosfaktorrelaterad apoptosinducerande ligand (TRAIL) (Modur et al., 2002; Fu et al., 2009) (figur 3f). Repression av Skp2-uttryck förbättrade också celldöd (figur 3g).

Skp2 reglerar cellulärt FOXO3-proteinmängd. ( a ) Endogena FOXO3- och FOXO1-proteinnivåer detekterades i DU145- och HeLa-celler med Skp2-knockdown. NSB: icke-specifikt band. V, vektor. ( b ) Skp2 slogs ner i HEK293T-celler genom transient transfektion med en plasmidinnehållande Skp2-målriktad shRNA. FOXO3-proteinnivåer undersöktes efter behandling med 25 μg / ml emetin. ( c ) HeLa-celler som stabilt uttrycker His-biotin-ubikvitin transfekterades med ökande mängder Skp2. Vid 30 timmar efter transfektion analyserades endogena FOXO3-proteinnivåer genom western blotting. Uttrycket av Skp2 och glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) i celllysat detekterades också genom western blotting. ( d, e ) HEK293T-celler transfekterades med 6xDBE-Luc och FOXO3, tillsammans med Skp2 eller shSkp2. Celler skördades för luciferasanalys. ( f ) HEK293T-celler transfekterades med FOXO3 och shSkp2. 24 timmar efter transfektion detekterades uttrycket av tumörnekrosfaktorrelaterad apoptosinducerande ligand (TRAIL) med RT-kvantitativ PCR. ( g ) HeLa-celler transfekterades med FOXO3 och shSkp2. 24 timmar efter transfektion detekterades cellviabilitet genom MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicitetsanalys. * P <0, 05, ** P <0, 01.

Bild i full storlek

E3 ubiquitin ligas subenhet Skp2 interagerar med FOXO3 protein

Dessa resultat fick oss att undersöka om Skp2 interagerar med FOXO3. För detta ändamål transfekterade vi HEK293T-celler med Flag-FOXO3 och Skp2. Celler skördades sedan, och Flagg-märkta FOXO3-proteiner immunutfälldes med anti-Flag agarospärlor. Western blot-analys med användning av anti-Skp2-antikropp avslöjade att Skp2 interagerar med FOXO3 (figur 4a). Vi undersökte sedan den endogena interaktionen mellan Skp2 och FOXO3 i HEK293T-celler genom samimmunutfällningsförsök. Endogena FOXO3-proteiner immunutfälls med anti-FOXO3-antikropp, och samimmunutfällningen av Skp2 detekterades genom immunblotanalys med anti-Skp2-antikropp. Såsom visas i figur 4b interagerade endogena Skp2- och FOXO3-proteiner fysiskt med varandra. Nivån av samrenat Skp2-protein minskades när Skp2 slogs ner, vilket bekräftade specificiteten för samimmunutfällningen av Skp2. Den endogena interaktionen mellan Skp2 och FOXO3 detekterades också i HeLa-cellerna (kompletterande figur 3).

Skp2 interagerar företrädesvis med deacetylerad FOXO3. ( a ) HEK293T-celler transfekterades med Flag-FOXO3 och Skp2. 24 timmar efter transfektion lyserades cellerna och Flag-FOXO3 immunutfälldes med användning av anti-Flag agarospärlor. Samimmunutfällningen av Skp2 med FOXO3 detekterades genom western blotting. ( b ) Lysater från HEK293T-celler med eller utan Skp2-knockdown inkuberades med anti-FOXO3-antikropp, medan lysat från HEK293T-celler utan Skp2-knockdown inkuberades med kontrollimmunglobulin G (IgG) som negativ kontroll. Efter immunutfällning med BioMag get-anti-mus IgG-magnetiska pärlor detekterades närvaron av Skp2 i immunutfällningen genom western blotting. ( c ) HEK293T-celler transfekterades med Flag-FOXO3 och Skp2. Efter transfektion i 22 timmar behandlades celler med antingen 1 μM TSA, 5 m M nikotinamid (Nic) eller båda (T + N) under 2 timmar. Interaktion mellan Skp2 och FOXO3 analyserades genom immunutfällning följt av western blotting såsom indikerats. ( d ) HEK293T-celler transfekterades med Flag-FOXO3, Skp2 och SIRT1. Cellerna behandlades med 1 μM TSA under 6 timmar före skörd. Flag-FOXO3-proteiner immunutfälldes med anti-Flag agarospärlor. Interaktion mellan Skp2 och FOXO3 detekterades genom Western blot-analys.

Bild i full storlek

Deacetylering av FOXO3 ökar dess interaktion med Skp2

Eftersom deacetylering av FOXO3 leder till FOXO3 poly-ubikvitering och nedbrytning testade vi nästa om deacetylering av FOXO3 underlättar dess associering med Skp2. Vi behandlade först celler med deacetylasinhibitorer TSA eller nikotinamid. Vi fann att antingen TSA eller nikotinamidbehandling minskade bindningen av Skp2 till FOXO3 (figur 4c), medan kombinationen av TSA och nikotinamid hade en tillsatseffekt, vilket antyder att Skp2 företrädesvis binder till deacetylerad FOXO3. Dessutom ökades interaktionen mellan Skp2 och FOXO3-proteiner i närvaro av SIRT1 på ett dosberoende sätt (figur 4d). Därför ger vi bevis för att deacetylering av FOXO3 underlättar Skp2-dockning på FOXO3.

SCF-Skp2 ubikvitinerar FOXO3

Därefter undersökte vi om Skp2 är involverad i FOXO3-ubiquitination. Skp2 och Flaggmärkt FOXO3 samtransfekterades i HeLa-celler, som redan har stabilt uttryck för His-biotin-ubiquitin. Vi fann samuttryck av Skp2 kraftigt ökad poly-ubiquitination av FOXO3-proteiner (figur 5a). På liknande sätt minskades FOXO3 ubikvitationsnivå när Skp2 slogs ned i HEK293T-celler (figur 5b). För att demonstrera att Skp2-innehållande E3 ubiquitin-ligaskomplex direkt ubikvitinerar FOXO3, återuppbyggde vi ubiquitineringssystemet in vitro med renade FOXO3- och SCF – Skp2-komplexkomponenter, tillsammans med E1- och E2-enzymer. Såsom visas i figur 5c hittades poly-ubikvitinering av HA-FOXO3 endast när SCF-Skp2 tillsattes. Närvaron av HA-FOXO3 och ubiquitin krävdes också. Detta resultat indikerar att SCF-Skp2 direkt ubikvitinerar FOXO3.

SCF-Skp2 ubikvitinerar FOXO3. ( a ) HeLa-celler med stabilt uttryck av His-biotin-ubiquitin transfekterades med Flag-FOXO3 och Skp2. Två dagar efter transfektion lyserades cellerna och FOXO3-Flag-proteiner immunutfälldes med anti-Flag agarospärlor. Ubiquitination av FOXO3 detekterades genom western blotting med anti-ubiquitin antikropp. Skp2-överuttryck i celllysat visades i bottenpanelen. ( b ) HEK293T-celler transfekterades med FOXO3-Flag och shSkp2. Efter 24 timmar efter transfektion behandlades celler med 20 μM MG-132 under 4 timmar. FOXO3-Flag-proteiner immunutfälls med anti-Flag agarospärlor och ubikvitineringen av FOXO3 detekterades genom western blotting. ( c ) HA-FOXO3 och SCF – Skp2 komplexa komponenter uttrycktes i HEK293T-celler och renades separat. Ubiquitination av FOXO3 med SCF-Skp2 utfördes i ett in vitro rekonstituerat system under 2 timmar, och detekterades genom western blot-analys med användning av anti-ubiquitin-antikropp. Ingången till FOXO3 visas i bottenpanelen.

Bild i full storlek

Fyra FOXO3-lysinrester kända för acetylering är också ubikvitationsställen

Brunet et al. (2004) har identifierat fem lysinrester i FOXO3, som är acetylerade. FOXO3-lysinrester modifierade genom ubiquitination är emellertid inte kända. För att bestämma om de kända acetyleringsställena är viktiga för FOXO3-ubikvitering undersökte vi ubikitinationen av en FOXO3-mutant (FOXO3-4KR) med fyra kända acetyleringsställen (K242, K259, K290 och K569) muterade till argininer. Dessutom har det andra kända FOXO3-acetyleringsstället, K270, och dess intilliggande två lysinrester, K269 och K271, den högsta sannolikheten för ubikitinering baserad på online-ubikitineringsprognosanalys (//bdmpub.biocuckoo.org/prediction.php). Därför genererades och testades också en FOXO3-3KR-mutant med K269, K270 och K271 muterad till argininer. Såsom visas i figur 6a har FOXO3-4KR-mutant, men inte FOXO3-3KR-mutanten, en kraftigt reducerad nivå av acetylering; detta bekräftar att lysinrester vid 242, 259, 290 och 569 är huvudsakliga FOXO3-acetyleringsställen. Vi undersökte sedan effekterna av dessa mutationer på ubiquitinering av FOXO-protein när de är övergående uttryckta i HEK293T-celler. Till vår överraskning fann vi att FOXO3-4KR-mutanten faktiskt hade en signifikant reducerad nivå av ubiquitination, medan FOXO3-3KR-mutationen inte hade något märkbart inflytande på FOXO3-ubiquitinering (figur 6b). Detta resultat antyder att de fyra lysinrester som muterades i 4KR-mutanten (K242, K259, K290 och K569), men inte de tre lysinerna i 3KR-mutanten (K269, K270 och K271), krävs för FOXO3-ubikvitering. Som vi har visat att deacetylering av FOXO3 främjar Skp2-bindning och lysin-till-argininmutation efterliknar det deacetylerade tillståndet, bör FOXO-4KR-mutationen öka Skp2-bindningen. Som förutsagt visade FOXO3-4KR-mutant förbättrad interaktion med Skp2 (figur 6c). En förklaring till ökningen av Skp2-bindning med reducerad ubiquitination av 4KR-mutanten är att de fyra lysinresterna (K242, K259, K290 och K569) också är platserna för ubiquitination. Denna uppfattning bekräftas genom in vitro ubikvitationsanalyser med användning av renade FOXO3-proteiner med antingen mutationer av var och en av dessa fyra lysinrester, eller alla fyra kombinerade, tillsammans med E1 – E2 – SCF – Skp2-komplex. Ubiquitinationen av FOXO3 detekterades med Western blot-analys med användning av antikroppar mot antingen ubiquitin (figur 6c) eller FOXO3 (figur 6d). Vi fann att K569R-mutation minskade något FOXO3 in vitro ubiquitination, medan andra individuella mutationer hade liten effekt (figur 6c och d). Mutering av alla fyra lysiner minskade dramatiskt FOXO3 ubiquitination. Detta resultat antyder att K569 och åtminstone en av de andra tre lysinresterna (K242, K259 eller K290) är ubikvitinerade av Skp2.

Identifiering av FOXO3-lysinrester som krävs för ubikvitinering. ( a ) HEK293T-celler transfekterades med vildtyp FOXO3, FOXO3-3KR (K269R, K270R och K271R) eller FOXO3-4KR (K242R, K259R, K290R och K569R). Efter 40 timmar efter transfektion behandlades cellerna med 1 μM TSA och 5 m M nikotinamid under 4 timmar. FOXO3a immunutfälldes med agarospärlor mot flaggan. FOXO3-acetyleringsnivåerna detekterades genom western blotting. ( b ) HEK293T-celler transfekterades med vildtyp FOXO3, FOXO3-3KR eller FOXO3-4KR. Efter 40 timmar efter transfektion behandlades celler med 25 μM MG-132 under 4 timmar. Ubikvitinationen av FOXO3 detekterades genom western blotting efter immunutfällning av Flag-FOXO3. ( c ) HEK293T-celler transfekterades med Skp2, tillsammans med vildtyp FOXO3 eller FOXO3-4KR. Interaktionen mellan Skp2 och antingen FOXO3 eller FOXO3-4KR detekterades genom västlig blotting av Skp2 efter immunutfällning av Flagg-märkta FOXO3-proteiner. ( d, e ) Flaggmärkt FOXO3 av vildtyp och olika FOXO3-mutanter uttrycktes tillfälligt i HEK293T-celler och immunutfälldes individuellt med användning av anti-Flag agarospärlor. Ubiquitination av FOXO3 med SCF-Skp2 utfördes i ett in vitro rekonstituerat system under 2 timmar, och detekterades genom western blot-analys med anti-ubiquitin-antikropp ( d ) eller anti-FOXO3-antikropp ( e ).

Bild i full storlek

FOXO3-nivåer är omvänd korrelerade med SIRT1- och Skp2-nivåer i prostatacancercellinjer

Det rapporterades att SIRT1-nivåerna var markant uppreglerade i PC3- och DU145-maligna prostatacellinjer jämfört med normala humana prostatapitelceller (PrECs) (Kojima et al., 2008). Hämning av SIRT1 i PC3- eller DU145-celler undertryckte cellproliferation och sensibiliserade celler för kamptotecin och cisplatin (Kojima et al., 2008). Men den underliggande mekanismen var inte klar. Eftersom vi fann att SIRT1 främjar FOXO3-nedbrytning och FOXO3 kan fungera som en tumörsuppressor (Dansen och Burgering, 2008), upptäckte vi FOXO3-nivåer i PrEC, PC3 och DU145 prostataceller. Vi bekräftade att SIRT1-expression var förhöjd i PC3- och DU145-celler i en ordning av PrEC

PC3> DU145. Intressant nog fann vi att Skp2-nivåerna också var förhöjda på liknande sätt som SIRT1 i PC3- och DU145-celler (figur 7a). För att bekräfta att det förhöjda uttrycket av SIRT1 och Skp2 i prostataceller är ansvarigt för de minskade FOXO3-proteinnivåerna, slog vi ner SIRT1-uttrycket i DU145-celler och observerade en ökning av FOXO3-uttrycket (figur 7b). På liknande sätt höjde ned Skp2 också FOXO3-nivå i DU145-celler (figur 3a).

FOXO3-proteinnivåer är omvänt korrelerade med SIRT1- och Skp2-nivåer i prostatacellinjer. ( a ) FOXO3-, SIRT1- och Skp2-proteinnivåer i PrEC-, PC3- och DU145-celler detekterades genom Western blot-analys. ( b ) DU145-celler transfekterade med kontroll (CTL) eller SIRT1-shRNA-uttryckande plasmider (shSIRT1) behandlades med 40 ug / ml cykloheximid (CH) och 10 n M emetin (EM) under 4 timmar. FOXO3-nivåer detekterades genom western blotting och kvantifierades. ** P <0, 01.

Bild i full storlek

Diskussion

FOXO-transkriptionsfaktorerna regleras av post-translationella modifieringar såsom fosforylering, acetylering och ubikvitering. Vi undersökte om deacetylering av FOXO3 med SIRT1 och SIRT2 påverkar FOXO3 poly-ubikvitination och nedbrytning. Vi har funnit att överuttryck av SIRT1 eller SIRT2, men inte en SIRT1 eller SIRT2 deacetylas-mutant, förhöjd FOXO3-poly-ubiquitination och nedbrytningshastighet på ett proteasomberoende sätt, medan att slå ner SIRT1 eller SIRT2 ökade FOXO3-proteinstabilitet. Således presenterar vi bevis som visar att SIRT1 och SIRT2 negativt reglerar FOXO3 genom att underlätta dess proteasomala nedbrytning. Effekterna av SIRT1 och SIRT2 kan vara partiella, eftersom FOXO3 är känt för att också deacetyleras av HDAC: er (Brunet et al., 2004). Det är möjligt att HDAC kan reglera FOXO3-proteinstabilitet på liknande sätt. I överensstämmelse med detta ledde behandling av celler med HDAC-hämmare, TSA, också till en ökning av FOXO3-proteinnivån (figur 2c).

Vidare visade vi att E3 ubiquitin ligas subenhet Skp2 är ansvarig för att erkänna deacetylerad FOXO3 för att ubikitinera FOXO3 för proteasomal nedbrytning. Skp2 rapporterades tidigare att interagera med FOXO1, men inte FOXO3 (Huang et al., 2005). Vi fann dock att endogen FOXO3 interagerar med Skp2 i både HEK293T-celler (figur 4b) och HeLa-celler (kompletterande figur 3). Acetyleringsstatusen för FOXO3 påverkar Skp2-dockning på FOXO3-protein. Deacetylasinhibitorer, nikotinamid och TSA, minskar Skp2-bindningen till FOXO3, medan vildtyp SIRT1 och SIRT2 ökar bindningen av Skp2 till FOXO3. Vidare främjar mutation av fyra FOXO3-lysinrester (K242, K259, K290 och K569), som är kända för att vara acetylerade, till deacetylerings-efterliknande argininer Skp2-bindning. Dessa fynd fastställer en preferens av Skp2 för deacetylerad FOXO3. Vi hittade nästa SCF-Skp2 ubiquitinater FOXO3 i odlade celler och in vitro , möjligen på K569 och på minst en av tre andra lysiner (K242, K259 och K290). Vidare höjer Skp2 FOXO3 i tre olika cellinjer, medan överuttryckning av Skp2 sänker FOXO3-proteinnivåerna på ett Skp2-dosberoende sätt. Alla dessa data ger starka bevis på att deacetyleringen av FOXO3 inte bara underlättar Skp2-bindning, utan gör också tidigare otillgängliga lysiner redo för ubiquitinering.

De rapporterade effekterna av FOXO-acetylering på FOXO-målgenuttryck är kontroversiella. Fukuoka et al. (2003) rapporterade att acetyltransferas CBP undertrycker FOXO4 genom acetylering, medan Perrot och Rechler (2005) fann att p300 acetylater FOXO1 och stimulerar FOXO1-inducerad transkription. På liknande sätt kontroversiella är effekterna av FOXO deacetylering av sirtuins, med rapporter om antingen ökning eller minskning av uttrycket av FOXO målgener (Brunet et al., 2004; Daitoku et al., 2004; Motta et al., 2004; van der Horst et al., 2004; Yang et al., 2005). Hittills är emellertid uppgifterna konsekventa angående effekten av FOXO deacetylering på FOXO DNA-bindning till målinriktade genpromotorer. Matsuzaki et al. (2005) fann att FOXO1-3KR (K242R, K245R och K262R) -mutanten, som härmar den oacetylerade formen av FOXO1, har samma DNA-bindande affinitet till glukos-6-fosfatasgenpromotorn som vildtyp FOXO1. Däremot har FOXO1-3KA och FOXO1-3KQ-mutanter av samma lysinrester mindre DNA-bindande affinitet. På liknande sätt har Kitamura et al. (2005) fann att FOXO1-6KR-mutant (efterliknar deacetylerad form av FOXO1) har bättre DNA-bindande affinitet och starkare transaktivering av en FOXO luciferasreporter än 6KQ-mutanten (K242R, K245R, K259R, K262R, K271R och K291R), acetylerad form av FOXO1. Vi har också funnit att SIRT2 ökar FOXO3-bindning till p27-promotorregionen genom kromatinimmunutfällningsanalys (Wang et al., 2007).

Vår observation att deacetylering av FOXO3 med SIRT1 och SIRT2 främjar FOXO3 proteasomal nedbrytning indikerar en potentiellt negativ regleringsmekanism för att kompensera den positiva effekten av aktiveringen av FOXO DNA-bindning och transaktivering. Detta fynd erbjuder en möjlig förklaring till de motsägelsefulla upptäckterna av effekten av FOXO deacetylering på FOXO målgenuttryck . Således kan nettoutfallet av SIRT1 eller SIRT2 på FOXO-målgenuttryck vara en balans mellan den positiva effekten genom ökningen av DNA-bindning och den negativa effekten genom FOXO-poly-ubikvitinering och nedbrytning orsakad av sirtuin deacetylering av FOXO-proteiner. Tänkbart kan denna balans mellan transaktivering och nedbrytning av FOXO lutas av andra post-translationella modifieringar av FOXO3, såsom fosforylering (Matsuzaki et al., 2003; Hu et al., 2004), som svar på cellulära signalhändelser initierade av hormonella, närings- eller stresssignaler. Arbetet av Brunet et al. (2004) har indikerat att sirtuin deacetylering av FOXO-proteiner kan aktivera transaktivering av en delmängd av FOXO -målgener men hämmar uttrycket av andra FOXO -målgener och förskjuter celler från apoptos mot tillväxtstopp och DNA-reparation. FOXO ubiquitination efter deacetylering kan också bidra till denna process.

Slutligen kan regleringen av FOXO3-proteinstabilitet genom sirtuins och Skp2 ha en roll i nedregleringen av FOXO3-nivån i cancerceller. Det har dokumenterats att uttrycket av SIRT1 (Deng, 2009) och Skp2 (Chan et al., 2010) ökas i många typer av tumörer eller cancerceller. Vi fann att höjningen av SIRT1 och Skp2 i prostatacancerceller är ansvariga för nedregleringen av FOXO3. Eftersom FOXO3 hämmar cellproliferation och främjar apoptos har den egenskapen som en tumörsuppressor (Paik et al., 2007) och dess nivå nedregleras i vissa tumörer (Hu et al., 2004). Vårt fynd erbjuder en mekanistisk koppling mellan uppregleringen av SIRT1 och Skp2 och nedregleringen av FOXO3 i tumörceller.

Material och metoder

Plasmider och antikroppar

pBabe-puro SIRT2, pCMV-SIRT2 och pcDNA-SIRT2-Flag beskrivs tidigare (Wang et al., 2007). N168A- och H187A-mutanterna av SIRT2 genererades med PCR-metoden såsom beskrivits tidigare (Wang et al., 2007; Wang och Tong, 2009). pcDNA-SIRT1 var en gåva från Dr Tony Kouzarides. pcDNA-SIRT1-H363Y tillhandahölls av Dr Junjie Chen. 6X DBE-Luc levererades av Dr Boudewijn MT Burgering. pcDNA-hSkp1, pcDNA-Cul1 och pcDNA-Roc1 tillhandahöll vänligen av Dr Steven I Reed. pECE-FOXO3-M2 vildtyp, K242R, K259R, K290R, K569R och 4KR (K242, K259, K290 och K569 ersattes med argininer) tillhandahölls av Dr Anne Brunet. pECE-FOXO2-M2-3KR (K269, K270 och K271 ersattes med argininer) genererades från vildtyp FOXO3 med användning av PCR-metoden (Makarova et al., 2000) med följande primer: 5'-GGCCGCGCAGCCAGAAGACGGGCAGCCCTGCAGAC-3 . Följande antikroppar användes för immunutfällning eller Western blot-analys: SIRT1 (Upstate, Lake Placid, NY, USA, 07-131), SIRT2 (Santa Cruz, Austin, TX, USA, sc-20966), Tubulin (Sigma, St Louis, MO, USA, T5168), Actin (Santa Cruz, sc-1616), glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenas (Ambion, St Louis, MO, USA, 4300), FOXO3 (Upstate, 06-951; Sigma, F1304), FOXO1 (Santa Cruz, sc-11350), Skp2 (Santa Cruz, sc-7164), Ubiquitin (Santa Cruz, sc-9133, sc-8017), anti-Flag-HRP (Sigma, A8592), HRP-konjugerad anti-mus ( Bio-Rad, Hercules, CA, USA, 170-6516, 1: 3000), anti-kanin (Bio-Rad, 170-6515, 1: 3000) och anti-kaninimmunoglobulin G-nativt (Sigma, R3155, 1: 2000) antikroppar. SuperSignal West Pico Chemiluminescent kit (Pierce, Rockford, IL, USA) användes som underlag.

Cellodling och transfektion

NIH3T3, Bosc23 och HEK293T bibehölls i Dulbeccos modifierade örnmedium med 10% kalvserum. HeLa-celler med stabilt uttryck av His-biotin-ubiquitinceller tillhandahölls av Dr Jianping Jin och bibehölls i Dulbeccos modifierade örnmedium med 10% fetalt bovint serum. PC3- och DU145-celler bibehölls RPMI1640-medium med 10% fetalt bovint serum. PrEC: er upprätthölls i PrEM-medium (Lonza, Walkersville, MD, USA, CC-3166). För transient transfektion transfekterades Bosc23, HEK293T-celler i 100 mm plattor eller sex-brunnars plattor med kalciumfosfatmetoden (Jordan et al., 1996). His-biotin-ubiquitin och DU145-celler transfekterades med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. NIH3T3-stabila SIRT1-uttryckande celler upprättades med användning av det pBabe-puro retrovirala vektorsystemet som beskrivits tidigare (Wang et al., 2007) NIH3T3-stabila celler som uttrycker SIRT2 eller en SIRT2-mutant eller NIH3T3-celler med stabil SIRT2 (shRNA) knockdown rapporterades tidigare (Wang et al., 2007). Skp2-inriktning shRNA (5'-TCTAAGCCTGGAAGGCCTG-3 ') och GFP shRNA (5'-GCAAGCTGACCCTGAAGTTC-3') subklonades in i pSUPER-puro-vektorn (Oligoengine, Seattle, WA, USA), följt av transfektion i Phoenix-förpackningsceller och infektion i DU145-celler enligt standardförfarandet (Brummelkamp et al., 2002). Dessa plasmider användes också för övergående knockdown av Skp2 i HEK293T-celler genom transient transfektion. pRS-shSIRTl-plasmid (Origene, Rockville, MD, USA, TI337728, 5'-TTATTTGGCTACACTAAAGAATGCAGTAT-3 ') användes för övergående knockdown av SIRT1 i HEK293T-celler och DU145-celler. pRD-shGFP icke-effektiv (Origene, TR30003) användes som kontroll.

Immunutfällning och immunblotanalys

Celler lyserades med lysbuffert (50 m M Tris, 50 m M KCL, 20 m M NaF, 1 m M Na3 VO4, 10 m M EDTA, 1% NP-40, 10 m M nikotinamid, 1 m M TSA (Trichostatin A), 1 m M fenylmetansulfonylfluorid, 5 ug / ml leupeptin, pH 8, 0). För immunutfällning inkuberades celllysat med 20 ul agaros-pärlor mot anti-flagga (Sigma, A2220) vid 4 ° C med skakning över natten. Efter att ha tvättats fem gånger med lysbuffert, upplöstes de utfällda proteinerna med natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores följt av immunblotanalys. För endogen protein-proteininteraktion lyserades HEK293T-celler med eller utan Skp2-knockdown och följdes av inkubation med anti-FOXO3 monoklonal antikropp eller kontroll av immunoglobulin G vid 4 ° C över natt. Immunkomplexen fälldes sedan ut med BioMag Goat anti-mus immunoglobulin G magnetiska pärlor (Polysciences, Warrington, PA, USA, 84340G) och följdes av immunoblotanalys.

Ubiquitinering in vitro

Ubiquitinering in vitro genomfördes baserat på ett protokoll utvecklat av Steven I Reed (Strohmaier et al., 2001; Tedesco et al., 2002). I korthet transfekterades HA-FOXO3 eller SCF – Skp2-komplex (Skpl, Cul1, Roc1 och Skp2-Flag) till HEK293T-celler. Efter 40 timmar efter transfektion behandlades cellerna med 5 ug / ml insulin under 30 minuter. Recombinant SCF–Skp2 complexes were isolated from cell lysate with anti-Flag agarose beads (Sigma), and then eluted in ubiquitination buffer (5 m M NaF, 1 m M NaVO 4, 1.5 m M MgCl 2, 5 m M KCl, 1 m M Dithiothreitol, 20 m M (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) (pH 7.4), 2 μg/ml aprotinin, 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin and 1 m M phenylmethanesulfonyl fluoride ) containing FLAG peptide (Sigma). HA-FOXO3 was isolated with HA antibody and anti-mouse immunoglobulin G magnetic beads (Polysciences). SCF–Skp2 complex, in the volume 12 μl, was added to 12 μl HA-FOXO3 immobilized on beads. In all, 0.5 μg ubiquitin (Boston Biochem, Cambridge, MA, USA), 1.5 μg methyl ubiquitin (Boston Biochem), 1.3 μg UbcH3/Cdc34 (Boston Biochem), 0.65 μg E1 enzyme (Boston Biochem) and 2.5 m M adenosine triphosphate were added to make a final volume of 30 μl reaction system. Ubiquitination reactions were maintained at 30 °C for 2 h and then terminated by washing the pellets three times in cell lysis buffer. HA-FOXO3 were eluted in sodium dodecyl sulfate sample buffer with boiling and analyzed by western blotting.

Luciferasanalys

FOXO-responding luciferase report construct 6xDBE-Luc (van der Horst et al., 2006) was transfected into HEK293T cells along with plasmids expressing FOXO3, Skp2 or shSkp2 using the calcium phosphate method. A construct expressing Renilla luciferase was included as an internal control for transfection efficiency. At 24 h after transfection, cells were lysed and the activities of both luciferases were measured using the dual luciferase kit (Promega, Madison, WI, USA) according to the manufacturer's instruction. Firefly luciferase activity was normalized by the Renilla luciferase activity.

PCR i realtid

Real-time PCR was performed using Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to manufacturer's instruction. Following primers were used: tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand: 5′-GACCTGCGTGCTGATCGTG-3′ and 5′-TGTCCTGCATCTGCTTCAGCT-3′; 18sRNA: 5′-AACGAGACTCTGGCATGCTAACTAG-3′ and 5′-CGCCACTTGTCCCTCTAAGAA-3′.

Cell viability measurement

HeLa cells were transfected with pSuper, pSuper-shSkp2 and FOXO3 with lipofectamin. At 40 h after transfection, cell viability was measured with the MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay kit (Promega) according to the manufacturer's instruction. Briefly, cells in each well of 96-well plates were incubated with 100 μl fresh medium containing live-cell Fluorescence Reagent (Promega). After incubation for 30 min, fluorescence produced by living cells was measured using a SPECTRAmax GEMINI XS Spectrofluorometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). The results were presented as means±sd of three independent experiments.

Statistisk analys

The statistical significance was determined using the Student's t -test. Differences between groups were considered statistically significant if P <0.05.

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

  3. 3.

    Kompletterande figur 3

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)