Karakterisering av kliniskt och immunsvar i en rotavirusdiarrémodell hos sugande lewisråttor | pediatrisk forskning

Karakterisering av kliniskt och immunsvar i en rotavirusdiarrémodell hos sugande lewisråttor | pediatrisk forskning

Anonim

Abstrakt

Rotavirus i grupp A är de ledande patogenerna som orsakar diarré hos barn och djur. Föreliggande studie utformades för att upprätta en experimentell modell för RV-infektion och immunsvar hos ammande råttor. Wistar (W) och Lewis (L) ammande råttor ympades oralt med två olika doser av en simian RV SA-11-stam. RV-infektion utvärderades med tillväxthastighet och kliniska index. Virus-shedding och serum anti-RV antikroppar mättes genom enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). Mukosalt interferon-y (IFNy), specifik splenocytproliferation och milt och intestinal intraepitelialfymfocyt (IEL) fenotyp analyserades. Ingen diarré observerades i någon inokulerad WS. Alla Ls utvecklade akut måttlig diarré, och en hög poäng och förekomst av diarré hittades hos råttor infekterade med högre RV-titrar. Specifikt humoralt och cellsystemiskt immunsvar bekräftades genom splenocytproliferation och genom närvaron av serum-anti-RV-antikroppar. Dessutom inducerade RV-infektion förändringar i IEL-kompositionen, som visade en ökning av andelen medfödda immunceller med avseende på celler involverade i förvärvad immunitet. Denna akuta måttliga diarréprocess utgör en bra experimentell modell som också ger vissa immunbiomarkörer som kan möjliggöra etablering av modulering med läkemedel eller dietkomponenter.

Huvudsaklig

Grupp A rotaviruses (RVs) - icke-hölje, icosahedral och dubbelsträngade RNA-medlemmar i familjen Reoviridae - är de ledande patogenerna som orsakar diarré hos barn yngre än 2 år. De infekterar enterocyter i tunntarmen och orsakar svår gastroenterit och uttorkning; hög sjuklighet beskrivs över hela världen, och symptomatisk behandling som rehydrering är det enda sättet att kontrollera denna sjukdom (1, 2). Patofysiologin för grupp A-RV-associerad diarré har experimentellt studerats i flera djurarter och har bidragit till att främja vår kunskap om infektionsprocessen (3, 4). Nyligen har några experimentella djurmodeller varit mycket hjälpsamma för att demonstrera att RV-replikation också existerar utanför tarmen, sera och vävnader genom detektering av RNA eller infektiösa virus (5). RV-infektion hos möss har använts för att definiera några kliniska egenskaper hos diarréprocessen (4); emellertid har endast ett fåtal studier av RV-infektion genomförts hos råttor (3), och ännu färre fokuserades på immunsvaret som inducerats av viruset (6). Förhållandet mellan RV och immunsvaret och utvecklingen och lösningen av sjukdomar har inte varit väl etablerat. Undantagsvis har vissa arbeten fokuserat på immunparametrar, såsom nivåer av specifik antikropp (Ab) i sera, avföring och tarm (7, 8).

Mattillskott med flera föreningar ( dvs. probiotika, prebiotika eller proteinkoncentrat) hos RV-infekterade djur har visat sig ge en signifikant minskning av förekomsten och svårighetsgraden av diarré såväl som förändringar i laboratorieparametrar, såsom viral shedding eller RV-koncentration i tarmsegmenten (8–10). Återigen inkluderades inte tillräckligt med immunbiomarkörer i dessa studier.

Förutom bestämningen av sjukdomsparametrar vid RV-infektion kommer markörer för immunsvar att ge ledtrådar om mekanismerna som används för kontroll, upplösning eller förebyggande vid efterföljande infektioner. För att bättre förstå immunrespons mot RV-infektioner designades denna studie för att utveckla en RV-infektionsmodel för råttor som fastställer vissa egenskaper hos immunsvar, utöver kliniska index. Systemisk immunresponsbedömning inkluderade lymfoproliferativa analyser och Ab-produktion. Mucosal immunresponsbedömning införlivade tarmens IFNy-produktion och förändringar i intraepitelialymfocyt (IEL) -komposition. Karaktäriseringen av denna modell kan göra det möjligt för oss att etablera vissa immunbiomarkörer som kan användas för screening av något läkemedel eller kosttillskott som föreslås för att behandla eller förbättra diarréprocesser.

RESULTAT

Infektion av W-ammande råttor med SA-11.

SA-11-infektion utvärderades först i W-stammen. Inokulering av 10 8 PFU av SA-11-virus per djur på 8- eller 11-d-gamla W-ammande råttor (W8-HD respektive W11-HD) modifierade inte deras kroppsviktökning med avseende på icke-inokulerat W (WRef) (Fig. 1 A ). Inga djur från W11-HD-gruppen utvecklade diarré (Fig. 1 B ), och endast 20% av W8-HD-infekterade djur utvecklade en mild diarré vid 2 DPI, med svårighetsgrader på endast cirka 2. Efter dessa kliniska resultat utvecklades detta stam avvisades som en råttmodell för utvärdering av immuns RV-svar, och inga andra bestämningar gjordes.

Kroppsvikt ( A ) och diarréincidens (%) ( B ) under hela studietiden hos W-ammande råttor ympade med RV SA-11 och Ref-grupper: W8-HD (•), W11-HD (○) och WRef (▴ ). Värdena uttrycks som medelvärde ± SEM ( n = 10).

Bild i full storlek

Infektion av L-ammande råttor med SA-11 och klinisk utvärdering.

Efter borttagande av W-stammen inokulerades L med SA-11 med två olika doser (10 7 PFU per djur [LD] eller 10 8 PFU per djur (HD)) till två olika grupper, baserat på djuråldern (8- eller 11 -d-gamla råttor) RV-inokulation modifierade inte ökning av kroppsvikt i någon experimentell L-grupp. Alla grupperna visade en parallell tillväxt med avseende på referensgruppen (Fig. 2 A ).

Kroppsvikt ( A ), diarréincidens (%) ( B ) och svårighetsgraden av diarré (DI) ( C ) under hela studieperioden hos L-ammande råttor ympade med RV SA-11 och Ref-grupper: L8-LD (▴), L8-HD (•), L11-HD (

) och LRef (○). Individuella data motsvarar medelvärdet ± SEM ( n = 6–10).

Bild i full storlek

Alla L-inokulerade grupper (L8-HD, L8-LD och L11-HD) utvecklade diarré såsom observerades genom incidensresultat (Fig. 2 B ) och DI (Fig. 2 C ). De flesta L8-LD- och L11-HD-grupper utvecklade mild diarré (DI 2) eller ingen diarré (DI <2) (Fig. 2 C ) under 1–6 DPI, och andelen djur som utvecklade sjukdom överskred endast 50% på 4 respektive 2–3 DPI (Fig. 2 B ). Å andra sidan hittades en hög förekomst (upp till 90%) av RV-infektion av L8-HD-råttor med diarré vid 2 och 4 DPI (fig. 2 B ). Dessa djur utvecklade en bifasisk sjukdom med två infektionstoppar på 2 och 4 DPI.

För att bättre jämföra grupper upprättades några relaterade kliniska svårighetsindex (tabell 1). Djur från L8-HD uppvisade signifikant högre DI (MDI) än de andra två ympade grupperna ( p <0, 05). I L8-HD-gruppen startade dessutom diarré tidigare (fastställd genom början av diarrédag [BDD]) och slutade senare (fastställdes genom att avsluta diarrédag [EDD]) än båda andra infekterade grupper ( p <0, 05). Sålunda var varaktigheten för den totala diarréprocessen (fastställd genom diarréperioden [DP]) också cirka 2, 5 gånger längre än de andra ( p <0, 05).

Full storlek bord

Fekalvikt och SA-11 viral shedding.

Betydande fekal viktökning hittades i båda inokulerade grupperna (Fig. 3 A ), L8-LD och L8-HD, under DP mellan 1 och 4 DPI, när det jämförs med LRef-djur ( p <0, 05). Den fekala viktökningen observerades endast i DP eftersom senare, när klinisk försvann (7–12 DPI), var fekalvikten lik den från LRef-djur.

( A ) Fekalvikt under DP (mellan 1 och 4 DPI) och när kliniska tecken försvann (7–12 DPI) hos L-ammande råttor ympade på 8-d-gamla djur med RV SA-11 och Ref-grupper: L8 – LD ( skuggade kolumner ), L8-HD ( solida kolumner ) och LRef ( öppna kolumner ). ( B ) Virala antigen-kasta kurvor av enskilda fekala prover av L-råttor ympade med RV SA-11 och Ref-grupper från ympningsdagen till 14 DPI: L8-HD (○) och LRef (•). Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM ( n = 6–10). * p <0, 05 mellan SA-11-infekterade djur och dess motsvarande Ref-grupp (LRef).

Bild i full storlek

Viral belastning analyserades i L8-HD-djur under postinfektionsperioden med maximal virusutgjutning omedelbart efter ympningen. Dessutom uppträdde det bimodala mönstret som förekom i förekomst och svårighetsgrad av diarré här igen på 1-2 och 5 DPI (fig. 3 B ), medan belastningen med fekala RV-partiklar nästan inte kunde upptäckas efter 6 DPI av ELISA.

Mucosal immunrespons.

I L8-HD-gruppen utvärderades immunsvar på slemhinneceller. Fenotyp av effektorceller i intraepitelceller (IE) -utrymme analyserades genom att etablera huvudsubsuppsättningar: T CD8 + IEL (IE-T), intraepitelceller naturliga mördare (NK) -celler (IE-NK) och IE-NKT-celler. RV-infektion inducerade förändringar i IEL-sammansättning, som redan fanns på 1 DPI (data visas inte) och tydligare vid 3 DPI (fig. 4 A ). Vid 3 DPI inducerade således inokulation en lägre andel av IE-T. Å andra sidan observerades en signifikant ökning i IE-NK-cellandel och en signifikant minskning i IE-NKT-cellandel i L8-HD-gruppen i förhållande till referensdjur (27% respektive 29%). Eftersom CD8aα + IEL inkluderar både CD8 + IE-NK-celler och vissa IE-T, och CD8aß + IEL inkluderar IE-NKT-celler och vissa IE-T, kan CD8aa / CD8aP-förhållandet i totalt gated IEL: er representera förhållandet mellan medfödda immunceller med respekt för celler involverade i mer förvärvade immunförfaranden i tarmen. I detta avseende ökade CD8aα / CD8aß-förhållandet i L8-HD-råttor vid 3 DPI ungefär tre gånger med avseende på LRef-djur vid samma ålder (11 d) (data visas inte, p <0, 05).

( A ) IEL-fenotyp vid 3 DPI i L-råttor ympade på 8-d-gamla djur med RV SA-11 och Ref-grupper: L8-HD (○) och LRef (•). Representativa cytogram vid 3 DPI av fördelningsfrekvensen för fluorescensintensitet erhållen genom TCRaP / NKR-P1A MAb-märkning av IEL: er. Markerade regioner inkluderar tre cellundersättningar: TCRaß-NKR-P1A + -celler (IE-NK), TCRaß + NKR-P1A + -celler (IE-NKT) och TCRaß + NKR-P1A-celler (IE-T). Procentandelen av varje delmängd (visas i figuren) motsvarar medelvärdet härledd från tre till fem djur. Tidsförlopp av IFNy-nivåer kvantifierade i tarmvättningar ( B ) och i tarminnehållet ( C ), bestämt av ELISA, under postinfektionsperioden i L-ammande råttor ympade med RV SA-11 (L8-HD) och Ref (LRef) -grupper. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM ( n = 2–6).

Bild i full storlek

Mucosal IFNy-produktion förblev mycket låg vid en tidig ålder (<100 pg / ml) i både inokulerade och Ref-djur som visas i figur 4 B och C. IFNy-nivåerna i tarminnehållet var låga från inokuleringsdagen (8-d-gamla djur) till 9 DPI, men senare tenderade dessa nivåer att öka. IFNy i tarmsvätt visade ett åldersberoende beteende ( p <0, 01) från den första dagen (8-d-gamla djur) till den sista perioden av den studerade perioden (18 d gammal), då värden ökade fem till sju gånger. Trots dessa observerade mönster var IFNy-nivåerna så låga i tarminnehåll och tvättar att signifikanta skillnader mellan infekterade och icke-inokulerade djur inte kunde fastställas.

Systemiskt humoral och cellimmunrespons. Specifikt humoralt immunsvar utvärderades genom kvantifiering av serum anti-RV Ab i ympade djur trots djuren tidigt; alla RV-inokulerade råttor producerade höga titrar av en specifik Ab mot RV (2, 3 ± 0, 09 Absorbansenheter, medelvärde ± SEM, n = 6), bestämd av ELISA i slutet av studieperioden, vilket således utvecklade ett bra immunsvar mot SA-11 infektion.

Å andra sidan bekräftades systemiskt immunsvar genom specifik splenocytproliferation mot SA-11-partiklar på 14 DPI (fig. 5). Mjältceller från L8-HD-gruppen visade hög förmåga att specifikt proliferera under SA-11-stimuleringsbetingelser med avseende på LRef-splenocyter eller andra odlingsbetingelser ( dvs inert protein tillsatt till plattan) ( p <0, 05).

Specifikt splenocytproliferativt svar. Splenocyter erhölls från L-ammande råttkull ympade på 8-d-gamla djur med RV SA-11 (L8-HD) och Ref (LRef) -grupper vid 14 DPI och odlades med 10 μg / ml SA-11-proteiner ( fasta kolonner ), inert protein (IP) i samma koncentration ( skuggade kolumner ), eller utan stimulans (NS, öppna kolumner ). Resultaten visas som absorptionsenheter erhållna i samma platta och uttryckta som medelvärdet ± SEM av tre till fem värden, var och en härledd från fyrduplikat från ett ammande djur. * p <0, 05 mellan SA-11-infekterade djur och dess motsvarande referensgrupp (LRef).

Bild i full storlek

DISKUSSION

Mycket få studier ger experimentella data om RV-infektioner i råttor, en djurart som används allmänt för att utveckla experimentella modeller för patofysiologiska studier. Vissa av dessa studier har utvecklats på groddfria ammande råttor (13), men Ciarlet et al (3) utvecklade ett omfattande arbete i karaktäriseringen av diarréprocessen hos ammande L, med några heterologa RV-stammar. Vi inrättade våra studier i W- och L-stammar och hos äldre ammande djur (8 och 11 d gamla). När diarréprocessen induceras senare, desto mer mogna har immunsvaret utvecklats för att kontrollera infektionen; dessutom kan längre förebyggande eller förbättrande tillvägagångssätt testas.

I denna studie övervägdes W-råttor först, trots den knappa litteraturen beträffande känsligheten för denna råttstam för RV-infektion. Det har föreslagits att vissa råttstammar verkar vara resistenta mot RV-infektion på grund av förändringar i virusets naturliga inträde i tarmens epitelceller, som är baserad på en komplex flerstegsprocess (14–16). På grund av bristen på exakt information om RV-infektion hos W-råttor utfördes RV-associerad diarré hos W-råttor genom högtiterinokulering (10 8 PFU per djur) av SA-11-stammen. Emellertid utvecklade endast ett par djur som inokulerades på d 8 i livet mild diarré. Våra resultat visade att W-råttor inte utvecklar diarré från grupp A, kanske saknar proteinet som förmedlar RV-cellfästning eller hämning av RV-replikation av vissa muciner, som tidigare antydts (17, 18).

Även om alla 8- och 11-d-gamla L-råttor infekterade grupper med SA-11 utvecklade diarré utan att påverka deras tillväxtmönster, var den genomsnittliga incidensen och svårighetsdiarréen högre hos 8-d-gamla djur ympade med hög titer SA-11 stam (10 8 PFU per djur). Som förväntat påverkade ålder och dos markant sjukdomens svårighetsgrad, med den tidigaste inokuleringen (vid 8 d livstid) och den högsta dosen (HD) som registrerade den mest kraftfulla effekten på diarréprocessen fastställd med kliniska index. Den signifikanta ökningen i fekalt provvikt som samlats in under DP som hittades här beskrevs också i andra studier, liksom fallet med RV-inducerade groddfria råttor (13). Sålunda ger de funktioner som bestäms i vår råttsugningsmodell av 8-d-gamla L-råttor infekterade med 10 8 RVs per djur (L8-HD), som utvecklar en akut och måttlig diarréprocess, en god experimentell modell för akut infektiös diarré i konventionella råttor.

Vidare visade kliniska studier och resultat från djurmodeller förmågan hos RV att spridas till blodomloppet och infektera perifera vävnader förutom tarmen (19). Således kan RV upptäckas i ett brett spektrum av organ, och dess närvaro kan förklara vissa kliniska konsekvenser som infekterade barn uppvisar (20, 21). Annars har skyddsmekanismer och interaktion med immunsystemet mindre studerats, och utvärdering av cell / humorala och slemhinnor / systemiska immunsvar har blivit fokus för uppmärksamhet i det nuvarande arbetet.

Det bör noteras att immunsvar hos råttor som suger är begränsade och mindre kompetenta än de som utvecklats av vuxna djur. I detta avseende har vi i tidigare studier visat åldersrelaterade förändringar i lymfocytkomposition och funktionalitet i neonatal råttmjälte och slemhinnelymfocyter (11, 12, 22).

Immunsvar mot RV-infektion måste först ske på slemhinneställen. Av denna anledning analyserades slemhinne-IFNy-produktion och IEL-fenotyp i tunntarmen. IFNy-produktion vid tarmställen, som en mediator för effektor-T-cell-respons, analyserades i tarmsvätt och innehåll i 8-d-gamla djur ympade med hög titer av SA-11-stam (L8-HD). Inga skillnader mellan inokulerade och Ref-grupper hittades, i överensstämmelse med andra studier på möss infekterade med RV (23). I detta avseende tyder dessa resultat på att neonatal immunsvar, avseende IFNy-produktion involverad i RV-clearance, verkar vara begränsad och mindre kompetent än hos vuxen ålder. Annars är det möjligt att IFNy inte har en avgörande roll vid diarréupplösning eftersom IFNy-knockout-möss kan kontrollera denna typ av infektion (24).

Eftersom en viktig andel av RV-specifika T- och medfödda immunceller kan förbli i ett IE-fack för att kontrollera infektionen undersöktes IEL-underuppsättningar av huvudeffektor. I tidigare studier visade vi att tarmfacket inkluderar en hög andel NK-celler (12, 21) under tidig råtteliv, vilket borde ha en viktig roll i försvaret under detta utvecklingsstadium. Nuvarande studier antyder också övervägande av IE-NKT under ammande (opublicerade observationer). Vi beskriver här för första gången förändringar i vissa populationer orsakade av RV-infektion. Förändringar i IE-NK-, IE-NKT- och IE-T-cellmängdmängdproportioner visar att de medfödda immuncellprocentandena är tydligt ökade efter RV-infektion, baserat på ökningen av CD8aα / CD8aβ-förhållandet i totalt gated IEL. Ökningen i detta förhållande återspeglar ökningen av IE-NK- och IE-T CD8αα + -celler - medfödd immunitet - och respektive minskning av IE-T CD8aβ + -celler - förvärvad immunitet eller IE-NKT-celler - brygga mellan medfödd och förvärvad immunitet ( 25). Detta faktum antyder att det medfödda immunsvaret är immunsystemets arm som ansvarar för att kontrollera denna typ av virusinfektion på slemhinnestäder vid en tidig ålder, när förvärvad immunitet fortfarande inte är fullt utvecklad.

Eftersom en viktig andel av RV-specifika T- och medfödda immunceller kan förbli i IE-avdelningen för att kontrollera infektionen undersöktes IEL-underuppsättningar av huvudeffektor. Vi beskriver här för första gången förändringar i dessa populationer orsakade av RV-infektion. Förändringar i IE-NK-, IE-NKT- och IE-T-cellmängdmängdproportioner visar att medfödda immuncellprocenttal tydligt ökas efter RV-infektion, baserat på ökningen av CD8aα / CD8aß-förhållandet i totalt gated IEL. Detta faktum antyder att det medfödda immunsvaret är immunsystemets arm som ansvarar för att kontrollera denna typ av virusinfektion i slemhinnestäder vid tidig ålder, när förvärvad immunitet fortfarande inte är fullt utvecklad.

Det har beskrivits att serum-IgA-titrar korrelerar med skydd mot RV-sjukdom och höga titrar korrelerar med skydd mot återinfektion (26). Eftersom ammande gnagare fortfarande producerar låga nivåer av slemhinne-IgA, huvudkällan till detta Ig (21), analyserade vi serumspecifikt anti-SA-11 totalt Ig i ympade djur, och våra resultat bekräftade att dessa djur presenterade höga titrar av anti- RV Ig, som andra författare hittade i avföring (8).

Eftersom mjältlymfocyter från ympade råttor kan sprida sig som svar på antigen in vitro föreslår vi att antingen primade lymfocyter har migrerat till extraintestinala vävnader såsom mjälten eller viruspartiklar har kommit till andra vävnader där celler har stimulerats. Icke desto mindre kan lymfoproliferativ förmåga användas som en bra biomarkör för specifika immunsvar mot RV-infektion. Analysen utfördes efter den aktiva infektionsprocessen vid 14 DPI; således kan det återspegla närvaron av minneslymfocyter och kan således representera en markör för försvar mot återinfektion.

Sammanfattningsvis ger denna studie en självbegränsande akut RV-inducerad diarré-experimentell modell som inte påverkar valpens utveckling och bidrar till förståelsen av de mekanismer som är involverade i immunskydd och upplösning av diarréprocessen och förebyggande av återinfektion. Ännu viktigare är att det ger vissa immunresponsbiomarkörer såsom lymfocytfenotyp och proliferativ förmåga, vilket kan hjälpa till att utvärdera aktiviteten hos flera livsmedelsföreningar inte bara genom att förkorta diarréprocessen utan också förbättra det specifika RV-immunsvaret.

Ordlista

Ab

antikropp

DI

diarréindex

DPI

dag postinokulering

HD

hög dos

IEL

intraepitelialymfocyt

L

lewis

LD

låg dos

NK

naturlig mördare

PFU

plackbildande enhet

Ref

referens

RV

rotavirus

W

Wistar