Smulor interagerar med xpd för kontroll av kärnkraftsdelning i drosophila | onkogen

Smulor interagerar med xpd för kontroll av kärnkraftsdelning i drosophila | onkogen

Anonim

ämnen

  • Utvecklingsbiologi

Abstrakt

Crumbs (Crb) familjeproteiner är avgörande för cellpolaritet. Nya studier visar att de också är involverade i tillväxtreglering och cancer. Det är emellertid inte väl förstått hur Crb deltar i mitotiska processer. Här rapporterar vi att Drosophila Crb är kritiskt involverad i kärnkraftsdelning genom att interagera med Xeroderma pigmentosum D (XPD). En ny gen med namnet galla-1 identifierades från en genetisk screening för crb- modifierare. Galla-1-protein visar homologi med MIP18, en underenhet av det mitotiska spindelassocierade MMS19 – XPD-komplexet. Förlust av funktionsgalla -1- mutanter visar onormal kromosomsegregation, defekta centrosompositioner och grenade spindlar under kärnkraftsdelning i tidiga embryon. Embryon med funktionsförlust eller överuttryck av crb uppvisar liknande mitotiska defekter och genetisk interaktion med galla-1 . Både Galla-1 och Crb-proteiner visar överlappande lokalisering med spindelmikrotubulor under kärnindelning. Galla-1 interagerar fysiskt med den intracellulära domänen av Crb. Intressant nog visar Galla-1 liten bindning till Drosophila- homologen av XPD, men ett relaterat protein Galla-2 binder både Crb och Xpd. Förlust av funktionsgalla -2- mutanter visar liknande mitotiska defekter som galla-1 och stark genetisk interaktion med crb . Xpd kan bilda ett fysiskt komplex med Crb. På imaginär skiva orsakar Crb-överuttryck vävnadsöverväxt såväl som DNA-skador markerade med H2Av-fosforylering. Dessa fenotyper undertrycks genom reduktion av Xpd. Sammantaget identifierar denna studie ett nytt Crb – Galla – Xpd-komplex och dess funktion för korrekt kromosomsegregation under kärnkraftsdelning, vilket innebär en potentiell koppling mellan Crb och Xpd-relaterad genominstabilitet.

Introduktion

Mitos är avgörande för utveckling av alla eukaryota organismer. Den tidiga utvecklingen av Drosophila embryo kännetecknas av snabba synkrona 13 kärnkraftsdelningscykler efter befruktning. 1 Under dessa kärnkraftsdelningar består varje mitotisk cykel endast av S- och M-faser som inte följs av cytokinesis, vilket resulterar i en multinucleatcell som kallas syncytial blastoderm. Vid cykel 14 sker en process som kallas cellularisering för att bilda den embryonala epitel som genomgår gastrulering.

En viktig händelse vid cellularisering är bildandet av den apikala basala polariteten hos epiteliet. Transembranproteinsmulor (Crb) har studerats i stor utsträckning i denna process eftersom det har en central roll för att bibehålla den apikala-basala cellpolariteten hos embryonal epitel. 2, 3 Crb-protein är lokaliserat i cellmembranet apiskt till vidhäftningsföreningarna (AJ) och är involverat i mognad och stabilisering av AJ: er. 2, 4 Under postembryonisk utveckling krävs Crb också för retinal morfogenes och underhåll. 1, 5, 6 Bibehållandet av Crb-funktion i näthinnecellerna är viktigt eftersom mutationer i den humana homologen av Crb-genen (CRB1) orsakar näthinnsjukdomar. 7, 8 Nyligen genomförda studier har visat att Crb också är involverat i tillväxtreglering genom att påverka cellsignaleringsvägar. 9, 10, 11, 12 Crbs förstärkning och funktionsförlust orsakar defekter i Hippo-signalering som styr cellspridning hos Drosophila och däggdjur. Crb orsakar uppreglering av Hippo-målgener och interagerar fysiskt med Hippo-vägkomponenter. 9, 10, 11 Det rapporterades att Crb också deltar i Notch-signalering genom att modulera aktiviteten för y-sekretaskomplex. 12 Dessa fynd stöder Crb: s roller i olika cellulära processer inklusive cellpolaritet, morfogenes och tillväxtreglering.

Funktionen av Crb vid utveckling av epitel är beroende av den korta intracellulära domänen (Crb intra ), eftersom det är nödvändigt för bildandet av apikalt membrandomän och delvis kan rädda crb-mutantfenotyperna . 4, 5, 13 Överuttryck av Crb intra försämrar också cellpolaritet genom ektopisk rekrytering av apikala och AJ-proteiner. 4, 5 Crb- intra består av två funktionella motiv, juxtamembrandomän (JM) och det C-terminala PDZ-bindande motivet (PBM). Crb bildar ett konserverat proteinkomplex genom sitt PBM med PDZ-domänprotein Stardust och Dpatj. 14, 15 JM-domänen används för att binda ett FERM-domänprotein Moesin 16 och är involverat i rekryteringen av AJ-proteiner såsom Armadillo och Bazooka. 5, 13

Förutom de kända funktionerna för Crb vid cellularisering, morfogenes och Hippo-signalering, kan Crb också vara involverad i andra funktioner. Ett av dessa områden där Crb inte har studerats inkluderar händelserna före cellulariseringen i embryo. Kärnkraftsdelningscykler vid tidig embryogenes är avgörande för genereringen av cellulariserad epitel som kan genomgå gastrulering. Mitotisk kärnindelning under denna period kontrolleras av modergenfunktioner med liten eller ingen zygotisk genuttryck. 17 Det är okänt om Crb har en roll i mitos under denna tidiga embryogenes före cellularisering. Crb krävs för utveckling av follikulärt epitel i äggstocken. 18 Modersfunktion hos Crb har studerats med användning av groddkloner som genererats genom transplantation av crb- mutanta polceller till sterila kvinnliga ovo D1 . Denna studie föreslog att crb- mutanta fenotyper i embryokutikula och nervsystemet kan vara resultatet av förlust av zygotisk genuttryck ensam. 19 Eftersom tidigare defekter innan cellularisering kanske inte har upptäckts i den tidigare studien, återstår det att studera om Crb spelar en roll under kärnkraftsdelningsperioden i tidigt embryo.

Med tanke på att endast ett begränsat antal Crb-interagerande proteiner har identifierats, kan 20 skärmar för nya Crb-partners hjälpa till att identifiera nya funktioner hos Crb. Intressant nog har vi från en sådan genetisk screening identifierat konserverade nya crb- interaktiva gener som ledde till ett oväntat konstaterande av Crb-funktion i tidig embryogenes. Denna nya funktion av Crb är relaterad till kontrollen av nukleär uppdelning i samband med Xeroderma Pigmentosa-D (XPD) som är inblandad i genominstabilitet. Xpd är en väsentlig underenhet av TFIIH-transkriptionsfaktorn som krävs för nukleotid-excisionsreparation och transkription. 21 En ny studie har identifierat nya cytoplasmatiska proteiner med namnet MIP18 och MMS19 från XPD-proteinkomplexet. 22, 23, 24 Oväntat innehåller detta MMS19 – XPD – MIP18-komplex inte några andra underenheter av TFIIH, och nedslagningen av varje komponent i detta proteinkomplex orsakade defekter i kromosomsegregation under mitos, 22 vilket resulterade i kromosominstabilitet. 25 Dessutom har det visats att Drosophila Xpd har en roll i kromosomsegregation genom att reglera cellcykelfunktionen för cyklinaktiverad kinasaktivitet under embryogenes. 26

I denna studie rapporterar vi om en ny gen med namnet galla-1 identifierad som en genetisk modifierare av crb . Galla-1 visar proteinsekvenshomologi med MIP18 i däggdjurs MMS19 – XPD-komplexet, vilket väcker spännande frågor om in vivo- funktion av galla-1 och dess förhållande till crb . Vi visar att Galla-1 och dess relaterade protein Galla-2 krävs för korrekt kromosomsegregering under kärnuppdelning i tidigt embryo, i överensstämmelse med dess överlappande lokalisering med spindelmikrotubulor. Förlust av Crb orsakar liknande mitotiska defekter i tidigt embryo före cellularisering. Vi visar bevis för genetisk interaktion mellan galla gener och crb , och för direkt bindning av Galla proteiner och Crb. Dessutom bildar Crb och Galla-2 ett proteinkomplex med Xpd. Reduktion av Xpd-nivå undertrycker Crb-fenotyper såsom överväxt och hyperfosforylering av H2Av, en markör för DNA-skada. Sammantaget föreslås att Crb krävs för kromosomsegregation under mitos genom att rekrytera Galla och Xpd för att bilda ett nytt komplex. Denna studie ger mekanistiska insikter om en möjlig koppling mellan Crb och Xpd för genomstabilitet och cancer.

Resultat

Knockdown av en ny gen- galla-1 undertrycker Crbs vinst-av-funktion

För att identifiera ytterligare crb- interaktiva gener som kan erbjuda nya ledtrådar till Crb-funktionen, utnyttjade vi grovheten av ögonytan orsakad av överuttryck av Crb intra av glass multiple reporter (GMR) –Gal4 i näthinnan (märkt som GMR > Crb intra ; figur 1a). Genom att använda GAL4 – Upstream Activating Sequence (UAS) -systemet, 27 genetiska korsningar mellan GMR> Crb intra- och UAS– RNA-interferenslinjer (RNAi) ledde oss till att identifiera gener vars knockdown i utvecklande ögon förbättrar eller undertrycker den grova ögonfenotypen av GMR> Crb intra (Mukhopadhyay och Choi, opublicerade).

Minskad Galla-1 undertrycker fenotypen av Crb-överuttryck. ( a ) Överuttrycket av Crb intra under GMR - Gal4 visar en liten, grov ögonfenotyp. ( b ) galla-1 –RNAi undertrycker effekterna av GMR> Crb intra i ögat. ( c ) GMR> galla-1 – RNAi i sig har liten effekt. ( d ) Exakt excision av P-element galla-1 EY01427 genererade galla-1 Δ52 och galla-1 Δ182 , två raderingsmutanter som saknar det mesta av galla-1- kodningssekvensen. Varken galla-1 Δ52 eller galla-1 Δ182 vuxna producerar detekterbara galla-1 messenger RNA (mRNA) och proteinuttryck, vilket bekräftas genom omvänd transkription-PCR (RT – PCR) ( e ) respektive Western blot-analys ( f ). ( g ) GMR> Crb intra / +. ( h ) Fenotypen med grov öga orsakad av Crb-intraöveruttryck undertrycks signifikant i homozygot galla-1 Δ182- mutanter. ( i ) galla-1 Δ182 vuxen escaper som kontroll. ( j ) Sekvensanpassningar av Galla-1-protein med dess homologer producerade med ClustalW. 42 Den C-terminala regionen är starkt konserverad, men de ryggradiga MIP18-familjeproteinerna saknar Galla-1 N-terminal region. Högkonserverade rester indikeras med grå (identiska i fem av sex arter) och svarta (identiska i alla listade arter). Genbankens anslutningsnummer för listade proteiner: Jäst (P38829), Worm (CAB07619), Zebrafish (AAH59535), Mouse (NP_080911) och Human (NP_115607).

Bild i full storlek

På den här skärmen fann vi att RNAi-knockdown av en okarakteriserad gen CG30152 undertrycker starkt Crb-ögonfenotypen (figur 1b). CG30152 RNAi- knockdown i vildtypsbakgrund visar endast subtila effekter i ögat (figur 1c). CG30152 kallades galla-1 (ett koreanskt ord för delning) efter dess förlust-av-funktion-fenotyper av onormala mitotiska kromosomer, såsom visas nedan. galla-1 kodar ett 218 aminosyraprotein (aa) -protein med en konserverad C-terminal region (aa111-aa218) och en okonserverad N-terminal region (figur 1j). Intressant nog är den C-terminala regionen i Galla-1 59% identisk med mänsklig MIP18, en underenhet av MMS19 (34% identisk med Drosophila CG12005) –XPD (MMS19 – XPD – MIP18) -komplex. 22

För att studera funktionen hos Galla-1 genererade vi borttagningar i galla-1- genen genom opriktig excision av P-elementet EY01427 infogat i 5'-regionen i galla-1 (115 bp nedströms från översättningsstartplatsen). Två obekräftade excisionslinjer, galla-1 Δ52 och galla-1 Δ182 , visade 894 bp respektive 968 bp borttagningar, vilka båda tar bort nästan hela kodningssekvensen (aa38-218) nedströms P-elementets införingsplats (figur 1d ). Inget budbärar-RNA-uttryck detekterades genom omvänd transkription-PCR i vuxna vävnader från antingen galla-1 ~ 52 eller galla-1 ~ 182- mutanter (figur 1e). Eftersom Western blot-analys inte visar något detekterbart Galla-1-protein i varken mutant i larv-, valp- och vuxenstadierna (figur 1f), är både galla-1 Δ52 och galla-1 Δ182 troligtvis nollmutationer.

Homozygota galla-1 Δ182- mutanter visar temperaturberoende dödlighet (kompletterande figur S1A), vilket antyder att Galla-1 spelar en roll i normal utveckling. Medan cirka 50% av mutanterna dör under utveckling vid 25 ° C, dör 95% av djur vid 29 ° C. Vid 29 ° C dör mer än 70% av mutanterna under embryonala stadier och resten dör genom larv- och valparstadier. Därefter testade vi om galla-1 Δ182- mutationen också kan undertrycka ögonfenotypen orsakad av överuttryck av Crb intra . Partiell reduktion av Galla-1 i galla-1 / + heterozygoter undertryckte uppenbarligen inte den lilla och grova ögonfenotypen av Crb-intraöveruttryck (inte visad), men homozygot galla-1- mutation resulterade i signifikant räddning av Crb-intrafenotypen (figur 1h ). Liknande undertryckning av Crb-intrafenotypen med RNAi eller galla-1- mutation indikerar att undertrycket beror på en minskning av Galla-1-funktionen.

Förlust av Galla-1 orsakar fel i kromosomsegregation

Eftersom en majoritet av galla-1- mutanter dör under embryogenes, kontrollerade vi om de mutanta embryona uppvisar några defekter relaterade till crb- mutanter. Oväntat visade galla-1- mutanta embryon fläckiga områden som har centrosomer men inte kromosomer (figurerna 2b och c). Dessa kromosomfria centrosomer kan observeras i cortexområdet när felaktigt uppdelade kärnor faller in i det inre av embryot. 26 I vild typ visade ungefär 10% (± 3, 4%) av 2 timmar gamla tidiga embryon före cellularisering (hädanefter "tidiga embryon") ibland onormala kärnviddsdelningar (figur 2a). Däremot visade nästan 40% (± 5, 6%) av galla-1- mutanta embryon stora områden med defekta uppdelningar såsom kromosombroar och onormal placering av centrosomer på grund av ofullständig segregering 28, 29 (figur 2e, kompletterande figur S1B). Dessa resultat antyder att Galla-1 spelar en roll för korrekt kromosomsegregation under mitotisk uppdelning.

galla-1- mutanta embryon visar defekter i kromosomsegregation. ( a - a ′ ′) 2-h-gamla (cykel 13) embryon visar regelbunden 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och centrosomin (CNN) färgning. ( b - b ′ ′) galla-1- mutanta embryon har fläckiga områden med kromosomfria centrosomer som saknar DAPI-färgning (pil). ( c ) En högre förstoringsvy av det boxade området som visar kromosomfria centrosomer ( b ′ ′). ( d ) Vildtyp (WT) -embryon med en högre förstoring visar mellanfasekromosomer med två centrosomer belägna vid motsatta poler. ( e ) Kromosombroar (pilar) och ektopiska centrosomer ses i galla-1- mutanta kärnor. Skalstänger = 20 μm.

Bild i full storlek

Homozygota galla-1- mutantembryon användes för att analysera de mitotiska defektfenotyperna eftersom embryona delvis är livskraftiga som homozygot. För att bekräfta dessa onormala kromosomfenotyper av galla-1- mutanter under nukleär uppdelning undersökte vi trans-heterozygota embryon ( galla-1 / Df ) som innehåller varje kopia av galla-1- mutant och en brist Df (2R) Exel6070 (57A6-57B3) som avslöjade galla-1 . Dessa trans-heterozygota embryon uppvisade också konsekvent kromosomsegregationsdefekt-fenotyper, såsom kromosombroar, ektopiska centrosomer och onormalt mönster av spindelmikrotubulor (kompletterande figur S2).

För att kontrollera om galla-1- mutantembryon visar DNA-defekter undersökte vi nivån för γ − H2Av, Drosophila- homologen för fosforylerad histonvariant H2AX, som är en markör för DNA-strängbrott. 30 Resultaten visade att nivån av y-H2Av signifikant ökas i galla-1- mutanta embryon jämfört med nivån för vild typ (kompletterande figurer S3A och B). y-H2Av detekterades starkt i området där kärnor faller in i det inre av embryot, varigenom området visades där det finns felaktig kärnindelning.

För att förstå grunden för de mitotiska defekterna hos galla-1- mutanter genererade vi en anti-Galla-1-antikropp som specifikt känner igen Galla-1-protein på western blot och i vävnader (kompletterande figur S4). Immunfarvning av tidiga embryon visade avsevärd överlappning av Galla-1-färgning med tubulin i det apikala området (figur 3a). Tangentiella konfokala sektioner visade en väsentlig överlappning av Galla-1 med spindelmikrotubulor under metafas (figur 3b). Som stöd för dessa data visade Galla-1-protein uttryckt i S2-celler överlappande lokalisering med spindelmikrotubuli (figur 3c). Detta antyder att det onormala mönstret för kromosomsegregation kan vara relaterat till den defekta organisationen av spindelmikrotubulor. I själva verket avslöjade galla-1- mutantembryon onormal positionering av centrosomer och förgrening av spindelmikrotubul (figur 3e och f).

galla-1 mutantembryon visar överlappning med mikrotubuluspindlar. ( a - a ′ ′) Sidovyer av vildtyp (WT) embryon i cykel 14 visar partiell överlappning av Galla-1 och a-tubulinfärgning. 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) -färgning visas med blått. ( b - b ′ ′) I vildtypembryon i cykel 12 berikas Galla-1 med ett punktatmönster i mitotiska kromosomer och överlappar α-tubulin i de mitotiska spindlarna. ( c - c ′ ′) S2-celler som uttrycker Galla-1 – FLAG visar överlappande lokalisering av a-tubulin och Galla-1. ( d ) Embryon av vildtyp i metafas med cykel 11 färgade för tubulin (grönt) och centrosomin (CNN) (röd). ( e ) galla-1- mutantembryon visar onormala mönster av mikrotubuluspindlar och centrosomer (pilar). ( f ) Närbild av onormala mikrotubuli i galla-1- mutanta embryon visar onormal förgrening av centrosomer och spindlar. Skalstänger = 5 um.

Bild i full storlek

Crb krävs för korrekt kromosomsegregation under mitos i tidig embryogenes

Eftersom crb messenger RNA är känt för att vara närvarande i 0–3 timmar embryon, 2 och crb visade genetisk interaktion med galla-1 , undersökte vi om Crb också är involverad i kärnkraftsdelning under tidig embryogenes. Först använde vi crb 11A22 null mutant för att undersöka rollen som Crb i tidiga embryon. Ungefär 32% (± 4, 2%) av 2 timmar gamla embryon av denna genotyp uppvisade kromosomfel såsom kromosomfria centrosomer, kromosombryggor och onormalt mikrotubulmönster under mitos (figur 4a).

Crb krävs för korrekt kromosomsegregation. ( a - a ′ ′) crb 11A22 nullmutanta embryon (cykel 12) visar fläckiga områden med kromosomfria centromerer ( a, vita rutor), kromosombroar ( a ′, pilar), onormala mikrotubulusspindlar ( a ′ ′, pilar) . ( b - b ′ ′) matta> crb RNAi- embryon visar också böjda kromosomer och kromosombroar ( b, pilar), monopolära spindlar ( b ′, pil) och fusion med angränsande spindlar ( b ′ ′, pil). ( c - c ′ ′) crb 8F105 null-allelen visar liknande kromosomsegregationsfel som crb 11A22 null mutant ( c ′ ′, pilar). ( d, e ) crb ΔJM och crb ΔPBM mutant alleler visar inte sådana mitotiska defekter. Skalstänger = 20 μm.

Bild i full storlek

Eftersom det finns litet eller inget zygotiskt genuttryck i 0-2 timmar embryon, antyder observationen av kromosomdefekter i crb 11A22- mutantembryon att den reducerade nivån av Crb-funktion i crb 11A22 kanske inte är tillräckligt för normala kärnkraftsdelningar i tidiga embryon. Vi har försökt att generera groddkloner genom mitotisk rekombination med användning av ovo D1 FRT 31 men kunde inte hitta crb 11A22- kloner. För specifik knockdown av maternellt Crb-uttryck, korsade vi crb RNAi med matern-gal4 , vilket kan driva Gal4-uttryck i groddceller. 32 För att testa specificiteten för crb RNAi utförde vi embryofärgning med Crb-antikropp och den totala nivån av Crb i crb RNAi- embryon reducerades jämfört med vildtypen (kompletterande figur S5B). crb RNAi minskade också kraftigt nivån av Galla-1 i tidigt embryo (kompletterande figur S5D). Liksom i galla-1- mutanter visade embryon från matta> crb-RNAi- kvinnor allvarliga kromosomdefekter som kromosombroar och böjda kromosomer (figur 4b). De visade också defekter i spindelmikrotubulor såsom monopolära spindlar och fusion med en eller flera angränsande spindlar (figur 4b ′ och b ′ ′). Vi testade om återuttryck av Galla-1 kan rädda defekter i crb- mutantembryon. Mer än 80% ( n = 113 från 138 embryon värderade) av matta> crb-RNAi- embryon visade defekter i kromosomsegregation. Galla-1-överuttryck i matta> crb-RNAi- bakgrund minskade emellertid de defekta embryona till ~ 30% ( n = 47 från 141 embryon som fick poäng) (Kompletterande figurer S5E – E ′ ′). Detta antyder att Crb-funktionen åtminstone delvis medieras av Galla-1.

Baserat på fenotypen crb 11A22 testade vi med en annan nullallel crb 8F105 som tar bort C′-terminal 23 aa inklusive två funktionella motiv, PBM och JM. 33 Konsekvent visade crb 8F105- mutantembryon liknande defekter under mitotisk uppdelning som crb 11A22- mutantembryon (figur 4c och c '′). För att bestämma om JM- och PBM-motiv också krävs för mitotisk funktion, kontrollerade vi genetisk interaktion med användning av varje JM- och PBM-bristmutant-alleler. 10 Intressant nog orsakade crb- mutanta alleler med antingen radering av PBM ( crb ΔPBM ) eller förändrade JM ( crb ΔFBM , Y10A, E16A-substitutioner i JM) mutanter inte sådana fenotyper som ses i crb 11A22 eller crb 8F105 null alleler (figur 4d och e) . Således verkar mitotiska defekter i crb- mutanta embryon vara oberoende av PBM- och JM-motiv.

Crb uttrycks i stort sett i tidiga embryon i ett nätverkmönster. Dubbel märkning med Tubulinfärgning indikerar att två sidor av varje nät överlappar varandra med metafaskromosomerna och mitotiska spindlar (figur 5a). Denna Crb-färgning liknar mesh-nätverksmönstret för Galla-1-lokalisering i samma stegembryo (figur 5c), i överensstämmelse med defekterna i spindelmikrotubuli. Vi använde också en Crb :: grönt fluorescerande protein knock-in-allel 34 för att bekräfta mönstret för Crb-lokalisering upptäckt av anti-Crb-antikropp. Antikroppfärgningen för Crb :: grönt fluorescerande proteinreporter visade ett liknande uttrycksmönster som Crb-protein (figur 5b). Både Crb :: grönt fluorescerande protein och Crb-protein verkar vara mer berikade i nodområdet i nätet där centrosomer är lokaliserade. Dessa data antyder att en betydande del av Crb är lokaliserad till regionen för kromosomsegregation, i överensstämmelse med crb- RNAi och mutanta fenotyper av defekta kärnkraftsdelning i tidiga embryon.

( a - a ′ ′) Crb uttrycks i ett nätverkmönster och överlappar med metafas-spindelmikrotubulor av vildtyp (WT) -embryon. ( b - b ′ ′) Embryo som bär Crb :: grönt fluorescerande protein (Crb :: GFP) allel visar GFP-reporteruttrycket som liknar Crb-proteinmönstret som visas i figur 5a. ( c - c ′ ′) Crb samlokaliseras med Galla-1 och visar liknande nätverksmönster i tidiga embryon. Skalstänger = 20 μm. ( d ) I samimmunutfällningsanalyser med S2-cellextrakt binder Galla-1 till Myc-märkt Crb intra . ( e ) I GST-nedtagningsanalyser binder Galla-1 direkt till Crb: s intracellulära domän.

Bild i full storlek

Den genetiska interaktionen mellan galla-1 och crb ökar möjligheten att dessa två proteiner fysiskt kan interagera. I samimmunutfällningsanalyser med användning av extrakt av odlade S2-celler utfälldes anti-Myc-antikropp för Myc-märkt Crb- intra Galla-1 (figur 5d). Som stöd för detta resultat indikerade glutathion S-transferas (GST) neddragningsanalyser också att Galla-1 direkt binder till Crb: s intracellulära domän (figur 5e).

Identifiering av Galla-2 som företrädesvis binder Drosophila Xpd

Human MIP18 är associerad med Xpd i MMS19 – XPD – MIP18-komplexet. Knockdown av MMS19 – XPD – MIP18-komplexet orsakar defekter i kromosomsegregation under mitos. 22 Drosophila- homologen från Xpd är också involverad i flera uppgifter såsom korrekt spindelmikrotubulorientering, kromosomsegregation och reglering av mitotisk kinasaktivitet. 26 Eftersom galla-1- mutanter uppvisar anmärkningsvärt liknande kärndelningsdefekter som ses i Drosophila xpd- mutantembryon, kan Galla-1 vara relaterad till Xpd-funktionen. Således kontrollerade vi om knockdown av Xpd kan undertrycka fenotypen av Crb-intraöveruttryck, som galla-1 RNAi eller mutanter gjorde. Faktum är att reduktion av Xpd-nivån med antingen xpd RNAi eller + / xpd - heterozygositet ledde till stark undertryckning av Crb-intrafenotypen (kompletterande figurer S6B och C).

Eftersom den C-terminala halvan av Galla-1 visar en hög sekvenslikhet med MIP18 (figur 1j) testade vi sedan om Galla-1 fysiskt interagerar med Xpd. Oväntat visade neddragningsanalyser med bakteriellt renat Galla-1 och Xpd liten bindning in vitro . För att testa om den N-terminala halvan av Galla-1 kan vara hämmande för bindningen av MIP18-liknande domän av Galla-1 till Xpd, genomförde vi liknande neddragningsanalyser med separata N- och C-terminala halvor. Varken N-terminal halva eller den MIP18-liknande C-terminala halvan av Galla-1 visade emellertid märkbar bindning till Xpd (figur 6a). Vidare indikerade samimmunutfällningsanalyser med användning av S2-celler att Galla-1 inte bildar ett starkt komplex med Xpd (figur 6b). Detta antydde att det kan finnas andra Galla-1-liknande proteiner som kan binda Xpd.

Galla-2 binder Drosophila Xpd och krävs för normal mitos. ( a ) Xpd binder inte till Galla-1 men visar konsekvent bindning med Galla-2. ( b ) I co-immunutfällningsanalyser med S2-cellextrakt bildar Xpd inte ett proteinkomplex med Galla-1. ( c ) En galla-2- deletionsmutant ( galla-2 Δ203 ) genererades genom exakt excision av P-elementet galla-2 EPG5485 . Det borttagna området indikeras med fyrkantiga parenteser. ( d - d ′ ′) Vildtyp (WT) embryon i cykel 12 färgade med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och anti-centrosomin (CNN). ( e - e ′ ′) galla-2- mutanta embryon har kromosomfria centrosomer (vit ruta i e ′ ′) och kromosombroar (pilar i e ′ ′). Skalstång = 20 μm.

Bild i full storlek

Från en BLAST-sökning identifierade vi ett okarakteriserat Galla-1-relaterat protein (CG7949) som är 51% identiskt med Galla-1 (kompletterande figur S7). Denna genprodukt med namnet Galla-2 saknar den N-terminala regionen av Galla-1, som MIP18. Galla-1 och Galla-2 visar 59 och 71% proteinsekvensidentitet till human MIP18. För att bestämma om Galla-2-funktionerna liknar de i Galla-1 genererade vi först en raderingsmutant, galla-2 Δ203 , som saknar hela (526 bp) kodningssekvensen (figur 6c). Denna mutation är embryonal dödlig, vilket indikerar att Galla-2 är nödvändig för embryogenes. Sedan testade vi huruvida galla-2- mutanter kan undertrycka fenotypen av Crb-överuttryck i ögat. galla-2 Δ203 / + heterozygoter undertryckte avsevärt Crb-intratiska ögonfenotyp (kompletterande figur S6F), sett med galla-1 homozygotmutant. Undertryckning av Crb-intraögonfenotyp med galla- mutationer antydde att Crb-intraöveruttryck kan öka nivån av Galla-1 / -2-proteiner. Western blot-analys av huvudekstrakter visade emellertid att Crb-intraöveruttryck av GMR-Gal4 inte signifikant förändrar proteinnivån för Galla-1 / -2 jämfört med den för vild typ (kompletterande figur S8). Således beror de mitotiska defekterna i GMR> Crb intra troligen inte på en ökad nivå av Galla-1 / -2-proteiner.

Därefter försökte vi generera kimlinje galla-2 Δ203 mutantkloner med hjälp av ovo D FRT för att analysera förlust-av-funktion fenotyp. Vi kunde inte hitta germline-mutanta kloner, vilket tyder på att Galla-2 är involverad i oogenes. Emellertid visade 0–2-timmars galla-2 mut203- mutanta embryon liknande kärndelningsdefekter i crb- och galla-1- mutanter såsom kromosombryggor och kromosomfria centrosomer (figur 6e, kompletterande figur S9). Dessa resultat indikerar att Galla-1 och Galla-2 har liknande funktioner i mitos. I överensstämmelse med galla-1 - mutantembryon visade galla-2- mutanta embryon också den ökade nivån av y-H2Av (kompletterande figur S3C).

Det är anmärkningsvärt att även om Galla-1 och Galla-2 delar konserverade proteinsekvenser, är de inte helt redundanta i sina funktioner eftersom mutationer i endera genen leder till liknande fenotyper. Galla-2 verkar dock vara mer kritiskt än Galla-1, eftersom galla-2- nollmutanter är 100% dödliga, medan galla-1- nollmutanter visar partiell dödlighet. Partiell dödlighet av galla-1- mutanter förbättrades avsevärt genom att minska doseringen av galla-2 med galla - 2 / + (kompletterande figur S10). Detta stöder att både Galla-1 och Galla-2 krävs för normal utveckling och korrekt kärnkraftsdelning, men Galla-2 kan endast delvis ersätta Galla-1-funktionen i dess frånvaro.

Crb bildar ett komplex med Galla-Xpd och krävs för fosfohiston H3 (PH3) lokalisering

Vi testade om Galla-2 kan binda Xpd. Till skillnad från Galla-1 uppvisade Galla-2-proteinet konsekvent bindning med Xpd i neddragningsanalyser (figur 6a), och det sameffektivt samutfälldes med Xpd i S2-cellextrakt (figur 7a). Som väntat från bindningen mellan Galla-1 och Crb intra interagerade Galla-2 också direkt med Crb intra (figur 7b och c). Dessa resultat antyder att Crb intra bildar ett nytt proteinkomplex med Galla-proteiner och Xpd. Eftersom Galla-2 kan binda både Crb och Xpd (figurerna 7a och b), är det möjligt att Crb kan interagera med Xpd. I själva verket kan Crb intra bilda ett proteinkomplex med Xpd (figur 7d). I frånvaro av exogent Crb intra kunde Galla-2 samimmunutfällas med Xpd såsom visas tidigare (figur 7a och spår 3 i figur 7e). Vidare ökade en tillsats av Crb intra genom transfektion avsevärt nivån på samimmunutfällt Xpd (ungefär 2, 1 gånger i genomsnitt från tre analyser) (figur 7e), vilket visar en Crb-dosberoende interaktion. I överensstämmelse med den tidigare visade genetiska interaktionen (figur 4d och e) visade den fysiska interaktionen att Galla / Xpd-proteiner fortfarande kunde binda till Crb intra-JM, Crb intra-PBM och till och med Crb intra-JM Δ PBM med mutationer i både JM och PBM (kompletterande figur S11). Dessa resultat antyder att varken JM- eller PBM-domänen är väsentlig för att binda Galla / Xpd-proteiner och för den mitotiska funktionen av Crb.

Crb bildar ett komplex med Galla – Xpd och krävs för PH3-lokalisering. ( a ) Co-immunoprecipitation (Co-IP) -analyser i S2-celler visar att Galla-2 binder FLAG-märkt Xpd. ( b, c ) Crb bildar ett proteinkomplex med Galla-2 genom direkt bindning bekräftad med Co-IP ( b ) och GST-neddragningsanalys ( c ). ( d ) I samimmunoprecipiteringsanalyser med S2-cellextrakt drar Myc-märkt Crb intra Xpd. ( e ) Nivån för samimmunutfällt Xpd med Galla-2 ökar med tillsatsen av Crb intra genom transfektion. ( f ) Vildtyp (WT) embryon i cykel 12 anafas färgade för PH3 (röd). 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) -färgning visas med blått. ( g ) mat> crb RNAi- embryon visar ökade nivåer av PH3-färgning i hela kromosomregionen jämfört med vildtyp. Skalstänger = 20 μm.

Bild i full storlek

Det har visats att Drosophila Xpd krävs för reglering av mitotisk kinasaktivitet och kromosomstabilitet, oberoende av reparation av nukleotid excision. 26, 35 Denna studie antyder att Xpd krävs för korrekt lokalisering av cyklinaktiverat kinaskomplex, varigenom spindeldynamiken och kromosomsegregationen kontrolleras. 26 I vildtypembryon reduceras PH3-färgning kraftigt i det polära området för anafaskromosomer. Emellertid visar xpd- mutanta embryon ökade nivåer av PH3-färgning kvarhållen i större delen av kromosomer på grund av felaktig reglering av mitotisk kinasaktivitet. 26 Om Crb är involverat i bildandet och / eller underhållet av Xpd – Galla-komplexet, kan reduktion av Crb härma de mitotiska defekterna som finns i xpd- mutanta embryon. I matta> crb-RNAi- embryon visade anafas-kromosomer höga nivåer av PH3-färgning i alla kromosomala regioner jämfört med vildtyp, vilket indikerar att PH3-färgning kvarstår i det polära kromosomala området (figurerna 7f och g). Det har indikerats att kromosombroar som finns i xpd- mutanta embryon är relaterade till fasthållandet av PH3. 26 Liknande kromosombryggor och fasthållandet av PH3 i anafas-kromosomerna hos mat> crb RNAi- embryon stödjer idén att Crb och Xpd fungerar i ett proteinkomplex.

Interaktion mellan crb , galla-1 och xpd för cellproliferation i imaginal skiva

Både funktionsförlust och överuttryck av Crb- intra resulterar i överväxt av imaginära skivor, vilket indikerar att rätt nivå av Crb är viktig för dess funktion i tillväxtreglering och Crb intra kan fungera som en dominerande-negativ faktor. 9 Vi testade om Crb-funktionen för skivtillväxt också är relaterad till Galla- och Xpd-proteiner. Överuttryck av Crb intra i vingskiva med användning av MS1096-Gal4 resulterade i dramatisk överväxt (figur 8d). Denna överväxt med Crb- intra undertryckades starkt genom att reducera Galla-1 eller Xpd med RNAi (figurerna 8e och f). Detta stöder att Crb kräver Galla och Xpd för att främja överväxt av vingskiva.

Ektopisk Crb-aktivitet som orsakar DNA-dubbelsträngsbrott undertrycks av galla-1 och xpd- knockdown. ( a ) MS1096-Gal4 / + vingskiva färgad för y-H2Av. Insättningen visar expressionsmönstret för MS1096> grönt fluorescerande protein . ( b, c ) Överuttryck av galla-1 RNAi ( b ) och xpd RNAi ( c ) i vingskivan visar låga nivåer av fosforylerad H2Av liknande kontrollen ( a ). ( d ) Överuttryck av Crb intra i vingskiva med användning av MS1096-Gal4 resulterar i ökade nivåer av fosforylerad H2Av. ( e, f ) Den ökade nivån av fosforylerad H2Av undertrycks signifikant av galla-1 RNAi och xpd RNAi . Skalstänger = 100 μm. ( g ) Grafen visar antalet y-H2Av-positiva celler per vävnadsområde. Felfält indikerar sd

Bild i full storlek

Anmärkningsvärt ledde Crb-intraöveruttryck också till väsentliga ökningar i nivån av fosforylerad H2Av (figurerna 8d och g), såsom ses i galla- mutanta embryon (kompletterande figur S3). Detta antyder att överproliferation med Crb- intra inducerar DNA-lesioner och DNA-skador svar såsom H2Av-fosforylering. Det är möjligt att Crb-överuttryck resulterar i bildandet av ett överdrivet komplex med Galla som dominerande kan störa funktionen hos det endogena Crb – Galla-komplexet. I detta fall kan delvis sänka nivån av Galla sänka nivån av Crb- intra- Galla-komplexet och därmed undertrycka de dominerande effekterna av Crb-intraöveruttryck. I själva verket, när Galla-1 eller Xpd reducerades med RNAi, undertrycktes också nivån av y-H2Av förhöjd med Crb intra . Dessa resultat överensstämmer med vikten av Crb-interaktion med Galla-1 och Xpd för vävnadsväxt och tillhörande DNA-skador av Crb intra .

Diskussion

Crb har implicerats i tillväxtkontroll och tumörgenes. 10, 11, 20, 36 Det är känt att förlust eller överuttryck av Crb orsakar överproliferation av imaginära skivceller. Det har föreslagits att Crb krävs för aktivering av tumörsuppressorn Salvador-Warts – Hippo-vägen genom att lokalisera FERM-domänproteinet Expanded (Ex). 10, 11 Förlust eller överuttryck av Crb orsakar missokalisering av Ex, vilket leder till Yorkieberoende cellproliferation och cellöverlevnad. 9, 10 Trots de omfattande studierna på Crb är det fortfarande okänt om Crb är direkt involverad i mitotiska händelser. I vår studie har vi identifierat två nya gener, galla-1 och galla-2 , som interagerar med crb . Detta ledde till att vi fann en överraskande ny funktion av Crb för kromosomsegregation och stabilitet under mitos. Vidare tillhandahöll Galla-proteiner en länk mellan Crb och Xpd, en kritisk regulator för mitos och genomstabilitet.

En ny studie har visat att nedslagning av antingen MIP18 eller Xpd i mänskliga odlingsceller resulterar i onormala mitotiska spindlar såsom monopolära eller multipolära spindlar. 22 Men lite är känt om uppströmsfaktorer som kan reglera lokaliseringen och / eller funktionen av MIP18 och Xpd. Vår studie visar att de mitotiska defekterna i MIP18 / Xpd-knockdown-mänskliga celler liknar fenotyperna i Drosophila- embryon med reducerad funktion av galla- eller crb- genen. Eftersom Galla-1 är starkt minskat i Crb-mödrarna, verkar rekryteringen av Galla och Xpd bero på Crb. Nyligen genomförda studier har implicerat Crb vid tumörsuppression, 37 men hur Crb är relaterat till mitotiska händelser är okänt. Våra data ger bevis för lokalisering av Crb med Galla till mitotiska spindlar. En möjlighet är att Crb kan vara involverad i att reglera stabiliteten i kromosomsegregation genom att rekrytera Xpd till mitotiska spindlar, i överensstämmelse med den förbättrade Crb- intra- Xpd-interaktionen genom tillsats av Crb intra . Följaktligen ger denna studie en mekanistisk inblick i den nya funktionen av Crb som en möjlig ledning för rekrytering av ytterligare proteiner inklusive Galla och Xpd, involverade i stabilisering av mitotiska spindlar och kromosomsegregation. Det är okänt hur transmembranproteinet Crb kan lokaliseras till mitotiska spindelregioner. Intressant nog har nya studier visat att endosomer spelar roller för organisationen av astrala mikrotubulor och mitotisk spindel, 38 och kromosominställning under mitos. 39 Därför är det möjligt att Crb-lokalisering under kärnkraftsdelning kan regleras av vesikelberoende handel. Våra data föreslår en modell där Crb-intradomänen fungerar som en plattform för bildandet av nytt proteinkomplex, som vi kallar "CGX (Crb – Galla – Xpd) -komplexet", för att reglera kärnkraftsdelning under tidig embryogenes. Innan cellularisering i embryo distribueras Crb i ett nätverkmönster, vilket signifikant överlappar det mitotiska spindelmönstret och rekryterar Galla-1 och Galla-2-proteiner genom direktbindning till Crb-intradomänen. Crb intra kan också rekrytera Xpd och främja bindningen mellan Galla-2 och Xpd. Intressant nog tyder våra data på att fysiska interaktioner mellan Crb intra och Galla / Xpd kan involvera en annan region av Crb intra än JM- och PBM-motiv. I själva verket verkar Xpd binda bättre till Crb intra när både JM- och PBM-motiv är muterade, vilket antyder att närvaron av JM och PBM kan störa Xpd-bindningen. Eftersom Crb intra-PBM har substitutionsmutationer i endast två rester (Y10A och E16A) snarare än en radering av hela JM-domänen, är det fortfarande möjligt att andra rester i JM-domänen kan vara nödvändiga för att binda Galla / Xpd. Intressant nog visar crb 8F105- allelen med en radering av C-terminal 23 aa liknande mitotiska defekter som crb 11A22 null-allelen, vilket antyder att ett område mellan JM och PBM kan vara viktigt. Ytterligare studier är nödvändiga för tydlig identifiering av specifika motiv involverade i fysiska interaktioner mellan Crb och Galla / Xpd.

Trots de liknande proteinsekvenserna av Galla-1 och Galla-2, binder Xpd företrädesvis till Galla-2. Således kan Galla-2 vara mer kritisk än Galla-1 för bildning av CGX-komplexet. Detta kan också vara relaterat till det faktum att (i) galla-2- nollmutation visar mer allvarlig dödlighet än galla-1- nollmutationer och (ii) + / galla-2- heterozygot effektivt kan undertrycka ögonfenotypen av Crb-överuttryck, medan galla -1 kan undertrycka det bara som homozygot. Våra data visar att förlust eller minskning av varje komponent i CGX-komplexet resulterar i liknande defekter i spindelmönstret och kromosomsegregationen. Xpd krävs för att reglera mitotisk kinasaktivitet, spindeldynamik och kromosomsegregation, 26 men det är inte väl förstått hur det regleras. Våra data ger en ny ledtråd genom att visa att Crb och Galla deltar som bindande partners för att rekrytera Xpd till ett funktionellt komplex. Förutom deras roller i kärnkraftsdelning i tidigt embryo visar vi att överväxt av vingskiva av Crb intra kan undertrycks genom att antingen reducera Galla-1 eller Xpd. Följaktligen kan funktionen hos CGX-komplex också krävas för cellproliferation i utvecklande organ. Felreglering av mitos och genominstabilitet är ett kännetecken för cancer. Våra upptäckter av CGX-komplexet kan ge insikt i funktionen av Crb-familjproteiner från däggdjur och deras potentiella koppling till MIP18 – XPD-komplexet.

Material och metoder

Flygenetik

Alla Drosophila- stammar odlades och bibehölls vid rumstemperatur. För överuttryck av Crb intra korsades UAS – Crb intra med GMR – Gal4 (Bloomington). Galla-1 RNAi-linjen är från National Institute of Genetics aktiecentrum (Japan). Bristlinje Df (2R) Exel6070 , xpd RNAi , UAS – crb RNAi, crb 8F105 och matern-gal4 är från Bloomington aktiecentrum; Crb :: grönt fluorescerande protein, crb ΔFBM , crb ΔPBM alleler är från Dr Yang Hong och xpd p är från Dr Beat Suter.

Generering av galla null-mutanter

galla-1 och galla-2- deletionsalleler genererades genom exakt skärning av P-elementinsättningen galla-1 EY01427 respektive galla-2 [EP] G5485 . Potentiella excisionslinjer identifierades genom förlust av w- markörer, och genomiskt DNA från dessa linjer användes som PCR-mallar. Deletionsbrytpunkter bekräftades genom sekvensering. Embryodetalitet hos galla-1 och galla-2- mutanter räddades genom aktin> galla-1 respektive aktin> galla-2 .

Generering av Galla-1 och Galla-2 antikropp

Hela kodande sekvensen av Galla-1 amplifierades och klonades till pGEX-4T1 genom EcoRI och Xhol- ställen. GST – Galla-1-fusionsprotein uttrycktes i BL21 genom isopropyl-p-D-1-tiogalaktopyranosidinduktion, och renat protein användes för att immunisera kaniner (Peptron, Daejeon, Korea). Hela längden av Galla-2 klonades in i pGEX-4T1 genom BamHI och Xho I-ställen. GST – Galla-2-fusionsprotein extraherades och användes för att immunisera kaniner (Abfrontier, Seoul, Korea).

Immunfarvning av embryon

Embryofixering utfördes enligt standardmetoder. Embryon fixerades under 20 minuter i en lösning innehållande heptan (Sigma, St Louis, MO, USA) och 3, 7% formaldehyd (Polysciences, Warrington, PA, USA) i PEM-buffert (PIPES – EGTA – MgCl2). För färgning mot tubulin utfördes metanolfixering för att bevara mikrotubulstrukturer. 26 Följande antikroppar användes för embryofärgning vid angivna förhållanden: kanin-anti-centrosomin (från Dr Thomas Kaufman) 40 vid 1: 500, mus-anti-a-tubulin vid 1: 100 (Sigma), rått-anti-Crb vid 1: 500, kanin anti-Dpatj vid 1: 500, kanin anti-PH3 vid 1: 200 (Millipore, Billerica, MA, USA), kanin anti-y-H2Av vid 1: 1000 (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) och kanin anti-Galla-1 vid 1: 200. Sekundära antikroppar konjugerade med Cy3, Cy5 eller fluoresceinisotiocyanat var från Alexa Flour (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). Vectashield med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) användes för montering. Fluorescerande bilder förvärvades med hjälp av Carl Zeiss konfokala mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

Cellodling, transfektion, immunutfällning och Western blot-analys

Drosophila S2-celler odlades i M3-media (Sigma) med 10% insektmedietillskott (Sigma). Transfektion utfördes med Effectene-reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Totalt användes 1–2 μg DNA för varje transfektion. För immunutfällning lyserades celler i 0, 1% CHAPS-buffert (50 m M NaCl, 200 m M HEPES, 1 m M EDTA och proteasinhibitcocktail), och lysaterna förklarades genom inkubering med protein-G-sepharose-pärlor (Amersham Bioscience, Amersham, UK) under 1 timme vid 4 ° C. G-sepharose-pärlorna immunutfälldes med anti-Myc (Abcam, Cambridge, MA, USA) vid 4 ° C under 1 timme. Immunutfällningarna som fångats av protein G-sepharose inkuberades med de klara lysaten över natt vid 4 ° C. Immunutfällningar tvättades och utsattes för SDS – polyakrylamidgelelektrofores. Western blot genomfördes med kanin Galla-1 (1: 2000), kanin Galla-2 (1: 5000) och mus V5 vid 1: 5000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

In vitro -neddragningsanalyser

För neddragning av GST transformerades isopropyl-P-D-1-tiogalaktopyranosid-inducerbara R2-celler (BL21-derivat) med plasmider för MBP – Crb intra, GST – Galla-1 och GST – Galla-2. Bakteriella celllysat framställdes såsom beskrivits. 41 Neddragbar buffert vid följande tillstånd användes: 20 m M Tris pH 7, 5, 150 m M NaCl, 0, 5 m M EDTA, 10% glycerol, 0, 1% Triton X-100, 1 m M ditiotreitol och proteasinhibitorcocktail. För western blotting användes kanin-anti-MBP-antikropp (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) och sekundär anti-kaninantikropp (Jackson, Newmarket, UK).

anslutningar

GenBank / EMBL / DDBJ

  • AAH59535
  • CAB07619
  • NP_080911
  • NP_115607
  • P38829

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

  3. 3.

    Kompletterande figur 3

  4. 4.

    Kompletterande figur 4

  5. 5.

    Kompletterande figur 5

  6. 6.

    Kompletterande figur 6

  7. 7.

    Kompletterande figur 7

  8. 8.

    Kompletterande figur 8

  9. 9.

    Kompletterande figur 9

  10. 10.

    Kompletterande figur 10

  11. 11.

    Kompletterande figur 11

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)