Konstruktiv ombyggnad av en syntetisk endotel extracellulär matris | vetenskapliga rapporter

Konstruktiv ombyggnad av en syntetisk endotel extracellulär matris | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Analyssystem
  • Bioinspirerade material
  • Lab-on-a-chip

Abstrakt

Konstruktionen av välkontrollerbara in vitro- modeller av fysiologiska och patologiska vaskulära endotel är fortfarande en grundläggande utmaning i vävnadsteknik och läkemedelsutveckling. Här presenterar vi ett tillvägagångssätt för att bilda en syntetisk endotel-extracellulär matris (ECM) som liknar den hos den ursprungliga strukturen genom att lokalt avsätta källmembranmaterial på typ 1 kollagen-nanofibrer endast i ett område intill monokiktet av endotelcellen (EC). Att odla EC-monolageret på denna syntetiska endotel-ECM förbättrade anmärkningsvärt dess fysiologiska egenskaper, minskade dess vaskulära permeabilitet och främjade en stabiliserad, lugnande fenotyp. Vi demonstrerade att EC-monolageret på den syntetiska endotel-ECM varken skapar icke-fysiologiska hinder för cell-cell- eller cell-ECM-interaktioner, och inte heller hindrar molekylär diffusion av tillväxtfaktorer och andra molekyler. Det syntetiska endotelet ECM och vaskulärt endotel på det kan hjälpa oss att gå in i en ny fas av forskning där olika modeller av det biologiska barriärbeteendet kan testas experimentellt.

Introduktion

Det vaskulära endotelet, som ligger vid gränsytan mellan blodvävnad, är både en viktig leverantör av avgörande metaboliska faktorer och också en grundläggande barriär, selektivt begränsande genomgång av blodplasma, cirkulerande celler och olika patogener 1 . Barriärfunktionen är huvudsakligen bildad av cytoskeletter och cell-cell / matrisföreningar 1 och är väl känd för att störas i vävnader med sjukdomar 2, 3 . Ett antal in vitro- analyser som använder en endotelcell (EC) monolager har utvecklats för att bedöma dess barriärfunktion, inklusive intravasationsanalys, extravasationsanalys, artificiellt membranpermeabilitetsanalys och Caco-2 permeabilitetsanalys 4, 5 . Emellertid finns inget enkelt förfarande som rekapitulerar alla funktioner i det nativa vaskulära endotelet, inklusive ett lägre, in vivo- liknande permeabilitetsvärde, cellulära / extracellulära komponenter och en tredimensionell (3D) struktur, ännu 4, 5 . I en sådan tidigare utvecklad modell, Cecchelli et al. (1999) rapporterade att en hjärnkapillär EG-astrocyt-samkultur nära efterliknar blod-hjärnbarriären in vivo (BBB) 6 . I denna tvådimensionella (2D) -modell odlades bovina hjärn-EC: er på extracellulär matris (ECM) -belagda porösa membran (luminal sida) och astrocyter odlades på bottenytan (abluminal sida) på en sexbrunnsplatta samtidigt. Andra forskningsgrupper har använt liknande metoder för att generera in vitro blodkapillärmodeller och andra BBB-modeller 7, 8 . Dessa tidigare beskrivna modeller har begränsningar, inklusive ett högt vaskulärt permeabilitetsvärde jämfört med det som observerats in vivo , diffusionsinstabilitet för Transwell-enheterna som används som plattform, och en icke-fysiologisk 2D-struktur (poröst membran eller enkel ECM-belagd hård yta) 6 9 3D-cellkultursteknologi har nyligen kommit i rampljuset på grund av dess in vivo- relevans 10 ; emellertid har ingen tidigare studie visat in vivo- liknande vaskulära permeabilitetsvärden. In vivo finns EC-monolager på endotel-ECM, som består av tunt källarmembran (BM) på tjock interstitiell matris och är nödvändigt för stabilt underhåll av homeostas i vaskulärt endotel 1 . Konstruktion av in vitro- modeller som verkligen återger de patofysiologiska förhållandena för in vivo vaskulärt endotel är allt viktigare för att skapa olika sjukdomsmodeller, vävnadstekniska tillämpningar och läkemedelsupptäcktinsatser.

Här beskriver vi ett syntetiskt endotel-ECM som består av ett tunt lokalt skikt av källmembranbelagd kollagen (BM-COL1) nanofibrer för att efterlikna det tunna källarmembranet på den mellanliggande matrisen in vivo . Vi presenterar en enkel metod för att generera 3D-rörliknande vaskulärt endotel omgivet av BM-COL1 nanofibrer. Skiktet med BM-COL1 nanofibers formulering innefattar effekterna av ECM-proteiner och andra stimuli och tillhandahåller ett medel för att återkapitulera olika fenotyper av EC-monolager, inklusive lugnande / täta EC-monolager under normala förhållanden och läckande / angiogen kapillär morfogenes under specifika patologiska förhållanden.

Tidigare rapporterade vi en metod för att införliva COL1 hydrogel i en mikrofluidanordning för att härma en interstitiell matris 11, 12, 13 . Med denna enkla mikrofluidiska metod kan COL1 gelas i en mikrofluidisk kanal genom införande av natriumhydroxid (NaOH) och termisk inkubation. Denna COL1-gel är mångsidig och kan användas som en grundläggande ECM-mall i olika 3D-cellkulturapplikationer, inklusive permeabilitetsanalyser och spirande angiogenes 13, transendotelial migration 14, cancermetastas 15 och andra mono / samkulturmodeller 16, 17 . Det särskiljande kännetecknet för EG-monolageret som är viktigast för att uppnå tillförlitliga experimentella resultat, särskilt vid permeabilitet och transendotelmigrationsanalyser, är dess barriärfunktion. Emellertid är EC-monolager odlade på COL1 relativt läckande jämfört med kärl in vivo . Vi antar att den låga permeabiliteten 18, 19 kan bero på frånvaron av en åtföljande BM på ytan av COL1, eftersom det är välkänt att BM stabiliserar endotelet genom orkestrering av aktincytoskeletten och rekrytering av kinaser (t.ex. Src kinas och fokal vidhäftningskinas [FAK]), en process som utlöses av integrinbindning till lamininet (LN) som är den vanligaste i BM 1 . Vi har skapat en syntetisk endotel ECM med ett lokalt lager av BM-COL1 nanofibrer genom introduktionen av utspädd tillväxtfaktorreducerad (GFR) Matrigel-lösning, som har liknande komponenter (t.ex. LN och kollagen typ IV) till en naturlig BM (Fig. 1 och kompletterande figur S1, 2).

( a ) Schematisk översikt över deponeringsprocessen. BM-material fästes gradvis på ytan av COL1 bildad före avsättningsprocessen och ombyggnad till en syntetisk endotel ECM. Dessa illustrationer skapades från området motsvarande den prickade rektangeln i tilläggsfigur S.2b. ( b ) I avsättningsprocessen kontrolleras skikttjockleken för BM-COL1 nanofibrer ( h ) genom inkubationstid ( t ) och följer en kvadratrotrelation (inbyggd ekvation), vid en fast koncentration av BM-lösning och inkubationstemperatur. Den konfokala mikroskopiska bilden (insättning) erhölls från området motsvarande den prickade rektangeln i tilläggsfigur S.2b, som visar det bildade skiktet av BM-COL1 nanofibrar (grönt, LN). Felstänger, ± SEM ( n = 4 ~ 6). ( c ) Tvärsnittsbilder av COL1 (övre vänstra), syntetisk endotel ECM (övre högra) och en EC på ytan av syntetisk endotel ECM (nedre bild). Skalstänger = 4 mikrometer.

Bild i full storlek

Ett skikt av BM-COL1 nanofibrer, som kontrasterar skarpt med normal COL1, detekteras enkelt genom faskontrastmikroskopi med polyklonal anti-LN-primärantikropp från kanin och Alexa Fluor 488-konjugerad get-anti-kanin sekundär antikropp (fig. 1b och kompletterande fig S2b). GFR Matrigel börjar gela vid temperaturer över 10 ° C. För att förhindra för snabb gelning, vilket skulle leda till igensättning i den mikrofluidiska kanalen, utspädde vi GFR Matrigel-lösningen till 200 μg / ml med serumfri, mikrovaskulär endotelcellväxtmedium-2 (EGM2-MV) på en is -kall platta. BM-COL1-nanofiberlagertjockleken mättes med konfokal mikroskopi (fig. Ib) och visade sig regleras genom varierande inkubationstider och koncentration av GFR Matrigel-lösningen. Vid en fast koncentration av GFR Matrigel-lösning är tjockleken relaterad till inkubationstiden ensam,

där h (t) är den resulterande tjockleken hos BM-COL1-skiktet, A är en empirisk konstant som innefattar den fixerade gelningstemperaturen och koncentrationen av lösningen, och t är inkubationstiden (fig. Ib). Detta förhållande tillät oss att kontrollera tjockleken på skiktet av BM-COL1 nanofibrer på en COL1 med ett väldefinierat penetreringsdjup (Fig. La, c). Vidare fann vi att det lokaliserade skiktet av BM-COL1 nanofibrer genererade stabiliserad human mikrovaskulär endotelcell (hMVEC) monolager (Fig. 1c).

För att bekräfta att hMVECs stabilt bildar ett 3D-rörliknande vaskulärt endotel i närvaro av BM-COL1-nanofibrer, odlade vi hMVECs under två ECM-förhållanden: syntetiskt endotel-ECM (lokaliserat lager av BM-COL1-nanofibrer på normala COL1) och COL1-endast . Såddensiteten i alla experiment fixerades till 3 x 106 celler / ml och det fanns ingen signifikant skillnad i cellpopulationer under odlingsdag 5 (kompletterande fig. S3). I fallet med hMVEC som odlats på endast COL1, fästes celler initialt på kanalens yta och COL1 omedelbart efter sådd, och växte gradvis under en period av 5 dagar för att bilda rörliknande EC-monolager (fig. 2a och kompletterande fig. S4). Men på odlingsdag 5 lossades hMVEC: er från ytan (fig. 2a). Denna frigöring kan vara ett resultat av en kombination av mekaniska sammandragningar av EC: erna, vilket kan orsaka en läckande monoskiktbildning med defekter i cell-cellkorsningar. Emellertid bildade hMVECs som odlats på den syntetiska endotel-ECM stabila 3D-rörliknande vaskulära endotel utan att lossa och spira, även efter 5 dagars odling (fig. 2b). För att undersöka integriteten av kopplingsproteiner i 3D-vaskulär endotel som odlas på de syntetiska endotel-ECM- och COL1-förhållandena, utvärderade vi uttryck av VE-cadherin, en av de viktigaste vidhäftande korsningarna (AJ: er) (Fig. 2c och kompletterande Fig. S5) 1 . Konfokala mikroskopiska bilder visade att VE-cadherin var tätt lokaliserad vid varje cell-till-cell-kontakt av EC på det syntetiska endotel-ECM, medan det inte finns ett kontinuerligt nätverk av VE-Cadherin vid cellcellskontakten i endast COL1-tillstånd ( Fig. 2c och kompletterande filmer S1-4). hMVECs konstant genererade groddar in i COL1 i frånvaro av skiktet av BM-COL1 nanofibrer (fig. 2c, kompletterande fig. S6 och kompletterande filmer S1, 2). Åtta sekventiella tvärsnittsvyer och 3D-konfokala bilder visar att det 3D-rörliknande vaskulära endotelet på det syntetiska endotelet ECM var kontinuerligt och tycktes vara i ett lugnt tillstånd (Fig. 2d – f). Skiktet av BM-COL1 nanofibrer undertryckt framträdande beteenden som var fenotypiskt associerade med de funktioner som observerades i COL1-enda tillstånd, såsom frigöring av hMVEC, ofta spira i gelutrymmet och glest fördelade AJ-proteiner.

( a, b ) Fluorescensmikroskopiska bilder och schematiska skildringar av blodkapillärbildning över tid. ( a ) EC: er (gul, aktin; blå, kärnor) som odlas i COL1-systemet lätt lösgöras från topp- och bottenytorna. Röda pilspetsar anger de fristående områdena och vita pilar indikerar tillväxtriktningen för EC-monolager på toppytorna. ( b ) EC: er (gul, aktin; blå, kärnor) i det syntetiska endotel-ECM-systemet vidhäftade stabilt till alla områden. Vita pilar indikerar tillväxtriktningen för EC-monolager på toppytorna, och en asterisk indikerar det sammanslagna området för båda EG-monolagskulturerna från övre kanten på varje ECM-kanal. ( c ) VE-cadherin (grön) AJ: er lokaliserades vid varje EC-EC-kontakt i det syntetiska endotel-ECM-systemet (nedre bilder), men var bristfälliga i COL1-systemet (övre bilder). En asterisk i den övre panelen indikerar oavsiktlig spirande angiogenes, och en vit pilspets indikerar VE-cadherin-bristen i EC: s odlade på COL1. ( d ) Konfokala mikroskopiska bilder visar att den konstruerade blodkapillär (röd, aktin; blå, kärnor) odlade i det syntetiska endotel-ECM-systemet inte har några defekter på någon yta, inklusive topp-, botten- och BM-COL1-sidor. ( e ) Åtta sekventiella tvärsnittsbilder tagna från fig. 2d (i-viii) visar en perfekt EC-monolager. ( f ) En 3D-vy av det konstruerade blodkapilläret som visas i fig. 2d, e. Skalstänger, 200 μm ( a, b ), 100 μm ( c, d, f ) och 50 μm ( e ).

Bild i full storlek

För att kvantifiera permeabiliteten för det vaskulära endotelet odlat på det syntetiska endotel-ECM, injicerade vi tillväxtmedium kompletterat med fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran (MW: 40 kDa; 10μM) i EC-kanalerna under odlingsdag 4 och 5 (fig. 3a, d, e). Två timmar efter tillsats av FITC-dextran-mediet mätte vi fluorescensintensitetsprofilerna. I det vaskulära endotelet på det syntetiska endotel-ECM noterades ett plötsligt intensitetsfall, större än vad som observerades i EC-monolageret endast på COL1 (fig. 3a). Skiktet av BM-COL1 nanofibrer hindrade således inte diffusionen av FITC-dextran (fig. 3b och kompletterande fig. S7), eventuellt på grund av att skiktet är tunt och det endast är en liten skillnad mellan diffusionskoefficienterna för Matrigel (MAT) (5, 76 × 10 −11 m 2 / s) och COL1 (5, 80 × 10 −11 m 2 / s) (Kompletterande bild S8) 20, 21, 22 . Skiktet har också stora mellanfiberutrymmen fyllda med tillväxtmedium, och diffusion i skiktet av BM-COL1 skiljer sig inte mycket från det i COL1. Den syntetiska endotel-ECM utan en EC-monolager passerade enkelt FITC-dextran-molekyler (fig. 3c). Resultaten leder till att vi drar slutsatsen att skiktet av BM-COL1 nanofibrer inte stör störningsöverföringen, men förbättrar kraftigt tätheten hos EG-monolageret på det. Det uppmätta permeabilitetsvärdet för det 3D-rörliknande vaskulära endotelet på det syntetiska endotelet ECM (P = 8, 305 × 10 −9 m / s) var signifikant lägre än det i COL1-enbart tillståndet (P = 3.186 × 10 −7 m / s) s) (Fig. 3d) 23 . Så vitt vi vet är den förvärvade permeabiliteten lägre än alla andra värden erhållna av befintliga in vitro- system och ligger nära de som mäts in vivo 11, 12, 23 . Vi jämförde permeabilitetsvärden för EC-monolager odlade på MAT, det syntetiska endotel-ECM och COL1 och fann att permeabilitetsvärdet för MAT-endast tillstånd var mycket högre än det för det syntetiska endotel-ECM-tillståndet (Fig. 3e). Istället för en utspädd MAT-lösning användes en LN-lösning för att bilda LN-belagd kollagen (L-COL1) nanofibrer i syntetisk endotel ECM och gav följaktligen ett liknande lågt permeabilitetsvärde (P = 1.623 × 10 −8 m / s) som det för skiktet av BM-COL1 nanofibrer. Det bevisade direkt att LN var en huvudkomponent i BM-COL1 för att generera tätt vaskulärt endotel (fig. 3f).

( a ) Absoluta permeabilitetsvärden för EC-monolager i COL1-systemet (vänster) och det syntetiska endotel-ECM-systemet (höger) mättes genom införande av tillväxtmedium kompletterat med 10 mikrometer FITC-dextran (40 kDa, grönt) i EC-kanalen och övervakning FITC fluorescens. Införda diagram visar intensitetsprofiler för varje prickad linje (blå streckad linje, COL1; röd streckad linje, syntetisk endotel ECM) och vita pilar indikerar diffusionsriktningen. Bilderna togs 2 timmar efter införandet av FITC-dextran-kompletterat tillväxtmedium. Skala, 100 μm. ( b ) Simulerade diffusionsprofiler 2 timmar efter införandet av FITC-dextran-kompletterat tillväxtmedium i COL1 (blå linje) och det syntetiska endotel-ECM-systemet (röd linje) som innehåller ett EG-monolager på varje gelyta. ( c ) Den fluorescensmikroskopiska bilden visar diffusionen av FITC-dextran från en EC-kanal till en sidokanal som passerar genom BM-COL1-skiktet i frånvaro av ett EG-monolager. Bilden togs 1 timme efter tillsatsen av FITC-dextran-kompletterat tillväxtmedium. Inmatningsgrafen indikerar intensitetsprofilen för den vita prickade linjen. Skala, 100 μm. ( d ) Absoluta vaskulära permeabilitetsvärden för det syntetiska endotel-ECM-systemet (röda staplar) reducerades dramatiskt jämfört med värdena för COL1 (* P = 0, 029 ) och ungefärliga nivåer in vivo . Felstänger, ± SEM ( n = 4). ( e ) Absoluta vaskulära permeabilitetsvärden för MAT-systemet var mycket högre än för det syntetiska endotel-ECM-systemet (*** P < 0, 001 för MAT på odlingsdagen4; ** P = 0, 002 för MAT och ** P = 0, 005 för COL1 på kulturdag5). Felstänger, ± SEM ( n = 8 ~ 24). ( f ) Absoluta vaskulära permeabilitetsvärden för det syntetiska endotel-ECM (BM-COL1), COL1 (COL1) och LN-belagda COL1 (L-COL1) -systemen. För att skapa ett optimalt lager för L-COL1 belagde vi LN: er på COL1-fibrerna under 20, 40, 60 och 80 min. i en fuktig inkubator på 37 ° C. Felstänger, ± SEM (** P <0, 01 och *** P <0, 001, n = 5 ~ 18). ( g ) Nivåer av mRNA för TJ-proteinerna CLDN1, CLDN5 och OCLN i COL1 (blå staplar) och det syntetiska endotel-ECM-systemet (röda staplar), normaliserat till de för GAPDH, förvärvades på odlingsdag 1, 2 och 3 (* P = 0, 016 och *** P < 0, 001 ). Felstänger, ± SEM ( n = 3 ~ 4). ( h – j ) Expressionnivåer av CLDN1, CLDN5 och OCLN-proteiner i COL1 och de syntetiska endotel-ECM-systemen på odlingsdag5 bestämdes genom fluorescensmikroskopi (grönt, CLDN1 / CLDN5 / OCLN; blå, kärnor). Skalstänger, 50 μm.

Bild i full storlek

Skiktet av BM-COL1-nanofibrer påverkade tätheten hos hMVEC-cell-cellekorsningar. Vi undersökte mRNA-nivåer av de stora täta övergångarna (TJ) -proteiner, claudin-1 (CLDN1), claudin-5 (CLDN5) och occludin (OCLN) 1 . De flesta blodkapillärer innehåller TJ: er; och TJ: erna bidrar till barriärfunktion i specialvävnader, såsom hjärnan och näthinnan 24, 25 . Kvantitativa realtids-polymeraskedjereaktionsanalyser (qRT-PCR) -analyser avslöjade att CLDN1- och OCLN-mRNA-nivåerna ökades väsentligt i det vaskulära endotelet på det syntetiska endotel-ECM på odlingsdag 3 (fig. 3g). Dessa resultat korrelerades också med proteinnivån på odlingsdag 5 genom immunocytokemisk färgning (Fig. 3h – j). I båda odlingssystemen var nivåerna av CLDN5-mRNA inom liknande intervall, men fluorescensintensiteten för immuntärdat CLDN5-protein verkade något högre i det vaskulära endotelet på det syntetiska endotel-ECM (fig. 3g, i).

Förutom TJ: er mellan EC: er är fokala vidhäftningar också avgörande för att upprätthålla starka EC-ECM-vidhäftningar, vilket ger en mekanisk anslutning till endotel-ECM. Integriner, transmembranreceptorer som interagerar med cytoskelettet i det intracellulära utrymmet genom länkproteinerna paxillin, vinculin och talin, är de viktigaste strukturella komponenterna i fokala vidhäftningar 26 och av vilka de extracellulära domänerna binder till specifika ECM-proteiner, inklusive fibronektin, kollagen, vitronektin, entaktin och LN 1 . Bland dessa ECM-proteiner fokuserade vi på LN, eftersom det uppvisar stark cellvidhäftningsaktivitet, har potentialen att stabilisera endotelet 27 och är, som vi har bevisat, en komponent i BM-COL1 för att generera tätt vaskulärt endotel (Fig 3f). Integrin a6 har en hög affinitet till LN 28 och visade sig visa förbättrad expression i det vaskulära endotelet på det syntetiska endotel-ECM (fig 4a). LN-integrin-α6-interaktioner är kända för att leda till "utanför-i-signalering" -händelser som informerar EC om deras miljö och första möten med omgivande molekyler 1, och ytterligare förbättrar LN-integrin-a6-bindningsaffinitet och integrinkluster på platsen för fokala vidhäftningar., vilket senare kan stärka vidhäftningen till BM-COL1 nanofibrer. Blockering av antikroppsbehandling av GoH3 (mot integrinet a6 ß1 29 ) ökade signifikant permeabiliteten för det vaskulära endotelet på den syntetiska endotel-ECM (fig. 4b). Sammantaget drar vi slutsatsen att de LN-belagda COL1-nanofibrerna i den syntetiska endotel-ECM ger en gynnsam effekt och fungerar som en väsentlig vidhäftningspromotor och stabilisator av EC: er.

( a ) Uttryck av integrin a6 (grön) i COL1 och syntetiskt endotel ECM-system. EC: er i det syntetiska endotel-ECM-systemet uttryckte starkt integrin a6 på sina cellmembran. Skala, 100 μm. (höger) Genomsnittliga fluorescerande intensiteter för integrin alfa6-uttryck i det syntetiska endotel-ECM (röd stapel) och COL1 (blå stapel) -systemen vid odlingsdag5. Felstänger representerar standardavvikelse (*** P = 0, 001, n = 4 ~ 6). ( b ) Absolut kärlpermeabilitetsvärden för den blockerande antikroppen (monoklonal antikropp från råttan från råttan mot den integrerade alfa-6-subenheten) -behandlade syntetiska endotel-ECM-systemet ökades signifikant till nivåerna för COL1 jämfört med de med negativ kontroll (IgG2a). (* P = 0, 030, ** P = 0, 001 på odlingsdagen4; * P = 0, 042 på odlingsdagen5). Felstänger, ± SEM (n = 8 ~ 20). ( c ) Spänningskraften utvärderades genom övervakning av expressionsnivåerna för difosforylerad regulatorisk myosin lätt kedja 2 (RLC-pp; grön). Vita pilar i den övre bilden indikerar överuttryckt RLC-pp i EC: s odlade på COL1. (höger) Genomsnittliga fluorescerande intensiteter av RLC-pp-uttryck i det syntetiska endotel ECM (röd stapel) och COL1 (blå stapel) -systemen vid odlingsdag5. Felstänger representerar standardavvikelse (*** P = 0, 001, n = 4 ~ 6). ( d ) Schematisk över mekanismen som ligger till grund för stabilisering och åtdragning av EC genom att stärka EC-ECM vidhäftning. ( e ) Neutrofila-liknande celler (differentierade humana HL-60-promyelocytiska leukemiceller [dHL-60]) kunde passera genom EC-monolageret och till och med BM-COL1-skiktet. Faskontrastbilden togs 1 timme efter sådd av dHL-60-celler. Skala, 100 μm. ( f ) Faskontrastbilden visar spirande angiogenes i närvaro av BM-COL1. Bilden togs tre dagar efter stimulering med VEGF. ( g ). Totala spiralängder av spirande angiogenes i det syntetiska endotel-ECM och COL1-systemen under det angiogena tillståndet (50-20 ng / ml VEGF-gradient) och kontrolltillståndet (20-20 ng / ml, ingen VEGF-gradient). Felrad representerar standardfel (** P = 0, 006, n = 2). ( h ). En konfokal mikroskopisk bild av det prickade kvadratiska området i fig. 4f. Skalstänger, 100 μm ( a, c ) och 150 μm ( e, f, h ).

Bild i full storlek

En potentiell mekanism för varför det enkla tillskottet av skiktet av BM-COL1 nanofibrer mellan COL1 mellanliggande matris och EC: er fysiologiskt sänkte den vaskulära permeabiliteten kan vara att den förbättrade fokala vidhäftningsstyrkan för EC: er till BM-COL1 nanofibrer främjade effektiv integrin-kluster. Dessa integrinkluster stabiliserades därefter genom intracellulära anslutningar till aktincytoskelettet, vilket till sist främjade den funktionella integriteten hos endotelbarriären. Vaskulär permeabilitet är känd för att regleras av denna cytoskeletalspänning och tillbakadragning 1 . Difosforylering av regulatorisk myosin-lätta kedja 2 (RLC-pp) på Thr 18 och Ser 19 förbättrar spänningskraften, ökar den fysiska klyftan mellan EC-EC-korsningar och främjar hyperpermeability 30 . Vi fann att under en 5-dagars odlingsperiod reglerades den difosforylerade formen av MLC-2 nära EC-EC-kontakter i endotelmonoskiktet på endast COL1 (fig. 4c, d). Skiktet av BM-COL1 nanofibrer tycks undertrycka difosforylering av MLC-2. Det rörliknande vaskulära endotelet på den syntetiska endotel-ECM har mycket låg vaskulär permeabilitet, men hindrar inte extern stimulering eller hindrar transendotelial migration av neutrofiler (fig. 4e och kompletterande fig. S9). EC på skiktet av BM-COL1 nanofibrer svarar på 50 ng / ml av vaskulär endotelväxtfaktor (VEGF) -gradient och bildar angiogen spira och 3D kapillär morfogenes i den syntetiska endotel-tillväxtfaktorn (fig. 4f – h och kompletterande fig. S10) .

I detta arbete utvecklade vi en enkel, men pålitlig metod för att belägga LN på varje COL1-nanofibrer med tätt lokaliserade de belagda nanofibrerna för att bilda ett tunt lager på den normala COL1-mellanstatmatrisen. Metoden använde naturlig ECM av COL1 som de grundläggande strukturella nanofibrerna och GFR Matrigel som en biomimetisk BM-källa för att producera den väsentliga mallen för att bygga stabilt, lågpermeabelt och funktionellt rörliknande 3D-vaskulärt endotel. Från AJ: er till TJs och vid nivån av mRNA och källarmembranbundna biologiskt aktiva proteiner, visade det vaskulära endotelet på den syntetiska endotel-ECM fysiologiska egenskaper som liknar de i in vivo , uppvisar tätt lokaliserade VE-cadherin-korsningar och starkt uttryckta TJ-proteiner och motsvarande mRNA. Den huvudsakliga fördelen med denna metod är att den syntetiska endotel-ECM enkelt framställs genom att helt enkelt exponera 3D COL1 för BM-lösningen under högst 1 timme. Detta är i motsats till andra modeller som använder en EC-monolager, inklusive ex vivo och in vitro 2D-kapillärmodeller, som ger strukturer som knappast liknar goda blodkapillärer . Dessutom kan många tester, såsom mätningar av vaskulär permeabilitet och övervakning av transendotelial migration av immunceller eller tumörceller och angiogenesanalyser, utföras i samma format med rörliknande 3D-vaskulär endotel. Befintliga ex vivo- och in vitro- analyser för undersökning av EG-läkemedels- och EC-ECM-interaktioner och morfogenes av vaskulära nischer har inte lyckats hålla jämna steg med forskningsbehov på grund av deras strukturella sårbarheter och fysiologiska brister, och ökad vikt läggs vid konstruerade 3D-blodkapillärer . Metoden som presenteras här, med dess syntetiska endotel-ECM baserat på naturliga material, enkel mikrofluidteknik och fysiologiska egenskaper hos det resulterande 3D-vaskulära endotelet, som är in vivo- liknande i alla avseenden, ger ett attraktivt alternativ till den släpande tekniken för konventionella modeller . Vi förutser också att metoden kommer att hjälpa till att främja en ny fas av forskning om olika aspekter av många epitelbarriärer.

metoder

Tillverkning och beredning av mikrofluidkanal före fyllning med COL1 gel

Mikrofluidkanalerna mönstrades med mjuk litografi. Först roterades SU-8-100 fotoresist (MicroChem, USA) på en kiselskiva, som sedan bakades vid 95 ° C under 1 timme. Den belagda fotoresisten exponerades selektivt för UV-ljus genom en mask som bär det mikrofluidiska mönstret, varefter den exponerade fotoresisten utvecklades i propylenglykolmonometyleteracetat (PGMEA) fotoresistutvecklare (MicroChem, USA). Poly (dimetylsiloxan) (PDMS) -lösning innehållande Sylgard 184 silikonelastomerbas och härdningsmedel (viktförhållande, 10: 1; Dow Corning, USA) härdades på den mönstrade skivan vid 80 ° C under 1 timme i en torr ugn. Inlopps- och utloppsportar för alla kanaler, inklusive en EC-kanal, två sidokanaler och fyra ECM-kanaler, öppnades sedan med en biopsipunch. Efter autoklavering av denna mönstrade PDMS (övre delen) och ett glasskydd (nedre delen; Paul Marienfeld, Tyskland), var kanalsidan av den övre delen bunden irreversibelt till bottendelen genom syreplasmabehandling (CUTE; Femtoscience, Sydkorea). Därefter pipetterades omedelbart en 1 mg / ml poly-D-lysin (PDL; MW: 30 000–70 000; Sigma-Aldrich, USA) i destillerat avjoniserat vatten (DDW) i den bundna anordningen, varefter anordningen placerades i en fuktig inkubator på 37 ° C under 4 timmar. Efter tvättning av överskottet av PDL torkades anordningen vid 80 ° C i en ugn i mer än 24 timmar.

Bildning av COL1 i mikrofluidiska kanaler

En blandad COLl-lösning (BD Biosciences, USA), framställd genom utspädning i en blandning av 10X fosfatbuffrad saltlösning (PBS; Thermo Scientific, USA) och DDW, injicerades i ECM-kanaler och fick gela i inkubatorn under 30 minuter. COL1-lösningens pH justerades med en 0, 5N NaOH-lösning till pH 10. Därefter fylldes alla kanaler, exklusive ECM-kanalerna, med EGM2-MV innan tillsatsen av BM-lösning till EC-kanalen.

Bildande av BM-COL1-lager på COL1

BM-lösningen är gjord av tillväxtfaktorreducerad (GFR) Matrigel (BD Biosciences, USA) och basal endotelcellodlingsmedium (EBM2, Lonza, USA). Vi utspädde GFR Matrigel till cirka 200 μg / ml med EBM2. Efter gelningsprocessen av COL1 i mikrofluidkanaler tillsattes BM-lösningen till EC-kanalen och fick beläggas på COL1 under 40 minuter. Överskott av BM-lösningen avlägsnades sedan och tvättades noggrant med EGM2-MV.

Mätning av BM-COL1-skiktets tjocklek

LN färgades med polyklonal anti-laminin-primärantikropp hos kanin (1: 100; Abcam) och Alexa Fluor 488-konjugerad get-anti-kanin-sekundär antikropp (1: 200; Molecular Probes). Tjockleken på BM-COL1-skikt i det syntetiska endotel-ECM-systemet mättes med en konfokal mikroskopi (n = 4 ~ 6, per grupp).

EC-kultur före sådd av celler i mikrofluidkanalen

Kryopreserverade hMVEC (tredje passagen), endotelcellbasalt medium-2 (EBM-2) och mediumtillskott i form av EGM-2-MV SingleQuots innehållande human epidermal tillväxtfaktor (hEGF), hydrokortison, gentamicin, VEGF, human basic fibroblasttillväxtfaktor (hFGF-B), R3-insulinliknande tillväxtfaktor-1 (R3 -IGF-1), askorbinsyra, heparin och fetalt bovint serum (FBS), erhölls från Lonza (USA). hMVEC expanderades genom odling i EGM-2MV (en blandning av EBM-2 och EGM2-MV SingleQuots) på vävnadsodlingskolvar för högst fem passager. Dessa hMVEC: er konserverades sedan i en koncentration av 1 x 106 celler / ml i EGM2-MV innehållande DMSO (10% volym / volym) och FBS (10% volym / volym) fram till användning.

EC-kultur i en mikrokanal

Innan man sådd hMVEC in i EC-kanalen tinades ett injektionsflaska med kryokonserverade hMVEC i ett vattenbad. Cellerna ympades sedan i en T75-vävnadsodlingskolv och inkuberades vid 37 ° C i en fuktad CO2-inkubator tills de uppnådde ~ 80% sammanflöde. Tillväxtmedium byttes var 48: e timme. HMVEC lossades genom behandling med en 0, 05% trypsin / 1 mM EDTA-lösning och bereddes vid en densitet av 2 x 106 celler / ml. Den centrala EC-kanalen fylldes med 50 mikroliter av denna cellsuspension och anordningen placerades i en inkubator på 37 ° C under 30 minuter för att möjliggöra cellfästning. Därefter avlägsnades icke-vidhäftande celler och cellskräp genom att placera 50 mikroliter droppar vid alla inlopp och utlopp i mikrofluidkanalerna. Tillväxtmediet i alla mikrofluidiska kanaler ersattes dagligen med EGM2-MV.

Numerisk simulering av massöverföring

Koncentrationsprofilerna för molekylär diffusion från EC-kanalen till varje sidokanal i anordningar innehållande COL1 / EC-monolager eller syntetiska endotel-ECM / EC-monolager illustrerades genom att generera beräkningsmodeller med användning av COMSOL Multiphysics 4.3 (COMSOL, Sverige) mjukvara. Diffusionskoefficienterna för 40-kDa FITC-dextran i EGM2-MV, gelat COL1, gelat Matrigel och EC-monolager antogs vara 8, 00 × 10 −11, 5, 80 × 10 −11, 5, 76 × 10 −11 och 1, 57 × 10 −12 m 2 / s (tilläggsfigur S4). De övergående diffusionsprofilerna för FITC-dextran i anordningen från 0 till 12 timmar uppskattades av Ficks andra lag, och gränserna för anordningen inställdes på tillståndet utan massflöde.

Mätning av endotelpermeabilitet

Absolutt endotelpermeabilitet bestämdes genom att tillsätta 10 mikrometer FITC-dextran (MW: 40 kDa) till enhetens EC-kanal 4 dagar efter sådd av EC: er. Fluorescerande bilder förvärvades 2 timmar efter tillsatsen av FITC-dextran-lösningen. Endotelpermeabilitet uppskattades genom FITC-dextran-diffusion, visualiserad genom analys av fluorescerande bilder med användning av ImageJ-programvara. Koncentrationsfördelningen av FITC-dextran-lösningen regleras av Ficks första lag, beskrivet av följande ekvation:

där J är flöde, är D diffusionskoefficienten och x är positionen.

Ficks första lag ger upphov till följande formel:

där P är permeabilitet och C är koncentration.

Överföringselektronmikroskopi (TEM) av COL1, syntetisk endotel ECM och syntetisk endotel ECM med en EC-monolager

Allt material som användes i denna process erhölls från Sigma-Aldrich. Proven fixerades genom inkubering med 2, 5% glutaraldehyd i 0, 15 M 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) buffert vid 4 ° C under minst 24 timmar. Proverna efterfixerades sedan i en 0, 1 M natriumkakodylat-trihydratbuffrad 1% osmiumtetroxid (OsO4) -lösning under 1 timme och kontrasterades med 0, 5 M Trizma maleat-buffrad 0, 5% uranylacetat. Därefter dehydratiserades prover med graderade serier med etanollösningar (25%, 50%, 75%, 95% och 100%) i DDW. COL, syntetisk endotel ECM och EC i mikrofluidkanaler inbäddades med en Epoxy Embedding Medium Kit. Inbyggda prover togs loss med PDMS-membranet, som hade behandlats med syreplasma under relativt kort tid, istället för den nedre delen (glasskyddsglas) på mikrofluidapparaterna. Ultratinsektioner (60–70 nm) bereddes med en ultramikrotom (Ultracut UCT; Leica, Tyskland) och uppsamlades på 200-mesh rutnät. Sektioner kontrasterades med uranylacetat och undersöktes i ett JEM 1010 transmissionselektronmikroskop (JEOL, Japan) som arbetade vid 60 kV. TEM-bilder inspelades med en CCD-kamera (SC1000; Gatan, USA).

qRT-PCR-analyser

Totalt RNA isolerades från varje prov (n = 4 per grupp) med användning av RNeasy Mini-kit (Qiagen, USA). RNA-koncentrationen bestämdes och normaliserades genom att mäta absorbansen vid 260 nm med användning av en NanoDrop-spektrofotometer (Thermo Scientific). RT-reaktioner utfördes med användning av ett RNA-till-cDNA-kit med hög kapacitet (Invitrogen, USA). qRT-PCR-mätningar av genuttryck utfördes med Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) med användning av ett StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Genuttryck i hMVEC i COL1 och syntetiska endotel-ECM-system kvantifierades med användning av TaqMan-genuttrycksanalyser (Applied Biosystems) för CLDN1 (Hs00221623_m1), CLDN5 (Hs00533949_s1), OCLN (Hs00170162_m1), och GAPD). MRNA-nivåerna för målgener normaliserades till nivåerna för den endogena referensen (GAPDH), och relativa skillnader i målgenuttryck bestämdes med användning av den jämförande Ct-metoden. Det normaliserade uttrycket för varje markör i hMVEC odlade i COL1 och de syntetiska endotel-ECM-systemen uttrycktes relativt det i COL1-systemet på odlingsdag 1.

immunocytokemi

EC: er odlade i mikrofluidapparater fixerades genom att tillsätta 4% (vikt / volym) paraformaldehyd (i PBS) i varje reservoar av anordningarna och inkubera under 15 minuter. Cellerna permeabiliserades med 1% Triton-X100 (Sigma-Aldrich) i PBS under 10 minuter. Efter blockering med 20% Block Ace (i PBS) (Dainihon-Seiyaku, Japan) i 1 timme och tvättning av kanalerna med PBS, lösningar av polyklonalt anti-laminin från kanin (1: 100; Abcam, USA), polyklonalt anti-CLDN1 av kanin (5 μg / ml; Abcam), polyklonal anti-CLDN5 från kanin (1: 100; Abcam), polyklonal anti-OCLN från kanin (2 μg / ml; Abcam) och monoklonal anti-integrin från mus alfa 6 (1 μg / ml; Abcam) primära antikroppar infördes i anordningarna och inkuberades under 1 timme vid rumstemperatur. Efter tvättning med PBS tillsattes Alexa Fluor 488-konjugerad get-anti-kanin och get-anti-mus-IgG-sekundära antikroppar (1: 200; Molecular Probes, USA) till anordningen och inkuberades under 1 timme. Cellkärnor och aktinfilamenter motverkades med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; Sigma-Aldrich) respektive rodamin-falloidin (Sigma-Aldrich). Färgade celler observerades under ett fluorescensmikroskop (Axio Observer D1; Carl Zeiss, Tyskland) och ett konfokalt mikroskop (LSM-700; Carl Zeiss).

Neutrofilliknande celldifferentiering för en in vitro- inflammationsmodell

Humana promyelocytiska HL-60-celler (KCLB, Sydkorea) odlades i RPMI-1640 medium (Thermo Scientific) kompletterat med 10% FBS (Lonza), 0, 1 mM icke-essentiella aminosyror, 50 U / ml penicillin och 50 μg / ml streptomycin vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator. HL-60-cellerna inducerades att genomgå differentiering längs den neutrofila linjen genom att sätta alikvoter av HL-60-cellsuspension (2 x 106 celler / ml) på en vävnadsodlingskolv och växa under 5 dagar i närvaro av 1, 25% dimetylsulfoxid (DMSO). Fullständig differentiering av HL-60-celler i neutrofila-liknande celler (förkortad dHL-60) bekräftades genom kärnsegmentering och granulatbildning, spektrofotometri vid 540 nm och flödescytometri av FITC-konjugerade monoklonala antikroppar mot CD11b, CD16 och CD33 (BD Biosciences). Därefter kryokonserverades dHL-60-celler i en koncentration av 2 x 106 celler / ml i FBS innehållande DMSO (10% volym / volym) tills sådd in i EC-kanalen.

In vitro- modeller

För in vitro- inflammationsmodellen tinades snabbt ett kryovial av dHL-60-celler i ett vattenbad på 37 ° C. DHL-60-cellssuspensionen framställdes vid en densitet av 1 x 106 celler / ml, och 100 ul av denna cellsuspension sattes till det konfluenta EC-monoskiktet i anordningen vid EC-odlingsdag 5. Därefter droppade 100 ul tillväxtmedium droppar innehållande N-formylmetioninleucyl-fenylalanin (fMLP; 10 nM), som en kemoattraktant, sattes till sidokanalerna. För in vitro- angiogenesmodellen tillsattes tillväxtmedium kompletterat med 50 ng / ml VEGF och EGM-2MV (VEGF-koncentration: 20 ng / ml) till det konfluenta EC-monolaget och sidokanalerna på anordningen vid EC-odlingsdag 5, och media byttes var 24 timmar under 3 dagar.

Bildbehandling

Alla bilder bearbetades och kompositer gjordes med programvarupaketet Adobe Design Premium CS6. Vid behov justerades endast kontrasten och ljusstyrkan för originalbilderna minimalt; alla justeringar låg inom det linjära området.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Han, S. et al. Konstruktiv ombyggnad av en syntetisk endotel extracellulär matris. Sci. Rep. 5, 18290; doi: 10.1038 / srep18290 (2015).

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

videoklipp

  1. 1.

    Kompletterande film 1

  2. 2.

    Kompletterande film 2

  3. 3.

    Kompletterande film 3

  4. 4.

    Kompletterande film 4

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.