Konnexiner och cyklooxygenas-2 övergång i uttrycket av strålningsinducerade åskådareeffekter | brittisk journal för cancer

Konnexiner och cyklooxygenas-2 övergång i uttrycket av strålningsinducerade åskådareeffekter | brittisk journal för cancer

Anonim

ämnen

  • Cell signalering
  • DNA-skada och reparation
  • strålbehandling

Den här artikeln har uppdaterats

Abstrakt

Bakgrund:

Signalhändelser medierade av connexins och cyclooxygenase-2 (COX-2) har viktiga roller i åskådareeffekter som induceras av joniserande strålning. Huruvida dessa proteiner medierar åskådareffekter oberoende eller kooperativt har emellertid inte undersökts.

metoder:

Ovanstående normala humana fibroblaster odlades med bestrålade adenokarcinom HeLa-celler i vilka specifika föreningar (Cx) uttrycks i frånvaro av endogent Cx, före och efter COX-2-knockdown, för att undersöka DNA-skador i åskådarceller och deras avkommor.

Resultat:

Inducerbart uttryck av gapövergångar sammansatta av connexin26 (Cx26) i bestrålade HeLa-celler förbättrade induktionen av mikrokärnor i åskådareceller ( P <0, 01) och reducerade den nödvändiga kokulturen för manifestation av effekten. Däremot gav uttryck av connexin32 (Cx32) skyddande effekter. COX-2-knockdown i bestrålade HeLa Cx26-celler dämpade åskådarsvaret på grund av connexinuttryck. COX-2-knockdown resulterade emellertid i förbättrad mikronukleusbildning i avkommet från de åskådande cellerna ( P <0, 001). COX-2-knockdown försenade förbindelsekommunikation i HeLa Cx26-celler och reducerade, i plasmamembranet, den fysiska interaktionen av Cx26 med MAPKKK, en styrenhet för MAPK-vägen som reglerar COX-2 och connexin.

Slutsatser:

Junctional kommunikation och COX-2 förmedlar kooperativt spridningen av strålningsinducerade icke-målinriktade effekter. Att karakterisera de medierande händelserna som påverkas av båda mekanismerna kan leda till nya tillvägagångssätt som mildrar sekundär försvagande effekter av cancerstrålbehandling.

Huvudsaklig

Utbredda bevis har utmanat paradigmet att strålning genom en cellkärna är den enda förutsättningen för produktion av genetisk skada eller ett biologiskt svar. I en landmärkesstudie rapporterade Nagasawa och Little att när <1% av kärnorna i en cellkultur korsas av ett α- partikelspår, genomgår mer än 30% av cellerna en ökad frekvens av syster-kromatidutbyten (Nagasawa och Little, 1992 ). Sedan dess har strålningsinducerade åskådareeffekter (RIBE) demonstrerats i ett flertal in vitro- och in vivo- studier med olika biologiska slutpunkter (granskad i Prize och O'Sullivan, 2009). Förekomsten av RIBE har konsekvenser för strålbehandling, diagnostisk radiologi och hälsorisker vid exponering av miljöstrålning. Två huvudmekanismer förmedlar RIBE; i sammanhängande kulturer av normala och vissa cancerceller är intercellulär kommunikation genom gapövergångar en kritisk mediator (Azzam et al, 2001; Zhou et al, 2001), och i subkonfluenta normala eller tumörcellkulturer, diffusibel faktor (er), inklusive biprodukter av cyklooxygenasaktivitet, delta i processen (Mothersill och Seymour, 2004; Hei, 2006).

Gapkorsningar är intercellulära kanaler som uttrycks i praktiskt taget alla mänskliga vävnader. De tillåter små molekyler, som joner och sekundära budbärare, att passera fritt mellan angränsande celler, och därför är de viktiga för att upprätthålla cellulär homeostas och funktion (Goodenough och Revel, 1970; Willecke et al, 2002). De består av connexins (Cx), som är en stor familj av proteiner med minst 21 identifierade medlemmar i mänskliga celler. Förenade kanaler som innehåller specifika Cx har olika permeabilitetsegenskaper (Harris, 2001). Vi har visat att molekyler som kommunicerats genom gapövergångar resulterar i uppreglering av oxidativ stress i celler intill de exponerade för de bestrålade cellerna (Azzam et al, 1998) och i synergistisk förstärkning av toxicitet bland de bestrålade cellerna (Autsavapromporn et al, 2011) ). Reglering av connexinuttryck / gap-junction-funktion med kemiska medel, tvingad connexin-expression genom transfektion och connexin-gen-knockoutstudier ger betydande bevis för rollen för gap-junctions i RIBE (Azzam et al, 2001). Spaltkorsningarnas deltagande i toxiska åskådareeffekter är inte unikt för joniserande strålning; det beskrivs också i celler med hög densitet exponerade för kemoterapeutiska medel (Jensen och Glazer, 2004).

Cyklooxygenas-2 (COX-2), den inducerbara formen av cyklooxygenas, aktiveras av tillväxtfaktorer och cytokiner för att katalysera omvandlingen av arachidonsyra till prostaglandiner (Subbaramaiah et al, 1998). Mitogenaktiverat proteinkinas (p38 MAPK ) och hämmare kärnfaktor K B-kinas (IKK) -NF- κ B signalvägar har varit inblandade i COX-2-uppreglering. COX-2 har en viktig roll i att modulera det inflammatoriska svaret, vilket ofta är förknippat med genomisk instabilitet och karcinogenes (Stasinopoulos et al, 2013). I synnerhet undertryckte tillsatsen av COX-2-hämmaren NS-398 COX-2-aktiviteten och dämpad åskådarmutagenes i icke-bestrålade humana lungfibroblaster i kulturer där en liten fraktion av celler korsades av a- partiklar (Zhou et al, 2005) . Huruvida connexin-kanaler och COX-2 förmedlar RIBE genom vanliga eller oberoende mekanismer har emellertid inte undersökts. Att förstå de medierande händelserna är relevant för att förstärka effektiviteten av cancerterapi och formulera strategier för att dämpa postterapeutiska patologier.

I den här studien använde vi en genetisk strategi för att undersöka den möjliga övergång mellan COX-2 och Cx i utbredningen från bestrålade tumörceller för signalhändelser som leder till DNA-skador i sammanhängande normala celler. Vi kännetecknade mikronukleusbildning i åskådarceller, övergripande kommunikation och konnexin-interagerande proteiner före och efter COX-2-knockdown i bestrålade HeLa-celler som uttrycker Cx32 eller Cx26, som bildar kanaler med distinkta permeabilitetsegenskaper. Vi undersökte också induktionen av DNA-skada i åskådarceller där COX-2-nivån slogs ner.

Resultat

Gapkorsningar som består av Cx26, men inte Cx32, påskyndar uttrycket av stressande RIBE

För att undersöka rollen för gap-junction permeabilitet i RIBE, använde vi HeLa-celler som ett modellsystem. Dessa celler, som saknar endogent Cx, transfekterades stabilt med antingen tom vektor (framöver myntad HeLa-förälder) eller inducerbara vektorer innehållande Cx26 eller Cx32 cDNA (framöver myntade HeLa Cx26 eller HeLa Cx32). I de transfekterade cellerna lokaliseras det uttryckta Cx i plasmamembranet och bildar funktionella gapskorsningar (Koreen et al, 2004). Vi har tidigare visat att HeLa Cx26- och HeLa Cx32-celler också bildar funktionella gapskorsningar med normala humana diploida AG1522-fibroblaster (Autsavapromporn et al, 2013). HeLa-cellerna exponerades för en genomsnittlig absorberad dos på 50 cGy från 3, 7 MeV a- partiklar som resulterar i 50% klonogen överlevnad (Autsavapromporn et al, 2013), och inom 5 minuter efter exponering kokades de bestrålade cellerna intimt med åkande AG1522-celler i Transwell-insatser, som beskrivs i avsnittet Metoder. Efter 6 timmar eller 24 timmar isolerades åskådarcellerna och utvärderades för DNA-skada i form av mikronuklei. Jämfört med kokultur med skambestrålade celler resulterade en 6-timmars kultur av AG1522-celler med bestrålade HeLa-föräldrceller inte någon signifikant förändring i fraktionen av åskådare-celler med mikronkärnor (figur 1A). En 24-timmars kokultur resulterade emellertid i en ökning ( P <0, 01) (figur IB). Denna grad av mikronukleusinduktion i åskådareceller tillskrivs icke-gapskiftande effekter (t.ex. utsöndrade faktorer). När HeLa-cellerna uttryckte funktionella Cx26-kanaler sågs en väsentlig åskådareffekt vid 6 timmar, och vid 24 timmar med kokultur var åskådareffekten större än den som sågs vid kokultur med föräldra HeLa-celler ( P <0, 01) (figur 1A). Däremot inducerade inte kokultur av åskådare-celler med bestrålade HeLa Cx32-celler under 6 timmar eller till och med 24 timmar inte mikronukleusbildning i åskådarceller (figur 1A och B). Dessa data stöder en kritisk roll för permeabilitet i gapskorsning vid bestämning av storleken på inducerade åskådareeffekter. Medan uttrycket av Cx26 i HeLa-celler förmedlade intercellulära effekter som leder till DNA-skador i åskådande normala celler, uttryckte Cx32-medierade intercellulära effekter som mildrar effekterna som annars skulle vara uppenbara vid 24 timmar.

Image

Effekten av förenad permeabilitet på induktion av DNA-skador i åskådare-celler. HeLa-föräldrarceller som var bristfälliga i förbindningskommunikation, eller som uttrycker Cx26- eller Cx32-kanaler, utsattes för en medelabsorberad dos av 50 cGy från 3, 7 MeV a- partiklar eller behandlades med skam. Inom 5 minuter efter bestrålning koklades de med AG1522-normala celler under 6 timmar ( A ) eller 24 timmar ( B ) på ett sätt som tillät övergripande kommunikation mellan de förbipasserande AG1522-cellerna och bestrålade HeLa-celler som uttryckte konnexiner. Efter kokultur skördades åskådarcellerna och utsattes för mikronukleusbildningsanalysen.

Bild i full storlek

Cx26-övergångskanaler, men inte hemi-kanaler, har en betydande roll i utbredningen av signalhändelser som leder till DNA-skador i åskådare-celler

För att särskilja rollerna för Cx26-förbindningskanaler och hemi-kanaler i utbredningen av signalhändelser som ledde till DNA-skador i åskådarcellerna, odlades AG1522-åskådarceller med bestrålade HeLa Cx26-celler i närvaro eller frånvaro av gapövergångshämmaren AGA eller hemi-kanalinhibitor La 3+ (figur 2). En 24-timmars odlingsperiod i närvaro av La 3+ hade väsentligen ingen effekt på bildande av kringstående mikronukleus ( P <0, 01), men inkubering av cellerna i närvaro av AGA hämmade åskådarinduktionen av DNA-skada (figur 2). Det vill säga, hämning av förbindningskanalerna och inte hemikanalerna eliminerade effekten av Cx26-expression på mikronukleusbildning i åskådande celler. Dessa resultat visar att Cx26 förmodligen medierar åskådaresponsen genom sin roll i att bilda övergångskanaler. Jämfört med uppgifterna i figur IB, där en åskådareeffekt detekterades i AG1522-celler som samlades under 24 timmar med föräldrar HeLa-celler utan funktionell Cx, tyder dessa resultat på att kommunikation genom gap-övergångar ersätter effekten av händelser som förökats genom extracellulär utsöndring.

Image

Rollen för connexin26-kanaler i spridningen av skadliga effekter av joniserande strålning. Mikronukleusbildning i åskådare AG1522-celler som kokades i 24 timmar med a- partikelbestrålade eller skambehandlade sammanhängande HeLa-celler som uttrycker Cx26 i närvaro av icke-toxiska koncentrationer (50 μM ) av gapskärningsinhibitorn AGA eller hemi- kanalinhibitor La 3+ .

Bild i full storlek

COX-2 knockdown dämpar effekterna av strålningskontroller medierade av gapkorsningar och diffunderbara faktor (er)

För att undersöka om COX-2-signalering har en modulerande roll i gap-junction-medierade bystander-effekter, slog vi ner COX-2-nivån i HeLa-föräldrar, HeLa Cx26 och HeLa Cx32-celler genom shRNA-konstruktioner som riktar sig till olika regioner i COX-2-mRNA-sekvensen. . Klonerna med den bästa knockdown-effektiviteten användes i experimenten (kompletterande figur 1). I likhet med resultaten i figur 1 ökades mikronukleusbildning i åskådare AG1522-celler som kokades med bestrålade HeLa-förälderceller under 24 timmar men inte 6 timmar ( P <0.01) (figur 3A och B); knockdownen av COX-2 förhindrade denna ökning (figur 3B), vilket antydde att bestrålning inducerar en COX-2-medierad väg som leder till komponenten toxicitet som inte kan förmedlas av gapskärningar. Påfallande, dämpning av COX-2 i HeLa Cx26-celler dämpade också åskådareffekten som detekterades vid både 6 timmar och 24 timmar med kokultur (figur 3C och D). Förutom de resultat som erhölls med celler från klon 5 där ökningen i mikronukleusbildning fortfarande var signifikant vid 6 timmar ( P <0, 015 mot P <0, 001 i respektive kontroll) (figur 3C) var trenden mot en ökning av mikronukleusbildning i den andra klon och vid 24 timmar i klon 5 var inte signifikant när COX-2-basnivån minskades i de bestrålade cellerna (figur 3C och D). Å andra sidan förändrade inte nedslagning av COX-2 i HeLa-celler som uttrycker Cx32 nivån på DNA-skada i form av mikronuklei i åskådare AG1522-celler som undersöktes antingen 6 timmar eller 24 timmar efter kokultur (figur 3E och F). Det fanns inga signifikanta skillnader i mikronukleusbildning i AG1522-celler som kokades med bestrålade eller skambehandlade HeLa Cx32-celler härrörande från någon av de 2 använda klonerna.

Image

Effekten av COX-2 på strålningsinducerade åskådareeffekter förmedlade av connexin-kanaler. Mikronukleusbildning i åskådare normala humana AG1522-fibroblaster samkulturerades med sammanhängande HeLa-celler med normala (kontroll) eller nedslagsnivåer av COX-2. HeLa-föräldrarceller ( A och B ) och HeLa-celler som uttrycker Cx26 ( C och D ) eller Cx32 ( E och F ) med normala eller knockdown-nivåer av COX-2 exponerades för en medelabsorberad dos på 50 cGy från 3, 7 MeV a- partiklar eller blev skambehandlade. Inom 5 minuter efter exponering kokades de intimt med AG1522-fibroblaster under 6 timmar (vänsterpaneler) eller 24 timmar (högerpaneler). Efter kokultur skördades åskådarcellerna och utsattes för mikronukleusbildningsanalysen.

Bild i full storlek

COX-2 knockdown försenar cellkopplingen via Cx26-kanaler

För att testa effekten av COX-2-knockdown på cellkoppling laddades HeLa Cx26-celler med normal eller knockdown COX-2 med CellTracker Orange CMTMR fluorescerande färgämne (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) som förblir tätt bundet till celler. Dessutom laddades cellerna med Calcein AM (Molecular Probes). När det har laddats i cellen kan detta färgämne migrera till intilliggande celler endast genom gapskorsningar. Efter laddning trypsiniserades kulturerna och cellerna ersattes med avlastade AG1522-åskådarceller i ett respektive förhållande av 1: 99 och ympades med hög densitet. Vid olika tidpunkter därefter undersöktes cellerna med ett fluorescerande mikroskop. Uppgifterna i figur 4 (övre raden) visar att CellTracker Orange-laddade HeLa Cx26-celler med normal COX-2 upprättar övergångskommunikation med AG1522-celler inom 2 timmar från kokulturen, vilket illustreras genom överföringen av Calcein AM-färgämne. När HeLa Cx26 med COX-2 knockdown odlades med AG1522-celler inträffade också funktionell koppling; emellertid dämpades och försenades (figur 4, mitt- och bottenrader). Vid 2 timmar och 3, 5 timmar kokultur var den endast ∼ 15% respektive 35% av kopplingen som observerades vid 2 timmar i HeLa Cx26-celler med normal COX-2-nivå.

Image

Effekten av COX-2-knockdown på övergripande kommunikation mellan HeLa Cx26-celler och AG1522-fibroblaster. HeLa Cx26-celler laddade med Calcein AM (grön fluorescens) och CellTracker Orange (röd fluorescens) blandades med icke-laddade AG1522-celler i ett respektive förhållande av 1: 99. Celler undersöktes mikroskopiskt med Texas Red ( A ) eller FITC-filter ( B) ). ( A ) Representativt fält som visar de laddade cellerna som finns i kokulturen. ( B ) Samma fält i ( A ) som visar Calcein AM-färgöverföring som sker mellan HeLa Cx26-celler med normal eller knockdown-nivå av COX-2 och AG1522-fibroblaster vid 2 timmar och 3, 5 timmar efter kokultur.

Bild i full storlek

COX-2 knockdown påverkar interaktionen av Cx26 med det mitogenaktiverade proteinkinas-kinas-kinaset (MAPKKK) MLT

För att få en större förståelse av övergången mellan COX-2 och gap-junction-koppling, karakteriserade vi Cx26-interagerande proteiner i plasmamembranet i HeLa-celler med normala eller knockdown COX-2-nivåer. Kolesterol-rika domäner i plasmamembranet isolerades, och proteiner som samimmunutfälldes med Cx26 renades och identifierades genom vätskekromatografimassaspektrometri (LC-MS). Bland andra proteiner befanns MLTK existera i komplex med Cx26 i celler med normal COX-2-nivå. MLTK är medlem i MAPKKK-familjen och är uppströms om p38 MAPK (Gotoh et al, 2001) som reglerar uttrycket av COX-2 (Zhou et al, 2005) och flera strålningsinducerade svar, inklusive åskådareeffekter (Azzam et al., 2002; Asur et al, 2010). Vidare påverkar fosforylering av connexin av MAPK dess interaktion med andra proteiner (Cameron et al, 2003). Nedslagningen av COX-2 minskade interaktionen mellan Cx26 och MLTK med 8 gånger. Immunutfällnings- / immunoblottingresultaten i figur 5 bekräftar LC-MS-resultaten och visar att knockdown av COX-2 drastiskt dämpade Cx26-MLTK-interaktionen. Denna reducerade interaktion påverkade emellertid inte aktiveringen av ERK1 / 2, p38 MAPK och NF- K i HeLa Cx26-celler exponerade för a- partiklar (figur 6). Intressant är dock att i skambehandlade celler var basnivåerna för ERK1 / 2, p-ERK1 / 2, p38 MAPK, p-p38 MAPK och p-NF- K lägre i COX-2 knockdownceller jämfört med celler med en normal nivå av COX-2 (0, 73 ± 0, 31, 0, 55 ± 0, 01, 0, 61 ± 0, 14, 0, 36 ± 0, 22 respektive 0, 6 ± 0, 02).

Image

Effekten av COX-2-knockdown på plasmamembraninteraktionen av connexin26 med Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase (MAPKKK). Fysisk interaktion av Cx26 med MAPKKK MLK i kolesterolrika domäner i plasmamembranet av bestrålade (4 Gy från 137 Cs y- strålar) eller skambehandlade HeLa Cx26-celler med normal eller COX-2 knockdown. Western blot-analyser av MAPKKK MLK i supernatanten och den pelleterade fraktionen efter immunutfällning med anti-Cx26-antikropp.

Bild i full storlek

Image

Effekt av COX-2-knockdown på nivåerna av stressresponsiva proteiner i skambehandlade och bestrålade HeLa Cx26-celler. Western blot-analyser av COX-2-regulatoriska proteiner i HeLa Cx26-celler med normal eller COX-2-knockdown vid 3 timmar efter bestrålning med en medelabsorberad dos på 50 cGy från 3, 7 MeV a- partiklar. Färgning med Ponceau S Red användes som lastkontroll.

Bild i full storlek

COX-2-knockdown främjar genomisk instabilitet i avkomma av normala åskådareceller som är odlade med cancerceller som uttrycker Cx26

Resultaten i figur 3 indikerar att nedslagning av COX-2 dämpar stressande effekter i normala åskådare som undersöktes inom timmar efter kokultur med bestrålade cancerceller. För att undersöka det långsiktiga utfallet av åskådareffekten utvärderade vi spontan mikronukleusbildning i avkomma från de åskådande cellerna. Åskådare AG1522-celler som odlades med bestrålade eller skambehandlade HeLa Cx26-celler med normala eller knockdown COX-2-nivåer skördades efter 6 timmars kokultur. De förökades sedan för 20 befolkningsfördubblingar och undersöktes med avseende på mikronukleusbildning. Det fanns ingen skillnad i mikronukleusbildning i avkommor med AG1522-celler som tidigare samkulturerades med bestrålade eller skambehandlade HeLa Cx26-celler med normal COX-2-nivå ( P = 0, 36) (figur 7). I motsats härtill uppkom avkommande celler som kokades med bestrålade HeLa Cx26-celler med COX-2-knockdown, som visade en kortvarig dämpad åskådareeffekt (figur 3C), en förbättrad genomisk instabilitet återspeglas i en större andel avkommande celler som innehöll mikronkärnor ( P <0, 01) (figur 7).

Image

Effekt av COX-2-knockdown i bestrålad HeLa Cx26 på fördröjda förändringar inducerade i avkommor från normala åskådande celler. Mikronukleusbildning i avkomma av isolerade åskådare AG1522-celler som tidigare koklades med a- partikelbestrålade eller skambehandlade HeLa Cx26-celler med normala eller COX-2 knockdown under 6 timmar.

Bild i full storlek

Diskussion

Våra resultat av mikronukleusbildningen (figur 1, 2, 3) indikerar att flera vägar förmedlar spridningen av stressande effekter från bestrålade celler till angränsande åskådarceller, vilket resulterar i induktion av DNA-skador i åskådarcellerna. Dessa effekter, vare sig de medieras av förbindningskommunikation eller extracellulär sekretion, moduleras signifikant av COX-2 (figurerna 1, 2, 3). Det är uppenbart att uttrycket av skadliga åskådareeffekter påverkar det långsiktiga resultatet av terapeutisk bestrålning.

Inte oväntat ersatte effekterna som spridits genom gapövergångar de som sprids genom extracellulär utsöndring (figur 1), eftersom denna typ av kommunikation överträffar barriären som presenteras av det mellanliggande plasmamembranet. Dessa resultat bygger på en mängd bevis som visar att strålningsskada sträcker sig från de bestrålade till icke-bestrålade cellerna i en exponerad cellpopulation. Specifikt avslöjar våra data den nya upptäckten att storleken / naturen hos effekterna som kommuniceras från bestrålad tumör till normala celler är beroende av permeabiliteten hos kanalerna som kopplar dessa celler ihop (figur 1 och 3). Medan inducerbart uttryck av Cx26-kanaler förökade strålningseffekter som resulterade i överskott av DNA-skador i åskådarceller, hjälpte intercellulär kommunikation genom Cx32-kanal att förhindra uttrycket av en sådan effekt (figur 1A och B). Tidigare studier har visat att beroende på deras isoformkomposition kan connexinkanaler skilja mellan mycket likadana andra budbärare (t.ex. cAMP och cGMP och bland inositoltrifosfater) (Harris, 2001). Den minskande effekten av Cx32-kanaler kan bero på förbättrad eller reducerad permeabilitet för vissa signalmolekyler. Räddningsfaktorer kan också kommuniceras från åskådaren till de bestrålade cellerna, vilket skulle motverka utbredningen av signalmolekyler som leder till skadliga åskådarsvar. Detta utesluter emellertid inte en roll för involvering av Cx32-effekter som är oberoende av övergripande kommunikation, inklusive utsöndring av skyddande molekyler. Specifikt skulle experiment där HeLa Cx26-celler eller HeLa Cx32-celler är odlade med AG1522-celler där Cx26 eller Cx32 slås ned skulle belysa specificiteten hos dessa Cx i RIBE och de sätt på vilka de förmedlar deras effekter.

I likhet med gapskorsningar påverkar hemi-kanaler också fysiologiska processer som påverkar överlevnaden av celler (Harris, 2001). Våra resultat stöder konceptet att de skadliga åskådareffekterna som sprids av bestrålade HeLa-celler som uttrycker Cx26 beror på detta proteins roll i bildandet av övergångskanaler och inte hemi-kanaler. Inkubering av bestrålade och sammanhängande åskådarceller med gap-korsningsinhibitorn AGA (Gaillard et al, 2009) och inte hemi-kanalinhibitorn La 3+ (50 μM ), hämmade induktionen av DNA-skada i åskådarceller (figur 2) . Det är uppenbart att ytterligare experiment som undersöker högre koncentrationer av La 3+ (Wang et al, 2013) kan ge olika resultat; tolkningar av resultaten kan emellertid vara komplicerade på grund av toxiska effekter av de högre koncentrationerna. Dessutom skulle effekterna av AGA på åskådareeffekter inducerade i AG1522-celler samkulturerade med bestrålade HeLa-förälderceller (bristfällig kommunikation i gap-junction) vara informativa; avsaknad av en effekt på storleken på åskådarsvaret skulle stödja att hämning av mikronukleusinduktion i åskådare AG1522-celler samkulturerade med bestrålade HeLa Cx26-celler i närvaro av AGA berodde på hämning av förbindningskommunikation. Våra resultat har framträdande visat att effekterna medierade genom att inducera Cx26-uttryck i HeLa-celler påverkades starkt av COX-2-nivå. COX-2 knockdown minskade signifikant graden av skadliga åskådareeffekter som spridits från bestrålade HeLa Cx26-celler (figur 3C och D).

Tidigare studier visade att COX-2 är en viktig mediator för åskådareeffekter (Zhou et al, 2005). Resultaten i figur 3 stödjer dessa fynd och visar att COX-2 modulerar åskådareffekter medierade av både extracellulär sekretion och gapskorsningar. I bestrålade HeLa-förälderceller utan funktionell Cx upphävde nedreglering av COX-2 uttrycket av skadliga åskådareeffekter som observerades vid 24 timmar av kokultur (figur 3A och B). I bestrålade HeLa-celler som uttrycker Cx26 påverkade COX-2-knockdown kraftigt induktionen av mikronuklei i åskådarceller. Intressant nog sjönk basalnivån av COX-2 i HeLa-celler inducerade för att uttrycka Cx26 (kompletterande figur 2), och COX-2-nedslagning påverkade uttrycket av mediatorer för den åskådande effekten, nämligen p38 MAPK och NF- K (figur 6 ).

I motsats till HeLa Cx26-celler hade knockdown av COX-2 i HeLa Cx32-celler ingen modulerande effekt på åskådarsvar bedömda vid 6 timmar eller 24 timmar av kokultur; det fanns ingen induktion av mikrokärnor i åskådare AG1522-celler samkulturerade med bestrålade HeLa Cx32-celler som uttrycker normala eller reducerade nivåer av COX-2 (figur 3). Avsaknaden av en effekt antyder att räddningsrollen för Cx32-kanaler är oberoende av COX-2, eller att effekterna medierade av dessa kanaler blockerar COX-2-effekt (er) som leder till mikronukleusbildning i åskådarceller.

Våra resultat visade också att COX-2 är avgörande för att förmedla icke-målinriktade effekter när de moduleras på nivån för de åskådande cellerna. Motståndare HeLa-föräldrarceller med COX-2-knockdown som delade medium med koktodlade bestrålade HeLa-förälderceller med normalt COX-2-uttryck uppvisade inte en ökning i mikronukleusbildning jämfört med respektive kontroll (kompletterande figur 3).

Medan övergripande utbredning av strålningsinducerade effekter som förbättrar celldödandet av tumörceller ökar den terapeutiska vinsten (Autsavapromporn et al, 2011), kan spridning av effekter som förbättrar genomisk instabilitet i avkomma av normala åskådarceller orsaka sekundära skadliga effekter. Även om knockdown av COX-2 i bestrålade HeLa Cx26-celler (klon 7) dämpade skadliga effekter bedömdes vid 6 timmar eller 24 timmar i AG1522-åskådarceller, visade avkommarna av de åskådare signifikant förbättring i spontan mikronukleosbildning 20 populationsfördubblingar senare (figur 7) . I motsats härtill visade inte avkommet från åskådare från AG1522 som kokades med bestrålade HeLa Cx26-celler med normal COX-2-nivå en sådan persistent skadlig effekt (figur 7). Troligtvis bidrog nivån av stress som kommunicerades från de senare cellerna till de åskådare kort efter bestrålning till de drabbade åskådarnas död eller hämmade deras spridning permanent. Å andra sidan är uppkomsten av en betydande del av celler som har mikronuklei bland avkommet av åskådare som uppenbarligen inte påverkades kort efter kokultur (dvs AG1522-celler kokt med bestrålade HeLa Cx26 knockdown-celler) överensstämmer med ackumulerade förändringar i dessa celler. Våra tidigare studier visade att avkommor från åskådare från kulturer exponerade för mycket låga medelabsorberade doser av tätt joniserande strålning upplever störningar i oxidativ metabolism manifesterats i minskad antioxidantpotential, minskad akonitasaktivitet och ökad nivå av oxiderade proteiner (Buonanno et al, 2011) .

Connexins är kända för att interagera i plasmamembranet med andra kopplingsproteiner, enzymer, strukturella proteiner och andra molekyler (Harris, 2001). Vår studie visar att dessa interaktioner påverkas av COX-2-knockdown. Specifikt reducerades den fysiska interaktionen av Cx26 med MAPKKK MLT i plasmamembranet drastiskt (figur 5). MAPKKK deltar i många funktioner, inklusive kontrollskador för DNA-skador och apoptos. Det är viktigt att det involveras i aktiveringen av p38 MAPK att vi och andra har visat sig vara involverade i joniserande RIBE (Azzam et al, 2002; Asur et al, 2010; Guo et al, 2013). Påpekande reglerar p38 MAPK COX-2-aktivitet (Hei, 2006), och fosforylering av connexin av MAPK eller andra kinaser reglerar gap-junction-montering och rollen för Cx i spridning och i andra fysiologiska vägar (Solan och Lampe, 2005). Det är därför attraktivt att spekulera att den minskade interaktionen mellan Cx26 och MAPKKK kan vara en kritisk länk i övergången mellan connexin och COX-2.

Sammanfattningsvis visar denna studie att flera mekanismer deltar i spridningen av stressande effekter från bestrålade till åskådande celler. När celler kan kommunicera genom direkta och indirekta lägen dominerar det mest effektiva läget (dvs. förbindningskommunikation) (figur 1 och 2). Medan olika signalmolekyler kan kommuniceras via extracellulär sekretion eller förbindningskommunikation verkar en vanlig moduleringseffekt involvera COX-2-aktivitet: COX-2 modulerar åskådarsvar på nivån för både de bestrålade och åskådande cellerna (figur 1, 2, 3, Kompletterande figur 3). Viktigare är funktionell koppling mellan HeLa Cx26-celler och AG1522-fibroblaster avsevärt försenad efter COX-2-nedslagning (figur 4); huruvida detta beror på förändrad fosforylering av Cx26 återstår att undersöka. Att karakterisera de temporära interaktioner av Cx med partnerkinaser / fosfataser i kontroll, bestrålade och åskådande celler med normala eller COX-2-knockdownnivåer kommer sannolikt att ge ytterligare ledtrådar till vägarna som reglerar intercellulär kommunikation genom gapskorsningar. Sådana studier kommer sannolikt att avslöja att olika proteininteraktioner inträffar med olika Cx som en funktion av tiden efter behandlingen. Tillsammans kommer dessa studier, och deras expansion till intakta vävnader / organ, att bidra till en ökad förståelse av icke-målinriktade svar i hela det biologiska systemet och genom att följa de försvagande patologierna som uppstår efter cancerterapi.

Förändra historien

Kompletterande information

Bildfiler

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

  3. 3.

    Kompletterande figur 3

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figurlegender

    Detta arbete publiceras under standardlicensen för att publicera avtal. Efter 12 månader blir arbetet fritt tillgängligt och licensvillkoren byter till en Creative Commons Erkännande-Icke-kommersiell-Dela Lika 3.0 Unported-licens.

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på webbplatsen British Journal of Cancer (//www.nature.com/bjc)