Avdelning av genuttrycksprofilering av receptivt endometrium avslöjar att progesteronreglerad enpp3 uttrycks och utsöndras differentiellt i glykosylerad form | vetenskapliga rapporter

Avdelning av genuttrycksprofilering av receptivt endometrium avslöjar att progesteronreglerad enpp3 uttrycks och utsöndras differentiellt i glykosylerad form | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Diagnostiska markörer
  • Infertilitet

Abstrakt

Komplexiteten hos endometrial receptivitet på molekylnivå måste undersökas i detalj för att förbättra hanteringen av infertilitet. Här avslöjade differentiellt uttryck av transkriptomer i mottagande endometrialkörtlar och stroma ektonukleotid pyrofosfatas / fosfodiesteras 3 (ENPP3) som en progesteronreglerad faktor och bekräftades med olika metoder, både på mRNA och proteinnivå. ENPP3: s involvering i embryonfästning testades i en in vitro- modell för implantation av humant embryo. Intressant nog fanns det högt uttryck av ENPP3 mRNA i stroma men inte protein. Närvaron av N-glykosylerad ENPP3 i livmodervätska i mottagningsfas hos kvinnor bekräftar dess reglering med progesteron och gör det möjligt att använda i ett icke-invasivt test av endometrial mottaglighet.

Introduktion

En betydande orsak till kvinnlig infertilitet (10–15% globalt) är misslyckandet med att upprätta en mottaglig endometrium, varvid den senare främst drivs av progesteron (P). Trots optimering av kritiska händelser inom assisterad reproduktionsteknologi överstiger graviditetstakten inte 30% 1 . Viktiga begränsningar är bristen på kunskap om implantationsprocessen, inklusive endometrial mottaglighet och brist på tillförlitlig diagnos av mottaglighet. De senaste framstegen inom omics-tekniken, antingen genom en genomisk eller proteomisk metod, har gett många molekyler som reglerats under den mottagande fasen: integriner αvp3 2, LIF, gp130 3, kärnporproteiner 4, HB-EGF 5, muciner 6, hjärta och neural crest derivat 2 7, homeobox gener 8, Annexin A2 9, Annexin IV 10, Calreticulum 11, Stathmin 1 9 och Ezrin 12, men ingen entydig mottagningsmarkör har ännu inte definierats hos människor.

Med hänsyn till endometriumets dynamiska natur förändras cellulära och molekylära signaturer snabbt på grund av hormonreglering i äggstockarna i en given menstruationscykel 13 . Provtagning av endometrial vävnad för identifiering av biomarkörer i endometrial receptivitet genom mikroarray-studier inkluderar divergerande kohorter: normo-ägglossande kvinnor 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, bördiga donatorer 23, bördigt mitt-sekretionsfaser och infertila kvinnor 24, 25, naturliga och stimulerade cykler 16, 26, och kvinnor med återkommande implantationsfel eller missfall 27, 28 . Den höga grad av heterogenicitet leder till svårigheter att härleda slutsatser för receptivgener. Tillägg till detta gjordes ovanstående studier med användning av hela endometrial vävnad, som utgör olika celltyper i förändrade förhållanden med distinkta genotypiska och fenotypiska uttryck, vilket leder till olika resultat.

Antiprogestin-mifepriston som administrerades på cykeldag LH + 2 har tidigare använts för att studera P-reglerad endometrial receptivitet 29, 30, 31 . Potentiellt kan denna metod också användas för att identifiera en möjlig biomarkör för endometrial mottaglighet. För att övervinna förvirrande faktorer såsom vävnadsvariabilitet och för att minimera variationer från ämne till ämne isolerade vi selektivt mitt-sekretorisk faskörtelepitel och stroma från fertila och infertila kvinnor genom laserupptagning av mikrodissektion (LCMD) följt av mikroarray. Resultaten bekräftades genom realtid PCR och immunohistokemi. Från våra resultat rapporterar vi här en P-reglerad molekyl, Ectonukleotid Pyrofosfatas / Fosfodiesteras 3 (ENPP3) som kan fungera som en potentiell biomarkör för progesteronreglerad endometrial receptivitet. Expression av detta glykoprotein kvantifierades också i livmodervätska med det möjliga syftet att utveckla en icke-invasiv endometrial receptivitetsanalys.

Resultat

LCMD och genuttrycksanalys

LCMD på cirka 200 celler gav minst 500 pg RNA som togs för amplifiering. Analys av mikroarray-data visade att 32 gener av 47 var uppreglerade och 15 gener nedreglerade i epitelrummet, medan i stromavdelningen 79 av 85 gener var uppreglerade och 6 nedreglerade med mifepristonbehandling (tilläggstabell) 1). Ett högre antal signifikant nedreglerade gener observerades i körtlarna jämfört med stroma med mifepristonbehandling (Fig. 1).

Gener som regleras av progesteron i endometrial körtel (G, vänster panel) och stromala (S, höger panel) avdelningar som visas med värmekartor. Genuttryck studerades i det mottagande endometriumet (C) i en icke-behandlad cykel och icke-mottagande endometrium (T) med behandlingen av progesteronreceptorantagonisten mifepriston. Varje kvinna i studien agerade som sin egen kontroll.

Bild i full storlek

Biologisk och molekylär bananalys

De 132 signifikant reglerade (upp eller ned) generna analyserades för uppströms regulatorer, kanoniska vägar och biologiska nätverk. De ledande fem kanoniska vägarna som erhölls var NRF2-medierad oxidativ stressrespons, ovariecancer-signalering, superoxidradikaler, samt prostatacancersignalering och glioblastoma multiforme signalering. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) förutspår aktivering eller hämning av uppströmsregulatorer som kan vara ansvariga för förändringar av genuttryck som observerats i det experimentella datasättet, vilket hjälper till att förstå de biologiska aktiviteterna som förekommer i vävnaderna eller cellerna. I det nuvarande datasättet förutsågs transkriptionsfaktorn Chromobox Homolog 5 (CBX5) att hämmas med en opartisk Z-poäng av -2.236 och uppströms regulatormolekyler. Kolonistimulerande faktor 2 (CSF2) och tidig B-cellfaktor 1 (EBF1) förutspåddes att aktiveras med en Z-poäng av 2, 43 respektive 2, 0.

Validering av mikroarray med realtid PCR

PCR-analys i realtid var i linje med mikroarray-studien, eftersom 13 och 11 differentiellt uttryckta gener från stromal- och epitelrummen bekräftades i båda metoderna (kompletterande tabell 2). Utsöndrad frizzled-relaterat protein 4 (SFRP4) reglerades upp med 8, 76 gånger (p = 0, 013) i stroma-avdelningen och med 16, 25 gånger (p = 0, 0001) i epitelrummet. Karboxypeptidas M (CPM) reglerades upp med 29 gånger (p = 0, 005) i stromala facket, medan Ubiquitin-Conjugating Enzyme E2E 2 (UBE2E2) uppreglerades med 7 gånger (p = 0, 024) i epitelrummet. MT1G nedregleras med 7 gånger (p = 0, 008) i stromal och 519 gånger (p = 0, 005) i epitelrum och MT2A reglerades ned med 3 gånger (p = 0, 031) i stromal och med 7 gånger (p = 0, 03) ) i epitelrum. ENPP3 var signifikant nedreglerad i både stromala (−55, 93 gånger; p = 0, 015) och epitelial (−9, 46 gånger; p = 0, 035) fack (fig 2 och 3).

Tukey plottar betydande gener av stromavdelningen som analyseras med PCR i realtid. Progesteroninhibering uppreglerade CPM och SFRP4 och nedreglerade MT1G, MT2A och ENPP3.

Bild i full storlek

Endometrialt epitelrum visade ned reglering av MT2A, MT1 och ENPP3 med hämning av P av mifepriston. Genuttryck för SFRP4 och UBE2E2 uppreglerades signifikant med hämningen av progesteron.

Bild i full storlek

Immunohistokemisk analys

Baserat på litteraturöversikten, mikroarray-uttrycksnivåer och tillgänglighet av antikroppar studerade vi proteinuttrycket för stanniocalcin 1 (STC1); Cathepsin C (CTSC); Secrteoglobin-familj 2A-medlem2 (SCGB2A2); SWI / SNF-relaterad matrisassocierad aktinberoende regulator av kromatinundfamiljen en medlem 1 (SMARCA1); högmobilitetsgrupp nukleosombindningsdomän 5 (HMGN5); och B-cell CLL / lymfom 11A (zinkfingerprotein) (BCL11A). Immunodetektion av ENPP3 observerades i alla vävnader från friska fruktbara kvinnor och skilde sig signifikant mellan grupperna. Resultaten var i linje med resultaten från mikroarrayen (Fig. 4A – C).

Uttrycket av ENPP3 observerades mycket specifikt i den apikala gränsen till körtlarna i P-dominerande mitten-lutealfas som studerades genom immunohistokemi ( A, C, D ) hos kvinnor utan mifepristonbehandling (kontroll). Nedreglering av ENPP3 observerades i endometrialkörtlar med undertryckande av progesteronverkan genom mifepristonbehandling ( B, C ). Vid endometrium hos kvinnor utan mifepristonbehandling observerades hög nivå av ENPP3 under P-uppreglerad sekretionsfas, jämfört med proliferativ fas i menstruationscykeln. Skala bar anger 50 μm.

Bild i full storlek

Uttryck av ENPP3 i endometrium

Microarray-analys visade nedreglering av ENPP3 med 59 gånger i epitelrummet (p = 0, 04) med P-hämning. Immunohistokemisk analys för ENPP3 visade uttryck specifikt för den apikala ytan av epitelrummet och körtelutsöndringar, men var mycket smal i behandlingsgruppen. Den genomsnittliga immunoreaktiva poängen (IRS ± SD) för kontrollgruppen var 8, 8 ± 4, 41 och behandlingsgruppen var mycket låg 0, 42 ± 1, 13 (p = 0, 0007). Intressant nog sågs inte proteinuttrycket för ENPP3 i stroma i endera gruppen, även om mRNA-uttryck sågs i båda grupperna som studerats genom western blot och immunohistokemi. ENPP3 visade ett cykliskt uttryck högst i den mellersekretoriska fasen och lägst i den proliferativa fasen med genomsnittliga IRS ± SD-poäng respektive i proliferativa, mitten och sent sekretoriska faser var 1, 97 ± 2, 21, 10, 25 ± 3, 88 respektive 7, 12 ± 3, 83. Högre expression av ENPP3 observerades i den dominerande P-dominerande mitt-sekretoriska fasen vid jämförelse med den proliferativa fasen (p = 0, 0001). Det fanns ingen signifikant skillnad mellan mitten- och sent-sekretionsfaser (fig. 4D).

ENPP3-proteinuttryck i livmodervätska och hela endometriala vävnadslysater

Livmodersköljningarna från fertila kvinnor och samma kvinnor behandlade med en enda dos av 200 mg mifepriston på LH + 2 uppsamlades på LH + 6/7 och testades med avseende på ENPP3-proteinuttryck med den västra blottingtekniken. Ett starkt band observerades omkring 165 kd vilket indikerade glykosylerad ENPP3 och visade en signifikant nedreglering i P-inhiberad grupp (AUC - kontroll 17, 85: mifepristonbehandling: 9, 47; p = 0, 002) med ett liknande mönster som vävnad ENPP3 (AUC-kontroll) 18, 98: mifepristonbehandling 11, 94; p = 0, 002). Uttrycket av ENPP3 i endometrial vävnadslysat var rikligare än i livmodervätska (fig. 5).

Western blot-analys av ENPP3 i lysmaterial av receptom fas endometrivävnad ( A, B ) och livmodervätska ( C, D ) av Wes visade goda expressionsnivåer av ENPP3 i kontrollprover (spår 2-7). Antiprogestinbehandling ( A, C ): spår 8–13) visade inga påvisbara nivåer av ENPP3, både i endometrial vävnad och livmodervätska, vilket bekräftar regleringen av ENPP3-proteinet med progesteron. ( B, D ) visar semikvantitativ analys av immundetekterbar ENPP3 av Wes, uttryckt i log 2 AUC (område under kurvan). Spår 1: proteinmolekylviktsmarkör.

Bild i full storlek

Utvärdering av ENPP3 som glykoprotein

Den förutsagda molekylvikten för ENPP3 är cirka 100 kd, men Western blot-analys visade ett band vid 165 kd, vilket ledde till att vi ytterligare undersöker dess glykosylering. Vi testade lysera vätskor och livmodersvävnad efter digereringen med Peptid-N-Glykosidas F (PNGase F), som spjälkar glykoaminidasförbindelsen mellan asparagin och N-acetylglukosaminer. Vi observerade en förskjutning från 165 kD till 110 kD i de deglykosylerade proverna, vilket bekräftade att ENPP3 är N-glycosylerad i livmodervätska och endometri hos friska fruktbara kvinnor (Fig. 6).

Deglykosylering av livmodervätska visade en förskjutning av bandet från 165 kD till ett enda band vid 110 kD, vilket innebär att ENPP3 i livmodervätskan är närvarande i dess glykosylerade form. Den glykosylerade (spår 2-7) -formen av ENPP3 visade ett band vid 165 kD och den deglykosylerade (spåren 8–13) -formen hade ett enda band vid 110 kD.

Bild i full storlek

In vitro- funktionell analys

Embryobindning studerades i en tidigare beskrivet tredimensionell endometriell cellodlingsmodell för att studera humanimplantationsprocess in vitro 32, och visade att 7 av 10 blastocyster fästa till endometrialkonstruktionen i kontrollgruppen. I kontroller sågs en mycket bra uttrycksnivå av ENPP3 som studerad av PCR i realtid. Exponering för mifepriston (0, 5 μM) ledde till signifikant (p = 0, 004; Fishers exakta test) nedreglering av ENPP3, med ingen av embryona fästa vid in vitro endometrialkonstruktion (p = 0, 004, Fig. 7).

Mänskligt embryo kopplat till den tredimensionella cellkulturmodellen in vitro med exponering för progesteron ( A ). Inget av de 8 embryona i den anti-progestinbehandlade gruppen, där ENPP3 var signifikant nedreglerad hade fäst sig. I kontrollgruppen fästes 7 av 10 blastocyster ( B ) till konstruktionen, med mycket bra uttryck av ENPP3 i det tredimensionella endometriella cellodlingssystemet.

Bild i full storlek

Analys av livmodervätska i mottaglig och icke-mottaglig fas med nano-ESI-LC / MS / MS

Vi identifierade och kvantifierade uttrycket av ENPP3-protein med 35 ENPP3-specifika peptider som erhöll 53, 4% sekvensstäckning i masspektrometri av livmodervätska. Baserat på totala normaliserade proteinintensiteter observerades ENPP3-protein att uppregleras (medelviktförändring + 35, 0, p = 0, 003) under P-dominerande LH + 8, vid jämförelse med tidig sekretorisk fas (LH + 2) i den naturliga menstruationscykeln (Fig 8).

Tukey-plot för uttrycket av ENPP3 kvantifierat med nano-ESI-LC / MS i livmodervätskor från tidig sekretorisk fas (LH + 2) och mitt-sekretorisk fas (LH + 8) av samma uppsättning av kvinnor. En signifikant uppreglering av ENPP3 (p = 0, 0032) observerades i P-dominerande, mottagningsfas (LH + 8) i jämförelse med icke-mottaglig fas (LH + 2).

Bild i full storlek

Diskussion

Vår studie visar systematiskt att ENPP3, ett N-glykosylerat protein som regleras av P, är uppdelat i endometrialkörtlar såväl som livmoderutsöndringar under mottagningsfasen. Regleringen av ENPP3 med progesteron och rollen i implantationsprocessen testades med användning av en in vitro human embryoimplantationsmodell, där exponering för en P-receptorinhibitor hämmade mänsklig embryonfästning och därmed embryonimplantationsprocessen tillsammans med nedregleringen av ENPP3-uttrycket. Eftersom uttrycket av ENPP3 i endometriumet korrelerade med det i livmodervätska föreslår vi att analys av ENPP3 i livmodervätska kan användas som en potentiell markör i icke-invasivt test för P-reglerad endometrial mottaglighet. Innan vi använder en klinisk installation måste vi verifiera data från kvinnor med återkommande implantationsfel (RIF). Detta kommer att kräva ett stort antal prover för att få statistisk betydelse för att justera för olika faktorer som bidrar till RIF.

Det finns flera studier för att identifiera endometrialt transkriptom med array-teknik för att utforska endometrial receptivitetsmarkörer med syftet att översätta dem till klinisk användning, främst för diagnos 20, 26, 33, 34 . Ingen av ovanstående studier, inklusive studier som jämförde mRNA såväl som proteinprofilering mellan tidig (LH + 2) och mitten (LH + 7 eller 8) luteal fas har rapporterat uttrycket av ENPP3 35, 36, 37 . Här rapporterar vi för första gången att ENPP3 uttrycks starkt under progesterondominerande mitten-lutealfas (LH + 8) jämfört med tidig lutealfas (LH + 2), när nivån av P är lägre. Intressant nog visade en mycket nyligen genomförd studie för att dechiffrera transkriptomprofilen för endometrium hos RIF-patienter 303 prediktiva gener och ENPP5, en molekyl som tillhör ektonukleotidpyrofosfatasfamilj 38 . Även om dessa rapporterade data är av potentiellt värde för att identifiera och utveckla matrisbaserade förutsägelsemetoder 39, 40, kvarstår den funktionella rollen för dessa molekyler fortfarande att utforskas och för de flesta av transkripten vet vi inte om de transkriberas ytterligare till deras protein. I denna studie visar vi uttrycket av ENPP3 både på mRNA och proteinnivå i endometriet och försöker också visa sin möjliga roll i processen för implantation av humant embryo med den bästa tillgängliga in vitro- modellen för att studera humant embryoimplantationsprocess. Det kommer att vara viktigt att ytterligare undersöka molekylmekanismen för ENPP3 i endometrial mottaglighet och implantation, särskilt vid kvinnlig infertilitet.

För närvarande hävdar endometrial receptivitetsgrupp 34, 39 (ERA) vara en överlägsen och mer exakt metod för endometrial receptivitetsutvärdering jämfört med endometrial histologisk datering med användning av Noyes kriterier 41 . Avancerad teknik med kvalitetsstyrda centrala laboratorier krävs dock för denna analys 42 . En nyligen utvecklad metod baserad på uttrycket av integriner 43 (E-tegrity test ® ) kan ha potential men behöver ytterligare kliniska studier. Det bör noteras att båda metoderna är invasiva eftersom en endometrial biopsi krävs för analys. Den stora inverkan av P på uttrycket av ENPP3 i livmodervätskan i ett mottagande endometrium, som rapporterats i denna studie, är lovande och stöder dess möjliga användning i ett mottaglighetstest under den effektiva cykeln för embryoöverföring. Insamling av livmodervätska kräver dock införande av flexibel kateter i livmoderhålet, det orsakar inte skada på endometrium. Ännu viktigare är att provtagning av livmodervätska i en embryoöverföringscykel inte minskar implantationen eller graviditetshastigheten 44 . Därför föreslår vi att ENPP3 kan användas som en markör för ett icke-invasivt test av livmodervätska för progesteronreglerad endometrial funktion. Sådana tester är inte bara viktiga för att identifiera mottagande endometrium innan dyra fertilitetsbehandling påbörjas, utan också användbara vid personlig embryoöverföring, vilket har gett möjlighet för vissa kvinnor med RIF att bli gravid 45 .

Nyheten i denna studie jämfört med den i tidigare rapporter ligger i det faktum att vi studerade genuttrycket för huvudsakliga celltyper från en kohort av beprövade bördiga kvinnor som var deras egna kontroller, vilket minimerar de möjliga stora variationerna i idiopatisk infertilitet. För det andra isolerades stroma och körtlar i både mottagande och icke-mottagande endometrium genom laserupptagande mikrodissektion, vilket utesluter det möjliga globala genuttrycket för olika gener som sågs vid användning av hela endometriet. De flesta av de tidigare publicerade mikroarraybaserade genuttrycksstudierna genomfördes med användning av hela endometrial vävnad 14, 15, 20, 21, 23, 46, 47, vilket gav den kumulativa genuttryckseffekten av alla olika celltyper i endometrium. Vi använde mikroarray, en kraftfull teknik för att screena ett stort antal möjliga gener som uttrycks på olika sätt. Uttrycket av ENPP3 på transkriptomnivå bekräftades med en mer känslig och specifik metod, realtid PCR. Vidare tittade vi på uttrycket och distributionen av ENPP3 på proteinnivå genom Immunohistochemistry. Eftersom uttrycksnivån för ENPP3 drastiskt nedreglerades med P-hämning såg vi efter dess uttryck i livmodervätskan, med avsikt att ytterligare undersöka möjligheten att identifiera en markör som kan användas för att utveckla en mindre invasiv metod. För detta använde vi en av den nyligen introducerade känsliga och snabba metoden Wes 48, 49, som är lämplig för att analysera låg proteinnivå i mycket liten provvolym eftersom endast en mycket liten mängd protein och livmodervätska skulle kunna provtagas från kvinnor. För att studera uttrycket av ENPP3 i den mottagliga och icke-mottagliga fasen i menstruationscykeln, använde vi ännu en mycket känslig etikettfri proteinanalytisk teknologi, nano-ESI-LC / MS / MS 50 . Tidigare finns det inga rapporter om den rapporterade markörernas funktionella roll för endometrial mottaglighet eftersom studier på människor är omöjliga på grund av etiska skäl. Här verifierade vi den funktionella rollen för ENPP3 i endometrieceller med hjälp av en tidigare beskrivd, väletablerad in vitro- modell för embryonfästning 32 .

Regleringen av ENPP3 i endometriala celler är spännande, eftersom transkriptionen nedreglerades till en omfattning av 55 gånger i stromala avdelningar i icke-mottaglig endometri, men utan några detekterbara nivåer i protein. Detta studerades med användning av två olika antikroppar, både genom immunohistokemi och Western immunoblot. Dessutom var mRNA-uttrycket av ENPP3 mer än dubbelt i stromavdelningen jämfört med det körtande facket. Denna höga nivå av mRNA utan proteinuttryck i stromavdelningen för ENPP3 återspeglar inte bara post-translationella mekanismer på proteinnivån, utan kan ha en betydande biologisk roll, som måste studeras utförligt. I endometriala epitelceller regleras ENPP3 av P, eftersom höga nivåer observerades i den sekretoriska fasen av menstruationscykeln i jämförelse med den proliferativa fasen. Vi ser emellertid inte en statistisk betydelse mellan mitten och sen sekretorisk fas, även om det finns en minskning av deras medelvärden. Detta kan vara att tröskelnivån för P som krävs för att producera ENPP3 är mindre och även om P nedregleras i den sena sekretionsfasen, finns fortfarande en basnivå av P och detta kan vara tillräckligt för att producera en betydande nivå av ENPP3 som observeras i sen luteal fas. I endometriet finns det rapporter om att ENPP3 uttrycks i epitelkörtlarna sett av kvantitativ masspektrometrianalys hos premenopausala kvinnor 51 .

Vi försökte karakterisera ENPP3, som finns i endometrium och livmodervätska. För ENPP3 förväntas ett immunoblotband kring molekylvikten 100 kd. Överraskande observerades ett band med högre molekylvikt omkring 165 kd, vilket vid vidare undersökning visade sig vara den glykosylerade formen som finns i livmodervätskeproven. Vi bekräftade att detta band med hög molekylvikt är den glykosylerade formen av ENPP3, eftersom behandling av receptiva endometriala livmodervätskeprover med N-Glykanas resulterade i en förlust av immunblotbandet vid 165 kd och dess närvaro vid 100 kd. Uttrycket av ENPP3 i livmodervätska och endometrial vävnad under den mottagande fasen av menstruationscykeln från beprövade fertila kvinnor hade ett liknande mönster till den glykosylerade ENPP3-formen. Närvaron av ENPP3 i körtelutsöndringar som exosomer har rapporterats tidigare eftersom det är närvarande i humana parotida körtelutsöndringar inkapslade i exosomer 52 .

ENPP3 är en av de nyligen beskrivna molekylerna och därmed mindre studerade. Uttrycket av ENPP3 i allmänhet rapporteras huvudsakligen i basofil- och mastceller 53 . ENPP3 är ett typ II-transmembranprotein och saknar det di-leucin som är karakteristiskt för membranproteiner 54 . Detta är i linje med vår observation av endometriumet, eftersom ENPP3 bara ses i den apikala ytan på epitelceller. Den enda ENPP-familjen av protein som rapporteras i humant endometrium är ENPP5, ett typ I-transmembranprotein och det finns ingen rapport om dess funktion 38 . Det skulle vara intressant att studera ENPP3s biologiska funktion, särskilt i relation till dess uttryck och förståelse i fall av RIF. En av utmaningarna för att få en statistisk betydelse för att visa rollen av ENPP3 i RIF på endometrial nivå, vi kan kräva ett stort antal prover, eftersom ett brett spektrum av molekyler kan bidra individuellt eller kollektivt till RIF.

ENPP3-ektoenzym är involverat i extracellulär nukleotidhydrolys och har både ATPas- och ATP-pyrofosfatasaktivitet. Det klyver en mängd fosfodiester- och fosfosulfatbindningar inklusive deoxynukleotider, nukleotidsockerarter och NAD 55, 56, 57 . Nyligen visades det att ENPP3 reglerar glykosyltransferasaktiviteten, vilket underlättar glykosyleringen av många proteiner genom att hämma en inneboende faktor för N-acetylglucosaminyltransferas GnT-IX (GnT-Vb) i murint neuroblastom Neuro 2a celler 58 . Intressant nog är arbetet av Korekane et al . visar att ENPP3 antingen kan öka eller minska aktiviteten hos glykaner 59, och glykaner är närvarande både i endometrium- och livmodersekretioner och har en viktig roll i regleringen av endometrial mottaglighet. Uttrycket av Le (Y) oligosackarid under mottagningsperioden är känt för att nedregleras av hämningen av tidig luteal fas P av mifepriston i apea endometria 60 . Det är också känt att uttrycket av MUC16 försvinner från endometriet vid tidpunkten för embryoimplantation, sammanfaller med perioden för ENPP3-uttrycket 61 . Vi känner inte till de specifika glykanerna som regleras av ENPP3 i endometriet, men det är värt att undersöka när det gäller dess reglering under olika gynekologiska förhållanden.

Baserat på våra resultat drar vi slutsatsen att ENPP3 kan användas som en molekylär markör för progesteronverkan på endometrial nivå hos kvinnor. Med ytterligare studier kan detta användas för att utveckla en mindre invasiv metod för att screena kvinnor som söker IVF för endometrial receptivitet med livmodervätska, innan den planerade embryoöverföringen. Å andra sidan kan det också vara möjligt att utveckla en hämmare eller molekyl som kan förändra ENPP3: s funktion så att den kan användas för fertilitetskontroll. För detta kan det första steget vara att screena molekylbibliotek för att identifiera en potent hämmare. En detaljerad studie för att förstå den fysiologiska funktionen hos denna molekyl i endometrium och livmodervätska är väsentlig.

metoder

Etiska behörigheter

Alla experiment genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna. De experimentella protokollen inklusive vävnadsprövning godkändes av Karolinska universitetssjukhuset och den regionala etiska kommittén (EPN), Stockholm, Sverige. Den etiska kommittén från University of Tartu hade godkänt tillståndet att samla in och utföra analys av livmodervätska som samlats i deras centrum. Informerat och skriftligt medgivande erhölls från alla volontärer som deltog i studien och dokumenten lämnades in enligt institutionella dokumentationsriktlinjer.

Endometrial biopsier

Endometrial biopsier uppsamlades från beprövade friska bördiga kvinnor (n = 9) i åldern 22–37 år från den övre delen av endometrihåligheten med en Pipelle-aspirator (Prodimed, Neuilly en Thelle, Frankrike). Dessa kvinnor var fria från några gynekologiska störningar och tog inte någon hormonell preventivmedel eller hade några intrauterina enheter i minst tre månader före biopsin. Alla försökspersoner som själv undersökte LH-topp i urinprover som samlats in två gånger om dagen från ungefär cykel dag 10 till LH + 2 med hjälp av ett snabbt självtest (Clearplan, Searle Unipath Ltd., Bedford, UK). Biopsier erhölls från varje kvinna på cykeldag LH + 7 i en kontrollcykel och därefter i en behandlingscykel. Under behandlingscykeln fick kvinnor en enstaka dos på 200 mg mifepriston på LH + 2. Varje biopsi delades upp i två delar, med en fixerad i 4% paraformaldehyd för immunohistokemi och den andra snäpp fryst i flytande kväve för lasermikrodissektion och RNA-extraktion . Endometrialprover från friska kvinnor (n = 27) erhölls också under de proliferativa, mitt-sekretoriska och sen-sekretoriska faserna av menstruationscykeln, med nio endometrialprover för varje grupp.

För att bekräfta proteinuttrycket av ENPP3 under den mottagande fasen uppsamlades 6 endometriala biopsier från kontroll- och behandlingscykeln (200 mg mifepriston på LH + 2) under LH + 6 till LH + 9 från friska kvinnor och knäpptes fryst i vätska kväve tills vidare användning. För in vitro- funktionell analys av tredimensionella cellkulturer uppsamlades endometrial biopsier från beprövade fertila kvinnor (n = 30) på LH + 4, följt av isolering av stromal- och epitelceller med väl etablerade protokoll som tidigare beskrivits 62 .

Endometrial cellisolering

Kortfattat malades vävnaden till 1 x 1 mm i Ham F10 (Life Technologies, Sverige) och inkuberades med pancreatin-trypsin EDTA (0, 05 g / ml trypsin-EDTA-lösning) under 30 minuter vid 4 ° C följt av matsmältning med kollagenas 4 (125 IU / ml, Worthington Biochemical, Lakewood NJ) och DNAse (40 μg / ml slutkoncentration, Sigma, Sverige) och filtrerades genom en 40-mikron nätcellssil som tillät stromceller att passera genom och epitelkörtlar att förbli i silen. Epitelkörtlar digererades med kollagenas 3 (45 IU / ml, Worthington Biochemical, Lakewood, NJ) och DNAse och filtrerades genom en 40-mikron maskcellfilter. Stromal- och epitelceller separerades sedan i ett återhämtningscellodlingsmedium (Life Technologies) och bevarades i flytande kväve tills de tinades för den endometriala samkulturen.

blastocyster

Embryon / blastocyster (n = 18) för denna studie förvärvades genom standard in vitro- befruktning (IVF) eller intracytoplasmisk spermieinjektion (ICSI). De embryon som användes i denna studie var av minst grad 3BB (Gardners klassificering) och var kliniskt giltiga för embryoöverföring.

Tredimensionella endometriella cellkulturer

Endometrial cellkulturer genomfördes såsom beskrivits av Lalitkumar et al . 63 . Efter fem dagars odling behandlades en grupp kulturer med mifepristonkoncentration (Sigma Aldrich) av 0, 5 | im (n = 8) och kontrollgruppen behandlades endast med vehikeletanolen (n = 10). Ett embryo tillsattes till varje kultur samma dag som mifepristonbehandlingen inleddes. Odlingsmediet byttes varannan dag under ljusmikroskop, och kulturer undersöktes för fästning av embryona. På dag fem efter introduktion av embryon noterades bindningsgraden efter mekanisk testning genom att skaka kulturerna och tvätta dem med PBS två gånger. Innan kulturerna avslutades avlägsnades eventuella fästade eller icke-fästa embryon. Efter avslutande avlägsnades kulturerna från cellinsatserna och löstes i 1 ml Trizol-reagens (Invitrogen) och lagrades vid -80 ° C före RNA-extraktion.

Livmodervätska

Livmodervätska uppsamlades från beprövade fertila kvinnor på LH + 7 med eller utan mifepristonbehandling. Två ml vatten av injektionsgrad (Gibco) infunderades i livmoderkaviteten med användning av en modifierad matningskateter (Nutrisafe 2, Fr-L.75 cm, Vycon Value Life, Ecouen, Frankrike) fixerad till en 10 ml spruta. Med hjälp av sprutan sugs ungefär 1 ml tillbaka tillsammans med livmodersköljningen och centrifugerades vid 200 g under 10 minuter för att avlägsna alla celler eller cellskräp. Supernatanten lyofiliserades och rekonstituerades i 50 ul sterilt vatten och togs för ytterligare analys.

I en annan uppsättning fruktbara kvinnor (n = 6; University of Tartu, Estland), samlades livmodervätska i samma cykel under den tidiga sekretionsfasen (LH + 2) och progesteron-dominerande mitt-sekretorisk (LH + 8) -fas för att utföra etikettfri proteomisk analys för ENPP3-uttryck.

Automatiserad western blot

En helt automatiserad western blot utfördes med användning av Simple Wes (Protein Simple, San Jose, CA) enligt tillverkarens instruktioner. I korthet tillsattes 2 μg protein från vävnadslysat eller livmodervätska till standard fluorescerande mastermix och laddades i motsvarande brunnar i den förfyllda Wes-analysplattan, tillsammans med antikroppspädningsmedel (Protein Simple), anti-ENPP3-antikropp (1:50 utspädning Sigma LifeSciences, HPA043772), anti-kanin sekundär antikropp (Protein Simple) och Streptavidin, följt av luminolperoxidblandning. Avbildning och analys gjordes med kompassprogramvara (Protein Simple).

Etikettfri proteomisk analys med Nano-ESI-LC / MS / MS

Livmodervätskorna separerades i sex fraktioner baserat på dess molekylvikt med användning av SDS-PAGE (Invitrogen). Proteiner reducerades sedan, alkylerades och gel-digererades med dimetylerat svin trypsin (Sigma) följt av analys med nano-ESI-LC / MS / MS (Dionex Ultimate 3000 RSLC och Q Exactive MS / MS, Thermo Fisher Scientific vid University of Tartu ) med användning av 2 timmar omvänd fasgradienter och en topp-10 dataintervänt förvärvningsmetod. De erhållna etikettfria mass-spektrometriska data identifierades och kvantifierades med MaxQuant-mjukvarupaket 64 (UniProtKB human referens proteome database, 2014 version 2014). Märkningsfri data normaliserades med MaxLFQ-algoritmen 50 och jämfördes med parade eller oparade två-svansade t-test.

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

Stromalceller isolerades selektivt från poolen av endometrieceller genom negativ selektion med FACS. I korthet tvättades och färgades cellerna för epitelceller med EPCAM / CD326 under 30 minuter och sorterades med användning av MoFLOW ® XDP-flödescellaktiverad cellsorterare (Beckman Coulter, USA).

immunohistokemi

The 5 μm paraffin-embedded endometrial tissue samples were deparaffinized using a 2100-retriever autoclave (Histolab, Gothenburg, Sweden) and antigen retrieval done with a Diva Decloaker (Biocare Medical, Concord, CA). After peroxidase quenching, the sections were incubated with Background Sniper (Biocare Medical) followed by incubation with the primary antibodies (Supplementary Table 3) overnight at 4 °C. The primary antibodies were diluted in the diluent DaVinci Green (Biocare Medical, Concord, CA). The biotin-free detecting system Rabbit/Mouse HRP polymer kit MACH 3 TM (Biocare Medical, Concord, CA) was used for detection. The reaction was developed with the Betazoid DAB Chromogen kit (Biocare Medical, Concord, CA). The counterstained hematoxylin (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) sections were mounted using the xylene-based medium Pertex ® (Histolab, Gothenburg, Sweden) and analyzed in a Zeiss Axiovert 200 M microscope (Zeiss, Göttingen, Germany) 62 . All the slides were blinded and scored by two independent observers. The semi-quantitative IRS-score 65 was used to assess the percentage of the positive cells (PC) and the staining intensity (SI). On disparity between the two observers, a third independent observer analysed the blinded slides and the average score of the two closest results was taken for further analysis.

Deglycosylation

Endometrial tissue lysates and uterine fluid samples were subjected to mild denaturation with 0.2% Rapigest SF Surfactant (Waters, 186001861) and DTT (5 mM) and the samples were denatured for 5 minutes at 95 °C. Iodoacetamide (15 mM final concentration) was added and incubated for 30 minutes in dark, and in-solution enzymatic digestion was done by incubation with 1 μl/sample PNGase F (Roche, 11365169001) for 2 hours at 37 °C and analyzed by Simple Wes.

Statistisk analys

The paired T-test and SAM methods were performed to analyze microarray data by MultiExperiment Viewer. The Mann-Whitney U test was applied to compare immunohistochemical staining between the control and treatment groups. Based on the statistical assumptions, either an unpaired T-test or Mann Whitney test was performed for analyzing the real time PCR and western blot data. Fisher's exact test was performed to analyze blastocyst attachment rate. All the statistical analysis was done with XLSTAT 2015 (Addinsoft) and Prism 6 (GraphPad Software).

ytterligare information

Accession code : Microarray data, GEO repository accession number GSE59447.

How to cite this article : Boggavarapu, NR et al . Compartmentalized gene expression profiling of receptive endometrium reveals progesterone regulated ENPP3 is differentially expressed and secreted in glycosylated form. Sci. Rep. 6, 33811; doi: 10.1038/srep33811 (2016).

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.