En kemiluminescent proteinmikroarray-metod för bestämning av seroglykoidfukosyleringsindex | vetenskapliga rapporter

En kemiluminescent proteinmikroarray-metod för bestämning av seroglykoidfukosyleringsindex | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Biologiska tekniker
  • cancer
  • Diagnostiska markörer

Abstrakt

Den Lens culinaris agglutinin-reaktiva fraktionen av AFP (AFP-L3) används allmänt för att screena för hepatocellulärt karcinom (HCC) i Japan och Kina. Vi utvecklade ett kemiluminescerande proteinmikrofärg för att bestämma AFP-L3 / AFP-indexet (förhållandet AFP-L3 till total AFP, AFP-L3%) genom att fixera AFP-specifika antikroppar och Lens culinaris lektin på aldehydbelagda glasglas. Serumprover testades för AFP med användning av en enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) för att validera mikroarrayen. AFP-L3 detekterades med användning av Hotgen Biotech-glykosyl-fångstspinnkolonnförbehandlingsteknik och ELISA. När AFP-avstängningsvärdet ställdes till 20 ng / ml, uppvisade proteinmikroarray 89, 74% känslighet och 100% specificitet för HCC-diagnos, och ELISA visade 87, 17% känslighet och 100% specificitet. När AFP-L3% avstängningsvärdet sattes till 0, 1, uppvisade proteinmikroarray 56, 41% känslighet och 100% specificitet för HCC-diagnos, och ELISA visade 53, 84% känslighet och 100% specificitet. ROC-kurvan för HCC-diagnosen visade att AFP-området under ROC-kurvan (AUC = 0, 996; 95% CI: 0, 986–1, 005) var mycket högre än AFP-L3 (AUC = 0, 857; 95% CI: 0, 769–0, 94) ) och AFP-L3% (AUC = 0, 827; Cl: 0, 730–0, 924). Mikroarrayanalysen som användes i denna studie är en mycket känslig, noggrann och effektiv analys för bestämning av AFP-L3%.

Introduktion

Alfafetoprotein (AFP) producerat av primär levercancer skiljer sig från det som genereras av hepatit, levercirrhos och andra godartade leversjukdomar med avseende på kolhydratkedjan. Jämfört med AFP som genereras av godartade leversjukdomar har AFP genererat av levercancer ett mycket högre fukosyleringsindex. Fucose har karakteristiken att binda till Lens culinaris agglutinin (LCA), som isoleras från Lens culinaris (linser) frön. Den har två underenheter och en molekylvikt på 46 kDa och bildar ett komplex med sackaros. LCA är en användbar komponent i affinitetskromatografikolonner för separering av glykokonjugat. AFP kan kategoriseras i AFP-L1, AFP-L2 och AFP-L3 beroende på affiniteten hos fucosresterna för LCA. AFP-L3 har en hög bindande affinitet för lektin LCA. AFP-L1 produceras huvudsakligen vid godartade leversjukdomar, AFP-L2 produceras främst av gravida kvinnor, och AFP-L3 produceras huvudsakligen i hepatocellulärt karcinom (HCC) 1, 2, 3 . 2005 godkände Food and Drug Administration (FDA) i Förenta staterna (USA) användningen AFP-L3 som en tumörmarkör för primär levercancer. AFP-L3 har hög specificitet och känslighet för tidig diagnos, differentiell diagnos, utvärderingar av terapeutiska effekter och prognosövervakning 4, 5, 6 .

Fucose är en metylerad hexos som finns i kolhydratkedjor av olika glykoproteiner i vävnad och serum och kallas proteinbunden fucos (P-bf). En fukosrest finns i kolhydratkedjan i AFP. Denna heteroplasmon kallas fucosylated AFP (FucAFP), och dess procentandel av den totala mängden AFP kallas fucosylation index (Fuol) 7, 8, 9 . Fuol har viktig teoretisk och klinisk betydelse och kan användas som en viktig indikator vid diagnostisk diagnostik och prognostiska applikationer i lever. AFP-L3 är en indikator på det biologiska beteendet hos HCC. AFP-L3-nivåerna korrelerar med patientens överlevnad och behandling. AFP-L3-positiv HCC har potential för snabb tillväxt och tidig avlägsna metastaser. Förhöjda nivåer av AFP-L3 anses indikera behandlingssvikt.

Den konventionella metoden för separering av serumfukosprotein involverar den korsade affinitetens immunoelektrofores teknik 10, 11, affinitetsblotting 12, 13, affinitetskromatografi 14, 15, en "dubbel-plats-sandwich" enzymbunden immunosorbentanalys 16, en LiBASys-testare (Chuo-ku Japan), detektionssystemtekniken μTASWako ® i30 (Richmond, VA USA), och Hotgen Biotech-glykosylfångstningsteknologi för förbehandling av spinnkolonn (Peking, Kina). Av dessa komponenter har fytolektinaffinitetsimmunoelektrofores-tekniken och μTASWako ® i30-detektionssystemtekniken sofistikerade krav och använder dyra reagens, vilket begränsar deras popularisering och tillämpning. Dessutom gör glykosylfångstspinnkolonnen förfarandena mer komplicerade eftersom provbehandlingen och detekteringen separeras.

I denna studie utvecklades en proteinmikroarray-metod för att kvantitativt detektera AFP och / eller FucAFP i biologiska prover och ta itu med avsaknaden av kvantitativ detekteringsteknologi för AFP och AFP-L3 i serum. Tillämpningen av proteinmikroarray-tekniken på AFP är inte ny, men dess tillämpning på AFP-L3 är ny. Så vitt vi vet har en proteinmikroarray-metod för att detektera AFP-L3 inte rapporterats tidigare. Denna metod är tillämpbar både för detektion av AFP-antigen i serum såväl som för den allmänna detektionen av andra fukosylerade proteiner. Dessutom har det fördelarna med att vara tidsbesparande, billigt, korrekt och bekvämt.

Resultat och diskussion

Alla serumprover, inklusive de från försökspersoner med HCC och friska kontroller, detekterades genom AFP-L3% proteinmikroarrayanalys. Serum-AFP- och AFP-L3-nivåerna var markant högre hos patienter med HCC än hos friska individer. Den nuvarande AFP-detektionsnivån antar 20 ng / ml som gränsen 17, 18, med friska individer med AFP-värden på mindre än 20 ng / ml. En AFP-L3%> 10–15% är en positiv indikator på HCC 17 .

Serumprover erhållna från 39 friska blodgivare och 10 tomma kontrolllösningar testades för att utvärdera detektionsspecificiteten för proteinmikroarrayen. Skanningsdiagrammen för nio HCC-serumprover och ett normalt friskt serumprov visas i fig. 1. Varken AFP-nivåer större än 20 ng / ml eller AFP-L3% större än 10% erhölls från de friska serumproven, vilket indikerar att den falska positiva frekvensen för mikroarrayen som presenterades här var mycket låg eller till och med noll. AFP-nivåer mindre än 20 ng / ml men större än 0 detekterades i 2 av 39 friska prover, och en AFP-L3% på mindre än 10% detekterades i 1 av 39 friska prover. Med användning av ELISA-analysen detekterades AFP-nivåer mindre än 20 ng / ml men större än 0 i 3 av 39 friska prover, och en AFP-L3% på mindre än 10% detekterades i 1 av 39 friska prover. Varken AFP-nivåer större än 20 ng / ml eller en AFP-L3% större än 10% erhölls från de friska serumproverna av ELISA.

HCC-serumprover, 1–9; normalt friskt serumprov, 10.

Bild i full storlek

Resultaten av proteinmikroarrayen visade att AFP detekterades i 37 av 39 HCC-prover (94, 87%). En AFP-nivå överstigande 20 ng / ml observerades i 35 av 39 HCC-prover (89, 74%). Både AFP och AFP-L3 detekterades i 26 av 39 HCC-prover. Varken AFP eller AFP-L3 detekterades i 2 av 39 HCC-prover. En AFP-L3% större än 10% observerades i 22 av 26 HCC-prover (84, 61%), medan en AFP-L3% mindre än 10% observerades i 4 av 26 prover. Samtliga data sammanfattas i tabell 1. Proteinet för mikromikroarray uppvisade en känslighet av 89, 74% och en specificitet av 100% för att detektera AFP och kan således pålitligt användas i kliniska tillämpningar.

Full storlek bord

Alla de ovan beskrivna proverna testades också med användning av Hotgen Biotech-glykosyl-fångstspinnkolonnförbehandlingsteknologi och ELISA-analys vid det kliniska laboratoriet vid Beijing YouAn Hospital. Tidigare data med användning av Hotgen Biotech-glykosylupptagning av spinnkolonnförbehandling och ELISA jämfördes med proteinmikroarray-resultaten från den aktuella studien för att utvärdera mikroarray-analysen. AFP detekterades i 37 av 39 HCC-prover (94, 87%). En AFP-nivå högre än 20 ng / ml observerades i 34 av 39 HCC-prover (87, 17%). Både AFP och AFP-L3 detekterades i 26 av 39 HCC-prover. Varken AFP eller AFP-L3 detekterades i 2 av 39 HCC-prover. En AFP-L3% större än 10% observerades i 21 av 26 HCC-prover (80, 76%), medan en AFP-L3% mindre än 10% observerades i 5 av 26 prover (tabell 1). Det fanns inga statistiskt signifikanta skillnader mellan ELISA och proteinanalyser i endera gruppen (P> 0, 05; χ2-test). Det fanns en statistiskt signifikant skillnad i mätningen av proteinmikroarray och ELISA mellan HCC-patienterna och friska kontroller (P <0, 01). När AFP-avstängningsvärdet sattes till 20 ng / ml, uppvisade proteinmikroarray 89, 74% känslighet och 100% specificitet för HCC-diagnos, medan ELISA uppvisade 87, 17% känslighet och 100% specificitet. När AFP-L3% avstängningsvärdet sattes till 0, 1, uppvisade proteinmikroarray 56, 41% känslighet och 100% specificitet för HCC-diagnos, och ELISA visade 53, 84% känslighet och 100% specificitet.

ROC-kurvan för diagnos av HCC visas i fig. 2. Området under ROC-kurvan (AUC) indikerar den kliniska användbarheten av en tumörmarkör. Våra resultat visade att AFP-området under ROC-kurvan (AUC = 0.996; 95% Cl: 0.986–1.005) var mycket högre än AFP-L3 (AUC = 0.857; 95% Cl: 0.769–0.94) och AFP-L3 % (AUC = 0, 827; Cl: 0, 730-0, 924). Våra data visade att de förhöjda AFP-L3-nivåerna positivt korrelerade med AFP-nivåerna (r = 0, 974, P = 0, 000). AFP-L3 korrelerade emellertid inte med tumörstadierna, vilket kan bero på det begränsade antalet patienter (kompletterande information).

Området under ROC-kurvan (AUC) indikerar den kliniska användbarheten av en tumörmarkör. Våra resultat visade att AFP-området under ROC-kurvan (AUC = 0.996; 95% Cl: 0.986–1.005) var mycket högre än AFP-L3 (AU = 0.857; 95% Cl: 0.769–0.94) och AFP-L3 % (AUC = 0, 827; Cl: 0, 730-0, 924).

Bild i full storlek

Här presenterar vi ett kemiluminescerande proteinchip för att upptäcka seroglykoidfukosyleringsindex. Det kemiluminescerande proteinchipet är baserat på antikropp-antigen-antikroppssandwich-reaktionen och kemiluminescensprinciperna 19, 20 . De AFP-specifika antikropparna och LCA-föreningar fixerades på ytan av aldehydbelagda glasskivor. De AFP-specifika antikropparna användes för att binda alla AFP (AFP-L1, AFP-L2 och AFP-L3) i serum, medan LCA användes för att binda FucAFP (AFP-L3) 21, 22 . Kontrollfläckar ingick också. Därför kan den totala koncentrationen av AFP och koncentrationen av FucAFP i serumet detekteras samtidigt under identiska förhållanden; sålunda kan seroglykoidfukosyleringsindexet uppskattas exakt. Anti-AFP-antikroppen (0, 5 mg / ml) och LCA (4 mg / ml) upptäckta på de aldehydbelagda objektglasen var specifikt bundna till AFP-antigenet respektive AFP-L3. AFP är ett välkänt tumörassocierat protein. Mätningar av serum AFP-nivåer är användbara för att detektera HCC. Korrelationen mellan serum AFP eller AFP-L3 nivåer och graden av histokemisk AFP eller AFP-L3 positivitet har emellertid inte påvisats 23 . Avsaknaden av signal i HCC-patienter (eller friska) prover återspeglar de låga AFP- och AFP-L3-koncentrationerna. Referensområdet för totalt serumprotein är typiskt 60–80 g / l. Koncentrationer under referensområdet återspeglar vanligtvis en låg albuminkoncentration, såsom vid leversjukdom eller en akut infektion. I denna studie utfördes en retrospektiv studie vid Beijing Youan-sjukhuset bland 43 HBV-infekterade patienter, 79 patienter med cirros och 189 patienter med HCC (steg 0, 48; steg A, 47; steg B, 46 och steg C, 48). AFP-nivåerna och de totala serumproteinnivåerna i blodet mättes hos de 311 patienterna. Statistiska analyser genomfördes med användning av SPSS version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) för Windows. Våra resultat visade att serum-AFP-nivåerna var negativt korrelerade med totala serumproteinnivåer (r = 0, 113, P = 0, 046).

Alfafetoprotein (AFP) är huvudkomponenten i däggdjurets fosterserum. Det syntetiseras av den viscerala endodermen i äggulssäcken och av fostrets lever, och det kan inte upptäckas eller detekteras endast i spårmängder hos vuxna. AFP-L3 är en isoform av alfa-fetoprotein (AFP), ett ämne som vanligtvis används i trippeltestet under graviditet och för screening av patienter med kronisk leversjukdom för hepatocellulärt karcinom (HCC). AFP produceras av majoriteten av hepatocellulära karcinom och är direkt relaterad till sjukdomens svårighetsgrad 24 . Förutom utsöndring av AFP uttrycker 90% av hepatocellulära karcinomceller telomeras. Det har också rapporterats att AFP kan modulera de apoptotiska signaler som induceras av olika cytotoxiska faktorer genom att antingen främja eller hämma apoptos 25 . En ny studie visade att cytoplasmatisk AFP kan fungera som en regulator för celltillväxt genom att interagera med PTEN (fosfatas och tensinhomolog raderat på kromosom tio) och stimulera celltillväxt genom PI3K / AKT signalväg 26 .

Under graviditetens första trimester var AFP-nivåerna högre hos kvinnor med anti-HCV-antikropp än hos kvinnor utan den 27 . PLAP, CD117, AFP och ß-HCG är rutinmässiga immunhistokemiska markörer för diagnos och differentiell diagnos av maligna kimcells tumörer 28, 29, 30 . AFP-nivåerna ökas också ibland hos patienter med kronisk viral hepatit och cirros som inte har HCC 31, 32, 33, 34 . AFP och (eller) AFP-L3 nivåer kan vara förhöjda som svar på ovan nämnda sjukdomar. Därför kan denna analys också utföras hos gravida kvinnor med akut eller fulminant hepatit, kimcells tumörer, virusinfektioner och skrump.

HRP är den mest använda katalysatorn i enzymatiska reaktioner 35, 36 . Det är isolerat från pepparrotsrötter och innehåller fukosrester. Om proverna var märkta med HRP, skulle fukosresterna i HRP binda till LCA och därmed störa testet. Experiment utförda i denna studie visade att ett exakt fukosyleringsindex inte kan erhållas på detta sätt eftersom den falska positiva hastigheten är mycket hög och mycket höga fucosyleringsindexvärden kan erhållas för normalt serum. Emellertid kan proteinmikroarrayanalys som presenteras i denna studie användas för kvalitativ detektion och kan också kvantitativt bestämma AFP- och FucAFP-nivåerna baserat på kemiluminescensintensiteten. Proteinmikroarrayen som presenteras här tillhandahåller också en metod för kvantitativ bestämning av FucAFP-nivåerna. Med användning av specifik bindning mellan antikroppar och antigener och den specifika bindningen mellan LCA och fucos i kombination med biotinmärkta AFP-polyklonala antikroppar, HRP-märkt avidin och ett HRP-kemiluminescerande substrat, koncentrationerna av AFP och fucos AFP-L3 i provet kan erhållas genom att införa de förvärvade signalvärdena från skannern i en i förväg fastställd linjär regressionsekvation.

Även om ELISA kan kombineras med kemiluminescens, har vår proteinmikroarrayanalys många fördelar jämfört med ELISA-metoden. 1) Serum-AFP- och FucAFP-nivåerna detekteras under liknande förhållanden för att säkerställa att det detekterade fucosyleringsindexet är korrekt och pålitligt. 2) Flera prover kan analyseras samtidigt. Duplicerade prover eller prover tagna vid olika tidpunkter kan analyseras för att erhålla dynamiska värden, eller olika prover kan analyseras, vilket möjliggör detektering av hög kapacitet. Följaktligen kan detekteringskostnaden sänkas och detektionseffektiviteten kan förbättras. 3) De mängder av serum och antikroppar som krävs för det proteinchip som beskrivs här är väsentligt mindre än de som krävs för andra tekniker: endast 10 mikroliter originalt serum (eller utspädd) behövs, medan 50 mikroliter originalt serum (eller utspädd) krävs för ELISA-metoden. För antikroppstillämpningar på proteinchips kan 5 ul serum appliceras på prover på minst 20 proteinchips; sålunda är den erforderliga mängden antikropp väsentligt mindre än för ELISA-metoden när 200 serumprover analyseras, och detekteringskostnaden och kostnaden kan minskas kraftigt. 4) Proteinmikroarray utfördes under 1, 5–2 timmar i den aktuella studien (exklusive den tid som krävdes för att tillverka mikroarrayen), medan ELISA-kitet som användes i detta experiment krävde> 3, 5 timmar. Sammanfattningsvis säkerställer kemiluminescensdetekteringsmetoden, standardkurva och proteinchiptekniken hög känslighet, noggrannhet, effektivitet och låg kostnad när den används för den kvantitativa analysen av AFP- och AFP-L3-nivåer. Detekteringsmetoden som rapporteras här är en genomförbar, pålitlig, ekonomisk, enkel och tidsbesparande metod.

Material och metoder

Insamling av serumprover från patienter och friska kontroller

Totalt samlades 78 helblodsprover från patienter med HCC (n = 39) och friska kontroller (n = 39) vid Beijing YouAn Hospital. Skriftligt informerat samtycke erhölls från deltagarna före provsamlingen. Studieprotokollet godkändes av Beijing YouAn-sjukhusets etiska kommitté. Metoderna utfördes i enlighet med de riktlinjer som godkänts av etikkommittén vid Beijing YouAn-sjukhuset, Peking, Kina. Studien rekryterade patienter med HCC som genomgick leverresektionskirurgi eller transkateter arteriell kemoembolisering (TACE) och radiofrekvensablation (RFA) vid avdelningen för hepatobiliär kirurgi, Beijing YouAn Hospital, Peking, Kina. Patienterna var skyldiga att vara positiva för serumhepatit B-ytantigen och fria från kronisk hepatit C-infektion. HCC-diagnos bekräftades histologiskt efter kirurgisk resektion. Uppställningssystemet Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) är den vanligaste riktlinjen för hantering av HCC. Enligt BCLC-stagesystemet inkluderar HCC-iscensättning mycket tidigt stadium HCC eller steg 0; tidigt stadium HCC; och steg A, B, C och D (avancerat steg). Inte alla HCC-patienter som ingick i dessa studier kategoriserades enligt BCLC-stagesystemet. Vissa patienter klassificerades som steg 0, A, B eller C enligt BCLC-stagesystemet. Blodproven centrifugerades vid 3 400 RPM / min under 10 minuter efter koagulering, och serumalkvoter lagrades vid -70 ° C. Alla diagnoser av HCC bekräftades histologiskt efter kirurgisk resektion. Friska frivilliga utan diagnos av gastrointestinala eller lever- eller gallsjukdomar eller andra typer av sjukdomar rekryterades från polikliniken och användes som kontroller.

Beredning av reagens och prover

Följande reagens användes: Monoklonal mus [AFP-11] till alpha 1 Fetoprotein antikropp (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Kina), Rekombinant Human alpha 1 Fetoprotein (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Kina), LCA (Sigma), aldehydbelagda glasflis (Shanghai Baiao, Kina), biotinmärkt anti-AFP-antikropp (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Kina), streptavidin-pepparrotsperoxidas (Abcam Trading Company Ltd. Shanghai, Kina), RapidStep ™ ECL (Merck KgaA, Darmstadt, Tyskland) och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) -buffert innehållande 0, 05% Tween 20 (PBST). Den använda kemiluminescensskannern utvecklades av laboratoriet för professor Wang Sheng-Qi från Academy of Military Medical Sciences. Den biotinmärkta anti-AFP-antikroppen utspäddes 1: 100 i PBST, pH 7, 5. HRP-märkt streptavidin utspäddes 1: 100 i PBST. Serum utspäddes 1: 4 i PBST och 0, 5% BSA, pH 7, 5. Efter upptining på is lagrades alla serumprover och antikroppsreagenslösningar inte längre än 7 dagar vid 4 ° C, även om de är bäst inom en dag. I denna studie utfördes testen av proteinmikroarray och ELISA inom 24 timmar. Serumproverna kunde användas för att detektera AFP och AFP-L3 efter lagring vid 4 ° C under 7 dagar. Resultaten av proteinmikroarrayen med användning av serum lagrat vid 4 ° C under 7 dagar reducerades försumbar jämfört med serum lagrat vid 4 ° C under en dag.

Ett hydrofobt papper innehållande 10 hål fastades på ytan av en aldehydbelagd glasrutschbana (chip) för att bilda 10 reaktionsgaller (se fig. 3A). Anti-AFP-antikroppen (0, 5 mg / ml), LCA (4 mg / ml) och 10% bovint serumalbumin (BSA) upptäcktes på de aldehydbelagda objektglasen i fyrdubbla med en mikroarray-spotter (Cartesian Technologies, USA) ( Fig. 3A). BSA användes som en negativ kontroll. Efter fläcken inkuberades sliderna under 24 timmar vid 4 ° C. Sliderna blockerades med 20 ul blockerande buffert (10% normalt getserum innehållande 0, 1% NaN3) under 2 timmar vid 37 ° C och tvättades sedan fyra gånger med PBST. Efter torkning lagrades mikroarraychips vid 4 ° C tills användning.

( A ) Schemat för AFP-antikroppar och LCA-applikationer på proteinchipet. ( B ) Flödesschemat för proteinmikroarray-chip AFP / LCA-antikroppssandwich-metoden.

Bild i full storlek

Kör proteinmicrama

Ett prov av antingen 2, 5 ul serum eller 10 ul 1: 4 utspädd serum tillsattes till varje rutnät i mikrosystemet och inkuberades under 30 minuter vid 37 ° C. Utspädning av serum kan minska analysens förmåga att detektera AFP och / eller AFP-L3. När serum-AFP-koncentrationen var 1, 25 ng / ml, kunde AFP detekteras i det ursprungliga serumet med användning av denna analys. Efter ytterligare spädning var AFP-koncentrationen för låg (lägre än 1, 25 ng / ml) för att detektera. AFP-antigenet kunde inte detekteras i det utspädda serumet när AFP-nivån i det ursprungliga serumet var mindre än 1, 25 ng / ml.

I denna studie späddes alla serumprover 1: 4 med PBST. När AFP-nivån i det ursprungliga serumet var högre än 5 ng / ml, kunde AFP-antigenet detekteras i det utspädda serumet (10 ul). AFP-L1-, -L2- och -L3-proteinerna i serum var specifikt bundna till mus-anti-AFP-monoklonala antikroppar, medan AFP-L3-proteinet i serumet var bundet till LCA (fig. 3B). Vi kan inte utesluta möjligheten att AFP-L3 binds till musens anti-AFP monoklonala antikroppar. Spånarna tvättades fyra gånger med PBST för att eliminera ospecifik bindning. Därefter tillsattes den PBS-utspädda biotinmärkta kaninens anti-AFP polyklonala antikroppar, och flisarna inkuberades under 30 minuter vid 37 ° C. Spånarna tvättades fyra gånger med PBST för att eliminera ospecifik bindning. Därefter tillsattes PBS-utspädd streptavidin-HPR och flisarna inkuberades under 30 minuter vid 37 ° C. Spånarna tvättades åter fyra gånger med PBST för att eliminera ospecifik bindning. Därefter tillsattes det kemiluminescerande HRP-substratet (RapidStep ™ ECL) och flisarna inkuberades under 30 minuter vid 37 ° C och skannades sedan med en kemiluminescerande skanner utvecklad av laboratoriet för professor Wang Sheng-Qi. Denna analys kan reproduceras med en kommersiellt tillgänglig skanner, ChemiDoc ™ MP System (Bio-Rad, Kalifornien 94547 USA). Det var ett fullfunktionsinstrument för avbildning av proteinmikroarray designad för kemiluminescensdetekteringsapplikationer. Dess funktioner är baserade på högupplösta CCD-detekteringsteknik med hög känslighet. Systemet styrs av Image Lab-programvaran för att optimera prestanda för snabb, integrerad och automatiserad bildtagning och analys av olika prover. Det kemiluminescerande pixelvärdet (OD-värde) på en fastfasbärare korrelerar positivt med mängden antigen i provet. Den spånfångande antikroppen (mus-anti-AFP monoklonala antikroppar) och antikroppen som användes för detektion (biotinmärkt kanin anti-AFP polyklonal antikropp) var från olika djurarter. Figur 3B visar ett flödesschema över proteinchip-antikroppssandwichmetoden.

Standardkurvor för AFP och AFP-L3

Standardkurvan för AFP skapades genom att applicera olika koncentrationer av AFP-antigen (5, 10, 20, 40 och 80 ng / ml) på mikroplattplattan belagd med anti-AFP-antikroppen, som sedan inkuberades under 30 minuter vid 37 minuter. ° C (fig. 4A, B). Anti-AFP-infångningsantikroppen applicerades på objektglasen i olika koncentrationer: a, 1 mg / ml; b, 0, 5 mg / ml; c, 0, 25 mg / ml; och d, 0, 125 mg / ml. AFP detekterades såsom beskrivits ovan. Anti-AFP-antikroppen (0, 5 mg / ml) användes för att utforma standardkurvan genom att välja den bästa koncentrationen av anti-AFP-antikropp. Lägre koncentrationer av AFP kunde inte detekteras när 0, 25 mg / ml anti-AFP-antikropp applicerades på objektglasen. En högre koncentration (1 mg / ml) anti-AFP-antikropp var olämplig för utformning av standardkurvan eftersom de kemiluminescenta pixelvärdena (OD-värde) vanligtvis var högre än den övre gränsen för pixelanalysen för detta chip.

( A ) AFP-antigennivåer detekterade av AFP-proteinmikroarrayen. AFP-antikroppar applicerades på objektglasen i olika koncentrationer: a, 1 mg / ml; b, 0, 5 mg / ml; c, 0, 25 mg / ml; och d, 0, 125 mg / ml. Olika koncentrationer av AFP-antigenet användes: 1, 80 ng / ml, 2, 40 ng / ml, 3, 20 ng / ml, 4, 10 ng / ml och 5, 5 ng / ml. Sera från HCC-patienter och friska kontroller inkluderades också: 6, HCC-serum; 7, HCC-serum; 8, blank kontroll; 9, friskt serum; och 10, HCC-serum. ( B ) Standardkurvdiagrammet och regressionsekvationen för att bestämma AFP-nivåerna med hjälp av AFP-proteinmikroarrayanalysen.

Bild i full storlek

Serum med en känd AFP-L3-koncentration utspäddes i flera proportioner för att upprätta en standardkurva. Tio mikroliter-alikvoter av serum som innehöll olika koncentrationer av AFP-L3-antigenen (12, 5, 25, 50, 100 och 200 ng / ml) sattes till mikrolägget, som sedan inkuberades under 30 minuter vid 37 ° C (fig. 5A, B). AFP-L3 detekterades såsom beskrivits ovan.

( A ) Skannediagram över AFP-L3-standardämnen som detekteras av de AFP / LCA-belagda chips. AFP-antikroppar och LCA applicerades på objektglasen. a: AFP-antikropp, 0, 5 mg / ml; b: LCA, 4 mg / ml. Serumprover med olika koncentrationer av AFP-L3 användes: (1–5) 100, 50, 25, 12, 5 och 6, 25 ng / ml; (6–9) 100, 50, 25 och 12, 5 ng / ml; (10) blank kontroll. (B) Standardkurvdiagrammet och regressionsekvationen för AFP-L3 bestämdes med användning av AFP / LCA-proteinmikroarrayanalysen.

Bild i full storlek

Resultaten användes för att skapa en standardkurva med koncentrationen av AFP-antigenet på x-axeln och OD-värdet på y-axeln. OD-värdena på y-axeln och motsvarande koncentration på x-axeln avlästes och multiplicerades med utspädningsförhållandet för att erhålla koncentrationerna. Alternativt kan provkoncentrationen beräknas genom att bestämma den linjära regressionsekvationen för standardkurvan med användning av koncentrationerna och OD-värdena för AFP-antigenet och sedan multiplicera med utspädningsförhållandet (fig. 5B).

ELISA

Serum-AFP-nivåerna kvantifierades med användning av alfa-fetoprotein (AFP) human ELISA-kit (Abcam ab108838) enligt tillverkarens instruktioner. Först tillsattes 50 ul av alfa-fetoproteinstandarden eller provet till varje brunn. Brunnarna täcktes med tätningstejp och inkuberades i två timmar. Därefter tvättades brunnarna manuellt fem gånger med 200 ul 1X tvättbuffert. För det andra tillsattes 50 ul 1X biotinylerad alfa-fetoprotein-antikropp till varje brunn och inkuberades under en timme. Mikroplattan tvättades såsom beskrivits ovan för proteinmikroarrayen. För det tredje tillsattes 50 ul 1X SP-konjugat till varje brunn och inkuberades under 30 minuter. Mikroplattan tvättades såsom beskrivits ovan för proteinmikroarrayen. För det fjärde tillsattes 50 ul kromogensubstrat till varje brunn och inkuberades under 10 minuter eller tills den optimala blå färgdensiteten erhölls. Slutligen tillsattes 50 ul stopplösning till varje brunn. Färgen ändrades från blå till gul. Absorbansen bestämdes omedelbart på en mikroplåtläsare vid en våglängd av 450 nm. ELISA kan kombineras med kemiluminescens.

Statistiska analyser

Statistiska analyser genomfördes med användning av SPSS version 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) för Windows. Resultaten jämfördes med Pearsons χ2-test. Ett P-värde <0, 05 ansågs statistiskt signifikant. Mottagarens operationskarakteristik (ROC) -analys utfördes för att bestämma den diagnostiska prestanda för proteinmikroarrayen. Uppgifterna presenterades som medel ± SD (variationskoefficient) eller medianer (95% konfidensintervall [CI]).

ytterligare information

Hur man citerar den här artikeln : Zhang, A. et al . En kemiluminescerande proteinmikroarray-metod för bestämning av Seroglycoid Fucosylation Index. Sci. Rep. 6, 31132; doi: 10.1038 / srep31132 (2016).

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande databas 1

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.