Klonal arkitektur av del (5q) myelodysplastiska syndrom: avvikande cd5- eller cd7-uttryck i myeloidföräldrarutrymmet definierar en undergrupp med hög klonal belastning | leukemi

Klonal arkitektur av del (5q) myelodysplastiska syndrom: avvikande cd5- eller cd7-uttryck i myeloidföräldrarutrymmet definierar en undergrupp med hög klonal belastning | leukemi

Anonim

ämnen

  • Cancergenetik
  • Diagnos
  • Hematopoietiska stamceller
  • Myelodysplastiskt syndrom

Myelodysplastiska syndrom (MDS) representerar en heterogen hematopoietisk stamcellstörning. 1 En exakt uppskattning av prognosen inom de olika MDS-undergrupperna är avgörande för skräddarsydda terapeutiska beslut. Speciellt representerar MDS-patienter med en isolerad radering av den långa armen i kromosom 5 (del (5q)) en distinkt undergrupp angående kliniskt resultat med en gynnsam prognos i de flesta fall. 2 Dessutom har de karakteristiska cytomorfologiska särdrag, såsom hypoloberade megakaryocyter, makrocytisk anemi och ett normalt eller ökat perifert blodplättantal. 3 Nyligen har flödescytometri (FCM) visats fungera som ett värdefullt ytterligare diagnostiskt och prognostiskt verktyg, särskilt för att skilja mellan unilineage och multilineage dysplasi. 4, 5 Dessutom är det känt att onormalt antigenuttryck på myeloida stamceller (myPC) är förknippat med ett dåligt resultat. 6, 7 I själva verket förutspår avvikande CD7-uttryck på myPC hos anemiska MDS-patienter med lägre risk för en signifikant lägre svarsfrekvens på erytropoiesstimuleringsmedel (ESA) terapi oavsett jämförbara andra kliniska prediktiva markörer (erytropoietinnivå, transfusionsbelastning). 8 Den patofysiologiska bakgrunden för denna observation är fortfarande okänd. Det har noterats att det hittills inte har visats huruvida dessa distinkta immunofenotypiska egenskaper korrelerar med närvaro och omfattning av klonal hematopoies, vilket i sin tur kanske inte svarar på tillväxtfaktorstimulering. I denna studie separerade vi därför olika hematopoietiska cellfack av del (5q) MDS-patienter genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och kvantifierade respektive fördelning av klonbörda med interfasfluorescens in situ- hybridisering (iFISH).

Totalt undersöktes 41 benmärgsprover (IPSS-R mycket låg / låg / int = 22, hög / mycket hög = 19) av 30 MDS-patienter med del (5q) (kompletterande tabell 1). Före cellsortering, på en FACS-Aria-II (BD, San Jose, CA, USA), immunofenotypades prover för att säkerställa närvaron av de cellpopulationer som ska sorteras med hjälp av ett berednings-, grindnings- och analysförfarande enligt IMDSFlow Working Groups riktlinjer . 4 Således definierades och sorterades följande cellpopulationer: myPC - SSC låg CD45 dim CD34 + CD117 +, myPC med / utan CD56-uttryck; granulopoiesis (GP) —SSC ++ CD45 dim och deras respektive mognadningssteg (CD13 + CD16 -, CD13 - CD16 -, CD13 + CD16 + ); och kärnbildade röda celler (NRC) - CD45 - CD235a + CD71 (+) ++ (kompletterande figur 1A och E). Ett intervall på 5000–50 000 celler sorterades för efterföljande iFISH-analyser. Del (5q) detekterades med användning av LSI EGR1 / D5S23, D5S721 Dual Color Probe (Abbott, Wiesbaden, Tyskland). En detaljerad beskrivning av alla metoder ges som kompletterande information på Leukemis webbplats.

Först analyserades fördelningen av klonala celler i de huvudsakliga hematopoietiska facken. Som ett resultat kunde klonala iFISH + -celler detekteras i alla underuppsättningar med den högsta frekvensen i myPC (77%) följt av GP (69%) respektive NRC (31%) ( P <0, 020; figur 1a). Braulke et al. 9 beskrev en hög klonal belastning i MACS-sorterade CD34 + -celler i perifert blod och föreslog denna metod för terapeutisk övervakning av patienter. Vidare har Tehranchi et al. 10 rapporterade att den maligna klonen är dominerande och till och med kvarstår i förfädercellsavdelningen när patienterna går in i fullständig remission efter lenalidomidbehandling. Dessa fynd tillsammans med våra aktuella data bekräftar den höga frekvensen av klonala celler som dominerar i myPC igen vilket ger bevis för att MDS är en stamcellsjukdom.

Frekvens av klonala iFISH + -celler. ( a ) Huvudcellfack (myPC, n = 37; GP, n = 31; NRC, n = 31; myPC vs GP, P = 0, 015; myPC vs NRC, P <0, 001; GP vs NRC, P <0, 001). Par jämförelse av klonala iFISH + -celler i myPC och mogna subpopulationer av GP enligt IPSS-R-riskgrupper: ( b ) mycket låg / låg / int, n = 17 (myPC vs CD13 + CD16 -, P = 0, 004; myPC vs CD13 + CD16 +, P = 0, 009); ( c ) hög / mycket hög, n = 13 (inte signifikant). ( d ) Parad jämförelse av myPC enligt avvikande CD56-uttryck ( n = 5, P = 0, 043). * P <0, 05; ** P <0, 005.

Bild i full storlek

Därefter utvärderade vi immunofenotypiskt karakteriserade mognadsstadier av GP. Vi observerade att den klonala bördan minskade signifikant med mognad med den lägsta frekvensen för del (5q) celler i CD13 + CD16 + mest mogna fack ( P = 0, 023; data visas inte). Dessutom syftade vi till att undersöka om det finns ett samband mellan sjukdomsstadiet av IPSS-R (mycket låg / låg / int vs hög / mycket hög) och klonal belastning i de cellulära subpopulationerna. I själva verket presenterade myPC en jämförbar hög klonalitet oberoende av IPSS-R-riskkategori (figur 1b och c). Anmärkningsvärt resulterade jämförelsen av myPC och GP i en signifikant lägre frekvens av klonala iFISH + -celler i den mogna och omogna GP i del (5q) MDS med lägre IPSS-R (myPC: 87% mot mogna och omogna GP: 65% och 61 respektive%), medan i MDS med högre risk, visade myPC och GP liknande höga procentuella klonaliteter. Detta pekar mot en fördelning och differentieringsfördel av den cytogenetiskt onormala klonen, som blir ännu mer framträdande med utvecklingen till mer avancerade kliniska stadier. Den höga klonaliteten inom GP är inte förvånande men har hittills inte undersökts i del (5q) MDS. Eftersom GP representerar en betydande del av kärnbildade celler, återspeglar den också huvudsakligen den klonala bördan i hela benmärgen. Speciellt i lägre risk MDS verkar GP vara ett lättillgängligt mål för övervakning av terapi. Denna avhandling stöds av Lübbert et al. 11 som undersökte husläkaren hos fyra MDS-patienter under decitabinbehandling, med användning av densitetsgradientcellseparation. Beroende på framgången för terapin rapporterade de om en återkomst av normal GP och en blygsam differentiering av klonal GP.

Även om i mindre utsträckning än myPC och GP, visade kärnbildade röda celler (NRC) också ett distinkt klonalt engagemang. Klonalitetsgraden inom erytropoies utbreddes inom hela MDS-kohorten (figur 1a). Speciellt vid lägre risk MDS med anemi och dysplastiska förändringar av erytropoies som ett av de ledande symtomen kan NRC också fungera som ett avdelning som är värt att överväga för terapimätning. I framtiden kan en immunofenotypisk separering av NRC, till exempel i CD71 + CD117 + CD105 + omogna NRC vs den mer mogna motsvarigheten (CD105 - ), möjliggöra ny insikt när det gäller omfattningen av klonalitet inom de olika mognadsstadierna för erytropoies. .

Ett steg längre behandlade vi frågan om onormalt antigenuttryck på myPC är associerat med frekvensen av klonalitet. Särskilt inkluderade sorterade myPC med avvikande CD56-uttryck signifikant fler iFISH + -celler jämfört med den immunofenotypiskt opåtriktade motsvarigheten i samma prover (81% mot 54%, P = 0, 043; figur 1d). Observera att CD56-uttryck på myPC i sig inte var associerat med en mer avancerad klinisk poäng, eftersom endast tre av de fem sorterade proverna tillhörde patienter med en hög / mycket hög IPSS-R-poäng och / eller del (5q) som en del av en komplex karyotyp.

Westers et al. 8 fann ett samband mellan onormalt antigenuttryck på myPC, till exempel CD7, CD56 och CD11b, och resistens mot ESA-behandling vid transfusionsberoende MDS med lägre risk. Även om mekanistiskt inte är väl förstått vid denna tidpunkt föreslogs en förlängning av den nordiska poängen som tillför onormal antigenuttryck på myPC förutom erytropoietinnivåer. Rigolin et al. 12 upptäckte en högre andel cytogenetiskt onormala metafaser hos patienter som inte svarar på erytropoietin. Bardet et al. 13 pekar också på vikten av avvikande CD7-uttryck i MDS-diagnostik. Därför undersökte vi det klonala engagemanget i en undergrupp av övervägande MDS med lägre risk som innehöll del (5q) plus ett avvikande CD5 / CD7-uttryck på myPC och jämförde det med en kohort med matchad IPSS-R men utan detta avvikande antigenuttryck (tilläggstabell) 1). Anmärkningsvärt var frekvensen av klonala celler signifikant högre i alla FACS-sorterade huvudpopulationer (myPC, GP och NRC) jämfört med respektive kontroller (figur 2a och c). Denna skillnad var mest framträdande i NRC (72% mot 17%, P = 0, 002) jämfört med GP (88% mot 56%, P = 0, 003) och myPC (88% mot 73%, P = 0, 035). Dessutom fann vi något högre serum erytropoietinnivåer hos patienter med avvikande CD5 / CD7-uttryck jämfört med kontrollgruppen (355 mot 78 U / l) medan transfusionsbelastningen inte skilde sig (kompletterande tabell 1). Dessa resultat ger för första gången en förklaring på den klonala nivån för ovannämnda teori om fenotypiska förändringar (till exempel CD5 på myPC) och efterföljande resistens mot ESA. På grund av dessa fynd kan det vara möjligt att integrera kunskapen om den fenotypiskt onormala myPC tillsammans med den höga klonala bördan i NRC i framtida försöksdesign, till exempel genom att kombinera lenalidomid och hypometyleringsmedel.

Frekvens av klonala iFISH + -celler hos MDS-patienter med avvikande CD5- och / eller CD7-uttryck på myPC. ( a ) myPC ( n = 10/10, P = 0, 035); ( b ) GP ( n = 9/10, P = 0, 003); ( c ) NRC ( n = 7/11, P = 0, 002). * P <0, 05; ** P <0, 005.

Bild i full storlek

Slutligen är det känt att närvaron av en TP53- mutation i del (5q) MDS är förknippad med lenalidomidbehandlingsfel. 14 För att associera våra resultat med respektive klonalitet på molekylnivå jämförde vi iFISH-resultaten med mutationsbelastningen hos fem patienter som presenterades med en del (5q) och en samtidig TP53- mutation. Med tanke på huvudcellfacken observerade vi en liknande mutationsbelastning av TP53 inom myPC och NRC (50% respektive 49%), medan GP visade en lägre mutationsbelastning (29%). Intressant nog, i alla FACS-sorterade fack, var den klonala bördan bedömd genom mutationsanalys av TP53 lägre jämfört med mängden celler som innehöll en del (5q) som bedömdes av iFISH. Betydelse uppnåddes för GP (GP: 29% vs 83%, n = 5, P = 0, 043; myPC: 50% vs 85%, n = 4; NRC: 49% vs 77%, n = 3). Denna mycket höga andel av iFISH + -cellerna kunde tillskrivas närvaron av ett avvikande CD5 / CD7-uttryck i sig i fyra av de fem patienterna, men pekar också mot del (5q) som tidig händelse i patogenesen av MDS jämfört med TP53- mutationen . Dessa data stöder paradigmet att mTP53 är en sen händelse i utvecklingen av MDS och bekräftar den heterogena karaktären av denna sjukdom. 15

Sammanfattningsvis visar våra data en korrelation av specifika avvikande fenotyper som detekterats av FCM och respektive andel klonala celler inom olika hematopoietiska subpopulationer. Uppgifterna hjälper till att förbättra vår förståelse för MDS-biologi och garanterar ytterligare utvärdering av FCM i diagnostik och övervakning av MDS.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer detta dokument på Leukemia-webbplatsen (//www.nature.com/leu)