Konserverade funktioner hos cancerceller definierar deras känslighet för byninducerad död c-myc och glykolys | onkogen

Konserverade funktioner hos cancerceller definierar deras känslighet för byninducerad död c-myc och glykolys | onkogen

Anonim

ämnen

  • Cancermetabolism
  • Cancerterapi
  • Celldöd
  • onkogener

Abstrakt

HAMLET är den första medlemmen i en ny familj av tumördödande protein-lipidkomplex som dödar cancerceller i stort, samtidigt som man sparar friska, differentierade celler. Många och olika tumörcelltyper är känsliga för den dödliga effekten, vilket antyder att HAMLET identifierar och aktiverar bevarade dödsvägar i cancerceller. Här undersökte vi den molekylära basen för skillnaden i känslighet mellan cancerceller och friska celler. Med hjälp av en kombination av små hårnål RNA (shRNA) hämning, proteomisk och metabolom teknik identifierade vi c-Myc onkogen som en väsentlig bestämning av HAMLET-känslighet. Ökade c-Myc-expressionsnivåer främjade känsligheten för HAMLET och shRNA-nedslagning av c-Myc undertryckte det dödliga svaret, vilket antydde att onkogen transformation med c-Myc skapar en HAMLET-känslig fenotyp. Vidare modifierades HAMLET-känsligheten genom tumörcells glykolytiska tillstånd. Glukosberövning sensibiliserade tumörceller för HAMLET-inducerad celldöd och i shRNA-skärmen modifierade hexokinas 1 (HK1), 6-fosfofrukto-2-kinas / fruktos-2, 6-bifosfatas 1 och hypoxi-inducerbar faktor 1a HAMLET-känslighet. HK1 visade sig binda HAMLET i en proteinuppsättning innehållande 8000 mål, och HK-aktivitet minskade inom 15 minuter efter HAMLET-behandlingen, före morfologiska tecken på tumörcelldöd. Parallellt utlöste HAMLET snabb metabolisk förlamning i karcinomceller. Tumörceller visade sig också innehålla stora mängder oljesyra och dess derivat redan efter 15 minuter. Resultaten identifierar HAMLET som ett nytt anti-cancermedel som dödar tumörceller genom att utnyttja enande funktioner hos cancerceller som onkogenberoende eller Warburg-effekten.

Introduktion

Trots molekylkomplexiteten hos onkogen transformation, lider cancerceller ofta av "onkogenberoende", och störningen av en enda onkogen kan antingen vända onkogenes eller vara dödlig (Weinstein och Joe, 2008). C-Myc-onkogenet är ett klassiskt exempel (Felsher och Bishop, 1999) och avregleras i minst 40% av alla mänskliga cancerformer (Dang et al., 2009). Den breda transformerande effekten av c-Myc har förklarats av dess förmåga att binda till promotorer av minst 30% av alla kända gener (Dang et al., 2009), och i transgena möss, c-Myc överuttryck i kombination med hämning av apoptos är tillräckligt för att driva bukspottkörtelcancerbildning (Pelengaris et al., 2002). På senare tid föreslog hämning av c-Myc för att stoppa cancertillväxt och till och med tillåta vävnadsreparation och återgång till en funktionell fenotyp (Soucek et al., 2008). Friska celler, däremot, bibehåller en begränsad replikativ potential på grund av deras känslighet för programmerad celldöd, anti-tillväxt-signaler och andra molekylära interaktioner som begränsar livslängden och upprätthåller normal vävnadshomeostas (Hanahan och Weinberg, 2000, 2011).

Onkogenaktivitet kan också orsaka en förändring i den glykolytiska maskinen (Hsu och Sabatini, 2008), och cancerceller är starkt beroende av glykolys (Mathupala et al., 1997). Glukos fångas först in i celler av hexokinaser 1 och 2 (HK1 och HK2) (Wilson, 2003) och omvandlas sedan ytterligare till pyruvat. Till skillnad från friska celler driver cancerceller pyruvat till laktatomvandling även i närvaro av syre, en process som kallas Warburg-effekten (Warburg, 1956). Nya studier har visat att oxidativ fosforylering är funktionell i de flesta cancerceller (Vander Heiden et al., 2009) och har föreslagit att Warburg-effekten kan återspegla uttrycket av pyruvat-kinas-isoformen M2 (PKM2) (Christofk et al., 2008) som katalyserar avfosforylering av fosfoenolpyruvat till pyruvat och är ansvarig för nettoproduktion av ATP inom den glykolytiska sekvensen. Till skillnad från friska differentierade celler uttrycker embryonala celler och de flesta cancerceller huvudsakligen M2-isoformen (Mazurek et al., 2005), och i vissa tumörer vänder ersättning av M2 med M1 Warburg-effekten och minskar tumörgeniciteten (Christofk et al., 2008). Förutom PKM2 har c-Myc en grundläggande roll i omprogrammeringen av metabolism i vissa tumörceller och har visat sig förbättra aerob glykolys genom att direkt aktivera gener, såsom HK2 , PKM1 och LDHA (Shim et al., 1997; Dang et al. ., 2009). Transkriptionsfaktorns hypoxiinducerbar faktor 1 (HIF1) reglerar också glykolys genom att förbättra uttrycket av glukostransportörer, HK och fosfofruktokinaser (PFK) (Denko, 2008).

HAMLET är ett komplex av delvis utbredd a-laktalbumin och oljesyra, som företrädesvis dödar cancerceller och omogna celler (Svanborg et al., 2003). Den breda tumördödande aktiviteten inkluderar leukemiceller, karcinomceller och gliomceller, medan friska, differentierade celler överlever HAMLET-utmaningen (Fischer et al., 2004). HAMLET verkar således rikta in sig på mycket bevarade överlevnadsmekanismer som är avgörande för cancerceller. Denna selektivitet har bekräftats in vivo i en human glioblastomxenograftmodell och i en murin urinblåscancermodell (Fischer et al., 2004; Mossberg et al., 2010). I kliniska studier av hudpappillom och cancer i urinblåsan (Gustafsson et al., 2004; Mossberg et al., 2007) visade HAMLET tumördödande aktivitet med begränsade biverkningar.

Denna studie undersökte den molekylära basen för HAMLET-känslighet i cancerceller med användning av screeningstekniker för att upptäcka funktioner för transkription, proteininteraktion och metabolism som förändrar överlevnaden efter HAMLET-exponering. Vi visar att känsligheten för HAMLET är beroende av c-Myc och glykolys och identifierade det glykolytiska enzymet HK1 som ett potentiellt direkt mål för HAMLET. Resultaten indikerade också att HAMLET förändrar cancercellsmetabolismen och att det kan störa glykolys, vilket förändras i cancerceller på grund av Warburg-effekten.

Resultat

En shRNA-skärm identifierar c-Myc och glykolytiska relaterade proteiner som modifierare av HAMLET-känslighet

För att få en opartisk översikt över gener som är viktiga för HAMLET-känslighet, använde vi RNA-interferensstreckkodscreeningstekniken (Brummelkamp och Bernards, 2003; Silva et al., 2005, 2008). Streckkodsskärmar använder DNA-mikroarrayer för att följa den relativa mängden av varje liten hårnål-RNA-vektor (shRNA) i en stor population av celler infekterade med ett shRNA-vektorbibliotek (figur 1a). Med hjälp av retroviral infektion introducerade vi en samling av 4603 shRNAs utformade för att rikta in 1650 cancerrelaterade humana gener (Silva et al., 2005) för undertryckning genom RNA-interferens i A549 lungkarcinomceller, som är kända för att vara HAMLET-känsliga. De infekterade cellerna delades upp i tre pooler, varav en lämnades obehandlad och användes som referens, medan de andra två utsattes för låga (7 μM) och höga (35 μM) koncentrationer av HAMLET. Efter 2 timmars HAMLET-behandling återhämtade vi shRNA-kassetter genom PCR-amplifiering och analyserade deras relativa mängd genom hybridisering till DNA-mikroarrayer såsom beskrivits tidigare (Zender et al., 2008).

En shRNA-streckkodsskärm identifierar c-Myc och metaboliska proteiner som determinanter för HAMLET-känslighet. ( a ) Arbetsflöde för shRNA-skärmen. A549-celler infekterades med ett bibliotek med streckkodade shRNA-mål riktade till 1650 cancerrelaterade gener. Efter 2 timmars HAMLET-exponering utvanns streckkoder, amplifierades och märktes med Cy3 / Cy5, och den relativa mängden av varje shRNA mättes med mikroarrayer. ( b ) Ett litet antal hårnålar anrikades, vilket ses i MA (logintensitetsförhållanden ( M- värden) kontra logintensitetsmedelvärden ( A- värden)) av shRNA i kontrollprover (Cy3) mot HAMLET (35-värden) μM) prover (Cy5). ( c, d ) shRNA som är inriktade på HK1 och de metabolismreglerande generna PFKFB1 , HIF1a och c-Myc modifierar signifikant HAMLET-känsligheten. Diagrammet visar de högsta poäng som observerats för varje gen. ( e, f ) Genlistan innehållande alla positiva träffar från shRNA-skärmen utsattes för genuppsättning av anrikningsanalys med användning av den kanoniska vägsamlingen för att identifiera vanliga vägar riktade av positiva shRNA. Ras-vägen, tillsammans med glykolysrelaterade vägar, hade de högsta normaliserade anrikningsresultaten (NES).

Bild i full storlek

Ett litet antal shRNA-vektorer berikades eller tappades i den population som behandlades med HAMLET; 43 hämmande och 44 sensibiliserande shRNA visade en absolut MaxMean-poäng på> 0, 5 i både hög- och lågdosbehandlingsgrupper eller en absolut poäng av> 2 i vilken grupp som helst (figur 1b och kompletterande tabell S1). De identifierade generna inkluderade onkogener som c-Myc och glykolysrelaterade proteiner. shRNA mot HK1 och HIF1a sensibiliserade cellerna för HAMLET (figur 1c och d), vilket antyder att ökat HK1- och HIF1a-uttryck driver en fenotyp som är mer resistent mot HAMLET. Däremot räddade shRNA som är inriktat på 6-fosfofrukto-2-kinas / fruktos-2, 6-bifosfatas (PFKFB1) och c-Myc cellerna (figur 1c och d). Biologiska vägar berikade med HAMLET identifierades genom genuppsättning anrikningsanalys (GSEA) med användning av den kanoniska vägens genuppsättning. GSEA-algoritmen testar för anrikning av en uppsättning objekt inom en större rankad lista över sådana objekt. De identifierade vägarna bekräftade vikten av glykolys, eftersom fyra glykolysrelaterade vägar signifikant modifierade HAMLET-känslighet (figur 1e och f). Dessutom identifierades Ras-vägen, som styr c-Myc-uttryck, som en determinant av HAMLET-känslighet (figur 1f).

ShRNA-skärmen antydde att onkogen transformation av c-Myc sensibiliserar celler för HAMLET-inducerad celldöd och att den glykolytiska maskinerin påverkar HAMLET-känsligheten hos cancerceller.

C-Myc-onkogenet bestämmer tumördödande effekten av HAMLET

Därefter undersökte vi om HAMLET-känslighet återspeglar c-Myc-uttrycksnivåer. Mänskliga lungkarcinomceller (A549), njurkarcinomceller (A498) och halvdifferentierade friska njurceller (humana njurproximala tubulusceller) exponerades för HAMLET (21 μM) och ATP-nivåer övervakades (figur 2a). En snabb minskning av ATP-nivåer observerades i lung- och njurkarcinomceller men friska celler förblev opåverkade efter 3, 6 och 24 timmar. Vid högre HAMLET-koncentrationer sågs emellertid också ett partiellt svar i dessa celler (kompletterande figur S1A). Skillnaden i c-Myc-uttryck återspeglade skillnaden i HAMLET-känslighet, eftersom lung- och njurkarcinomceller visar högre uttryck för c-Myc än friska celler (figurerna 2b och c).

c-Myc modifierar känsligheten för HAMLET-inducerad celldöd. ( a ) Friska njurceller (HRPTEC), njurkarcinomceller (A498) och lungkarcinomceller (A549) behandlades med HAMLET (21 μM), och ATP-nivåer mättes efter 3, 6 och 24 timmar. HAMLET orsakade en minskning av ATP-nivåer i karcinomceller men inte i friska celler. ATP-nivåer anges i% av obehandlade celler vid samma tidpunkt. Medel av tre experiment + sem ( b ) qPCR-kvantifiering av c-Myc mRNA-nivåer. Relativa c-Myc mRNA-nivåer visas (c-Myc / GAPDH, i% av nivåerna i friska celler). Medel av två experiment + sem ( c ) c-Myc western blot med aktin som en lastkontroll. ( d, e ) Hämning av c-Myc-expression genom transfektion av A549-celler med c-Myc shRNA (72 h) bekräftades med qPCR (panel d ) och c-Myc western blot med aktin som en belastningskontroll (panel e ). Relativa c-Myc mRNA-nivåer visas (c-Myc / GAPDH, i% av nivåerna i CT (kontroll) shRNA-transfekterade celler). Medel av två experiment + sem ntf = icke-transfekterad. ( f ) c-Myc shRNA-transfekterade A549-celler (72 timmar) blir mer resistenta mot de dödliga effekterna av HAMLET. Den cytotoxiska effekten av HAMLET kvantifierades efter 3 timmar som en reduktion i ATP-nivåer eller i antalet celler, jämfört med icke-transfekterade celler (ntf) och celler transfekterade med CT-shRNA. ATP-nivåer i% av nivåerna i respektive obehandlade celler. Medel av 2-3 experiment + sem (ATP) eller medelvärde av triplikat i ett experiment + sd (cellöverlevnad). ( g ) A549-celler arresterades med cellcykel genom serumsvält (48 timmar) eller dubbel-tymidinblock och behandlades med HAMLET. Cancercells livskraft bedömdes efter 3 timmar efter användning av Trypan blue-uteslutning eller ATP-mätningar. Medel + sem av tre experiment.

Bild i full storlek

För att ta itu med om c-Myc-aktivitet påverkar HAMLET-inducerad celldöd transfekterades A549 lungkarcinomceller med hämmande c-Myc-shRNA eller irrelevant shRNA och reduktion i c-Myc-uttryck bekräftades efter 72 timmar (figur 2d och e). Celler med reducerat c-Myc-uttryck blev mera resistenta mot de dödliga effekterna av HAMLET (21, 36 μM, 3 timmar), medan celler transfekterade med irrelevant shRNA bibehöll sin känslighet, med en LC50 som liknar otransfekterade celler (figur 2f). Resultaten antyder att nivån på c-Myc-uttryck är en direkt bestämning av HAMLET-känsligheten i cancerceller.

Eftersom knockdown av c-Myc orsakar tillväxtstopp i många cellinjer (Watson et al., 1991) inducerade vi medvetet tillväxtstopp och testade effekten på HAMLET-känsligheten. A549 lungkarcinomceller utsattes för serumavlägsnande eller dubbel-tymidinblock, och tillväxtstopp bekräftades genom flödescytometri efter propidiumjodidfärgning (kompletterande figur Sb). Tillväxtstopp förändrade emellertid inte signifikant HAMLET-känsligheten (figur 2g), vilket indikerar att effekten av c-Myc shRNA på HAMLET-känsligheten inte är beroende av en möjlig tillväxtstopp inducerad av c-Myc knockdown.

Glukosberövande och hämmare av glykolys förstärker HAMLET-inducerad celldöd

ShRNA-skärmen och GSEA-analysen identifierade glykolysrelaterade proteiner som determinanter för HAMLET-känslighet. För att direkt ta itu med om glykolys modifierar känsligheten för HAMLET, A549 lungkarcinomceller berövades glukos under 30 minuter, HAMLET tillsattes (21 och 36 μM) och celldöd kvantifierades (15 min, 1 och 3 timmar). Glukosberövning sensibiliserade celler för HAMLET, vilket orsakade en dramatisk minskning av ATP-nivåer och Trypan-blå uteslutning, liksom en ökning i frisättning av laktatdehydrogenas och denna effekt reverserades genom tillsats av glukos (figur 3a och kompletterande figurer S2). Dessutom förbättrade glukosanalog 2-deoxyglukos, som hämmar glykolys, HAMLET-toxiciteten på ett dosberoende sätt (figur 3b och kompletterande figur S2).

Glukosberövning och glykolysinhibering förbättrar HAMLET-inducerad celldöd. Glukos (G) berövning och glykolytisk hämmare 2-deoxyglukos (2DG) ökar de dödliga effekterna av HAMLET, medan glukos (0, 5, 2, 5, 5, 0 mM) räddar cellerna på ett dosberoende sätt. Den cytotoxiska effekten av HAMLET kvantifierades genom att mäta ATP-nivåer eller genom att utesluta Trypan blue (TB) och förändringar i morfologi registrerades genom konfokal mikroskopi. ( a ) Glukosberövning eller 2DG (2, 5 m M) ökade den cytotoxiska effekten av HAMLET (HL, 21 μM) i A549-celler. ATP-nivåer anges i% av nivåerna i obehandlade celler i 2, 5 m M glukos. Medel av 2-4 experiment + sem (1 h) * P 0, 05, *** P 0, 001 (vs HL, 5 m M glukos för ATP och vs HL, 2, 5 m M glukos för TB). ( b ) Glykolysinhibering med 2DG förbättrade de dödliga effekterna av HAMLET i glukosberövade A549-celler på ett dosberoende sätt. ATP-nivåer i% av nivåerna i obehandlade celler. Medel av två experiment + sem ( c ) Glukosberövning förbättrad blåsning (indikerat med pil, b) och ökade antalet avrundade, döda celler som var starkt färgade med HAMLET (indikerat med pil, d). A549-celler berövades glukos, behandlades med Alexa Flour 568-märkt HAMLET (21 μM, röd), och förändringar i morfologi registrerades genom livscells-konfokalmikroskopi under 3 timmar. Kärnor visualiseras med Hoechst-färgning (blå). Skalstänger: 10 μm.

Bild i full storlek

För att ytterligare undersöka effekterna av glukos på det cellulära svaret på HAMLET tillsattes Alexa Fluor 568-märkt HAMLET till cancerceller färgade med Hoechst och undersöktes genom realtidskonfokalavbildning. Glukosberövade celler visade mer blåsning efter 1 timme än glukosmatade celler, och efter 3 timmar hade fler av de glukosberövade cellerna förändrat morfologi och visade stark HAMLET-färgning (figur 3c). Dessutom ökade 3-bromopyruvat, som hämmar glykolys och mitokondriell ATP-produktion (Ihrlund et al., 2008) signifikant HAMLET-inducerad celldöd (kompletterande figur S2F). Sammantaget visar dessa resultat att cancerceller är sensibiliserade för de dödliga effekterna av HAMLET när glykolys hämmas.

HAMLET binder till HK1

Potentiella bindningspartners för HAMLET i den glykolytiska vägen identifierades med användning av en funktionell proteinuppsättning med högt innehåll på vilken 8000 humana rekombinanta proteiner upptäcktes (figur 4a). Med användning av strikt statistisk filtrering identifierades 87 signifikanta träffar inklusive nukleotidbindande proteiner, proteinkinaser och GTP-bindande proteiner. Det glykolytiska enzymet HK1 med en Z- poäng på 5, 09 (figur 4a) var en av de högsta poängträffarna. Dessutom visade flera glykolytiska enzymer ökande signalintensitet med stigande HAMLET-koncentrationer men med lägre Z- poäng, vilket således inte uppfyllde de stränga kriterierna för en positiv träff på denna skärm ( Z- poäng> 3 och replikera spot och inter-array variationskoefficient (CV) <50%). Dessa enzymer inkluderade PFKFB2 och PFKFB4 ( Z- poäng 0, 3 respektive 0, 9), GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas, Z- poäng 0, 5) och PKM2 ( Z- poäng 0, 1). För att bekräfta bindningen av HAMLET till de glykolytiska enzymerna spottades polyvinylidenfluoridmembran med rekombinant His-märkt humant HK1 och PKM2, kaninglukos-6-fosfatisomeras (GPI, 93% identiskt med humant) och bovint serumalbumin som en negativ kontroll . Membranen inkuberades sekventiellt med HAMLET eller a-laktalbumin, get-anti-a-laktalbumin-antikropp och kanin-anti-get pepparrotsperoxidkonjugerad antikropp. HAMLET bundet starkt till humant HK1 men inte till humant PKM2, kanin GPI eller bovint serumalbumin (figur 4b). Denna starka interaktion sågs inte med a-laktalbumin, vilket tyder på att HAMLET-komplexet har signifikant högre affinitet för HK1 än det nativa, fettsyrafria proteinet.

HAMLET binder till HK1. ( a ) I en proteinuppsättning som innehåller 8000 proteiner, HAMLET bundet till HK1 på ett dosberoende sätt (5 eller 50 ng / ul) men inte till PKM2 eller andra glykolytiska enzymer. ( b ) I en västerländsk prickfläck, HAMLET bundet starkt till humant HK1 men inte till de andra tre proteinerna. Rekombinant humant His-märkt HK1 och PKM2, kaninmuskulär GPI och BSA upptäcktes på PVDF-membran och inkuberades med HAMLET (HL) eller a-laktalbumin (ALA) (båda 0, 2 mg / ml) eller buffert som kontroll. Bundet HAMLET eller a-laktalbumin detekterades med användning av get-anti-a-laktalbumin och HRP-konjugerade antikroppar mot kanin och kanifierades med hjälp av ImageJ-programvara. Medel av fyra (HK1 och PKM2) eller sju (GPI, BSA) experiment + sem för HAMLET. Resultat från ett experiment för a-laktalbumin. ( c ) HAMLET kolokaliserades med HK1 speciellt i det perinukleära området. A549-celler behandlades med Alexa Fluor 568-märkt HAMLET (HL, röd) under 15 minuter och färgades med anti-HK1 och Alexa Fluor 488-märkta antikroppar (grön). Skalstänger: 20 μM. ( d ) HAMLET reducerade HK-aktivitet men inte pyruvat-kinas eller glukos-6-fosfatisomerasaktivitet, på ett dosberoende sätt. A549-celler behandlades med olika HAMLET-koncentrationer under 15 minuter, lyserades och aktiviteten i lysaten kvantifierades genom en kopplad spektrofotometrisk analys. Medel av tre experiment + sem

Bild i full storlek

Konfokal mikroskopi användes för att visualisera interaktionen av HAMLET med HK1 i cancerceller. A549 lungkarcinomceller behandlades med Alexa Fluor 568-märkt HAMLET (15 min, 21 μM), fixerade och färgades med anti-HK1-antikroppar (figur 5c). Celler färgade med anti-PKM2-antikroppar användes som kontroller (kompletterande figur S3). Obehandlade celler visade granulär HK1-färgning med den högsta intensiteten i det perinukleära området (figur 5c). I HAMLET-behandlade celler observerades en stark kolokalisering mellan HAMLET och HK1 speciellt i perinucleara, rundade aggregat. Däremot detekterades endast en svag kolokalisering av PKM2 med HAMLET (kompletterande figur S3).

Knockdown av glykolysrelaterade proteiner förändrar HAMLET-känsligheten. ( a, b ) A549-celler transfekterades med siRNA-kontroller eller siRNA-mål riktade mot HK1 eller PKM2. Efter 2 dagar bekräftades knockdown med qPCR ( a ) och western blot med GAPDH som en lastkontroll ( b ). Relativa mRNA-nivåer visas (PKM2 / PPIA och HK1 / PPIA i% av nivåerna i CT siRNA-transfekterade celler). Medel av 3-5 experiment + sem ( c ) HK1 siRNAs förstärkte den cytotoxiska effekten av HAMLET i A549-celler. A549-celler transfekterades med siRNA-mål riktade mot HK1, kontroll-siRNA eller siRNA-mål riktade mot PKM2 och behandlades efter 2 dagar med HAMLET (3 timmar). ATP-nivåer och livskraft i% av nivåerna i respektive obehandlade celler. Medel på 3–5 experiment + sem * P <0, 05. ( d, e ) PFKFB1 siRNA minskade den cytotoxiska effekten av HAMLET i A549-celler. A549-celler transfekterades med PFKFB1 siRNA eller kontroll siRNA under 48 timmar och behandlades med HAMLET. ( d ) ATP-nivåer i% av nivåerna i respektive obehandlade celler. Medel av tre experiment + sem * P <0, 05. ( e ) Knockdown av PFKFB1 bekräftades med qPCR och western blot.

Bild i full storlek

HAMLET minskar HK-aktiviteten i cancerceller

För att bestämma huruvida HAMLET stör störande glykolys i cancerceller, mättes HK-, PK- och GPI-aktiviteter i detergentfria lysat från HAMLET-behandlade A549 lungkarcinomceller (7, 21 och 36 mikrometer) genom kopplade spektrofotometriska analyser. HK-aktivitet visade en dosberoende trend mot en minskning efter 15 min HAMLET-behandling (figur 4d), men GPI- och PK-aktiviteterna förändrades inte signifikant. Vid denna tidiga tidpunkt var det inga förändringar i cellmorfologi eller i cellulära HK1-nivåer (kompletterande figurer S4a och b). ATP-nivåer minskade på ett dosberoende sätt redan vid 15 minuter men laktatproduktionen minskades först efter 3 timmar (kompletterande figur S4c). Resultaten antyder att HAMLET kan minska HK-aktiviteten i lungkarcinomceller.

Knockdown av HK1 eller PFKFB1 modulerar HAMLET-känsligheten

För att verifiera shRNA-skärmen och ytterligare undersöka rollen för glykolysrelaterade proteiner i HAMLET-inducerad celldöd transfekterades A549 lungkarcinomceller med små störande RNA (siRNA) riktade mot HK1, PFKFB1 och PKM2. Knockdown bekräftades med qPCR och western blots (figurerna 5a, b och e), och känsligheten för HAMLET kvantifierades genom att mäta ATP-nivåer och Trypan-blå uteslutning (figurerna 5c och d). HK1 siRNA-transfekterade celler visade en mer uttalad förlust av ATP som svar på HAMLET (21 och 36 μM, P <0, 05) än otransfekterade celler eller celler transfekterade med siRNA med kontroll. Däremot ändrade PKM2 siRNA inte känsligheten för HAMLET (figur 5c). Liknande resultat observerades med Trypan blå uteslutning. Vidare minskade knockdown av PFKFB1, som gav resistens i shRNA-skärmen, känsligheten för HAMLET (figur 5d). Dessa resultat bekräftar att knockdown av HK1 och PFKFB1 ökar och minskar HAMLET-känsligheten.

HAMLET stör snabbt cancercellsmetabolismen

För att bedöma om HAMLET förändrar cellernas metabola tillstånd jämförde vi den metabolomiska profilen för HAMLET-behandlade lungkarcinomceller (36 μM, 15 min och 1 h) med den för obehandlade celler (figur 6 och kompletterande figur S5). Tre olika icke-riktade metabolitprofileringsmetoder användes för att studera de möjliga metaboliska effekterna av HAMLET. Vätskekromatografi i omvänd fas kopplad till elektrosprayjoniseringsmasspektrometri (LC-MS) användes för att jämföra hydrofoba metaboliter (såsom lipider), hydrofil interaktionskromatografi och LC-MS användes för att studera ett brett spektrum av polära metaboliter och gaskromatografi masspektrometri (GC-MS) för att profilera kärnmetaboliter (Baran et al., 2009). Genom omvänd fas-LC-MS-profilering detekterades 560 funktioner (inklusive olika addukter, isotoper och nedbrytningsprodukter i samma källa av samma metabolit) definierade av m / z- värde och LC-retentionstid (för kombinationen av m / z- värde och retentionstid, se figur 6a). Analysen avslöjade att 125 av de 560 funktionerna ändrades signifikant efter 15 min HAMLET-behandling (107 ökade, 18 minskade). Efter 1 timme reducerades de flesta av 76 förändrade funktioner istället (22 ökade, 54 minskade) (figur 6d). Som förväntat från upptag av HAMLET identifierades särdrag med den största signalintensiteten i HAMLET-behandlade celler vid båda tidpunkter och flera funktioner med liknande retentionstid som olika joniserings- och isotopvarianter av oljesyra, lipidkomponenten i HAMLET, baserad på exakt massa och LC-retentionstid.

HAMLET stör störningen av cancercellerna. ( a - e ) Förändringar i metaboliter i HAMLET-behandlade (15 minuter och 1 h) A549-celler analyserades med LC-MS omvändfas-kromatografi. ( a ) Totalt detekterades 520 funktioner, definierade av retentionstid och m / z- värde. ( b ) Frekvensfördelning av log 2-transformerade vikförändringar i signalintensitet mellan HAMLET-behandlade och kontrollceller. Efter en snabb ökning i genomsnittlig signalintensitet efter 15 minuter observerades en minskning i genomsnittlig signalintensitet som svar på HAMLET. ( c ) Funktioner som visar en absolut log tvåfaldig förändring 1 och P- värden .050.05 ansågs betydligt förändrade. ( d ) Med användning av denna definition befanns 125 funktioner förändras i celler behandlade med HAMLET under 15 minuter och 76 funktioner i celler behandlade under 1 timme jämfört med respektive kontrollceller. Totalt ändrades 24 av dessa funktioner betydligt vid båda tidpunkter. ( e ) Plott av de betydligt förändrade funktionerna med log 2-transformerad vikningsändring indikerad med färger.

Bild i full storlek

Oinriktad profilering med användning av hydrofil interaktionskromatografi LC-MS överensstämde med omvänd fasanalys, vilket visade signifikanta metaboliska förändringar efter HAMLET-behandling. Av de 1120 funktioner som upptäcktes befanns 103 förändras efter 15 minuter (28 ökades, 75 reducerades i HAMLET-behandlade celler) och 114 efter 1 timme HAMLET-behandling (64 ökades, 50 reducerades i HAMLET-behandlade celler celler). Flera av dessa metaboliter identifierades baserat på jämförelse av exakt massa och retentionstid med analytiska standarder. S -adenosyl-L-humocystein, kreatin, fosfokreatin, taurin och glutation-disulfid minskade alla i HAMLET-behandlade celler, vilket möjligen återspeglade en störning i aminosyrametabolismen och oxidativ stress. Identiteten av kreatin och glutation-disulfid bekräftades också genom efterföljande MS / MS-analys. Resultaten tyder på att HAMLET snabbt förändrar cancercellsmetabolismen.

GC-MS-profilen av cellulära metaboliter utfördes därefter i A549 lungkarcinomceller behandlade med HAMLET under 15 och 60 minuter. Genom hierarkisk kluster observerades tre separata kluster, varvid de första innehöll kontrollprover (15 och 60 min), de andra HAMLET-behandlade proverna erhållna efter 15 min respektive de tredje 60 minproven (figur 7a, kompletterande tabell S2). De totala metabolitkoncentrationerna var lägre i HAMLET-60-prover än i kontroller, vilket bekräftade den allmänna avstängningen av metabolism som identifierats i den oförsvarade profilen. För att härleda signifikant förändrade metaboliter anpassades en linjär modell till data och metaboliter med en absolut log tvåfaldig förändring av 1 och falsk upptäcktsfrekvens (FDR) -justerade P- värden <0, 05 ansågs vara signifikanta. Sammantaget förändrades 20 metaboliter signifikant efter 15 min HAMLET-behandling (figur 7b). Som väntat från det kända upptaget av HAMLET uppvisade oljesyra och dess derivat elaidinsyra den mest markanta ökningen (120-faldigt, justerat P- värde = 4 × 10 −6 respektive 84 respektive 8, 1 × 10 −6 ). Dessutom var ett antal andra metaboliter mer omfattande efter 15 minuter, inklusive glukonsyra (3, 3-faldigt), glukonat-lakton (2, 6-faldigt), glycerinsyra (2-faldigt) och pyruvat (1, 7-faldigt). Bland metaboliterna som reducerades signifikant var taurin, glycin, citronsyracykel mellanliggande akonitat och polyaminer putrescine och spermidin.

Hierarkisk gruppering baserad på resultat från GC-MS-analysen separerar HAMLET och kontrollprover. ( a, b ) Totalt analyserades 113 metaboliter med användning av GC-MS 15 minuter och 1 timme efter HAMLET-behandling. ( a ) Hierarkisk gruppering med användning av alla metaboliter separerar kontrollprover från HAMLET-behandlade prover (15 min och 1 timme). En majoritet av de uppmätta metaboliterna nedreglerades (röd) 1 timme efter HAMLET-behandling. Uppreglerade metaboliter (grön) inkluderade oljesyra och dess derivat. ( b ) Hierarkisk gruppering baserat på de signifikant förändrade metaboliterna vid 15 och 1 timme.

Bild i full storlek

Efter 1 timme identifierades 41 metaboliter som signifikant förändrade (figur 7b). Oleinsyra (log 2-faldig förändring av 5, 1 och P = 2 × 10 −10 ) visade den näst mest markanta ökningen tillsammans med dess derivat, inklusive elaidinsyra och palmitolsyra. Pyruvat och flera mellanprodukter i citronsyrecykeln, inklusive succinat, akonitat, fumarat och malat, var mindre omfattande efter HAMLET-behandling, vilket bekräftade den hämmande effekten av HAMLET på glykolys. Dessutom reducerades ett antal andra viktiga metaboliter metabolism, inklusive aspartat, glutamat och spermidin. Slutligen, för att bekräfta den oinriktade metabolomanalysen, orsakade HAMLET en utarmning av metaboliter relaterade till glutationmetabolism. Sammantaget visar dessa resultat att HAMLET snabbt orsakar en massiv förändring av cancercellsmetabolismen som delvis kan bero på en störning av glykolys.

Diskussion

HAMLET är den första medlemmen i en ny familj av tumördödande protein-lipidkomplex som dödar cancerceller i stort, medan de sparar differentierade, icke-transformerade celler (Hakansson et al., 1995; Svensson et al., 2000). Förutom sin förmåga att döda cancerceller in vitro har HAMLET visat terapeutisk effekt mot hudpapillom och snabba aktuella effekter på mänskliga blåscancer (Gustafsson et al., 2004; Mossberg et al., 2007). I djurmodeller av humant glioblastom eller blåscancer har HAMLET visat sig förlänga överlevnad och försena tumörutveckling (Fischer et al., 2004; Mossberg et al., 2010). Hittills har toxiska effekter på friska vävnader inte upptäckts, vilket antyder att HAMLET utnyttjar bevarade egenskaper hos cancerceller för dess aktivitet. Några av dessa konserverade funktioner identifierades här. HAMLET-känsligheten hos cancerceller visade sig vara beroende av c-Myc-onkogenuttrycket och den glykolytiska maskinen, speciellt HK1 och PFKFB1 och HIF1a, som aktiveras av hypoxi och onkogenaktivitet och verkar genom att förbättra transkriptionen av glykolytiska enzymer, glukostransportörer och laktatdehydrogenas (Kim et al., 2006; Papandreou et al., 2006).

c-Myc har kallats "den avgörande onkogenen" (Li et al., 1984; Nilsson och Cleveland, 2003) men effekterna förblir paradoxala, eftersom introduktion av c-Myc enbart i normala celler orsakar celldöd (Evan et al., 1992). I cancerceller påverkar c-Myc-överuttryck minst 30% om inte alla uttryckta gener, antingen direkt eller genom olika reglerande kretsar. Eftersom HAMLET har visat aktivitet mot> 40 olika tumörcelltyper från olika arter, vävnader och individer var den sensibiliserande effekten av den allestädes närvarande onkogen c-Myc inte helt oväntad. Tumörceller som uttryckte högre nivåer av c-Myc dog lättare när de utsattes för HAMLET än friska differentierade celler, och knockdown av c-Myc minskade HAMLET-känsligheten. C-Myc-onkogenen har föreslagits för att främja Warburg-effekten och beroendet av cancerceller av aerob glykolys. Således kan överaktiv c-Myc göra cancerceller alltför känsliga för en avreglering av glykolys av HAMLET. Förutom själva c-Myc identifierades Ras-signalvägen som en determinant av HAMLET-känslighet genom GSEA-analys och c-Myc aktiveras nedströms Ras, vilket kontrollerar cellproliferation och överlevnad tillsammans med andra effektorer såsom fosfoinositid 3-kinas. Vi har funnit att HAMLET orsakar en förskjutning från mitogen-aktiverat proteinkinas-kinas / extracellulärt signalreglerat kinas till p38-signalering i tumörceller och att p38 är involverat i det tidiga celldödssvaret på HAMLET (Storm et al. , Manuskript i beredning) . Friska celler, däremot, kännetecknas av låg intrinsisk aktivitet i Ras / mitogen-aktiverat proteinkinasväg och c-Myc-uttryck och upprätthåller en balanserad mitogen-aktiverad proteinkinasaktivitet under HAMLET-exponering, med liten p38-aktivering, i överensstämmelse med deras låga HAMLET-känslighet. Onkogenberoende och hög metabolisk aktivitet orsakad av mutant c-Myc i cancerceller kan göra dessa celler alltför känsliga för avreglering av glykolys genom HAMLET, vilket ytterligare kopplar effekterna av c-Myc till cancercelldöd.

Förutom c-Myc, inbegrep HIF1a, en andra onkogen som är välkänd för att modulera cancercellsmetabolismen, för att reglera känsligheten för HAMLET. HIF1a verkar genom att förbättra transkriptionen av kritiska beståndsdelar i den glykolytiska maskinen, inklusive glukostransportörer och HK1 (Dang et al., 2008). Det har föreslagits att HIF1 enbart kan driva de stora metaboliska förändringarna som följer med onkogen transformation, som identifierats av Otto Warburg (Denko, 2008). Denna synergi överensstämmer med de HAMLET-sensibiliserande effekterna av HK1 och HIF1 i shRNA-skärmen. Dessutom samarbetar deregulerad expression av onkogen c-Myc med HIF1a för att tillhandahålla tumörmetabolsk fenotyp. Paradoxalt nog kan HIF1a under fysiologiska förhållanden hämma aktiviteten hos c-Myc och HIF1a direkt påverkar uttrycket av MXI1, som binder MAX och därmed motverkar effekterna av c-Myc (Zhang et al., 2007). HIF1a minskar också c-Myc-aktiviteten genom att dämpa c-Myc-proteinnivåerna genom en proteasomberoende väg. Till skillnad från HIF1a har HIF2a visat sig stabilisera MYC – MAX-komplexet och därigenom stimulera c-Myc-inducerad transkription. Därför är effekterna av c-Myc på HAMLET-känslighet inte troligtvis bara återspeglar dess reglering av glykolys. I detta avseende är kontextberoende c-Myc-medierad transkription av avgörande betydelse för tumörprogression och kan också vara för HAMLET-känslighet.

Det glykolytiska tillståndet hos tumörceller definierades som en determinant för HAMLET-känslighet av shRNA-skärmen, och extracellulära glukosnivåer visade sig modulera känsligheten för tumörceller för HAMLET. Vidare identifierade GSEA-analysen av shRNA-skärmen flera vägar relaterade till glykolys som viktiga för HAMLET-känslighet. HK1 var ett direkt mål för HAMLET, sett av bindning i en proteomisk screening som involverade 8000 proteiner och i prickfläckar i vilka den renade humana HK1 – HAMLET-interaktionen bekräftades. Hämning av HK1 och HK1-homolog HK2 skulle förutsägas minska glukosfosforylering och därigenom skapa ett tillstånd som liknar glukosdeprivation genom att hämma glykolys i cancerceller. HK1 / 2-isoformerna är associerade med mitokondriell membran, där de kontrollerar glukosanvändningen. Dessutom minskar HK1 spänningsberoende anjonkanalkonduktans och skyddar därmed celler från cytokrom c- frisättning och apoptotisk död (Abu-Hamad et al., 2008). I en parallell studie har vi visat att jonkanalaktivering är en kritisk membranhändelse vid HAMLET-inducerad celldöd (Storm et al. , Manuskript under förberedelse), vilket ökar möjligheten att HK1 utöver dess effekter på glykolys verkar genom att modulera interaktionen av HAMLET med ionkanaler i mitokondriell membran. Vi har också sett att peroral HAMLET-behandling av APC min- möss med koloncancer modifierade transkriptionen av ett antal glykolysrelaterade proteiner (Puthia et al. , Manuskript i beredning), vilket antyder relevansen av dessa mål också in vivo .

ShRNA-skärmen identifierade också PKFKB1 som en signifikant determinant av HAMLET-känslighet, men i motsats till HK1 hade PKFKB1-shRNA skyddande effekter. Mekanismen bakom detta är inte direkt uppenbar eftersom de fyra PFKFB-isoformerna har motsatta kinas- och bisfosfatasaktiviteter, med oberoende domäner som katalyserar syntesen eller nedbrytningen av fruktos-2, 6-bifosfat respektive. Den resulterande effekten på glykolys bestäms av det totala förhållandet kinas: bisfosfatas i varje cell. PFKFB1, PFKFB2 och PFKFB4 har nära lika kinas- och bisfosfatasaktiviteter, medan PFKFB3 har starkare kinasaktivitet (740: 1) och är överuttryckt i cancerceller (Yalcin et al., 2009). Knockdown av PFKFB1 kan öka dominansen av PFKFB3-isoformen vilket resulterar i högre fruktos-2, 6-bisfosfatnivåer och förbättrad glykolys. Detta skulle vara förenligt med räddningen efter PFKFB1-knockdown, eftersom reducerad glykolys i en cell med Warburg-fenotypen verkar gynna HAMLET-inducerad celldöd.

Slutligen visade en bred metabolomskärm att HAMLET-behandlade celler snabbt förlorar metabolisk aktivitet. HAMLET utlöste snabba och djupgående förändringar i metabolismstillståndet för cancerceller, vilket visas med LC-MS och GC-MS-profilering. Efter 1 timme visade huvuddelen av metaboliterna en minskning i intensitet, i överensstämmelse med det snabba undertrycket av glykolys och en resulterande energiförlust som krävs för att upprätthålla det normala metaboliska maskineriet, särskilt i cancerceller. Förändringen var dramatisk, och det är troligt att det snabba celldödssvaret på HAMLET till viss del kan bero på denna effekt, eftersom celler som berövats energi och metabolisk aktivitet, är kända för att genomgå celldöd (Kroemer och Pouyssegur, 2008). MS / MS-analys identifierade metaboliter som var starkt reducerade, inklusive S -adenosyl-L-humocystein, kreatin, fosfokreatin, taurin och glutation-disulfid, som är grundläggande mellanprodukter i försvaret mot oxidativ stress (Balendiran et al., 2004). Riktad GC-MS-profilering identifierade stora mängder oljesyra i HAMLET-behandlade tumörceller redan efter 15 minuter, vilket indikerar att överskott av mängder fettsyra och mättnad i fettsyrametabolismmaskineriet kan vara ansvarig för det första, snabba svaret på HAMLET. Vi kunde konsekvent se en uttömning av viktiga glutation-mellanprodukter vid senare tidpunkter. Den ökade aktiviteten i anti-oxidationsvägarna tillsammans med p38-aktivering kan indikera att reaktiva syrearter är viktiga för HAMLET-inducerad celldöd.

Intresset för metaboliska förändringar i cancerceller, såsom deras högre glykolysgrader, har väckts upp igen av upptäckten att mutationer i välkända onkogener påverkar cancercellsmetabolismen och tillkomsten av ny teknik för att studera en cellmetabolom. Det är uppenbart att metaboliska vägar är mycket sammankopplade med vägar som styr de klassiska kännetecknen för cancer, såsom okontrollerad spridning och resistens mot celldöd. Således blir hämning av glykolys ett viktigt nytt terapeutiskt mål. Glukosanalogen 2-deoxyglukos har visat sig döda flera cancercellinjer in vitro , hämma tillväxten av cancer i bukspottkörteln i nakna möss och förbättra effekterna av dödreceptorligander, strålning och cytotoxiska läkemedel (Coleman et al., 2008 ; Hernlund et al., 2008). För närvarande är 2-deoxyglukos i kliniska studier som enstaka medel eller i kombinationsterapi. Dessutom utrotade 3-bromopyruvat avancerade cancerformer hos råttor utan uppenbara ogynnsamma effekter (Ko et al., 2004). HAMLET presenterar ett nytt terapeutiskt alternativ som potentiellt fungerar bredare genom att hämma glykolys och andra cellvägar som regleras av c-Myc- och Ras-beroende transformation. Bristen på HAMLET-känslighet i friska, differentierade celler och bristen på in vivo- toxicitet i olika tumörmodeller bidrar också till HAMLETs kliniska potential.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figurer S1 – S5

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurer Legender

  2. 2.

    Kompletterande tabeller Legender

Excel-filer

  1. 1.

    Kompletterande tabell S1

  2. 2.

    Kompletterande tabell S2

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)