Koncentrationsminneberoende synaptisk plasticitet hos en smakkrets reglerar saltkoncentrationens kemotaxi i caenorhabditis elegans | naturkommunikation

Koncentrationsminneberoende synaptisk plasticitet hos en smakkrets reglerar saltkoncentrationens kemotaxi i caenorhabditis elegans | naturkommunikation

Anonim

ämnen

  • Djurens beteende
  • Gustatory system
  • Lärande och minne

Abstrakt

Det är dåligt förstått hur sensoriska system memorerar intensiteten hos sensorisk stimulans, jämför den med en nyavkänd stimulans och reglerar orienteringsbeteendet baserat på minnet. Här rapporterar vi att Caenorhabditis elegans memorerar miljösaltkoncentrationen under odlingen och uppvisar en stark beteendepreferens för denna koncentration. Den högersidiga amfid-gustatoriska nerven, känd som ASER, avkännar i saltkoncentrationen, och denna information överförs till de postsynaptiska AIB-interneuronerna endast i saltkoncentrationsområdet som är lägre än odlingskoncentrationen. Inom detta område migrerar djur mot högre koncentration genom att främja vändbeteende vid minskningar i saltkoncentrationen. Dessa observationer tillhandahåller en mekanism för att justera orienteringsbeteendet baserat på minnet av sensorisk stimulans med hjälp av en enkel neuralkrets.

Introduktion

Alla levande djur har förmågan att söka optimala omgivningsförhållanden. Ett sådant beteende kräver att memorera intensiteten hos sensorisk stimulans som är förknippad med gynnsamma förhållanden, erkänna de spatio-temporala förändringarna av stimulansintensiteten under nuvarande förhållanden, jämföra den med den memorerade stimulansintensiteten och reglera motorutgången för att generera en rörelse mot en föredragen riktning. I de flesta sensoriska system har emellertid hur stimulansintensitet lagras och hur distinkta orienteringsbeteenden genereras beroende på minnet har undersökts dåligt.

Natriumklorid identifierades som ett kemoattractant för C. elegans 1 . Baserat på denna uppfattning har mekanismerna för saltkemotaxi undersökts i årtionden. Amfidsmak-neuroner ASE, som består av två morfologiskt symmetriska nervceller till vänster (ASEL) och höger (ASER), har en dominerande roll i kemotaxi till NaCl och andra oorganiska salter 2, 3, 4 . Kalciumavbildningsexperiment visade att dessa neuroner är funktionellt asymmetriska: ASER depolariseras av minskningar i saltkoncentrationen, medan ASEL svarar på ökningar 5 . Eftersom aktivering av ASER och ASEL främjar omdirigering av svängar respektive framåt rörelse, föreslogs det att höger- och vänsterneuronerna har distinkta roller men agerar i samverkan för att migrera upp saltgradient 5 . Genom en annan rad studier av migrationsbeteenden har två distinkta beteendemekanismer som driver djur mot högre saltkoncentration hittills karakteriserats (se nedan) 6, 7 . Trots dessa kunskapsuppsättningar har de fysiologiska och mekanistiska egenskaperna för informationsflödet för saltkemotaxis nedströms de sensoriska neuronerna inte varit uppenbara, eftersom ASEL och ASER bildar synapser på överlappande mål (fig. 1a).

Image

( a ) Ett diagram över ASE-saltavkännande nervceller och nedströms internuroner. Djärva pilar anger anslutningar med mer än fem synapser 19 . ( b ) Förfarande för den saltkemotaxisanalys som användes i denna studie. N anger antalet djur inom området som anges i parentes. ( c ) Representativa banor för djur av vildtyp som odlades vid olika NaCl-koncentrationer och testades på plattorna med en NaCl-gradient från 35 till 95 mM. Grafer visar skärningspositionerna mellan bana och saltgradienten (gul streckad linje). Medel ± sem; n = 4 analyser. ( d ) Kemotax av vild typ på testplattorna liknande den i b, till höger, med olika bakgrund NaCl-koncentrationer. Saltgradienter genererades med agarblock som innehöll 150 mM (för högre koncentration) och 0 mM (för lägre koncentration) NaCl, som inte hade ändrats från de som användes i c (se Metoder för detaljer). Medel ± sem; n = 6 analyser. ( e ) Förändringar av den föredragna odlingskoncentrationen. Vilda djur odlades vid antingen 25 eller 100 mM NaCl och överfördes till 100 mM eller 25 mM, ömsesidigt eller hölls i samma koncentration. Chemotaxis-analyser utfördes vid angivna tidpunkter med användning av standardprovplattor som i c . "naivt" representerar djur före överföring. Medel ± sem; n = 4 analyser.

Bild i full storlek

Samtidigt har vi tidigare visat att parning av svält och exponering för NaCl orsakar inlärning av salt undvikande i C. elegans 8 . Insulinsignaleringsvägskomponenterna, DAF-2-insulinreceptor, AGE-1 fosfoinositid 3-kinas och AKT-1 AKT-kinas, krävs i ASER för denna inlärning 9 . Aktivering av Gq / DAG / PKC-signalvägen bestående av EGL-30 Gq, diacylglycerol (DAG) och PKC-1 (även känd som TTX-4), ett proteinkinas C-e isoform som tros verka nedströms om Gq, motverkar insulinsignalering och främjar attraktion till salt 10 . En liknande svältberoende modulering av saltkemotaxi som kallas gustatory plasticity har också rapporterats 11 . I detta beteende har ASH-neuroner, ett par polymodala sensoriska nervceller som driver undvikande av hög osmolaritet 12, 13, en roll i att undvika salt 11, 14 . Således kan kemotaxi till salt i C. elegans förändras av tidigare erfarenhet av svält.

Här tillhandahåller vi bevis på att kemotaxi till NaCl av välfodrade djur också är ett lärt beteende hos C. elegans . Välfodrade djur vandrar upp och ner saltgradient mot koncentrationen av tidigare odling. En neural mekanism som genererar erfarenhetsberoende växling av migrationsförspänning tillhandahålls.

Resultat

C. elegans attraktion mot NaCl-odlingskoncentration

För att observera föredragna saltkoncentrationer av C. elegans utvecklade vi en beteendeanalys där vuxna djur odlas under definierade koncentrationer av NaCl och deras beteende undersöks därefter på en NaCl-gradient över ett brett koncentrationsintervall, vanligtvis sträcker sig från 35 till 95 mM ( Fig. Ib och kompletterande Fig. S1). Vi fann att vildtyp C. elegans migrerar till saltkoncentrationen där den har odlats med gott om mat (Fig. 1c, d, kompletterande Fig. S2, och se Metoder för detaljer). Företräde för en viss saltkoncentration är plast och djur anpassar sig till en ny koncentration inom några timmar (fig. 1e). Intressant nog undviker djur saltkoncentrationen, som de har upplevt under svältförhållanden (kompletterande bild S3a – c). Således påverkas saltkemotaxi av C. elegans av både saltkoncentrationerna av för-analysodling ( C cult ) och nuvarande miljö på testplattan ( C- test ). Fed djur rör sig upp saltgradient när C kult > C test och ner gradienten när C kult < C test ; detta förhållande är omvänd hos svälta djur.

Migrering till lägre koncentrationer är troligtvis inte ett osmotiskt undvikningsbeteende eftersom saltkoncentrationerna som används i denna studie är mycket lägre än de som framkallar osmotiskt undvikande 11, tillsats av osmolyter i odlingsplattorna istället för NaCl påverkar inte kemotaxi till NaCl (kompletterande Fig. S4a) och kemotaxis till C- kult kvarhålls i mutanter som är defekta i osmotisk respons, osm-9 och osm-10 (en TRPV (transient receptorpotential vanilloid) -kanal och ett nytt protein konserverat i Caenorhabditis- arter, båda erforderliga för osmosensorisk signalering i ASH-neuroner) (Kompletterande Fig. S4b). Dessutom beror inte beteendeförändringen på en icke-specifik effekt på kemosensering eller total rörlighet eftersom kemotaxis till luktämnen inte påverkades av C cult (kompletterande fig. S5).

Att vrida förspänningen regleras av saltkoncentrationshistoriken

Två beteendestrategier är kända för att reglera rörelse av C. elegans under saltkemotaxi. Den första är klinokinesis, även kallad piruettstrategin, där migration styrs av partisk slumpmässig promenad 6 . I denna mekanism ökar frekvensen för omdirigerande svängar, eller piruetter, när tidsderivatet för saltkoncentration är negativt, medan rörelse mot högre koncentrationer upprätthålls genom undertryckning av svängar (Fig. 2a, till vänster). Den andra mekanismen är klinotaxis, även kallad weathervane-mekanismen, i vilken djur sakta kröker sig mot föredragna riktningar (Fig. 2a, till höger) 7 . Båda dessa mekanismer stod ursprungligen för den totala migrationen mot högre saltkoncentrationer i standardformat för kemotaxi.

Image

( a ) Beteendestrategier hos djur vid kemotaxi: klinokinesis (vänster) och klinotaxis (höger). ( b ) Bias of klinokinesis (vänster) och klinotaxis (höger) representerade av pirouetteindex respektive weathervane index. Positiva index indikerar migrationsförspänning mot högre saltkoncentrationer och negativa index indikerar migration mot lägre koncentrationer. Resultat av djur av vildtyp och ASER. n ≥9 analyser; Två-tailed t- test. ( c ) Sannolikhet för djurfördelning under 250–500 s kemotaxitester. Övre raden, resultat från riktiga djur; andra raden, simulering baserad enbart på klinokinesis-mekanism; tredje raden, simulering baserad enbart på klinotaxismekanismen; nedre raden, simulering baserad på båda mekanismerna. Vänster kolumn, resultat från djur som odlats vid 25 mM NaCl; mittpelare, 50 mM; höger kolumn, 100 mM.

Bild i full storlek

Baserat på våra observationer om att C. elegans i själva verket kan migrera mot högre eller lägre saltkoncentrationer beroende på förhållandet mellan C- kult och C- test, analyserade vi kvantitativt djuren beteende och frågade hur kemotaxi till C- kult regleras av dessa två mekanismer, eller med en ny mekanism såsom ortotaxi, i vilken djurens hastighet regleras av stimulansintensitet 15 . När kultivering av saltkoncentration var högre än testkoncentrationen ( C cult > C test ), var klinokinesis partisk för att driva migration mot högre koncentrationer: djur visade högre piruettfrekvens om saltkoncentrationen minskade (d C / d t <0), men de visade lägre pirouettefrekvens om saltkoncentrationen ökade (dC / d t > 0). Å andra sidan, när C cult < C- testet, vändes förspänningen av klinokinesis (fig. 2b och kompletterande fig. S6a, vänsterpaneler). Reversering av beteendestrategi hittades också i klinotaxis. Djur visade en positiv klinotaxis när C cult > C- test och negativ klinotaxis när C cult < C- test (fig. 2b och kompletterande fig. S6a, höger paneler). När C cult = C- test fanns ingen förspänning i klinokinesis men svagt negativ klinotaxis observerades (fig. 2b och kompletterande fig. S6a). Det fanns ingen uppenbar förändring i rörelseshastighet tillsammans med saltkoncentration oavsett C- kult (kompletterande fig. S6d), vilket antydde att bidraget till ortotaxi är minimal, om någon, i den aktuella kemotaxisanalysen. Datorsimulering baserat på dessa förhållanden visade att klinokinesis hade en större effekt än klinotaxis i denna analys medan beteendet bäst återges med båda mekanismerna som verkar tillsammans (fig. 2c). Dessa resultat indikerar att utfodrade djur migrerar mot både högre och lägre koncentrationer genom att vända motorutgången beroende på relativa saltkoncentrationer mellan C cult och C- test .

Svält ändrar också egenskaperna hos klinokinesis och klinotaxis. Klinokinesis förspänning vändes grovt efter 6 timmar av svält (kompletterande figurer S3d och S6b). Därför förändrades förspänningen beroende på relativa saltkoncentrationer mellan C cult och C- test, men i motsatta riktningar jämfört med utfodrade förhållanden. Förspänningen av klinotaxis minskades allvarligt men omväntes inte efter svält (kompletterande figurer S3d och S6b). Dessa resultat liknar kvalitativt den tidigare observationen av svältberoende salt undvikande 7, med några mindre skillnader förmodligen på grund av skillnaderna i testförhållanden.

En central roll av ASER vid koncentrationsberoende kemotaxi

Vi frågade vilka neuroner som är ansvariga för beteendet (Fig. 3a). Förlust av che-1- transkriptionsfaktor, som krävs för differentiering av ASE-neuroner 16, orsakade en fullständig förlust av kemotaxi till C- kult . Funktionell inaktivering eller genetisk ablation av ASER 4 resulterade i svag positiv attraktion till salt där C- kultberoende plastisitet förloras ( gcy-22 och ASER (-) i fig. 3a). I enlighet med detta var förspänningen av klinokinesis något positiv vid varje odlingskoncentration, medan klinotaxis förspänning förlorades fullständigt i ASER-ablaterade djur (fig. 2b och kompletterande fig. S6c). Å andra sidan försvagade abelering av ASEL beteendevetenskapen, men djuren migrerade fortfarande upp och ner saltgradient (ASEL (-) i fig. 3a). Dessa resultat visar att ASER är viktigast för både att flytta upp och ner saltgradient mot C kult .

Image

( a ) Chemotaxis av ASE-mutanter. ASER svarar inte på salt i mutanterna av ASER-uttryckt guanylylcyklas gcy-22 (ref. 4). Se huvudtexten för andra stammar. Medel ± sem; n ≥6 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, annorlunda än vildtyp som odlas vid samma tillstånd; Dunnett test. ( b ) Chemotaxis av dyf-11 och dess cellspecifika räddningslinjer. Medel ± sem; n = 10 analyser; (**) P <0, 001, skiljer sig från vild typ med två-tailed t- test; (+) P <0, 01, (++) P <0, 001, olika från dyf-11- kontroll med Dunnett-test. ( c ) Avvikande stimulering av ASER förändrar den föredragna saltkoncentrationen. Chemotaxistest utfördes med eller utan 5 μM capsaicin inkluderade i testplattorna. Medel ± sem; n ≥6 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001; Tukey test.

Bild i full storlek

Därefter undersökte vi om ASER är tillräckligt för beteende genom cellspecifik återhämtning av sensorisk input (Fig. 3b). dyf-11 kodar en komponent i ciliärtransport, och på grund av frånvaro av sensorisk cilia är dyf-11- mutanterna allvarligt försämrade vid avkänning av kemikalier 17 . Cellspecifikt uttryck av dyf-11- komplementärt DNA (cDNA) i ASER räddade kemotaxi helt till C- kult . Sammantaget drar vi slutsatsen att input till ASER är nödvändigt och tillräckligt för beteendet: en enda sensorisk neuron ASER kan instruera djurets migration både upp och ner saltgradient.

Om ASER-neuron ensam kan driva kemotaxis till C- kult, bör modulering av ASER-aktiviteten förändra saltkoncentrationspreferensen. Faktum är att långvarig aktivering av ASER under kemotaxisanalys med TRPV1 (transient receptorpotential vanilloidreceptor 1, även känd som VR1), en katjonisk katjonkanal som öppnats av capsaicin 5, 18, förändrade djurens föredragna saltkoncentration mot högre saltkoncentrationer ( Fig. 3c).

Synaptisk plasticitet uppstår mellan ASER och AIB

Hur kan ASER och dess neurala kretsar nedströms koda memoriserade saltkoncentrationer och generera dubbelriktat beteende beroende på tidigare erfarenheter? Vi tog upp denna fråga genom att undersöka om svaren från dessa neuroner förändras beroende på C- kult, genom att övervaka den intracellulära kalciumdynamiken med användning av kalciumindikatorn G-CaMP 18 . ASER-svar på förändring av saltkoncentration från 50 till 25 mM var större hos djur som odlades vid högre saltkoncentrationer, inom intervallet av C- kult mellan 0 och 50 mM, men storleken på svaren mättade vid högre C- kult (fig. 4a och Kompletterande tabell S1). Därefter undersökte vi svar från AIB-interneuroner, som är direkt innerverade av ASER (Fig. 1a) 19 . Vi har nyligen funnit att AIB-neuroner aktiveras genom minskning av saltkoncentrationen och responsen minskas efter långvarig exponering för salt under svält 18 . I den aktuella analysen aktiverades ett NaCl-nedsteg från 50 till 25 mM AIB efter odling vid 50 mM eller högre, men inte efter odling vid 25 mM eller lägre (fig. 4b). Dessa resultat, tillsammans med experiment med olika stimuluskoncentrationer (kompletterande fig. S7 och kompletterande tabell S1), indikerade att storleken på kalciumrespons moduleras av saltupplevelsen i både ASER och AIB. ASER visade graderade svar enligt C- kulturen . Undantag var fallen där NaCl avlägsnades fullständigt (från 25 till 0 mM) och de som noterats ovan ( C cult ≥50 mM i fig. 4a). Under dessa förhållanden kanske fluorescensintensiteten inte är proportionell mot cellulära svar. Å andra sidan svarade AIB tydligt när C- kult var högre än stimuluskoncentrationen, men de svarade inte när C- kult var lägre än stimuluskoncentrationen. Detta neuronala svar parallellt med beteendet: djur svarar på minskningar i saltkoncentrationen genom ökad vändning endast när C cult > C- test (kompletterande fig. S6a).

Image

( a, b ) Kalciumrespons av ASER ( a ) och AIB ( b ) av vilda djur till ett NaCl-nedsteg från 50 till 25 mM (spår). Genomsnittliga fluorescensförändringar under 5 s (ASER) eller 25 s (AIB) efter stimulering (stapeldiagram). Skuggad region runt responskurvan och felstegen representerar sem Antalet testade djur för varje tillstånd anges i parentes. Statistik för ASER-svar i panel a är: (*) P <0.01; Tukey test; detaljer visas i tilläggstabellen S1. Statistik för AIB-svar i panel b är: (*) P <0.01, (**) P <0.001, (NS) inte signifikant; Mann – Whitney U- test jämfört med förestimulering. ( c - e ) Vändningsbeteenden som framkallas genom optisk stimulering av ASER ( c, d ) eller AIB ( e ) av ChR2. AIB-internuroner avlägsnas i d . Djur odlades vid de angivna förhållandena och upplystes med blått ljus (blå vertikala linjer) på agarplattor med 50 mM NaCl (överst). Stapeldiagram visar genomsnittligt vridfrekvens under perioder före och efter belysning (botten). Medel ± sem; n ≥6 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, (NS) inte signifikant; två-tailed t- test.

Bild i full storlek

AIB får synaptiska ingångar från många sensoriska nervceller, men vi resonerade att plasticiteten hos neuronala svar sannolikt är beroende av ASER eftersom input från ASER är tillräckligt för kemotaxi till C cult . För att testa detta utförde vi kalciumavbildning av ASER och AIB hos dyf-11- mutanter, som har försämrat sensorisk cilia. I dyf-11- mutanter var stimulus-framkallade kalciumrespons små och den C- kult- beroende plastisiteten avskaffades fullständigt i både ASER och AIB (kompletterande fig. S8a). Hos djur vars ASER enbart räddades återställdes svaret från ASER helt. Det ursprungliga kalciumresponset hos AIB återställdes också för att vara jämförbart med det av vild typ men det bibehölls inte, vilket indikerar att det långvariga svaret kräver insatser från andra neuroner än ASER. Det är viktigt att den C- kultberoende beroende av AIB-svar var väsentligen densamma som vild typ, vilket visar att plastisiteten hos AIB-svar beror på ASER (kompletterande fig. S8b).

Aktivering av AIB utlöser vändningar och vänder 20, 21 och kommer sannolikt att främja riktningsförändringar under kemotaxi 22 . För att undersöka om ASER- och AIB-framkallad vändning faktiskt moduleras av saltkoncentrationsupplevelse, tog vi ett optogenetiskt tillvägagångssätt genom att uttrycka channelrhodopsin-2 (ChR2) i dessa neuroner. ChR2 är en ljusgrindad katjonskanal och dess aktivering genom ljusbelysning depolariserar nervceller 23 . Aktivering av ASER genom ChR2 främjade vändning när saltkoncentrationen av odlingsplattan var över testplattans ( C cult ≥ C- test ), medan det undertryckte vändningen när C cult < C- testet (Fig. 4c). Å andra sidan främjade aktivering av AIB vändning oberoende av C- kult (fig. 4e). Om AIB-neuroner förmedlar information från ASER, kan ablation av AIB påverka sannolikheten för att ASER-framkallade vändningar. Förlust av AIB resulterade i en total minskning av piruettfrekvens: det basala piruettindexet för 50 mM NaCl-odlade djur var 0, 043 ± 0, 001 i vildtyp och 0, 022 ± 0, 001 i AIB-ablaterade djur ( n ≥16, medel ± sem, P < 0, 001 med två-tailed t- test, se Metoder för detaljer). När ASER stimulerades i AIB-ablaterade djur observerades fortfarande ASER-framkallande främjande av vändning under C cult > C testförhållanden men storleken var mindre. Å andra sidan eliminerades förändringar av vändhastighet under betingelserna för C cult = C- test och C cult < C- test (fig. 4d). Dessa resultat indikerar att den ASER-framkallade förändringen i vändningssannolikhet åtminstone delvis regleras genom AIB och den synaptiska förbindelsen mellan ASER och nedströms internuroner är en av platserna för modulering genom saltkoncentrationsupplevelse.

Kvantitativa beteendeanalyser av AIB-ablaterade djur avslöjade att även om AIB tydligen var involverat i reglering av piruettfrekvens, var klinotaxis intakt i AIB-ablaterade djur (Kompletterande Fig. S9a). Dessutom påverkade ablationen av AIB knappt kemotaxi i den aktuella analysen (kompletterande fig. S9b). Dessa resultat antyder att informationen från ASER överförs också av internuroner som verkar parallellt med AIB vid saltkemotaxi (se Diskussion).

Eftersom ASER enbart kan reglera hela orienteringsbeteendet på saltgradient (Fig. 3b), är det möjligt att ASER också medierar beteendesponsen för att öka saltkoncentrationen. I enlighet med denna idé går klinokinesisförspänningen vid ökning av saltkoncentrationer helt förlorad i ASER-ablaterade djur (kompletterande figur S6c). Ökning av saltkoncentration avaktiverar ASER 5 . Stegvis ökning av saltkoncentrationen resulterade faktiskt i en snabb minskning av G-CaMP-fluorescens i slutet av stimuleringen i våra avbildningsexperiment (Fig. 4a). Svaren var emellertid mindre framträdande när saltuppsteg levererades efter 8 min inkubation vid en konstant saltkoncentration (kompletterande fig. S7d), vilket förhindrade ytterligare analyser av svar på uppsteg (se diskussion).

Gq / DAG / PKC-signalering i ASER reglerar migrationsförspänning

För att se om insulinsignaleringen och Gq / DAG / PKC-signaleringen verkar vid odlingskoncentrationsberoende kemotaxisplastisitet undersökte vi saltkemotaxi av mutanterna efter odling under utfodrade och svältande förhållanden. Mutanter av daf-2 , ålder-1 och akt-1 , liksom ins-1 , en förmodad ligand för DAF-2, var defekta för att undvika C- kult efter svält. Men attraktionen mot C- kult i samband med mat var mindre försämrad hos dessa mutanter (Fig. 5a). Dessa resultat indikerar att insulinvägen verkar för att växla riktningen för saltkemotaxi efter svält. Aktivering av Gq / DAG / PKC-vägen genom tillsats av en DAG-analog phorbol 12-myristat 13-acetat till odlingsmediet eller genom en förmodad förstärkning av funktionsmutation i egl-30 (ref. 9) resulterade i migration till högre saltkoncentrationer oavsett livsförhållanden (Fig. 5c, d). Omvänt orsakade inaktivering av denna väg genom en nollmutation i pkc-1 migration till lägre koncentrationer (fig. 5d). I överensstämmelse med de centrala rollerna hos ASER i beteendet, cellspecifikt uttryck av en aktiverad form av PKC-1 eller inaktivering av pkc-1 i ASER efterliknade mutationerna som aktiverar eller inaktiverar banan, respektive (Fig. 5e). Därför kan Gq / DAG / PKC-vägen i ASER agera för att bestämma migrationsförspänningen på saltgradient under både matade och svältande förhållanden.

Image

( a ) daf-2 (e1370) mutanter visar defekter i svältberoende modulering av saltkemotaxi. När mutanterna blir dauerlarver vid en hög temperatur, odlades djur till L4 vid 15 ° C, och överfördes sedan till 25 ° C vid vilken temperaturförhandsanalys odling och kemotaxitest genomfördes. Medel ± sem; n = 6 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, olika från vildtyp som odlas vid samma tillstånd; två-tailed t- test. ( b ) Kemotaxi av andra insulinvägsmutanter. Se huvudtexten för beskrivning av stammarna. Medel ± sem; n ≥6 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, olika från vildtyp som odlas vid samma tillstånd; Dunnett test. ( c ) Tillsats av 0, 25 mg 1 -1 phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) till odlingsmedia främjar saltattraktion. Medel ± sem; n = 6 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, annorlunda än kontroll odlad vid samma tillstånd; två-tailed t- test. ( d ) Chemotaxis av egl-30 (pe914) och pkc-1 (nj3) mutanter. Se text för beskrivning av stammarna. Medel ± sem; n ≥6 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, olika från vildtyp som odlas vid samma tillstånd; Dunnett test. ( e ) ASER-specifik aktivering av PKC-1. Medel ± sem; n = 7 analyser; (**) P <0, 001, annorlunda än kontroll odlad vid samma tillstånd; två-tailed t- test. ( f ) ASER-specifik inaktivering av pkc-1 genom cellspecifikt dubbelsträngat RNA-uttryck. Medel ± sem; n = 10 analyser; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, annorlunda än kontroll odlad vid samma tillstånd; två-tailed t- test.

Bild i full storlek

I överensstämmelse med denna idé fann vi att mutationer i fosfolipas C (PLC) -ε plc-1 förändrar saltkoncentrationspreferensen (kompletterande figur S10a och se Metoder för detaljer). En semi-dominerande mutation plc-1 (pe1237) och en reduktion av funktionsmutation plc-1 (pe1238) visade motsatta fenotyper: den föredragna saltkoncentrationen skiftades upp i pe1237 och skiftades ned i pe1238 (fig. 6a). En transkriptionell reporter av plc-1 uttrycktes i huvudkänsliga nervceller AWC, AFD, ASE, ASG och BAG, såväl som interneuroner RIF, nervcentralnervers neuron, svansneuroner och kroppsmuskler (tilläggsfigur S10b). Cellspecifika räddningsförsök visade att PLC-1 verkar i ASER men inte i ASEL eller nedströms internuroner inklusive AIB (Fig. 6b). Kalciumresponser från ASER, inklusive modulering med C- kult, var jämförbara med den av vild typ i både plc-1 (pe1237) och plc-1 (pe1238) -mutanter , vilket antydde att DAG-signalering kanske inte påverkar saltavkänning av ASER (Fig. 6c, d). Däremot ökades svar från AIB i plc-1 (pe1237) efter odling vid 0 mM (fig. 6c), medan de minskade i plc-1 (pe1238) efter odling vid 50 mM eller högre (fig. 6d). ASER-specifikt uttryck av plc-1 (+) återställde svaren från AIB i plc-1 (pe1238) -mutanter utan att påverka svaren från ASER (fig 6e). Således korrelerar egenskapen hos AIB-svar väl med det förändrade beteendet hos plc-1- mutanter. Dessa resultat överensstämmer med idén att synaptisk koppling mellan ASER och internuronerna, som moduleras av saltupplevelse av ASER, är platsen för plastisitet som ligger under kemotaxi till föredragna koncentrationer. Chemotaxis-fenotyp av plc-1- mutanterna var svagare jämfört med egl-30 Gq eller pkc-1 nPKC-mutanter, vilket kan vara antingen för att vi använde svaga mutanter av plc-1 (nollmutanter av plc-1 är dödliga 24 ) eller en annan PLC, såsom egl-8 , verkar parallellt med plc-1 .

Image

( a ) Saltkemotaxi av plc-1- mutanter. Se text för beskrivning av mutanterna. Medel ± sem; n = 6 analyser; (**) P <0, 001, skiljer sig från vild typ; Dunnett test. ( b ) Chemotaxis av cellspecifika räddningslinjer för plc-1 (pe1238) . Medel ± sem; n ≥6 analyser; (++) P <0, 001, (NS) inte signifikant, skiljer sig från plc-1 (pe1238) kontroll; Dunnett test. ( c - e ) Kalciumsvar från ASER (vänsterpaneler) och AIB (högra paneler) i plc-1 (pe1237) ( c ), plc-1 (pe1238) ( d ) och plc-1 (pe1238) djur vars ASER var endast räddats av plc-1 cDNA ( e ). Genomsnittliga fluorescensförändringar under 5 s (ASER) eller 25 s (AIB) efter stimulering visas i stapeldiagrammen. Skuggad region runt responskurvan och felstegen representerar sem Antalet testade djur för varje tillstånd anges i parentes. Statistik för ASER-svar visas i tilläggstabellen S1. Statistik för AIB-svar är: (+) P <0, 05, (**) P <0, 001, (NS) inte signifikant; Mann – Whitney U- test jämfört med förestimulering för paneler c - e .

Bild i full storlek

Diskussion

Att leta efter ett acklimatiserat miljötillstånd observeras vanligtvis i anpassningsbeteenden hos vandrande djur. Här visade vi att C. elegans migrerar till saltkoncentrationen där den tidigare har matats. En sådan beteendestrategi kan vara fördelaktig för att stanna i matrik miljö eller hitta en ny matkälla i grannskapet. Efter odling vid högre koncentrationer ( C cult > C- test ) aktiverar minskningar i saltkoncentration ASER och AIB och inducerar vändningsbeteende, varigenom djuren drivs till högre saltkoncentrationer (kompletterande fig. S11), medan när djur odlades i lägre koncentrationer ( C- kult < C- test ), stimulering av ASER-undertryckta riktningsförändringar (Fig. 4c). Eftersom den ASER-framkallade stimuleringen av att vända i C- kulturen > C -testbetingelserna fortfarande inträffade i AIB-ablaterade djur (fig. 4d), medieras information av icke-karakteriserade neuron (er) som inerveras av ASER såväl som AIB (kompletterande fig. S11 ). Dessutom krävs inte AIB för klinotaxis under de aktuella testförhållandena (tilläggsfigur S9a). Dessa observationer indikerar att bearbetning av saltinformation inte förlitar sig på en enda internuron-klass utan bearbetas av en parallell krets som vid olfaction eller termosensation i denna organisme 22, 25 .

ASER känner uppenbarligen inte bara minskning utan också ökning i saltkoncentrationer som manifesteras av en minskning av intracellulärt kalciumnivå 5, och våra beteendeanalyser indikerade att ASER är viktigt för att beteendemässigt svar ska öka, liksom minskning av saltkoncentrationer (tilläggsfigur S6a, c). Vi kunde dock inte upptäcka tillräckliga förändringar i ASER-kalciumnivåerna (kompletterande fig. S7d), vilket förhindrade ytterligare analyser av aktiviteterna i nervkretsar som är kopplade till beteendet hos djur som migrerar upp lutningen. Detta kan bero på skillnaden i kalciumindikatorer eftersom GCaMP2 som användes i den aktuella studien har en större Kd än YC2.12 som användes i den tidigare studien 5 och därför kan vara mindre känslig för låga nivåer av intracellulärt kalcium. Ytterligare studier behövs för att klargöra den neurala grunden för detta beteende.

Det finns slående likheter mellan kemotaxi och termotaxi, inte bara i de homoeostatiska beteendemönstren 26, 27 utan också i rollen som DAG-signalering; genetiska manipulationer som ökar eller minskar DAG-signalering i AFD-termosensoriska nervceller resulterar i migration till lägre respektive högre temperatur, 28 . DAG-vägen var också inblandad i anpassning till omgivningstemperatur genom modulering av synaptisk utgång från AFD 29 . I motorcentralneuroner i ventralen reglerar DAG positivt synaptisk frisättning genom PKC-1 och UNC-13 (refs 30, 31). I analogi kan neurotransmission mellan ASER och AIB regleras av denna väg. Det finns fortfarande en möjlighet att en tröskel i svaren från ASER växlar exciterande och hämmande överföring till postsynaptiska internuroner, vilket nyligen har föreslagits mellan AFD och AIY 32 .

metoder

Stammar och kultur

C. elegans- stammar och transgena linjer som används i denna studie anges i tilläggstabell S2. Alla mutanta stammar överskreds flera gånger med N2. Djur odlades vid 20 ° C under standardförhållanden om inte annat anges 33 . Snabbväxande E. coli NA22 användes som en livsmedelskälla i beteendestest för att undvika svält. OP50 användes för avbildningsexperiment eftersom djur som odlades med NA22 tenderade att uppvisa hög bakgrundsfluorescens i tarmen. Skillnader i bakteriestammarna påverkar inte odlingssaltkoncentrationsberoende kemotaxi (Kompletterande Fig. S2). Standardgenetikmetoder användes för att generera stammar genom kors 33 .

Beteende tester

För att utvärdera djurens beteende på saltgradient användes en modifierad kemotaxisanalys i denna studie. Djur hanterades med kemotaxibuffert (25 mM kaliumfosfat (pH 6, 0), 1 mM CaCl2, 1 mM MgS04) kompletterat med 50 mM NaCl. Testplattor framställdes såsom visas i den kompletterande fig. S1a. Bakgrundsagaren var 8, 5 cm i diameter och 1, 76 mm i tjocklek (10 ml lösning hälldes) och inkluderade 50 mM NaCl och 2% agar i kemotaxibuffert. Ovanpå plattan, två cylindriska agarblock (vardera 14, 5 mm i diameter och 5, 3 mm i tjocklek, inklusive antingen 0 mM (undersida) eller 150 mM (högre sida) NaCl och 2% agar i kemotaxisbuffert och skärs ut från en agarplatta med användning av en korkborare) placerades vid positionerna 3 cm från plattans centrum i motsatta riktningar under 18 timmar vid 20 ° C och avlägsnades strax före analysen. Denna procedur skapade en koncentrisk saltgradient på testplattan med högsta koncentration i mitten av högsaltblocket, lägsta koncentration vid motsatt sida och bakgrundskoncentration runt mitten. De faktiska koncentrationerna av kloridjon mättes med användning av en kloridelektrod (Horiba). Bakgrunden var vanligtvis 55–56 mM, 3–4 mM högre än beräknat, förmodligen på grund av spårmängden klorid i agar (//www.bd.com/ds/productCenter/) och genom uttorkning.

Djur odlades till vuxna på vanligt nematodtillväxtmedium (NGM) och överfördes sedan till NGM-plattor med olika koncentrationer av NaCl för odling av förutbestämning under 6 timmar. Femtio till tvåhundra djur tvättades ut från plattorna, placerades vid startpunkten på testplattorna (2, 5 cm från mitten) och fick köras i 45 minuter. En mikroliter vardera av 0, 5 M NaN3 upptäcktes till toppen av NaCl-gradienten och till motsatt position för att fånga djur. Antalet djur inom en 2 cm radie från mitten av varje agarblock ansågs vara lockat och antalet djur inom en 1 cm radie från startpunkten ignorerades från det totala antalet djur för att beräkna kemotaxiindex ( Fig. Ib). Indexen 1.0 och −1.0 representerar kompletta preferenser för högre respektive lägre koncentrationer, och indexet för noll representerar preferens för bakgrundskoncentrationen, lika fördelning på båda sidor eller en slumpmässig fördelning. I fig. 1d genererades saltgradienter på testplattorna som innehöll indikerade bakgrundskoncentrationer av NaCl med användning av agarblock vars NaCl-koncentrationer var oförändrade. I fig. 1e varierades varaktigheten för odlingsförväg enligt förut. I fig. 3c sattes 5 | im kapsaicin (Sigma) eller lösningsmedel ensam (0, 1% etanol) till testplattorna. I fig. 5c tillsattes 0, 25 mg 11 av PMA (Sigma) eller lösningsmedel (0, 01% etanol) för odling av förhandsanalys. I alla beteendestester utfördes minst fyra försök oberoende för varje datapunkt och resultaten validerades statistiskt såsom beskrivits i varje figur.

Chemotaxis-analyser för luktämnen (kompletterande fig. S5) utfördes enligt beskrivning 34 . Utspädningar av luktmedel i etanol var 1: 1 000 för diacetyl och bensaldehyd och ingen utspädning för 2-nonanon. Saltkemotaxitest i kompletterande fig. S5 utfördes såsom beskrivits 9 med odling av föranalys.

Kalciumavbildning

Djur som uttrycker G-CaMP i ASER eller AIB i vild typ bakgrund har tidigare beskrivits 18, 22 . Det senare var en gåva från C. Bargmann. Vi hittade inga uppenbara defekter i saltkemotaxis hos dessa djur. Reporterstammar som har särskild genetisk bakgrund genererades genom genetiska kors (kompletterande tabell S2). Avbildningsexperiment utfördes såsom beskrivits 35 med modifieringar. I korthet odlades djur på standard NGM tills ung vuxen och inkuberades ytterligare över natten på NGM med olika koncentrationer av NaCl och vars osmolaritet justerades till 350 mOsm. Djur immobiliserades sedan med en mikrofluidanordning 36 och NaCl-koncentrationssteg tillfördes till deras nässpets genom omkoppling av lösningarna (25 mM kaliumfosfat (pH 6, 0), 1 mM CaCl2, 1 mM MgS04, 0, 02% gelatin, NaCl vid indikerade koncentrationer och glycerol för att justera deras osmolaritet till 350 mOsm). Time-lapse-bilder förvärvades med ett DMI-6000B-mikroskop (Leica) utrustat med ett HCX-PL-APO 63x-objektiv (NA, 1.40), L5-filteruppsättning (en kombination av bandvägsexciteringsfilter 480/40 nm och 505 nm dikromatisk spegel, Leica) och ImagEM EM-CCD-kamera (Hamamatsu) med två bilder per sekund. Den inledande ramen för inspelningar (Time = 0 i spår) fixerades som 8 min efter borttagning av djur från odlingsplattor i hela detta papper, eftersom förlängd varaktighet för prestimulusinkubation avsevärt påverkade svarets storlek och varaktighet. Enskilda djur utsattes för enstaka inspelning och ersattes för varje experiment. Genomsnittlig fluorescensintensitet för cellkroppen beräknades genom att korrigera positionen för region av intresse med Track Objects-funktionen för Metamorph-mjukvara (Molekylära anordningar) följt av subtrahera den genomsnittliga intensiteten för en bakgrundsregion. Den genomsnittliga fluorescensen i ett fönster på 10 s (vanligtvis Time = 4–14 s) ställdes in som F 0 och fluorescensintensiteten relativt F 0 ( F / F 0) beräknades för en serie bilder. För spår var F / F0 i genomsnitt för alla djur vid varje tidpunkt. För diagram beräknades medelvärde F / FO under 5 s (ASER) eller 25 s (AIB) efter stimulering.

Analys av rörelse

Snäckspårningssystemet identifierar och spårar tiotals djur samtidigt på en testplatta och extraherar beteendeparametrar för varje djur 37 . Chemotaxis tests were prepared as described above, but only 30–50 animals were placed at the start point to reduce the chance of collision of animals. Images of the whole test plate were acquired for 30 min at one frame per second. Probability of pirouette and curving rate were calculated as described 7 . Pirouette index was defined as the difference of probability of pirouette between negative d C /d T rank and positive d C /d T rank. Weathervane index was defined as the slope of the regression line in relationship between NaCl gradient in normal direction and the curving rate. These values were calculated for each test, and average and sem were shown in figures. Concentrations of NaCl on the test plate were calculated by three-dimensional Euler's method based on Fick's low adopting D =0.000013 (cm 2 s −1 ) as diffusion constant for NaCl (Supplementary Fig. S1b). This enabled us to analyse locomotion of animals on salt gradient precisely. In Supplementary Fig. S6, pirouette frequency was calculated according to the time derivative of salt concentration by 0.1 mM s −1 bins. Curving rate was calculated according to the NaCl gradient in normal direction by 0.5 mM mm −1 bins. Bins with <20 data points were omitted from further analyses. Data from the initial 500 s were used to calculate the behavioural parameters because most of the animals migrated to C cult within the period. The trajectories of animals in Fig. 1c and Supplementary Fig. S3a were reconstructed by the tracking system by excluding those interrupted by collision of animals. Simulation of animals' behaviour was performed as described 7 except that the curving rate

Image

(change of movement direction per unit length of progression, degree mm −1 ) of the animals followed a first-order autoregression, namely

Image

where k =0.933 is a decay constant determined from the data of real animals 7, and

Image

is a Gaussian white noise whose sd was also determined from real measurements.

Optogenetics

All optical stimulation experiments were carried out in lite-1(ce314) mutants to eliminate intrinsic light response 38 . For ASER-specific stimulation, animals that harbour chromosome-integrated gcy-5 promoter-driven ChR2 transgene, Is[gcy-5p::ChR2::yfp] (90 ng μl −1 ), were used. For AIB-specific activation, animals that carry extra-chromosomal Ex[npr-9p::ChR2::yfp] (90 ng μl −1 ) were used. A cDNA clone for murine caspase-1 (ref. 37) was expressed by npr-9 promoter to ablate AIB neurons. In the resultant Is[npr-9p::casp1] strain, AIB neurons were absent in >90% of animals. Adults grown on standard NGM plates were further cultivated overnight under various concentrations of salt supplemented with 5 μM all-trans retinal (Sigma). Their behaviour was tested on a retinal-free chemotaxis plate without salt gradient. One- (for ASER) or two-second (for AIB) pulse of blue light (peak wavelength=470 nm; 190 W m −2 ) was delivered by a ring-shaped light-emitting diode light (CCS). Each animal was tested six times with a 120-s interval between each test. Locomotion was monitored by the worm tracking system. The event rate was calculated as the ratio of animals that are during pirouettes, turns or pauses at each time point. At least six independent experiments were performed for each condition.

Characterization of plc-1

plc-1(pe1237) was isolated by a genetic screen as a mutation that confers preference for high concentrations of salt 35 . We assigned the mutation to a predicted gene frm-9 /F31B12.3, which encodes a 4.1 ezrin-radixin-moesin (FERM) domain-containing protein with unknown function (WormBase Release WS230) (Supplementary Fig. S10a). Then, we obtained a deletion allele of the gene pe1238 by ultraviolet/trimethylpsoralen mutagenesis. Interestingly, pe1238 showed chemotaxis phenotype opposite to the original mutation; it preferred lower concentrations if compared with wild type (Fig. 6a). In the course of rescue experiments, we noticed that gene prediction of frm-9 is incomplete because fosmids that cover the entire frm-9 region, WRM065aD07 and WRM0620c09 failed to complement pe1238 (Supplementary Fig. S10a). Extensive reverse transcription–PCR experiments revealed that there exists a 10.6-kbp cDNA that spans from frm-9 to plc-1 /F31B12.1 (Supplementary Fig. S10a). PLC-1 regulates epidermal morphogenesis in embryogenesis and also function in spermatheca to regulate ovulation through production of inositol 1, 4, 5-triphosphate 24, 39 . plc-1(tm753) showed chemotaxis defects similar to that of pe1238 , as well as partial sterility consistent with the previous report 24 . The cDNA clone for long isoform, but not the short isoform of plc-1 , rescued the salt preference defects in plc-1(pe1238) (Fig. 6b and Supplementary Fig. S10a). These results collectively show that the newly identified isoform is required for salt chemotaxis. The amino terminal region of PLC-1 is not required for fertility and may function as a regulatory domain of the enzyme.

Molekylärbiologi

Plasmids were generated by the GATEWAY system (Invitrogen) as described 34 . Details are available at our web site ( // molecular-ethology.biochem.su-tokyo.ac.jp/Gateway/Gateway_overview1.html) Promoters for flp-6 (ref. 40), odr-2 (ref. 41), dyf-11 (ref. 17), npr-9 (ref. 42), gcy-5 and gcy-7 (ref. 43) were described previously. Structure of the cDNA for plc-1 was determined by reverse transcription of total RNA of wild type followed by 5′- and 3′- rapid amplification of cDNA ends (RACE) using primers 5′-CCGTCTAGAACTAGTCCTCCTTTTTTTTTT-3′ for reverse transcription, 5′-TAGGTACCGGTTTAATTACCCAAGTTTGAG-3′ for 5′-RACE, and 5′-CCGTCTAGAACTAGTCCTCC-3′ for 3′-RACE. To generate a destination plasmid for plc-1 , full-length cDNA was amplified using primers 5′-GTGGACTCAATGCCAACATC-3′ and ATCACTCGTGTCTGGGATCCAT. A 5.1-kbp plc-1 promoter was amplified by PCR using primers 5′-ATGTCCTTACGCCAAGCATC-3′ and AAAATTTTCAGCATTTCAAACAT. Expression constructs for dyf-11 (ref. 17), pkc-1 (ref. 10) and fluorescence reporter proteins 44 were described previously.

Transformation

Germ-line transformations were performed by standard microinjection methods 45 . Expression constructs for dyf-11 were injected at 5 ng μl −1 along with transformation marker (20 ng μl −1 ) and pPD49.26 (75 ng μl −1 ) as carrier DNA. The expression constructs for plc-1 were introduced at 100 ng μl −1 with transformation marker (20 ng μl −1 ). An empty vector was introduced in place of the expression construct in control experiments.

Cell-specific RNA interference

Hairpin-structured double-stranded RNA for pkc-1 was expressed in a cell-specific manner using the pWormgate vector 46 . A 0.86 kb of pkc-1 cDNA fragment, which corresponds to the carboxyl terminal half of PKC-1, was driven by the gcy-5 promoter for ASER-specific expression. In control experiments, an empty pWormgate vector with gcy-5 promoter was introduced. Plasmids were introduced into wild-type animals at 100 ng μl −1 along with myo-3p::venus (15 ng μl −1 ).

Ytterligare information

How to cite this article: Kunitomo, H. et al. Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans . Nat. Commun. 4:2210 doi: 10.1038/ncomms3210 (2013).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

    Supplementary Figures S1-S11 and Supplementary Tables S1-S2

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.