Csbf / c10orf99, en ny potentiell cytokin, hämmar tillväxt av tjocktarmscancer genom att inducera g1-arrestering | vetenskapliga rapporter

Csbf / c10orf99, en ny potentiell cytokin, hämmar tillväxt av tjocktarmscancer genom att inducera g1-arrestering | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • cytokiner
  • onkogener

Abstrakt

Cytokiner är lösliga proteiner som utövar sina funktioner genom att binda specifika receptorer. Många cytokiner spelar väsentliga roller i karcinogenes och har utvecklats för behandling av cancer. I den här studien identifierade vi en ny potentiell cytokin med hjälp av immunogenomika betecknad kolon-härledd SUSD2-bindningsfaktor (CSBF), även känd som kromosom 10 öppen läsram 99 (C10orf99). CSBF / C10orf99 är ett klassiskt utsöndrat protein med förutsagd molekylmassa på 6, 5 kDa och en funktionell ligand av Sushi Domain Containing 2 (SUSD2). CSBF / C10orf99 har den högsta expressionsnivån i kolonvävnad. Både CSBF / C10orf99 och SUSD2 är nedreglerade i tjocktarmscancervävnader och cellinjer med olika regleringsmekanismer. CSBF / C10orf99 interagerar med SUSD2 för att hämma cellcancertillväxt i tjocktarmscancer och inducera G1-cellcykelstopp genom nedreglerande cyklin D och cyklinberoende kinas 6 (CDK6). CSBF / C10orf99 visar en klockformad aktivitetskurva med optimal effekt vid ~ 10 ng / ml. Dess tillväxtinhiberande effekter kan blockeras av sSUSD2-Fc lösligt protein. Våra resultat antyder att CSBF / C10orf99 är en ny potentiell cytokin med tumörsuppressorfunktioner.

Introduktion

Cytokiner är små utsöndrade proteiner (~ 5–20 kDa) som binder specifika receptorer för att utöva sina effekter på ett paracrin eller autokrin sätt 1, 2 . De produceras av immunceller, såsom dendritceller 3, NK-celler 4 och T-lymfocyter 5, 6, och icke-immunceller 7 inklusive endotelceller 8, fibroblaster 9, 10, stromalceller 11, 12 et al. Cytokiner spelar viktiga roller i immunsvar, inflammation och karcinogenes 13, 14, 15, 16 . EGF (epidermal tillväxtfaktor) 17, VEGF (vaskulär endotelväxtfaktor) 18 och HGF (hepatocyt tillväxtfaktor) 19 har betydande effekter på onkogenes, och de har utvecklats som mål för tumörterapi. Å andra sidan fungerar vissa cytokiner som tumörundertryckare, vilket förhindrar och undertrycker utvecklingen av cancer 20, såsom onkostatin M (OSM) 21 och interleukin-24 (IL-24) 22 . OSM är ett multifunktionellt interleukin 6-relaterat cytokin, som hämmar spridningen av olika solida tumörcellinjer. IL-24 är en cytokin tumörsuppressor, som initialt identifierades som en melanom-differentieringsassocierad molekyl. IL-24 är en av IL-10-familjecytokinerna och hämmar tumörcelltillväxt, invasion och migration genom att inducera tumörcellapoptos och G1-cellcykelstopp med nedreglering av Cyclin D. IL-24 är signifikant nedreglerat i kolorektal cancervävnader jämfört med den i den intilliggande normala slemhinnan med post-transkriptionella modifieringar 23 .

CRC representerar den tredje vanligaste cancer i världen 24 . Dess utveckling är en flerstegsprocess som kännetecknas av en komplex interaktion mellan genetiska förändringar och värdets immunsystem 25, 26 . Proto-onkogener, inklusive K-ras och c-myc 27, spelar viktiga roller i kolorektal karcinogenes. Å andra sidan är tumörundertryckningsgener (TSGs) 28, 29, såsom p16, p21, p27, p53, APC, DCC och MMR, också av stor betydelse under denna process. TSG hämmar obegränsad celldelning i normala celler och begränsar tumörcelltillväxt genom att bromsa celldelningen, reparera DNA-misstag och inducera programmerad celldöd. Emellertid kan förlust av funktion eller minskat uttryck av TSG, som orsakas av genetisk mutation, borttagning av allel, promotormetylering eller andra mekanismer, bidra till utvecklingen av okontrollerad celltillväxt av cancer. CRC kan behandlas med kirurgi i sina tidiga stadier 30, men det metastas vanligtvis vid diagnostiden, vilket kräver kemoterapi. Kemoterapi är emellertid inte särskilt effektiv i närvaro av metastaser, med överlevnadsnivån lägre än 10%. Sammantaget är misslyckande med tidig diagnos och terapimotstånd de viktigaste dödsorsakerna från CRC 31, 32, 33 .

Hittills har många cytokiner och deras relaterade proteiner utvecklats för behandling av cancer 34 . Till exempel använder tumörspecifika terapier mot CRC vanligtvis Avastin (bevacizumab) 35 eller Erbitux (cetuximab) 36, kombinerat med traditionell kemoterapi. Avastin hämmar tillväxten av blodkärl genom att blockera VEGF, och Erbitux minskar tillväxten av cancer genom att binda EGFR. En klinisk fas I-studie med en rekombinant adenovirusvektor som uttrycker IL-24 (Ad-IL24 / INGN241) rapporterade att Ad-IL24-behandling hade mätbara tumördödande effekter hos över 40% av patienterna 37 . Det kommer därför att vara av stort värde att identifiera och karakterisera nya cytokiner för både grundforskning och klinisk tillämpning.

För att isolera nya potentiella cytokiner har vi etablerat en plattform som använder immunogenomics som tidigare rapporterats 38 och hittat flera utsöndrade proteiner med viktiga funktioner. CSBF / C10orf99 är en av dem. Här visar vi att CSBF / C10orf99 är ett klassiskt utsöndrat protein med liten molekylstorlek. Den har den högsta expressionsnivån i normal kolonvävnad och minskar i tjocktarmscancervävnader och cellinjer. CSBF / C10orf99 interagerar med SUSD2 för att hämma cellcancertillväxt i tjocktarmscancer och inducera G1-cellcykelstopp genom nedreglerande cyklin D och cyklinberoende kinas 6 (CDK6). Den visar en klockformad aktivitetskurva med maximal effekt vid ~ 10 ng / ml och sSUSD2-Fc-lösligt protein kan blockera dess funktion. Våra resultat visar att CSBF / C10orf99 är en ny potentiell cytokin med tumörundertryckningsaktiviteter.

Resultat

CSBF / C10orf99 är ett klassiskt utsöndrat protein

Det fullständiga cDNA och härledda aminosyrasekvenserna av CSBF / C10orf99 visas i figur la. CDNA från CSBF / C10orf99 innehåller typisk polyadenyleringssignal (AATAAA) inom 3 'UTR och Kozak-sekvensen (CACCATG) 39 inom 5' UTR. CSBF / C10orf99 är sammansatt av 81 aminosyror, innehållande en signalpeptid som förutses av SignalP 4.0 Server (//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) och en transmembran helices-domän i N-terminalen förutsagd av TMHMM Server v 2, 0 (//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/). Transmembranhelikdomänen är belägen i signalpeptiden.

(a) CDNA och härledda aminosyrasekvenser av CSBF / C10orf99 visas. Den förutsagda signalpeptiden vid 5'-änden skrivs i kursiv stil. Transembranhelikdomänen indikeras med röd färg. Stoppsignal ersätts av asterisk. Den förmodade signalen för polyadenylering vid 3'-änden är understrukad. (b) Den subcellulära lokaliseringen av CSBF / C10orf99 bestämdes genom mikroskopi. Upp fixades Transfekterade HEK 293T-celler och färgades med anti-myc och Hoechst 33258. EGFP visas i grönt, medan anti-myc-färgning visas med rött. Lokaliseringen av CSBF-myc-His och det indikerade GFP-fusionsproteinet observerades genom konfokal laserscanningsmikroskopi (LSM). De visade uppgifterna är representativa för minst tre oberoende experiment. Skala bar = 25 μm. Ner, celler som uttrycker DsRed-ER, DsRed-Golgi och CSBF-myc-His fixerades, färgades och observerades av LSM. (c) Western blot-analys av CSBF / C10orf99 använde mus anti-human IgG (Fc-specifik) antikropp. HEK 293T-celler transfekterade med pwYD11-CSBF-Fc (pwYD11, en modifierad vektor, erhållna från National Research Council Biotechnology Research Institute, Kanada.) Eller kontrollvektor odlades i frånvaro eller närvaro av 10 ug / ml BFA. Supernatantema och celllysat bereddes 48 timmar efter transfektion. GAPDH detekterades som lastkontroll. De visade uppgifterna är representativa för minst tre oberoende experiment.

Bild i full storlek

Efter molekylär kloning av CSBF / C10orf99 utförde vi immunofluorescensmikroskopi för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av CSBF / C10orf99 i pcDNA3.1-CSBF-myc-His-transfekterade HEK 293T-celler. Som illustreras i figur Ib upp, representerade den röda fluorescensen CSBF-myc-His i cytosol. Detta bekräftades genom transfektion av en annan GFP-märkt CSBF / C10orf99-plasmid. De gröna fluorescenssignalerna avslöjade att CSBF-EGFP också hade en cytoplasmisk lokalisering. Det fanns ingen signal på cellmembranet eller i kärnan. De DsRed-taggade organellmarkörerna (DsRed-ER och DsRed-Golgi) användes för att exakt bestämma lokaliseringen av CSBF-myc-His. Resultaten visade att CSBF-myc-His befann sig i lumen i det intracellulära facket längs den klassiska sekretionsvägen (figur 1b, ned).

Lösliga proteiner innehållande N-terminala signalpeptider utsöndras vanligtvis genom den klassiska ER / Golgi-beroende vägen, som kan blockeras av brefeldin A (BFA) 40 . För att bekräfta om CSBF / C10orf99 utsöndras via den klassiska vägen, detekterade vi CSBF-Fc-protein i cellkultursupernatanten transfekterad med pwYD11-CSBF-Fc-plasmid och utförde sedan en BFA-hämningsanalys. Som illustreras i figur 1c minskade BFA-behandling sekretionen av CSBF-Fc, vilket bekräftade att CSBF / C10orf99 är ett klassiskt sekretoriskt protein. Renat CSBF-Fc-protein sekvenserades ytterligare genom Edman-nedbrytningsreaktion 41, 42 . Som visas i kompletterande figur SI är den N-terminala sekvensen KRRPAKAWSG i överensstämmelse med SignalP-förutsägelsen.

CSBF / C10orf99 är en ligand av SUSD2

Sammantaget bekräftade ovanstående fynd att CSBF / C10orf99 är ett klassiskt utsöndrat protein. Tidigare studier härledde interaktioner med högt förtroende mellan CSBF / C10orf99 och SUSD2, liksom Gal1 och SUSD2 43 . SUSD2 kodar ett 822-aminosyratyp I-membranprotein innehållande extracellulära domäner av SO, AMOP, VWD och CCP (kompletterande figur S2a) 44 . För att avgöra om dessa fyra domäner är nödvändiga för platsen och funktionen för SUSD2, konstruerade vi trunkerade mutanter av dessa fyra extracellulära domäner och kontrollerade uttrycket för dessa konstruktioner (Kompletterande figur S2b). Sedan undersökte vi subcellulär lokalisering av dessa mutanter i LoVo-celler. Kompletterande figur S2c visade olika uttrycksmönster för SUSD2 i full längd och alla dessa mutanter. Jämfört med den vilda typen av SUSD2, är alla dessa mutanter överflödiga i cytoplasma, vilket antyder att frånvaro av någon av dessa fyra domäner skulle förändra lokaliseringen av detta protein, vilket ytterligare kan påverka dess funktion. Så följande studier inkluderade bara funktionen av intakt SUSD2-protein.

För att verifiera interaktionen mellan SUSD2 och CSBF / C10orf99 konstruerade vi en dicistronic däggdjursuttrycksvektor 20, pcDNA3-SUSD2-HA :: IRES-CSBF-flagga, som utnyttjade det virus-härledda IRES-elementet för samuttrycket av SUSD2 -HA och CSBF-flagga. Sedan genomförde vi co-immunoprecipitation (co-IP) -analys. Som visas i figur 2a fann vi att CSBF / C10orf99 samimmunutfälldes med SUSD2 och vice versa, vilket indikerar att de två proteinerna var i samma komplex.

(a) Co-IP för CSBF-SUSD2-komplexet. Co-IP-studier genomfördes med lysat framställda från HEK 293T-celler. Celler transfekterades med CSBF-Flag, SUSD2-HA eller kontrollvektor ensam för kontroll. SUSD2-innehållande proteiner immunutfälldes med en monoklonal anti-HA-antikropp och blottades sedan med användning av en anti-Flag monoklonal antikropp. På ett ömsesidigt sätt immunoprecipiterades CSBF-innehållande proteiner med anti-Flag-antikroppen och blottades sedan med användning av anti-HA-antikroppen. De visade uppgifterna är representativa för minst tre oberoende experiment. (b) Upp, inducerades SUSD2 av CSBF / C10orf99. LoVo-celler som övergående uttrycker SUSD2-EGFP behandlades med CSBF / C10orf99 (0, 10, 100 och 500 ng / ml) vid 37 ° C under 30 minuter, fixerades och färgades med Hoechst 33258. SUSD2-EGFP observerades genom konfokal LSM visas i grön. De visade uppgifterna är representativa för minst tre oberoende experiment. Skala bar = 25 μm. Ner behandlades celler som uttrycker SUSD2-EGFP eller / och DsRed-Rab5 med CSBF / C10orf99 (500 ng / ml). (c) FRET togs ut mellan CSBF-mCherry och SUSD2-EGFP genom konfokal LSM. FRET-effektivitet E = 1 - F D ′ / F D, där F D ′ och F D är givarens fluorescensintensitet med och utan en acceptor. Gal1 är en positiv ligandkontroll. Histogram representerar medelvärde ± SD. (d, e) Kurvpassning visade affiniteten för radioligandbindning till sSUSD2-Fc. Den radioliganda konkurrensbindande analysen togs ut mellan CSBF och sSUSD2-Fc. Gal-1 är en positiv ligandkontroll.

Bild i full storlek

Eftersom ligandberoende internalisering är ett kännetecken för receptorn 45 lyckades vi nästa gång bekräfta om SUSD2 går igenom denna process. Först detekterades lokaliseringen av SUSD2-EGFP på plasmamembranet av pEGFP-N1-SUSD2-transfekterade LoVo-celler (kompletterande figur S2c). Sedan fick vi reda på att CSBF / C10orf99 inducerade internalisering av SUSD2-EGFP på ett dosberoende sätt (figur 2b upp). För att exakt bestämma internaliseringen av SUSD2-EGFP användes endosommarkören (DsRed-Rab5). Som illustreras i figur 2b nedan, var den internaliserade SUSD2-EGFP lokaliserad i endosomen. Teserna indikerade att CSBF / C10orf99 kan binda SUSD2 och utlösa receptorinternalisering.

För att bestämma om CSBF / C10orf99 direkt kan binda SUSD2, använde vi in ​​situ fluorescensresonans energiöverföring (FRET) för att bekräfta samlokaliseringen mellan CSBF-mCherry och SUSD2-EGFP. Fluorescensenergin kunde överföras från EGFP till RFP när avståndet mellan dem var mindre än 10 nm. Humant galektin-1 (Gal1) användes som en positiv ligandkontroll. Figur 2c sammanfattade resultatet av FRET-analysen. FRET-effektiviteten för CSBF / SUSD2 var 15, 2%, något högre än för positiv ligandkontroll Gal1 / SUSD2 (11, 6%), med smält EGFP-mCherry 46 som en positiv FRET-kontroll (25, 9%).

För att ytterligare belysa den biokemiska naturen hos CSBF / SUSD2-interaktionen, mätte vi affinitet av CSBF / C10orf99 till renad extracellulär region av SUSD2, som är en löslig form av SUSD2 genererad genom att smälta extracellulär grupp av SUSD2 till Fc-regionen hos humant IgG1 (sSUSD2 -Fc) (Kompletterande figur S3). Tävlingsbindningsanalys togs för att detektera affiniteten mellan CSBF / C10orf99 och sSUSD2-Fc efter CSBF / C10orf99 märkt med 125 I. IC50-värdet bestämdes genom icke-linjär regression av konkurrensbindningen. Såsom visas i figur 2e visade kurvpassning att omärkt CSBF / C10orf99 förträngde 125I-märkt CSBF / C10orf99 från sSUSD2-Fc med en IC50 av 0, 28 nM, medan Gal1 med en IC50 av 0, 19 nM. Tillsammans bekräftade dessa data starkt att CSBF / C10orf99 är en ligand av SUSD2.

CSBF / C10orf99 och SUSD2 minskas i vävnad i tjocktarmscancer

Eftersom CSBF / C10orf99 är ett nytt utsöndrat protein, för att upptäcka mer om dess funktion, sökte vi först uttrycksprofilen från kända databaser. GEO-profilanalys (GDS3113) visade att CSBF / C10orf99 uttrycks starkt i kolonvävnad och måttligt uttrycks i tonsillvävnad bland 96 prover. SAGE-databasen (//cgap.nci.nih.gov/SAGE/AnatomicViewer) och Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) rapporterade att CSBF / C10orf99 är nedreglerade i kolorektala cancervävnader.

Vi undersökte sedan expressionsmönstret för CSBF / C10orf99 i normala humana vävnader med RT-PCR och realtids-PCR, som detekterades i tre cDNA-paneler från Clontech, inklusive två multipla vävnader cDNA-bibliotek (16 prover) och ett immunsystemvävnad cDNA bibliotek (7 prover). Såsom visas i figur 3a och 3b befanns CSBF / C10orf99 mRNA uttryckas i specifika vävnader: på den högsta nivån i kolon, på måttlig nivå i mandel och nästan odetekterbar i andra vävnader.

(a) Expression av CSBF / C10orf99 genomfördes med användning av RT-PCR. Tre cDNA-paneler från Clontech analyserades, inklusive två cDNA-bibliotek med flera vävnader och ett cDNA-bibliotek för immunsystemvävnad. GAPDH detekterades som en referensgen. (b, d) Expression av CSBF / C10orf99 och SUSD2 utfördes med realtid PCR. GAPDH detekterades som en referensgen. PCR i realtid utfördes i tre exemplar och medelvärde ± SD visas. (c, e) Nedreglering av CSBF / C10orf99 eller SUSD2 detekterades i primära kolorektala cancer genom realtids-PCR. N / C, parade intilliggande vävnader / cancervävnader. GAPDH detekterades som en referensgen. (f) Representanter för immunohistokemisk färgning för CSBF / C10orf99 och SUSD2 i ett par kolorektal cancervävnad och intilliggande vävnad. Förstoring: 400 gånger.

Bild i full storlek

Därefter upptäckte vi uttrycket av CSBF / C10orf99 på en cDNA-panel härrörande från 42 par koloncancer och intilliggande vävnader. Såsom visas i figur 3c reducerades uttrycket av CSBF / C10orf99 dramatiskt i de flesta av de primära cancervävnaderna jämfört med det i de intilliggande vävnaderna. För att bestämma huruvida CSBF / C10orf99 var nedreglerat på proteinnivån, höjde vi en polyklonal antikropp från kanin mot CSBF / C10orf99 med GST-CSBF-fusionsprotein som immunogen och renades genom CSBF / C10orf99-affinitetskromatografi. Vi analyserade CSBF / C10orf99 i representativa prover genom immunohistokemi. Som visas i figur 3f, reglerades CSBF / C10orf99 i de flesta av tjocktarmscancervävnader, vilket var förenligt med mRNA-nivå.

Eftersom våra resultat indikerade att SUSD2 är receptorn för CSBF / C10orf99, kontrollerade vi uttrycksprofilen för SUSD2 ytterligare. Tidigare studie visade att SUSD2 uttrycktes starkt i lunga och njure och måttligt uttrycktes i bröstkörtlar med RT-PCR 44 . GEO-profilanalys (GDS3113) visade att SUSD2 uttrycktes starkt i ryggmärgen, hud och lunga och måttligt uttrycktes i vävnad i kolon och bröstkörtlar. SAGE-databasen och Human Protein Atlas rapporterade att SUSD2 är nedreglerat i kolorektala cancervävnader. Vi undersökte uttrycksmönstret för SUSD2 i normala humana vävnader med PCR i realtid. SUSD2 uttrycktes starkt i lunga och njurar och detekterades i kolonvävnad (figur 3d). Såsom visas i figurerna 3e och 3f, reglerades SUSD2 också ned både på mRNA- och proteinnivåer i de flesta av tjocktarmscancervävnader.

CSBF / C10orf99 och SUSD2 minskas i cellcancer i tjocktarmscancer med olika genregleringsmönster

Ovanstående resultat bekräftade att CSBF / C10orf99 och SUSD2 reducerades signifikant i tjocktarmscancervävnader. Sedan försökte vi undersöka uttrycket av CSBF / C10orf99 och SUSD2 i cellcancer i tjocktarmscancer. Såsom visas i figurerna 4a och b, reglerades både CSBF / C10orf99 och SUSD2 i sex koloncancercellinjer.

(a, b) Expression av CSBF / C10orf99 och SUSD2 i sex cellinjer utfördes med realtid PCR. cDNA för kolonvävnad från Clontech användes som positiv kontroll. GAPDH detekterades som en referensgen. PCR i realtid utfördes i tre exemplar och medelvärde ± SD visas. (c, d) Demetylering med Aza eller kombinerat med TSA (A + T) återställde uttryck av gener i LoVo- eller RKO-celler. (e) Aza kombinerat med TSA-återställt SUSD2-uttryck analyserades i LoVo-celler genom FACS-analys. FACS utfördes i tre exemplar.

Bild i full storlek

De förmodade CSBF / C10orf99- och SUSD2- promotorerna, identifierade genom bioinformatik-promotoranalys (//www.genomatix.de), innehåller båda icke-typiska CpG-öar. För att undersöka om nedregleringen av dessa två gener orsakades av promotormetylering, behandlade vi LoVo- och RKO-celler med demetyleringsmedel Aza, eller kombinerades med histondeacetylasinhibitor trikostatin A (TSA). Tumorsuppressorn CMTM3 kontrollerades som positiv kontroll 47 . SUSD2-uttryck återställdes faktiskt av Aza eller kombinerades med TSA både på mRNA (figurerna 4c och 4d) och proteinnivåer (figur 4e), medan uttrycket av CSBF / C10orf99 inte återställdes. Dessa resultat visar tydligt att nedreglering av dessa två gener har olika mekanismer.

CSBF / C10orf99 interagerar med SUSD2 för att inhibera tillväxt av tjocktarmscancer

Eftersom CSBF / C10orf99 och SUSD2 båda är nedreglerade i tjocktarmscancervävnader och cellinjer antog vi om CSBF / C10orf99 och SUSD2 har effekter på tillväxten av tjocktarmscancerceller. Såsom visas i figur 5a blev proliferation av HCT116- eller LoVo-celler betydligt långsammare i CSBF / C10orf99 och SUSD2 samuttryckt grupp jämfört med andra grupper. Dessa resultat indikerade att tillväxtinhiberingen inte har någon cellspecificitet, och CSBF / C10orf99 eller SUSD2 påverkade inte cellproliferationen enbart i det transient transfekterade systemet. För att ytterligare bekräfta om den hämmande effekten av CSBF / C10orf99 är beroende av förekomsten av SUSD2, använde vi renat rekombinant sSUSD2-Fc-protein i blockerande experiment och renat rekombinant Fc användes som negativ kontroll. Som visas i figur 5b ökade blockad av CSBF / SUSD2 med sSUSD2-Fc LoVo-cellproliferation.

(a) CCK-8-analys visade att celltillväxt inhiberades genom samuttryck av CSBF / C10orf99 och SUSD2 i HCT116- och LoVo-celler. De visade uppgifterna är representativa för minst tre oberoende experiment. (b) CCK-8-analys visade att LoVo-celltillväxtinhibering blockerades genom tillsats av sSUSD2-Fc-protein i experiment A. De visade data är representativa för minst tre oberoende experiment. (c) Samuttryck av CSBF / C10orf99 och SUSD2 inhiberade kolonibildning i LoVo-celler. Analyser utfördes i tre exemplar och medelvärde ± SD visas. (d) Expression av SUSD2 i LoVo-SUSD2 analyserades med FACS-analys. FACS utfördes i tre exemplar. (e) CCK-8-analys visade att LoVo-SUSD2-celler hade lägre celltillväxthastighet. De visade uppgifterna är representativa för minst tre oberoende experiment. (f) Kolonibildningsanalys visade att LoVo-SUSD2-1 # celler hade färre kolonier. Analyser utfördes i tre exemplar och medelvärde ± SD visas. (g) RT-PCR-analys visade långsiktigt ektopiskt uttryck av SUSD2 återställde uttrycket av CSBF / C10orf99 men inte Gal1. De visade uppgifterna är representativa för minst tre oberoende experiment. (h) Analys av kolonibildning visade att de hämmande effekterna av SUSD2 kan ökas genom tillsats av CSBF / C10orf99. Analyser utfördes i tre exemplar och medelvärde ± SD visas.

Bild i full storlek

Vi genomförde vidare kolonibaseringsanalys för att bekräfta att interaktionen mellan CSBF / C10orf99 och SUSD2 påverkar tillväxten av tjocktarmscancerceller. Såsom visas i figur 5c odlades transfekterade LoVo-celler i förekomsten av G418 under två veckor. En signifikant reduktion i koloni observerades i CSBF / C10orf99 och SUSD2 samuttryckta LoVo-celler. Kolonin av SUSD2-enstaka uttryckta celler var också mindre än hos vektorkontrollceller, medan det inte fanns någon uppenbar förändring i CSBF / C10orf99-uttryckta celler. Detta resultat indikerar att långsiktigt uttryckt SUSD2 minskade LoVo-celltillväxten.

För att ytterligare bekräfta de hämmande effekterna av långtidsuttryck av SUSD2 på celltillväxt i tjocktarmscancer genererades stabila SUSD2-uttryckande cellinjer. Som illustreras i figur 5d, erhöll vi efter screening med antibiotisk selektion två cellstammar av LoVo-SUSD2 (LoVo-SUSD2-1 #, LoVo-SUSD2-2 #) och två stammar av LoVo-Neo-celler (LoVo-Neo-1 #, LoVo-Neo-2 #). Som illustreras i fig. 5E, uppvisade LoVo-SUSD2-celler lägre tillväxthastigheter i CCK-8-analys. Sedan genomförde vi kolonibildningsanalys med LoVo-SUSD2-1 # och LoVo-Neo-1 # celler. Som visas i figur 5f var kolonin av LoVo-SUSD2-1 # celler också mycket mindre än hos LoVo-Neo-1 # celler.

För att klargöra varför långtidsuttryck av SUSD2 hämmar celltillväxt utförde vi RT-PCR för att undersöka om CSBF / C10orf99 ökades. Såsom visas i figur 5g var CSBF / C10orf99 verkligen uppreglerat genom återställd expression av SUSD2. För att klargöra effekten av CSBF / C10orf99 på LoVo-SUSD2-celler tillsatte vi CSBF / C10orf99 i analyssystemet för kolonibildning. Som visas i figur 5h, kunde CSBF / C10orf99 signifikant öka den tillväxtinhiberande effekten av SUSD2, men inte i LoVo-Neo-celler.

CSBF / C10orf99 interagerar med SUSD2 för att inducera G1-cellcykelstopp

Vanligtvis induceras hämning av celltillväxt genom apoptos eller cellcykelstopp 48 . Våra resultat visade att det inte fanns någon signifikant ökning i procentandelen apoptotiska celler (kompletterande figur S4). Sedan upptäckte vi vidare cellcykeln för transfekterade LoVo-celler med FACS. Såsom visas i figurerna 6a och b, när CSBF / C10orf99 uttrycktes tillsammans med SUSD2 i LoVo-celler, ökades G0 / G1-fasceller signifikant och S-fasceller minskades, men ingen uppenbar förändring observerades i andra grupper. Dessa resultat antyder att samuttryckning av CSBF / C10orf99 och SUSD2 kan inducera G1-cellcykelstopp. Vi undersökte vidare flera viktiga cellcykelregulatorer genom Western blotting. Som visas i figur 6c, reglerades cyklin Dl, cyklin D3 och CDK6 i CSBF / C10orf99 och SUSD2 samuttryckande LoVo-celler, i överensstämmelse med fenotyperna för G1-cellcykelstopp. Medan uttrycket av cyklin Bl inte förändrades, bestående av den odetekterbara förändringen av G2 / M-fasen. Sammantaget bekräftade dessa resultat att CSBF / C10orf99 interagerar med SUSD2 för att inducera G1-cellcykelstopp.

(a) Flödescytometri användes för att jämföra DNA-innehållet mellan håravfall, CSBF-uttryckande, SUSD2-uttryckande och samuttryckande celler. Sammanfattning av cellproportioner i olika faser av cellcykeln (b). Resultaten uttrycktes som medelvärde ± SD för tre oberoende experiment. (c) Proteinuttryck av cyklin Bl, cyklin Dl, cyklin D3 och CDK6 detekterades med Western blot (vänster). P-tublin användes som en intern kontroll. Och från tre oberoende experiment normaliserades nivåerna av cellcykelrelaterade proteiner till ß-tublin (till höger).

Bild i full storlek

Diskussion

Cytokiner är vanligtvis små utsöndrade proteiner med optimal aktivitet vid ganska låga koncentrationer och deras funktioner är beroende av bindningen av specifika receptorer 49 . I den aktuella studien identifierade vi en ny potentiell cytokin CSBF / C10orf99 med användning av immunogenomik. CSBF / C10orf99 är ett klassiskt utsöndrat protein med en vanlig N-terminal signalpeptid av 24 aminosyror. SUSD2 är nödvändig för den tillväxtinhiberande effekten av CSBF / C10orf99 på tjocktarmscancerceller och rekombinant sSUSD2-Fc kan blockera dess funktion. CSBF / C10orf99 visar en klockformad aktivitetskurva och dess optimala effekt är cirka 10 ng / ml, vilket är i överensstämmelse med cytokinernas egenskaper.

Så vitt vi vet är detta den första systemstudien av CSBF / C10orf99. GEO-profilanalys visade att 2610528A11Rik, mushomologen från CSBF / C10orf99, var signifikant uppreglerad i psoriasis-musmodeller (GDS3907). Dessutom var CSBF / C10orf99 också uppreglerade hos psoriasispatienter (GDS3539). Under tiden spekulerades CSBF / C10orf99 att vara involverad i patogenesen av psoriasis 50, som är en kronisk immunologisk hud- och ledsjukdom, som traditionellt tros vara involverad i Th1-vägen. Genom att utmana ovalbumin, Tang et al. rapporterade att de homozygota 2610528A11Rik-knockout-mössna uppvisade ett ökat genomsnittligt serum IgG2a-svar 51, som är en immunoglobulin-isotypmarkör för T-hjälpar 1 (Th1) -lymfocytrelaterade funktion, vilket indikerar att 2610528A11Rik kan hämma Th1-celler för att reglera adaptiva immunsvar. Ytterligare studier är nödvändiga för att belysa funktionen av CSBF / C10orf99 i Th1-cellernas immunsvar.

De uttryckliga och funktionella egenskaperna hos CSBF / C10orf99 indikerar att det kan vara en tumörundertryckare. Dess gen är lokaliserad på kromosom 10q23.1 bredvid den genomiska regionen hos tumörsuppressor PTEN (10q23.3) 52 . Inaktivering av TSG genom promotormetylering, genmutation eller förlust av heterozygositet är viktigt för karcinogenes. I humana koloncancercellinjer kan uttrycket av CSBF / C10orf99 inte återställas av Aza eller kombineras med TSA, vilket indikerar att det inte regleras av promotormetylering. Mekanismen bakom nedregleringen av CSBF / C10orf99 återstår att studeras ytterligare. Eventuella roller för genetiska och / eller andra epigenetiska kontroller måste beaktas. Promotorn för SUSD2 innehåller icke-typiska CpG-öar, men den kan återställas av Aza eller kombineras med TSA, vilket indikerar att promotormetylering manipulerar sitt uttryck direkt eller att transkriptionsfaktorer som reglerar dess uttryck är epigenetiskt reglerade.

Spännande, högre expression av CSBF / C10orf99 och SUSD2 har också detekterats i några få koloncancerprover (7/42 och 4/42), vilket liknar det ökade uttrycket av tumörsuppressor p16 i många maligna tumörer. Det finns några möjliga mekanismer för att klargöra varför p16-överuttryck inträffar. Å ena sidan kan partiell förlust av p16-funktion på grund av missense-mutationer kompenseras genom förhöjd expression såsom observerats i vissa tumörprover. Å andra sidan, i närvaro av vildtyp p16, har andra molekylära händelser, såsom överuttryck av CDC6 och cyklin D1, eller deregulering av Rb i tumörceller och cancervävnader potentialen att positivt återkoppla p16-uttryck 53, 54 . Med tanke på dessa tillgängliga mekanismer och våra resultat kan det finnas vissa mutationer av CSBF / C10orf99 och SUSD2 eller andra nedströmsmolekyler som förändras i de nämnda proverna.

Sugahara och kollegor har visat att det ektopiska uttrycket av Susd2, mushomologen från SUSD2, kan hämma tillväxt och vända tumörgena fenotyper av HT1080-celler och HeLa-celler in vitro 55, 56 . Deras resultat indikerade att Susd2 är en möjlig tumördämpare, vilket liknar våra resultat. Watson et al. rapporterade att SUSD2 interagerar med Gal1 och cellytlokaliseringen av Gal1 är beroende av förekomsten av SUSD2 44 . Interaktionen mellan SUSD2 och Gal1 ökade invasionen av bröstcancerceller och kan spela en viktig roll för att modulera kroppens immunrespons. GEO-profilanalys visade att SUSD2 var signifikant nedreglerad i östrogenreceptor (ER) alfa-tystade bröstcancerceller (GDS4061), och den var uppreglerad i ER-positiva celler (GDS4067) och några ovariella adenokarcinomceller (GDS3592). Under tiden är Gal1 den rapporterade liganden av SUSD2 och involverad i tumörtransformation, angiogenes, cellcykelreglering och apoptos 57 . Våra resultat visade att affiniteten mellan CSBF / C10orf99 och SUSD2 liknar den för Gal-1 och SUSD2, men funktionerna är olika. Sammantaget antyder dessa resultat att uttrycket och funktionen av SUSD2 kan påverkas av östrogen, ligander och mikromiljö.

Denna studie visar att CSBF / C10orf99 hämmar G1-S-fasövergång genom nedreglerande cyklin D och CDK6. G1-S-fasövergång är känd för att vara en viktig kontrollpunkt för cellcykelprogression 58 . Det är nödvändigt att identifiera de intracellulära interagerande proteinerna från SUSD2 och belysa dess mekanism på moduleringen av cyklin D och CDK6 i den framtida studien, vilket kommer att vara till hjälp för att förstå patogenesen för koloncancer.

metoder

Cellinjer, reagenser och cancerprover

HEK 293T-, HCT116-, HT29-, LoVo-, SW480-, SW620- och RKO-celler erhölls från våra medarbetare och upprätthölls i DMEM (GIBCO) kompletterat med 10% FBS (HyClone). CSBF / C10orf99 syntetiserades i Chinese Peptide Company (Hangzhou, Kina) med en renhet> 97%. Gal1 köptes från FoU-system (1152-GA-050). Antikroppar som användes i detta papper var: mus-anti-myc (9E10) (# SAB4700447, Sigma-Aldrich), kanin-anti-HA (C29F4) (# 3724, Cell Signaling Technology), get-anti-Human IgG (Fc-specifikt) (# I2136, Sigma-Aldrich), anti-cyclin D1 (# 2926, Cell Signaling Technology), anti-cyclin D3 (# 2936, Cell Signaling Technology), anti-CDK4 (# 2906, Cell Signaling Technology), anti-CDK6 (# 3136, Cell Signaling Technology), anti-fosfo-Cyclin B1 (Ser147) (# 4131, Cell Signaling Technology), anti-SUSD2 polyklonal antikropp för kanin (# HPA004117, Sigma-Aldrich), anti-p-tublin (# T8328, Sigma -Aldrich) och anti-GAPDH (# 2118, Cell Signaling Technology). Primära cancervävnader och parade intilliggande vävnader erhölls från patienter under primär kirurgi vid Peking University Cancer Hospital (Peking, Kina), med patientens samtycke och godkännande av institutionell etik. Färska humana vävnader fixerades med 10% formalin i PBS för immunohistokemi eller frystes i flytande kväve för RNA-extraktion. Denna undersökning genomfördes efter godkännande av etikkommittén vid Peking University Cancer Hospital.

Molekylär kloning och subkloning av CSBF / C10orf99 och SUSD2

CSBF / C10orf99 amplifierades från PBMC med PCR med primrar: 5'-CAgaattcCACCATGAGGCTTCTAGTCCTTTC-3 'och 5'-GCggtaccCCCACCTGTGGGAGTGCCCCAG-3', digererad med EcoRI och Kpn I och ligerat i (P-I) Denna plasmid digererades sedan med EcoRI och BamHI och ligerades in i pcDNA3.1 (-) - myc-His, pCMV-3 × Flag-C och pwYD11 (innehållande kondenserad human IgG1 Fc-tagg) för att erhålla pcDNA3.1-CSBF- myc-His, pCMV-CSBF-Flag respektive pwYD11-CSBF-Fc. SUSD2 amplifierades från HCT116 cDNA-bibliotek med primrar: 5'-CCgaattcGCCACCATGAAGCCAGCCCTCCTGC-3 'och 5'-CCgaattcGGGCTGTGCACCCCAGACG-3', digererades med EcoRI och klonades till pCMV-C-HA. Den EGFP-märkta SUSD2-plasmiden konstruerades med användning av SUSD2 i full längd som en mall för PCR med ett par av primrar: 5'-CCgaattcGCCACCATGAAGCCAGCCCTCCTGC-3 'och 5'-GGaccggtCCGGGCTGTGCACCCCAGACGTI Eco och G-3' klonades in i pEGFP-Nl-plasmiden. De trunkerade plasmiderna av SUSD2-HA konstruerades genom standardmetod för platsriktad mutagenes genom överlappande förlängning med användning av polymeraskedjereaktionen (PCR) med olika PCR-primersatser presenterade i kompletterande tabell S1.

Immunofluorescensmikroskopi

Cellerna ympades på täckglas under 24 timmar. 24 timmar efter transfektion tvättades cellerna och fixerades under 20 minuter med beredd 4% PFA, sköljdes i serumfritt medium och permeabiliserades under 30 minuter i 0, 1% Triton X-100 och 3% BSA i PBS. Celler inkuberades i följd med mellanliggande tvätt, med primär antikropp över natt vid 4 ° C och sekundär antikropp under 60 minuter vid rumstemperatur. Primära antikroppar var mus-anti-myc (9E10) och kanin-anti-HA (C29F4) utspädd 1: 1000. Rhodamin-konjugerade sekundära antikroppar applicerades för detektion. För att färga kärnorna inkuberades cellerna under 60 minuter med 0, 05 ug / ml Hoechst33342-färgämne (Sigma-Aldrich). Täckglas monterades, förseglades, undersöktes och fotograferades under ett konfokalt laserskanningsmikroskop (Leica TCS SP5 Microsystems, Tyskland).

BFA-hämningsanalys

24 timmar efter transfektion tillsattes HEK 293T-celler av antingen 10 | ig / ml BFA (# B7651, Sigma-Aldrich) eller etanol (vehikelkontroll) och odlades under ytterligare 24 timmar. Slutligen skördades de totala celllysatema och odlingssupernatanterna för Western blot-analys.

Western blot-analys

Detaljer har beskrivits tidigare 59 . I korthet separerades proverna och överfördes till nitrocellulosamembran, blockerades och inkuberades i följd med primär antikropp över natt vid 4 ° C och sedan med pepparrotsperoxidas-kopplad sekundär antikropp vid en utspädning av 1: 2000. Efter tvättning detekterades immunreaktiva band av Odyssey Infrared Imager (LICOR Bioscience, Lincoln, NE, USA).

Antikroppar som användes var: anti-myc (9E10), anti-human IgG (Fc-specifikt), anti-HA (C29F4), anti-cyclin D1, anti-cyclin D3, anti-CDK4, anti-CDK6, anti-fosfocyklin B1 (Ser147), anti-SUSD2 polyklonal antikropp för kanin, anti-p-tublin, anti-GAPDH och IRDye sekundära antikroppar mot mus-, kanin- eller getimmunglobulin G (Li-Cor Biosciences). Den anti-CSBF / C10orf99 polyklonala antikroppen från kanin och gjordes i vårt laboratorium.

Co-IP-analyser

De transfekterade HEK 293T-cellerna lyserades i buffert innehållande 50 mM HEPES (pH 7, 5), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA (pH 8, 0) och proteasinhibitorcocktail. Cellextrakt klargjordes genom centrifugering, och den resulterande supernatanten inkuberades över natten vid 4 ° C med anti-HA eller anti-Flag och sedan med protein G plus agarospärlor. Efter intensiv tvättning och centrifugering analyserades immunkomplex genom Western blotting.

Ligandberoende internalisering av SUSD2

LoVo-celler ympades på täckglas under 24 timmar. Efter transfektering med pEGFP-N1-SUSD2 (SUSD2-EGFP) eller vektorkontroll odlades cellerna under ytterligare 24 timmar. Därefter tillsattes olika doser av CSBF / C10orf99 till mediet under 30 minuter. BSA tillsattes som reagenskontroll. Täckglas monterades, förseglades, undersöktes och fotograferades under ett konfokalt laserscanningsmikroskop.

FRET-mikroskopi och bildanalys

HEK 293T-celler ympades på täckglas under 24 timmar. Efter transfektion med EGFP-mCherry, EGFP, mCherry, CSBF-mCherry, Gal1-mCherry, SUSD2-EGFP, EGFP + CSBF-mCherry, EGFP + Gal1-mCherry, SUSD2-EGFP + mCherry, SUSD2-EGFC + CSFry + -EGFP + Gal1-mCherry, celler odlades under ytterligare 24 timmar. Gal1 användes som ligandkontroll. Täckglas monterades, förseglades, undersöktes och fotograferades under ett konfokalt laserscanningsmikroskop. Bilder förvärvades under SP5-FRET-anskaffningsmodulen genom interline scanning för EGFP (488 nm excitation; 510 nm emission) respektive mCherry (514 nm excitation; 600 nm emission) FRET-effektivitet analyserades under SP5-FRET-analysmodul. Över 10 celler erhölls i varje grupp, och 10 ROI: er fick på varje cell.

Radioligandbindande till SUSD2

CSBF / C10orf99 och Gal1 märktes med 125 I med kloramin-T (ch-T) -metoden. Rekombinant sSUSD2-Fc användes som potentiell receptor i bindningsreaktionen. 125I-Gal1 sattes till bindningsreaktionen med omärkt Gal1 med 7 lämpliga koncentrationer (60, 30, 15, 7, 5, 3, 75, 1, 875 och 0, 9375 pg / ul). Efter en inkubationstid på 24 timmar vid 4 ° C separerades den bindande 125I-Gal1 från reaktionsblandningen genom utfällning av den bundna 125I-Gal1 med polyetylenglykol (PEG6000). Efter centrifugering avlägsnades supernatanten och den bundna radioliganden räknades i en vätskescintillationsgam-räknare. Resultat erhållna från standarderna användes för att konstruera en standard dos-svarskurva. Ospecifik bindning bestämdes inom varje experimentell serie. Under tiden sattes 125 I-CSBF till bindningsreaktionen med omärkt CSBF med 7 lämpliga koncentrationer (100, 50, 25, 12, 5, 6, 25, 3, 125 och 1, 5625 pg / ul).

Halvkvantitativ RT – PCR och realtids PCR-analys

Humana cDNA-bibliotek för multipla vävnader och cDNA-bibliotek för immunvävnad köptes från Clontech. Totalt RNA från koloncancerceller isolerades med användning av TRIzol-reagens (Invitrogen) och användes som en mall för cDNA-syntes. CSBF / C10orf99 PCR-amplifiering utfördes med användning av följande primrar: 5'-CTCCACAGAAGGGAAGAGGCG-3 'och 5'-GGACCACTGGATGCTGGTAG-3'; SUSD2 PCR-amplifiering: 5'-CTTCTTCACGGACTACGGCT-3 'och 5'-GACACACTCAGAGACACGGG-3'; Gal1 PCR-amplifiering: 5'-ATGGCTTGTGGTCTGGT-3 'och 5'-CAGAGGGAGCAGAGGCA-3'; och GAPDH PCR-amplifiering: 5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3 'och 5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'. Kvantitativ PCR kördes på ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Förstärkningsbetingelserna var 10 min initial denaturering vid 95 ° C, följt av 40 cykler av varje 15 s vid 95 ° C och 1 min vid 60 ° C. CSBF / C10orf99-amplifiering utfördes med användning av följande primrar: 5'-GGTCAGGCAGGAGAACCAG-3 'och 5'-AGCTTGCATGGTTTACAGAGC-3'. Primrar för SUSD2-amplifiering använde 5'-AGAGCTGGATGGACCTGAAA-3 'och 5'-ATGCCAGCATGATGGAGAC-3'. Prover kördes i tre exemplar. Alla prover normaliserades mot GAPDH med användning av en jämförande Ct-metod (ddCt).

immunohistokemi

Mänskliga vävnadsglas avparaffiniserades, rehydratiserades och blockerades i 10% normalt getserum under 30 minuter. Sliderna inkuberades sedan vid 37 ° C under 1 timme med kanin anti-CSBF / C10orf99 eller anti-SUSD2 polyklonal antikropp. Antikropp mot CSBF / C10orf99 framställdes och affinitetsrenades i vårt laboratorium. Efter noggrann tvättning applicerades Dakocytomation Envision System HRP (DakoCytomation, USA) under 30 minuter. Efter sköljning i PBS visualiserades alla objektglas med 0, 05% (vikt / volym) 3, 3'-diaminobenzidin.

Cellproliferationsanalys

Celler skördades, pläterades i plattor med 96 brunnar med en densitet av 2000 celler per brunn och inkuberades vid 37 ° C. Cellproliferation analyserades med användning av Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Japan). Vid angivna tidpunkter tillsattes 10 | il av CCK-8-lösningen i varje brunn och inkuberades under 2 timmar. Absorbans vid 450 nm och 630 nm mättes för att beräkna antalet livskraftiga celler.

Analys av kolonibildning

Kolonibildning analyserades genom plätering av 200 celler i 12-brunnars odlingsplattor (i tre exemplar). Efter 8 dagar fixerades kolonier och färgades med 0, 5% kristallviolett. Kolonier definierades som ett minimum av 50 celler i en grupp och räknades med användning av bildanalysprogramvara (IPP6).

Flödescytometri

För SUSD2-expressionsanalys färgades fixerade och permeabiliserade celler med musmonoklonal W5C5-antikropp (katalog # 327401, BioLegend) eller lämplig isotypkontroll (mus IgG1, kappa) (katalog # 401401, BioLegend). Märkta celler användes för flödescytometrisk analys av FACSCalibur (BD Biosciences). Data analyserades med användning av FlowJo-programvara (Tree Star).

Cellcykelanalys

Celler skördades och fixerades i 70% etanol, behandlades med RNas A och färgades med propidiumjodid, och DNA-innehåll analyserades med FACSCalibur. Resultaten analyserades med ModFit-programvaran.

Statistisk analys

Data uttrycktes som medelvärde ± SD och testades med avseende på statistisk signifikans av det två-svansade studentens t-test eller ANOVA med lämpliga faktorer mellan och inom ämnen för varje experiment. Värdena på p <0, 05 ansågs statistiskt signifikanta, där * = p <0, 05, ** = p <0, 01 och *** = p <0, 001.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    CSBF / C10orf99, en ny potentiell cytokin, inhiberar tillväxt av tjocktarmscancer genom att inducera G1-arrestering

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.