Cirkulerande växt mirnas kan reglera mänskligt genuttryck in vitro | vetenskapliga rapporter

Cirkulerande växt mirnas kan reglera mänskligt genuttryck in vitro | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Cancer förebyggande
  • miRNA
  • Denna artikel drogs tillbaka den 22 maj 2017

Den här artikeln har uppdaterats

Abstrakt

Medan Brassica oleracea- grönsaker har kopplats till cancerförebyggande förblir den exakta mekanismen okänd. Reglering av genuttryck med mikroRNA mellan olika arter har tidigare rapporterats; emellertid förblir dess koppling till cancerdämpning outforskad. I denna studie behandlar vi båda frågorna. Vi bekräftar växtmikroRNA i mänskligt blod i en stor kohort med nutrigenomics och i en randomiserad doskontrollerad studie, där vi hittade en signifikant positiv korrelation mellan den dagliga mängden broccoli som konsumeras och mängden mikroRNA i blodet. Vi visar också att Brassica-mikroRNA reglerar uttryck av mänskliga gener och proteiner in vitro , och att mikroRNA samarbetar med andra Brassica-specifika föreningar i en möjlig cancerförhindrande mekanism. Kombinerat ger vi starka bevis och en möjlig multimodal mekanism för broccoli i cancerförebyggande.

Introduktion

Grönsaker och frukt är viktiga komponenter i en hälsosam kost med en allmänt erkänd fördelaktig effekt på människors välbefinnande. Deras intag har förknippats med förebyggande av många sjukdomar inklusive koronar hjärtsjukdom, reumatoid artrit, kronisk obstruktiv lungsjukdom, astma, osteoporos, demens, och framför allt cancer 1 . Många epidemiologiska studier framhöll specifikt en viktig sjukdomsförebyggande roll för kruciferösa grönsaker (t.ex. Brassicaceae) 2 . Resultat från flera metaanalyser har visat att konsumtion av grönsaker från familjen Brassicaceae är omvänt förknippad med risken för många cancerformer, inklusive cancer i bröstet 3, kolon 4, mag-tarmkanalen 5, lunga 6, bukspottkörtel 7 och prostata 8 . Även om Brassica-grönsaker innehåller höga nivåer av flera näringsämnen och fytokemikalier inklusive vitaminer C, E och fiber, har det föreslagits att Brassicaceaes huvudförebyggande roll inte kan tillskrivas dessa molekyler 9 . Istället har studier visat att glukosinolater (som vid hydrolys producerar isotiocyanater såsom sulforafan och 3, 3'-diindolylmetan (DIM)), är unika för korsare och tros förklara Brassicaceae 10, 11, 12s cancerförhindrande roll. Transkriptomiska och proteomiska studier visar att intaget av Brassica-grönsaker påverkar många olika vägar (granskad i ref. 13). Det är osannolikt att denna effekt uppnås med endast en komponent, utan snarare kan vara beroende av interaktion mellan flera bioaktiva molekyler.

MikroRNA är små RNA-molekyler som har förmågan att kontrollera uttrycket av många messenger-RNA 14, och deras avvikande uttryck har kopplats till flera sjukdomar 15 (//210.73.221.6/hmdd). Liang et al . visade nyligen hos möss att Brassica oleracea microRNA överlever passagen genom mag-tarmkanalen efter matsmältningen och kan upptäckas i blodet såväl som i andra organ (t.ex. mage, tarm och mjälte) 16 . Icke desto mindre är rollen som livsmedelsrelaterade mikroRNA och deras förmåga att påverka mRNA-reglering mellan arter fortfarande mycket diskuterad, och det finns ett behov av väl utformade studier 17 .

I den aktuella studien konstaterade vi detekterbarheten av Brassica microRNA i humant blod både i en stor kohort och i en doskontrollerad randomiserad studie. Dessutom utförde vi in vitro- experiment som visade att Brassica microRNA kan reglera uttrycket av viktiga humana cancerrelaterade gener.

Resultat

Brassica oleracea microRNAs upptäckt i blod

En komplett lista över 64 mikroRNA tilldelade Brassica oleracea finns på mirNEST (//rhesus.amu.edu.pl/mirnest/copy/home.php) och listas i tilläggstabell 1.

Vi beslutade att fokusera vår analys på lungcancer, den främsta orsaken till cancerrelaterad död över hela världen 18, för vilken en förebyggande roll för Brassicaceae-konsumtion har beskrivits 6 . För att prioritera broccolimikroRNA för valideringsstudier förutspådde vi deras mål och vi korsreferenserade dem med generna signifikant och ofta uppreglerade i lungcancer, vilket resulterade i 193 uppreglerade mål (kompletterande tabell 2). Sammanfattningsdata för 8 mikroRNA prioriterade enligt antal uppreglerade mål och förutspådd bindande energi presenteras i tilläggstabell 3. Med undantag för miR160 och miR168 är de utvalda mikroRNA: er specifika för Brassica oleracea . I mänsklig kost är blommor den mest konsumerade broccolidelen, följt av stam och, mindre ofta, löv. Med tanke på skillnaden i konsumtionsbeteende kvantifierade vi uttrycket av 8 utvalda mikroRNA i blad-, stam- och blommaprover. För att redogöra för skillnader i mikroRNA-uttryck påverkade av växtutvecklingsstadiet och miljöstimulerna valde vi två "organiska" och två konventionella källor till broccoli erhållna från fyra olika leverantörer. Vi testade både föregångaren och mogna former av mikroRNA: er. Figur 1 belyser variationen i mikroRNA-uttryck mellan olika delar av samma broccoli-växt. Överraskande nog finns det stor uttrycksvariabilitet i samma del av broccoli-anläggningen som köpts från olika leverantörer (kompletterande figur 1). Det är spännande att prover från leverantör 1 visar lite eller inget uttryck för prekursormikroRNA medan prover av leverantör 3 har ett högt uttryck av prekursor (kompletterande figur 2). Eftersom mogna mikroRNA har mindre variation än föregångare, fokuserade vi de återstående analyserna på den mogna formen av mikroRNA. De mogna mikroRNA med det högsta uttrycket över prover och särskilt i blommandelen inkluderade: miR160, miR2673 och miR917. Slutligen valde vi miR160 och miR2673 för ytterligare analyser eftersom de förutspås att rikta in sig på det högsta antalet gener som är uppreglerade i lungcancer (kompletterande tabell 3).

De första tre raderna visar uttryck av mogna mikroRNA för stjälkar, blad och blommor i denna ordning, medan raderna 4 till 6 visar uttryck för föregångsform av mikroRNA för stjälkar, blad och blommor i denna ordning. Varje kolumn representerar en annan broccolimikroRNA (alla listade i den övre delen av figuren). Varje panel visar uttryck för en specifik broccoli-mikroRNA för en specifik växtdel från fyra olika leverantörer (45 ° hashmönsterstångförsäljare 1, 135 ° hashmönsterstångförsäljare 2, vitstångförsäljare 3 och gråstångförsäljare 4).

Bild i full storlek

Brassica-mikroRNA kan detekteras i humant serum från en retrospektiv nutrigenomicsstudie

Därefter testade vi upptäckbarheten för miR160 och miR2673 som cirkulerar i blod från mänskliga försökspersoner med regelbunden konsumtion av broccoli och utvärderade variationen i mängden detekterat mikroRNA. Vi jämförde serumnivåerna av 52 friska individer från en befintlig tvärsnittsstudie (kompletterande fig. 3), varav 26 var märkta som konsumenter (dvs. rapporterade konsumtion av minst en del kruciferösa grönsaker per dag) och 26 icke- konsumenter, som inkluderade individer som inte regelbundet konsumerade cruciferous grönsaker. Individer matchades för ålder och etnicitet, och könsförhållandet i varje grupp var 1: 1 (kompletterande tabell 4). Det finns en signifikant skillnad i mängd upptäckta mikroRNA i blod hos individer med regelbunden daglig konsumtion av korsbottengrönsaker jämfört med icke-konsumenter (p <0, 005 för båda mikroRNA; fig. 2a), vilket bekräftar vår förmåga att upptäcka Brassica-mikroRNA. Dessutom visade miR2673 en snävare gruppering jämfört med miR160, troligtvis på grund av att den förra endast var specifik för Brassica oleracea- grönsaker. En individ i konsumtionsgruppen hade inte någon av MicroRNA detekterbara. Denna individ rapporterade inga underliggande hälso- eller sjukdomsproblem, och eftersom proverna var anonymiserade, var det inte möjligt att identifiera om detta kan ha varit felaktig rapportering av den vanliga dieten eller någon annan faktor, till exempel en metabolisk avvikelse. Det är också spännande att det fanns variation i gruppen utan konsumtion, möjligen på grund av ofullständig rapportering av kosten (frågeformuläret för livsmedelsfrekvens som användes för att fånga diet bestod av "ja / nej" -svar samt konsumtionsfrekvens och frågorna inkluderar "mest" men inte "alla" Brassica-arter; se Metoder). Förutom livsmedelskällanseffekten som diskuterats ovan kan livsmedelsberedning också ha påverkat mikroRNA-innehållet. För att ta itu med denna variabilitet undersökte vi först hur matlagning påverkar broccoli microRNA-uttryck och utförde sedan en kontrollerad dietintension för att analysera dosberoende effekt i en randomiserad klinisk prövning (kompletterande figur 4).

( a ) Mängd mikroRNA påvisat i sera som samlats in i en epidemiologisk studie, jämför personer som äter en hög mängd (minst en portion, dvs 80 g) eller en låg mängd (0 portioner) Brassicaceae per dag. p-värden från ANOVA visas. ( b ) Uttryck av miR160 i kokta broccoliprover. Broccoli kokades med 7 olika tekniker och i ett fall (hälldes) med användning av tre olika tidpunkter (3 minuter P_3, 5 minuter P_5 och 10 minuter P_10). Uttryck normaliserades till rå broccoli. p-värden (ANOVA): ** 0, 01–0, 001, *** 0, 001–0, 0001, **** <0, 0001. ( c ) Uttryck i plasma hos individer som inte äter Brassicaceae (T1 och T3 0 g), 80 g broccoli per dag (T2 och T3 80 g), 160 g broccoli per dag (T3 160 g). p-värden beräknades med användning av Mann Whitney-testet.

Bild i full storlek

Tillagningsprocedurer påverkar broccoli microRNA: s uttryck

För att bekräfta att rå broccoli är en optimal källa till mikroRNA undersökte vi effekten av 7 vanliga kokningsmetoder på miR160-uttryck. Som visas i fig. 2b resulterar bakning och mikrovågsugn, såväl som proceduren för att hälla varmt vatten på rå broccoli och låta det vila i 3 minuter i den högsta mängden mikroRNA. Att öka tiden när broccoli förblev i varmt vatten minskade mängden detekterbart mikroRNA. Den mest signifikanta reduktionen i mikroRNA observerades när broccoli blandades eller ångades (p <0, 0001). Således ger rå eller kort tillagad broccoli den bästa källan till mikroRNA och potentiellt starkaste hälsofördelar. Intressant är att lång exponering för varmt vatten, ångande och blandning försämrar microRNA: s integritet, vilket minskar de potentiella fördelarna.

Brassica-mikroRNA kan detekteras i humant serum i en serveringskontrollerad randomiserad studie

Sedan genomförde vi en kontrollerad interventionsstudie, med en fördefinierad daglig broccoli servering och spårad dietintag. Målet var att identifiera ett dosberoende samband mellan broccolikonsumtion och cirkulerande broccolimikroRNA. För detta ändamål rekryterade vi 19 friska frivilliga som följde ett av tre dietinsatser som beskrivs i avsnittet Metoder och kompletterande figur 4. I början av studien avstod alla individer från att äta Brassicaceae under en vecka och åt sedan 80 g rå broccoli dagligen under en vecka och under den senaste veckan var de tre experimentgrupperna: sex individer som äter 160 g broccoli per dag, sju som äter 80 g per dag, och sex som avstod från att äta Brassicaceae. Vi observerade att mängden cirkulerande miR160 och miR2673 minskade signifikant efter en veckas fasta från Brassicaceae (p <0, 01, fig. 2c), medan den ökade signifikant igen efter intag av 80 g broccoli per dag (p <0, 01) . Fördubbling av den dagliga dosen av broccoli ökade signifikant närvaron av microRNA (p <0, 0001), medan att avstå från att äta Brassicaceae var associerat med en signifikant minskning (p <0, 01). Sekvensering av PCR-produkterna bekräftade amplifiering av microRNA och dess specificitet (såsom visas i tilläggstabell 5). hsa-miR21 inkluderades som en negativ kontroll och, såsom visas i fig. 2c, var det ingen förändring i dess detektering under hela experimentet. Individer som fortsatte att äta 80 g broccoli / dag upprätthöll en liknande mängd (p = 0, 37 för miR160 och p = 0, 10 för miR2673) men visade en liten minskning av de detekterbara cirkulerande mikroRNA, vilket antyder en möjlig tendens till platå efter en längre exponering för en konstant mängd broccoli. Vi drar således slutsatsen att broccolimikroRNA kan detekteras i serum på dos- och tidsberoende sätt.

Brassica microRNA är inriktade på humana gener in vitro

Eftersom flera epidemiologiska studier har visat en förebyggande roll som Brassica-grönsakskonsumtion på flera cancertyper, satte vi oss för att undersöka om miR160 nedreglerar gener som är signifikant och ofta uppreglerade i lungcancer som inte är små celler (NSCLC). Vi har fokuserat på lungcancer eftersom det förblir den främsta orsaken till cancerrelaterad död över hela världen 18, och specifikt på NSCLC eftersom det står för cirka 80–85% av alla fall av lungcancer 19 .

Vi har valt två NSCLC-cellinjer med det högsta uttrycket av minst en av de gener som identifierats som förmodade broccoli-miRNA-mål. Vi transfekterade sedan de två cancercellinjerna med miR160-mimik och mätte den potentiella nedregleringen av målen. Figur 3 visar att 8 av 9 testade gener signifikant nedreglerades genom transfektion av miR160 ((p <0, 05); MCM5 ändrades inte). Kompletterande figur 5 visar mängden transfekterad miR160 per cellinje, medan kompletterande tabell 6 visar p-värden för jämförelser av alla prover mot AllStars Negative Control. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan AllStars Negative Control, transfektionsreagens och inte behandlade celler (kompletterande tabell 6). NCBP2 och SHMT2 reducerades signifikant både som transkript och protein, medan MTHFD2 reducerades som transkript men inte protein efter transfektion av miR160 (kompletterande figur 6). Mänsklig mikroRNA-reglering av CDC6 har redan beskrivits som en mekanism för att förebygga bildning av lungcancer 20, medan PYCR1 och MTHFD2 har visats vara nödvändigt för brösttumorigenes in vitro 21 .

Förhållande av uttryck av testade gener efter transfektion av miR160 i två NSCLC-cellinjer jämfört med expression i negativ kontroll (AllStars, förvrängd sekvens). siPORT = transfektionsreagens. NT = inte behandlad. p-värden (t-test): * 0, 05–0, 01, ** 0, 01–0, 001.

Bild i full storlek

miR160 kompletterar bioaktiva föreningar

Eftersom flera föreningar som finns i Brassica-grönsaker hade varit implicerade med anticarcinogena effekter på tumörceller, beslutade vi att testa om molekylära mål kan påverkas unikt av miRNA eller om det är en kombinerad effekt av Brassica-mikroRNA och naturliga föreningar. Det enda offentligt tillgängliga datasättet som är lämpligt för att testa denna hypotes är emellertid en studie där gastriska biopsier samlades före och efter intag av högt glukosinolat (HG, berikat med sulforaphane) eller vanlig broccoli 22 . Som rapporterats nedreglerades tio sonder och 20 uppreglerades efter intag av HG-broccoli medan 21 nedreglerades och två uppreglerades efter intag av vanlig broccoli; överlappningen av de två uppsättningarna omfattade 8 sonder (201170_s_at, 209674_at, 209750_at, 209803_s_at, 225768_at, 225840_at, 228846_at, 244677_at).

Vi bestämde oss för att testa 11 gener, 4 avreglerade efter exponering för HG-broccoli, 3 avreglerats efter regelbunden exponering av broccoli och 4 gemensamt mellan de två uppsättningarna, i en magcellcellinje som uttryckte alla dessa mål, MNK45. Vi transfekterade cellerna med miR160-efterlikning och behandlade dem med sulforaphane eller DIM, och för varje behandling testade vi förändringen i uttrycket för de utvalda generna. DIM inkluderades i experimentet eftersom det är ett av de två isotiocyanaterna som finns i Brassicaceae, tillsammans med sulforaphane, som oftast studerades med avseende på deras cancerframkallande egenskaper 10 . Såsom visas i fig. 4 regleras de två generna som är uppreglerade i HG-gastriska biopsier också efter behandling med sulforaphane medan endast en (AKR1C2) är uppreglerad efter behandling med DIM. Av de återstående 9 nedreglerade generna avreglerades 6 enbart med miR160, en av miR160 och sulforaphane (DUSP4) och en av miR160 och DIM (FOS). Studentens t-test-p-värden beräknade för varje gen i DIM-, sulforaphane- eller miR160-behandling mot icke behandlade cellinjer listas i kompletterande tabell 7.

Figuren visar vikförändring för 11 gener och miR160 i 5 uppsättningar av prover. Högt glukosinolat (HG) och regelbundet representerar prover från gastriska biopsier efter intag av HG (berikad i sulforaphane) eller vanlig broccoli enligt Gasper et al . 22, och vikningsändringsdata samlas in från samma papper. Sulforaphane, DIM och miR160 avser MNK45-cellinje behandlad med var och en av de nämnda molekylerna, och vikförändring mättes med realtid PCR (logtransformerad för att vara jämförbar med Gasper et al . Vikningsändring). Blå block representerar nedreglerade gener, röda till gröna block uppreglerade. Grå block saknar värden från Gasper et al . papper.

Bild i full storlek

Dessa resultat indikerar att hälften av de testade generna inte skulle validera om endast kemiska föreningar beaktas för biologisk aktivitet av Brassica-grönsaker. Detta belyser de komplementära effekterna av mikroRNA och aktiva föreningar som finns i broccoli och betonar vikten av att beakta flera komponenter och mekanismer när man studerar effekten av diet på hälsan.

Diskussion

Efter Zhang et al . den första publikationen som rapporterade växtmikroRNA upptäckt i humant blod 23, flera forskare försökte replikera och vidare adressera dessa fynd. Även om resultaten förblir diskuterade är det uppenbart att dessa studier måste planeras ordentligt och kontrolleras för att ge meningsfulla resultat.

Tre studier misslyckades med att upptäcka växtmikroRNA i växtfodrade organismer: Witwer et al . detekterade en variabel mängd växtmikroRNA i blod av endast två Macaca nemestrina med en PCR-teknik och en låg mängd med två andra 24 ; Snow et al . misslyckades med att upptäcka växtmikroRNA i blod från idrottare som rapporterade att de ätit frukt till frukost på dagen för blodsamlingen och upptäckte låga mängder i mössplasma och vävnader (när möss matades färsk avokado istället för bearbetad mat) 25 ; Dickinson et al . detekterade mycket låga avläsningar i mössplasma och lever med djup sekvensering 26, men den använda tekniken har ifrågasatts 27 . Två andra publikationer antydde att detektering av växtmikroRNA i mänskliga datasätt kan bero på kontaminering från andra prover snarare än från den verkliga närvaron av sådana mikroRNA 28, 29 . Trots detta bekräftar fler grupper resultaten från Zhen et al . efter att ha utfört mer exakta och riktade studier. Wang et al . inrätta en mer exakt metod för att detektera exogena mikroRNA i djup sekvenseringsdata och lyckades identifiera en högre mängd av sådana molekylära arter än andra studier 30 . Liang et al . visade närvaron av växtmikroRNA i olika mössvävnader och gav en mycket användbar tidskurva för utseende och försvinnande av mikroRNA 16 . På liknande sätt Yang et al . visade att växtmikroRNA kan detekteras i mössserum och urin i nivåer som är proportionella mot mängden mikroRNA närvarande i växten som matats till djuret, medan en betydande mängd av den syntetiska formen av mikroRNA som matats till djuren knappt skulle öka detekteringen av molekyl och skulle rensas snabbt när den injiceras i svansven 31 . Samma grupp visade också att mängden växtmikroRNA ökar när det sker en patologisk eller inducerad förändring av tarmpermeabiliteten 32 . Intressant nog är studier på exogena mikroRNA inte begränsade till detektering av mikroRNA: Zhou et al . visade förmågan hos växtens mikroRNA att nå blod och lunga hos möss och att undertrycka replikering av influensa A-virus 33 ; Mlotshwa et al . modifierade mus-tumörsuppressormikroRNA för att molekylärt likna växtmikroRNA, och efter att ha matat dem till möss upptäckte en signifikant minskning av tumörbördan 34 ; Chin et al . visade en korrelation mellan mängden växtmikroRNA i humant blod och skydd från bröstcancer, detekterade en proportionell mängd växtmikroRNA i brösttumörvävnad och bevisade förmågan hos miR-159 att minska celltillväxt in vitro och tumörvikt in vivo 35 .

I detta sammanhang ger våra resultat bevis på att mikroRNA bör inkluderas i funktionella studier tillsammans med bioaktiva föreningar för att skapa en mer omfattande förståelse av de underliggande mekanismerna för de skyddande effekterna av grönsaker och frukt på människors hälsa. Att demonstrera den molekylära förmågan hos växtderiverade mikroRNA att kontrollera mänskliga gener in vitro , tyder på att vi inte kan ignorera dessa korta molekyler när vi överväger epidemiologiska effekter av ätliga växter.

Det är viktigt att våra data som erhållits från stor populationsstudie och en doskontrollerad randomiserad studie visade en stark dosberoende korrelation av broccolimikroRNA påvisade i humant serum. Vår randomiserade studie understryker också behovet av korrekt kontrollerade studier för att undersöka molekylära effekter av dietintag, för att minska effekten av förvirrande faktorer som alltid finns när man hanterar individuella livsstilsvanor, käll- och beredningsvariationer. Våra resultat antyder att mängden cirkulerande Brassica-mikroRNA väsentligt ökar med ökningen av Brassica-växtintaget. Det indikerar också att uttrycket mättas om man bibehåller samma antal portioner, vilket antyder en möjlig mekanism för människokroppens anpassning till en konstant mängd växt-härledd mikroRNA-exponering som behöver ytterligare undersökningar med längre exponeringstider.

Slutligen är väldesignade interventionsstudier som utvärderar andra livsmedel och mikroRNA nödvändiga för att fortsätta att noggrant hantera detekterbarheten och möjliga roller för exogena mikroRNA som cirkulerar i humant blod för regleringen av genuttryck och deras koppling till människors hälsa.

metoder

mikroRNAs inriktning och prioritering

Brassica oleracea microRNA erhölls från miRNEST 2.0 (//rhesus.amu.edu.pl/mirnest/copy/; laddas ner 15 september 2014). För att fastställa om förekomsten av något av dessa mikroRNA redan har validerats experimentellt sökte vi efter Brassica oleracea microRNA i PMRD version 1 36 (//bioinformatics.cau.edu.cn/PMRD/). Eftersom endast bol-miR824 har validerats experimentellt har vi inkluderat det i den efterföljande analysen oberoende av ytterligare prioritering.

Varje mogna mikroRNA-sekvens korsreferenserades mot hela miRNEST-uppsättningen för att identifiera artsspecificitet.

Inriktning av Brassica-mikroRNA till mänskliga gener förutsagdes med användning av Probability of Interaction by Target Accessibility (PITA) algoritm version 6 37 mot humana 3 ′ UTR (UCSC hg19, GRCh37, //hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html#human ). Som beskrivits av författarna definierades förmodade träffar med den rekommenderade ΔΔG-tröskeln på −10 kcal / mol · K. Dessa sökbara träffar är tillgängliga för allmänheten via mirDIP 2-portalen (//ophid.utoronto.ca/mirDIP).

För att prioritera mikroRNA att testa i våra efterföljande analyser undersökte vi CDIP-version 1 (//ophid.utoronto.ca/cdip) för gener som avreglerats i lungcancer och behöll de som var uppreglerade i mer än 10 studier. Vi valde sedan för vår analys Brassica oleracea microRNA som är inriktade på det högsta antalet av dessa gener och med en strängare termodynamisk energitröskel än den som föreslogs av PITA-författare (lägre än −15 kcal / mol · K).

Växtprover och extraktion

Som en representativ Brassica oleracea ätbar växt valde vi broccoli, en växt som finns i globala dieter. Broccoli-växter erhölls från fyra olika leverantörer i Toronto: Loblaws (1, //www.loblaws.ca), Metro (2, //www.metro.ca), Costco (3, //www.costco.ca) och Sobeys (4, //www.sobeys.com). Växter från Loblaws och Metro var "organiska" medan de två senare proverna var från konventionella källor. En liten kub eller kvadrat (3 mm per dimension) samlades in från blommor (högst upp på växten), stjälkar (1 cm under blommakronan) och bladens mitt.

Prover skars ytterligare med små saxar och återsuspenderades sedan i 1 ml Tri-reagens (BioShop, Kanada). Efter att lösningen fick stå i 10 minuter i is, spanns prover vid 13 000 g under en minut med användning av DNA IQ-spinnkorgar (Promega, Madison, WI, USA) för att separera växtämnen. 500 ul flödeslösning uppsamlades och användes för RNA-extraktion efter den första delen av tillverkarens protokoll. När vattenfasen samlades in fortsatte extraktionen med användning av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Limburg, Nederländerna) enligt tillverkarens protokoll.

För att testa effekten av tillagningsförfaranden på microRNA: n utförde vi 3 omgångar med olika tillagningsförfaranden med ett huvud av broccoli från Costco för var och en av dem. Förfarandena: bakades, lindade i aluminiumfolie, under 10 minuter vid 175 ° C; ångade 8 minuter; mikrovågsugn under 5 minuter i vatten vid 750 W; stekpanna stekt 5 minuter i vatten; kokt 5 minuter; hällde varmt vatten i en behållare ovanför rå broccoli och låt sitta i 3, 5 och 10 minuter; blandades i vatten i 3 minuter med användning av Magic Bullet. Prover placerades i 500 ul RNAlater (Life-teknologier) och extraherades såsom beskrivits ovan. 1 ml vatten uppsamlades också från ångade, kokta och hällda prover, snurrades vid 3000 g under 10 minuter, 500 ul supernatant avlägsnades och 1 ml Tri-reagens tillsattes för att fortsätta enligt ovanstående protokoll.

Broccoli-växter för den randomiserade försöket köptes på Costco två gånger per vecka. Vi använde paket med broccolihuvud (samma leverantör och parti) för att säkerställa konsumtionen av samma del av anläggningen av alla deltagare i alla tidpunkter.

Mänskliga prover och extraktion

För att testa närvaron av Brassica microRNA i serum hos unga individer som äter broccoli, valde vi 40 individer från Toronto Nutrigenomics and Health (TNH) Study (n = 1 631). TNH-studien är en tvärsnittsundersökning av unga män och kvinnor i åldern 20–29 år som rekryterades från campus University of Toronto mellan oktober 2004 och december 2010 38 . Studien godkändes av University of Toronto Ethics Review Board och alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och förordningar. Försökspersonerna fyllde ett 1 månaders halvkvantitativt Toronto-modifierat matfrekvensfrågeformulär (FFQ) från 196 objekt, ett allmänt frågeformulär för hälsa och livsstil, ett frågeformulär för fysisk aktivitet och gav ett fastande blodprov. Gravida eller ammande kvinnor såväl som individer som fasta av religiösa skäl utesluts från studien. Försökspersonerna delades in i konsumenter med hög korsfästare (minst en portion per dag) och konsumenter med låg korsfästare (0 portioner per dag) enligt deras broccoliintag som rapporterats i FFQ. Vi samlade en serumdel på 200 μl för var och en av dem och de sammanfattande funktionerna för varje grupp är listade i tilläggstabell 4.

Dessutom utförde vi en kontrollerad prospektiv studie: frivilliga ingick vid skriftligt informerat samtycke (studie godkänd av University Health Network Research Ethics Board, REB 13-7077 AE. Alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och förordningar. Vi inkluderade endast frivilliga som inte var allergiska mot broccoli). 15 ml blod uppsamlades i ACD före någon intervention (tid noll); efter en vecka med att avstå från att äta Brassicaceae (där individer avstod från att äta Brassica oleracea- grönsaker, tid 1); efter en veckas konsumtion av 80 g broccoli per dag (tid 2) och i slutet av den efterföljande veckan där individer delades upp i 3 grupper (tid 3 konsumerade en grupp 160 g broccoli per dag, en grupp konsumerade 80 g broccoli per dag och en grupp ätit inte broccoli). Kompletterande figur 2 visar samlingens protokoll. Under de två veckorna där individer äter broccoli ombads de att undvika andra grönsaker från Brassica-familjen. Individer gavs förpackade dagliga doser av broccoli två gånger per vecka (3 doser på måndag och 4 doser på torsdag).

Blod centrifugerades vid 2 000 g under 10 ° och 3 serumdelar om 200 ul vardera uppsamlades och lagrades vid -80 ° C. RNA-extraktion utfördes i en av de tre delarna med Tri-reagens (BioShop, Kanada) och RNeasy Mini Kit (Qiagen, Limburg, Nederländerna) enligt tillverkarens protokoll som beskrivits ovan.

Realtid PCR

RNA för varje prov transkriberades omvänd med miScript II RT Kit (Qiagen) enligt tillverkarens instruktioner. Resulterande cDNA utspäddes 1:10 och användes för att utföra Real Time PCR med användning av miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) efter tillverkarens protokoll. För att testa moget mikroRNA-uttryck använde vi den (omvända) Universal Primer som ingår i satsen och designade vår egen framåt, medan för prekursor-mikroRNA och genuttryck designade vi båda primrar (alla listade i tilläggstabell 8). För att bekräfta effekten av miR160 eller Brassica-föreningar på gener rapporterade som dereglerade i Gasper et al . 22, vi designade grundpar för 11 sådana gener. Vi använde Primer Design-verktyget i programvarupaketet Visual OMP (version 7.6.58 DNA Software Inc., Ann Arbor, MI, USA) under förhållanden vid 55 ° C, 0, 05 M NaCl, 0, 002 M MgCl2, vid 1 × 10 −7 M-koncentration och primrar valdes baserat på procentbundet. Anpassade primrar simulerades i silico med simuleringsverktyg inkluderat i Visual OMP-paketet (DNA Software Inc.) för att säkerställa en hög specificitet till lågt brusförhållande. Alla PCR: er i realtid kördes i ett LightCycler 480-system (Roche). I alla PCR: er i realtid beräknade vi uttryck med hjälp av geometriskt medelvärde för referensgener. I cellinjer normaliserades värden på icke-behandlade (MNK45-cellinjer) eller AllStars-transfekterade celler (H2170 och H2290). I MNK45-fall transformerades uttryck log2 för att göra värdena jämförbara med de som samlats in i litteraturen.

För att säkerställa specificiteten för broccoli microRNA PCR-produkterna i humant blod klonade vi de amplifierade PCR-produkterna från miR-160 och miR-2673 i pUCM-T-kloningsvektorn (Bio Basic Inc) med användning av DH5a-kompetenta celler. Plasmiden renades med användning av EZ-10 Spin Column Plasmid DNA mini-preps-kit enligt tillverkarens riktning. Sekvenser bekräftades genom Sanger-sekvensering (Center for Applied Genomics, Sick Kids Hospital, Toronto) och beräknades i linje med användning av blastn (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome).

Celllinjer och transfektion

Icke-småcelliga lungcancer och gastriska cellinjer med det högsta uttrycket för generna av intresse valdes baserat på data som samlats in från CCLE (//www.broadinstitute.org/ccle/home nedladdat 29 september 2012).

H2170 och H2290 lungcancercellinjer tillhandahölls vänligt av Dr. Ming Tsao (University Health Network) medan MNK45 gastriska cancercellinjer tillhandahöll vänligen av Dr. Morag Park (McGill University). Alla cellinjer odlades i RPMI 1640 (Invitrogen, Life-teknologier, Grand Island, NY, USA) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (Invitrogen) och 1% streptomycin / penicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) vid 37 ° C och 5% CO2.

Alla cellinjer transfekterades med 50 nM miR160 mimic eller 50 nM AllStars Negative Control (Qiagen) och siPORT NeoFX Transfection Agent (Life-teknologier) enligt tillverkarens protokoll. Varje brunn skördades efter 48 timmar och RNA extraherades såsom beskrivits ovan.

Gastricellinjer behandlades också med Sulforaphane, (Sigma-Aldrich, vid IC50 20 uM), diindolylmetan (Sigma-Aldrich, DIM) (vid IC50 100 uM) och DMSO (1%).

Western Blotting

Celler homogeniserades i en RIPA-buffert kompletterad med proteas- och fosfatasinhibitorcocktails (Roche). Homogenaten centrifugerades vid 13 000 rpm under 10 minuter, och supernatanterna användes som helcellslysat. Proteinkoncentration bedömdes genom Bio-Rad BCA-proteinanalys. 30 ug proteinlysat separerades med SDS-PAGE och överfördes sedan till ett PVDF-membran. Membranen testades med primär anti-CDC6 (Bethyl Laboratories Inc., kat. A302-487A-T-1), anti-NCBP2 (Bethyl Laboratories Inc., kat. A302-553A-T), anti-SHMT2 (Cell Signaling, kat. 12762), anti-MTHFD2 (Cell Signaling, kat. 41377) - allt vid 1: 1 000 utspädning - eller anti-aktin (Santa Cruz Biotechnologies) - vid 1: 500-utspädning - under 1 timme. Membran tvättades och inkuberades sedan med HRP-konjugerad åsna-anti-kanin (Santa Cruz Biotechnologies) vid 1: 5 000 utspädning eller HRP-konjugerad åsna-anti-get (Santa Cruz Biotechnologies) vid 1: 10 000 utspädning. Protein detekterades med Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer) och analyserades med användning av ImageJ Software ver. 1, 50 (NIH, USA).

Genuttrycksdatasats och statistisk analys

Ett offentligt tillgängligt datasätt som mätte genuttrycksdata före och efter intag av Brassicaceae användes för vår analys, som beskriver förändringar av genuttryck i magslemhinnan före och efter förtäring av regelbundet eller högt glukosinolat (berikat med sulforaphane) broccoli (i det papper vi refererar till dessa prover när det gäller "vanlig" och "HG") 22 . Vi har skapat en lista över deregulerade gener med kompletterande data från denna studie.

Statistiska analyser utfördes med användning av GraphPad PRISM 6.05. MicroRNA-transfekterade prover jämfördes med prover behandlade med AllStars Negative Control med användning av t-test. I gastriska cellinjer jämfördes mikroRNA-transfekterade eller förenade behandlade celler till ej behandlade med användning av t-test. Prover från olika tillagningsförfaranden jämfördes med rå broccoli med användning av envägs ANOVA och flera jämförelser. Prover från individer som ätde hög mängd Brassicaceae per dag jämfördes med prover som ät låg mängd med Mann-Whitney-test. Prover från olika tidpunkter i den kontrollerade broccolistudien jämfördes mellan varandra med användning av tvåvägs ANOVA och flera jämförelser.

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Pastrello, C. et al . Cirkulerande växt-miRNA kan reglera humant genuttryck in vitro . Sci. Rep . 6, 32773; doi: 10.1038 / srep32773 (2016).

Förändra historien

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande information

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.