Karakterisering av bcr-abl-deletionsmutanter från patienter med kronisk myeloid leukemi | leukemi

Karakterisering av bcr-abl-deletionsmutanter från patienter med kronisk myeloid leukemi | leukemi

Anonim

Abstrakt

BCR-ABL onkogent tyrosinkinas orsakar kronisk myeloid leukemi och är målet för imatinib-terapi. Under imatinib-behandling väljs celler hos vissa patienter med BCR-ABL-kinasdomänmutationer som gör minskad läkemedelskänslighet. Dessutom uttrycker vissa patienter deletionsmutanter av BCR-ABL, uppenbarligen på grund av felmissbruk. Vanligtvis saknar dessa deletionsmutanter en betydande del av kinasdomänen som inkluderar P-slingan. Vi beskriver en skärm för sådana mutationer hos patienter med CML och visar att de inte är onkogena och är katalytiskt inaktiva. Vi ansåg att samuttryckande BCR-ABL-borttagningsmutanter har en dominerande-negativ effekt på den ursprungliga formen genom heterokomplexbildning. Emellertid upprätthålls tillväxtfaktoroberoende och signalering aktiveras normalt vid samuttryck av nativt och deletionsmutant BCR-ABL i Ba / F3-celler. Trots detta har dessa celler ökat imatinib-känslighet jämfört med celler som endast uttrycker nativt BCR-ABL. Således kommer det att vara viktigt att undersöka den prognostiska effekten av samuttryck av deletionsmutanter hos CML-patienter under imatinib-behandling.

Introduktion

Den primära mekanismen för imatinibresistens vid kronisk myelooid leukemi (CML) är punktmutationer i BCR-ABL-kinasdomänet som minskar hämmarkänsligheten. L248V är en mutation i ATP-bindningsslingan (P-slinga) som har visat sig ge en hög nivå av imatinibresistens. 1 Det har nyligen rapporterats att L248V introducerar en sekundär 5 ′ givarsplitsningsplats i ABL exon 4. 2 Alternativ skarvning på denna plats resulterar i samuttryck av en mutant med borttagning av rester 248–274 (Δ248–274), som saknar del av kinasdomänens N-terminala lob. Bristen på kritiska strukturer inklusive P-slingan ledde till förutsägelsen att Δ248–274 är kinasinaktivt. Felaktig blandning av BCR-ABL- mRNA har också observerats hos en betydande del av patienterna utan L248V-mutationen, vilket indikerar att samuttryck av deletionsmutanter och infödda BCR-ABL kan vara vanligt. 3, 4

BCR-ABL bildar en dimer och / eller tetramer genom det spolade spoldomänet i N-terminalen av BCR, vilket tros främja BCR-ABL-aktivering och onkogenes genom att underlätta transfosforylering. 5, 6 Med tanke på kravet på dimerisering för kinasaktivering är det tänkbart att deletionsmutanterna har en dominerande-negativ effekt på den nativa BCR-ABL genom bildning av heterodimerer med minskad transfosforylering. Här rapporterar vi frekvensen för deletionsmutanter hos patienter som behandlas med imatinib och analyserar deras egenskaper enbart och när de samuttrycks med nativt BCR-ABL.

Material och metoder

Patientprover

Denna studie godkändes av Institutional Review Board vid Oregon Health and Science University och informerat samtycke erhölls från alla patienter. Mononukleära celler isolerades från benmärgsaspirat eller perifera blodprover genom densitetsgradientcentrifugering. Alikvoter av celler användes för RNA-extraktion (RLT-reagens, Qiagen, Valencia, CA, USA). qRT-PCR för BCR-ABL utfördes på perifert blod eller benmärgsaspiratprover såsom beskrivits. 7

Mutationsanalys

RNA isolerades med RNeasy-kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Superscript omvänt transkriptas användes för att syntetisera cDNA med slumpmässiga hexamer-primrar (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kapslade PCR utfördes från BCR till Abl exon 8 såsom beskrivits 8 med automatiserad sekvensering av 1, 5 kb BCR-ABL- produkten. Vi har funnit att denna direkta sekvenseringsprocedur har känslighet för mutanta transkript innefattande minst 30% av PCR-produkten. 9 För att detektera deletionsmutanter analyserades kromatogram visuellt för regioner med en plötslig försämring av sekvenskvaliteten på grund av brus. Vi uppskattar att detektionsgränsen för detta måste vara ungefär motsvarande detektionsgränsen för punktmutationer. Hos tre patienter subklonades PCR-produkter med användning av TOPO-TA-kloningssatsen (Invitrogen) och minst 16 individuella kolonier sekvenserades. Mutationer som förekom i endast en subklon kastades bort.

Generering av mutanta alleler

För att generera expressionskonstruktioner skars AatII / Kpnl ABL- kinasdomänfragment från pCR4-TOPO innehållande deletionsmutationer och klistrades in i full längd BCR-ABL i pGEM5. BCR-ABL- varianterna klonades sedan in i MSCV-IRES-GFP (MIGR1) med användning av kloningssystemet Gateway Vector (Invitrogen). För att generera c-Abl-expressionskonstruktioner infördes deletionsmutation genom platsriktad mutagenes med användning av Quik-Change-plats-riktat mutagenes-kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) och pSGT-c-Abl Ib som mall. 10 Alla deletioner bekräftades genom sekvensering.

Celllinjer

Ba / F3-cellerna bibehölls såsom beskrivits. 11 TonB210-celler tillhandahölls vänligen av George Daley (Children's Hospital, Boston, MA, USA). För TonB210-cellexperiment inducerades BCR-ABL genom tillsats av 1 ug ml -1 doxycyklin till kulturen. Ba / F3-celler transducerades med virala supernatanter från 293T-celler transfekterade med vildtyp och mutant BCR-ABL- MIGRl-konstruktioner. Isolering av Bcr-Abl-uttryckande celler utfördes genom cellsortering för GFP-uttryck med användning av en FACS Aria (BD Biosciences, San Diego, CA, USA).

immunoblotting

BCR-ABL och c-ABL autofosforylering detekterades genom immunblot med monoklonal mus-antifosfotyrosinantikropp 4G10 (Upstate Biotechnology, Waltham, MA, USA). BCR-ABL-uttryck detekterades med kanin-anti-ABL-antikropp K12 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Laddningskontroller utfördes med immunoblot med anti-aktin (Ab-1) mus monoklonal (JLA20) antikropp (Calbiochem, San Diego, CA, USA).

Kinasanalyser

Transfektion av HEK293-celler, immunutfällning av ABL-protein och ABL in vitro -kinasanalys utfördes såsom beskrivits tidigare. 12, 13 Den relativa koncentrationen av immunutfällt ABL-protein bestämdes genom immunblotting (anti-ABL Ab-3, Oncogene Science, Cambridge, MA, USA) och efterföljande kvantifiering med användning av Li-cor Odyssey-systemet och normaliserades för c-ABL vildtyp .

Cellproliferationsanalyser

Celllinjeberoende av IL-3 och känslighet för imatinib testades oberoende i MTS-baserade viabilitetsanalyser (CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent; Promega, Madison, WI, USA) såsom beskrivits. 14 Medelvärdet för två oberoende cellinjer rapporteras för varje tillstånd som den procentuella absorbansen jämfört med kontrollkoncentrationen (1 ng ml −1 för IL-3, ingen imatinib).

Resultat

Karakterisering av onormala BCR-ABL-transkript från CML-patienter

Vid sekvensering av BCR-ABL för kinasdomänmutationer har vi ibland observerat mindre band utöver den förväntade PCR-produkten på agarosgelelektrofores och / eller överlappande sekvens på kinasdomänssekvensspår av hög kvalitet (data visas inte). Detta fick oss att utföra en systematisk analys med en retrospektiv skärm med slumpvis utvalda patientprover. För att analysera hela PCR-produkten hos dessa patienter utfördes sekvensering med användning av primrar som täckte ABL Cap-, SH3-, SH2- och kinas-domänerna. Vi screenade 95 patienter med en medianålder på 54 (intervall, 22–80) år, median sjukdomstid var 49 månader (intervall, 4–186) och median tid på imatinib på 23 månader (intervall, 2–52). Bland dessa patienter började 79 terapi under kronisk fas, 15 i accelererad fas och en i explosionskris. Vid mutationsanalys hade 36 ett fullständigt cytogenetiskt svar, 22 huvudsakligt cytogenetiskt svar, 32 fullständigt hematologiskt svar och fyra hematologiska återfall. I denna grupp hade 14 (15%) patienter en deletionsmutation (tabell 1). Fem patienter visade sig innehålla Δ184–274, vilket motsvarar en fullständig förlust av ABL-exon 4. En av dessa fem hade också punktmutationen M244V. Tre patienter hade ett alternativt transkript som förenade BCR-sekvens till ABL exon 4, vilket resulterade i ABL-översättning (OOF) ABL (translation27–183 OOF, stopp vid 296) som tidigare beskrivits. 4 Två patienter visade sig ha Δ248–274, som tidigare rapporterats samexistera med L248V-mutanten. 2 Hos en annan patient upptäcktes förlust av ABL exon 7, vilket också resulterade i en ramförskjutning (Δ362–444 OOF, stopp vid 458). Δ342–383-mutanten upptäcktes hos två patienter, varav en också hade Q333R-punktmutationen. Slutligen detekterades Δ151-1883-mutanten hos en enda patient. Således involverade deletionsmutanter hos patienter som oftast involverade skarvkorsningar.

Full storlek bord

Vi beslutade att koncentrera våra studier på de inramade mutationerna som var vanligast hos våra patienter, Δ248–274 och Δ184–274. För att bekräfta de exakta gränserna för dessa raderade sekvenser subklonade vi PCR-produkterna och sekvenserade flera enkla kloner från tre av patienterna. För varje patient testades två oberoende prover från olika tidpunkter (tabell 2). Av de tre patienterna hade två kombinationen L248V / Δ248–274 och en Δ184–274-mutanten. Subkloning av BCR-ABL-amplikoner bekräftade de misstänkta raderingsgränserna och avslöjade att både patienter med L248V- och Δ248–274-mutanterna också uttryckte Δ184–274-mutanten. Båda patienterna med L248V-mutanten som testades vid olika tidpunkter visade den fortsatta närvaron av Δ248–274-borttagningen.

Full storlek bord

BCR-ABL P-loop-deletionsmutanter är katalytiskt inaktiva

Radering av resterna 248–274 eliminerar två av de fem strängarna på p-arket i den N-terminala loben på kinasdomänen och den glycinrika slingan (P-loop). Båda regionerna tillhandahåller väsentliga rester för ATP-bindning och katalys av fosforylöverföring (figur la). 15 I Δ184–274-mutanten saknas C-terminal α-helix (αB) för SH2-domänen och länken mellan SH2- och kinas-domänerna utöver de två beta-strängarna i N-loben och P-slingan (Figur Ib). Med tanke på den viktiga funktionella rollen för dessa motiv, antog vi att deras borttagning kan leda till förlust av enzymatisk aktivitet.

Raderade Abl-strukturelement i Δ248–274 och Δ184–274 Bcr-Abl-mutanter. Kristallstrukturen hos autoinhiberad c-Abl i komplex med kinasinhibitorn PD166326 (PDB-post 1OPK) 20 används för att illustrera omfattningen av rester förlorade i Bcr-Abl-deletionsmutanterna. Abl SH3-, SH2- och kinas-domänerna är färgade i cyan respektive blå och grå. ( a ) I Δ248–274-mutanten saknas en betydande del av kinasdomänens N-lob (visas med rött). Två av de fem trådarna på p-arket raderas (numrerade 2, 3), liksom P-slingan som överbryggar ATP-bindningsstället. ( b ) I Δ184–274-mutanten, sträng 1 i kinasdomänens p-ark, saknas också C-terminala a-helix (αB) för SH2-domänen och länken mellan SH2- och kinasdomänerna (visas i magenta ). ( c ) Den primära strukturen för Bcr-Abl visas för att indikera sammanhanget för SH2-, SH3- och kinas-domänerna inom hela fusionsproteinet (inte i skala). ABD: aktinbindande domän. DNAB: DNA-bindande domän. ( a och b ) skapades med PyMol. 21

Bild i full storlek

För att testa effekterna av deletionerna på ABL-kinasfunktionen införde vi deletionerna i c-ABL och överuttryckte de mutanta proteinerna i HEK293-celler och analyserade helcellsextrakt för proteintyrosinfosforylering. Varken c-ABL Δ184–274 eller c-ABL Δ248–274 som uttrycker celler visade påvisbara nivåer av cellulär tyrosinfosforylering, i motsats till en konstitutivt aktiv form av c-ABL innehållande P223E / P230E dubbla mutationer (ABL PP) 10 (figur 2a) . Dessutom kunde en liten ökning i cellulär tyrosinfosforylering observeras genom överuttryck av vildtyp-c-ABL-proteinet, men överuttryck av deletionsmutanterna visade ingen tyrosinfosforylering. Immunkomplex in vitro -kinasanalyser visade att deletionsmutanterna visade nästan odetekterbar kinasaktivitet, i motsats till den lätt observerbara aktiviteten för vildtyp c-ABL (figur 2b). Dessutom räddade inte aktivering av Δ248–274-mutanten genom introduktion av PP-mutationerna någon aktivitet (figurerna 2a och b, längst till höger). För att testa mutanterna i samband med BCR-ABL, uttrycktes deletionsmutantkonstruktionerna stabilt i Ba / F3-celler. Till skillnad från p210 BCR-ABL-uttryckande celler förblev deletionsmutanter beroende av IL-3 för proliferation (figur 2c). Även om de uttrycktes på en liknande nivå i Ba / F3-cellerna visade inte borttagningsmutanterna detekterbara BCR-ABL autofosforylering (figur 2d) och nedströms målfosforylering var frånvarande (se figur 3b). Sammanfattningsvis indikerar dessa experiment att de deletionsmutanta proteinerna är katalytiskt inaktiva.

Deletionsmutanter är kinas döda. ( a ) HEK293-celler transfekterades transient med de angivna SV40-driven Abl-expressionskonstruktionerna. Celler lyserades 40 timmar efter transfektion och totala proteinextrakt analyserades med anti-Abl och anti-fosfotyrosinimmunblotting. ( b ) Abl-immunutfällningar undersöktes med anti-Abl- och anti-fosfotyrosinantikroppar (nedre paneler) och analyserades med avseende på katalytisk aktivitet genom in vitro -kinasanalyser med användning av en optimal substratpeptid. Histografen visar in vitro- kinasaktiviteten (medelvärde med sd av två experiment utförda i tre exemplar) av Abl-konstruktionerna. ( c ) Deletionsmutant BCR-ABL stabilt infekterad i Ba / F3-celler hölls i IL-3-kompletterat medium. Tillväxtfaktorberoende testades genom cellproliferationsanalys med en gradient av IL-3 i 10-faldigt utspädningssteg från den normala koncentrationen av 1 ng / ml. ( d ) Deletionsmutanta Ba / F3-linjer upprätthållna i IL-3-kompletterat medium lyserades och testades med avseende på Bcr-Abl-expression och autofosforylering med immunblot.

Bild i full storlek

Samuttryck av deletionsmutanter med p210 BCR-ABL. ( a ) Deletionsmutant Bcr-Abl uttryckt stabilt i Ba / F3-p210-celler sorterades baserat på låga (L), medium (M) och höga (H) GFP-uttryck som ett surrogat för deletionsmutantproteinnivåer. ( b ) Deletionsmutanter i Ba / F3- eller Ba / F3-p210-celler testades med avseende på total Bcr-Abl-expression och autofosforylering med immunoblot. Infödda BCR-ABL transfekterades in i Ba / F3 och Ba / F3-p210-celler för att visa effekten av den uttryckta p210-dosen. Δ248–274 ( c ) och Δ184–274 ( d ) mutant Ba / F3-p210-cellinjer som bibehölls i frånvaro av tillväxtfaktor testades med avseende på känslighet för imatinib i cellproliferationsanalyser. Graferna representerar medel för två experiment.

Bild i full storlek

Samuttryck av P-loop-deletionsmutanter stör inte den onkogena aktiviteten hos nativ BCR-ABL

I celler som samuttrycker nativ och katalytiskt inaktiv deletionsmutant kan BCR-ABL heterokomplexbildning minska onkogen potential. Vi samuttryckte därför vildtyp och raderingsmutant genom att infektera Ba / F3-p210-celler med Δ248–274 och Δ184–274 BCR-ABL retrovirus. För att generera subliner med varierande mutant till naturligt BCR-ABL-förhållande, sorterade vi celler baserat på lågt (L), medium (M) och högt (H) GFP-uttryck. Samuttryckande cellinjer var fortfarande IL-3 oberoende (figur 3a). Immunoblot av de samuttryckande cellinjerna föreslog transfosforylering av Δ248–274-mutanten av infödda BCR-ABL, men inte för Δ184–274-mutanten (figur 3b). Vi föreslår att orsaken till denna skillnad kan vara bristen på fosforyleringsplatserna Y185, Y226 och Y232 från mutanten Δ184–274. 16 Som en positiv kontroll uttrycktes p210 i Ba / F3-p210-celler för att visa effekten av fördubbling av BCR-ABL-"dosen". Dessa resultat bekräftades genom samuttryckning av deletionsmutanterna med nativt BCR-ABL i ett tetracyklininducerbart system. 17 TonB210-celler som uttryckligen uttryckte Δ248–274 och Δ184–274 blev IL-3 oberoende vid tillsats av Doxycycline i cellodlingsmediet för att inducera p210 BCR-ABL (kompletterande figur 1a). Likaså detekterades BCR-ABL autofosforylering endast efter induktion av p210 (kompletterande figur Ib). Sammantaget visar dessa data att deletionsmutanterna inte uppvisar en dominerande-negativ effekt med avseende på BCR-ABL-aktivering och IL-3-oberoende.

Samuttryck av P-loop-deletionsmutanter i Ba / F3-p210-celler ökar känsligheten för imatinib

För att testa om deletionsmutanterna kan påverka imatinibkänslighet odlades Δ248–274 och Δ184–274-mutanta Ba / F3-p210-cellinjer i frånvaro av IL-3 och testades för deras känslighet för imatinib i cellproliferationsanalyser. Oväntat ledde samuttryck till en ökning av imatinibs känslighet som var reproducerbar i flera experiment (figur 3c och d). Vidare var ökningen i imatinibkänslighet konsekvent högst i linjerna som uttrycker de högsta nivåerna för deletionsmutant BCR-ABL. Således resulterar samuttryck av deletionsmutanter konsekvent i ökad imatinibkänslighet, även om den totala nivån av BCR-ABL-fosforylering ökas med deras uttryck. Denna observation indikerar att det finns en dominerande-negativ effekt av deletionsmutant samuttryck med avseende på imatinibkänslighet.

Uppföljningsanalys av patienter med upptäckt av en P-loop-deletionsmutation

För att bedöma möjliga kliniska implikationer hos de åtta patienter som uttryckte BCR-ABL-deletionsmutanterna samlades de relevanta laboratorievärdena och mutationsanalys utfördes på tillgängliga uppföljningsprover. Hos två patienter (patienter nr 2 och 7) detekterades deletionsmutanten samtidigt med en ökning av BCR-ABL- transkriptnivåer (figur 4a). En av dessa patienter hade också L248V-mutationen. Hos fyra patienter inträffade en ökning av BCR-ABL 3–21 månader efter detekteringen av borttagningen (patienter nr 1, 4, 5 och 8). Figur 4b visar uppföljningscytogenetik och mutationsanalys. Av de två patienterna med L248V- och Δ248–274-mutationerna, patient nr. 1 återkallade 25 månader senare; inga uppföljningsdata finns tillgängliga för patientnr. 3. Av de fem patienterna med Δ184–274-mutanten har två också haft en kinasdomänpunktsmutation. En annan patient med Δ184–274 erhöll ett stort cytogenetiskt svar (nr 4) och två upprätthöll en CCR (nr 2 och 8). Det är anmärkningsvärt att patient nr. 4 i vilka Δ184–274 detekterades vid det ursprungliga provet hade i stället detektering av Δ363–444 OOF (exon 7-förlust) vid 6-månaders uppföljningsprovet. Sammanfattningsvis avslöjar den kliniska uppföljningen hos dessa patienter ingen konsekvent samband mellan närvaron av deletionsmutanter och återfall.

Klinisk data för patienter med en P-loop-deletionsmutation. ( a ) Tillgänglig qRT-PCR-data för BCR-ABL hos patienter med en P-loop-raderingsmutation ritades under perioden 24 månader före och efter den ursprungliga detektionen av en mutant. QRT-PCR-uppgifterna visas inte för patientnr. 3 på grund av den långa tidsperioden mellan proverna. ( b ) Kliniska tidslinjer visas för att indikera cytogenetisk analys och mutationsanalys före och efter indexprovet med detektion av mutationsmutation. Alla patienter tog imatinib under hela den visade perioden, såvida inte de anges vid imatinib (IM) -start eller bytte till dasatinib (das). På grund av ett kryptiskt omarrangemang hos patient nr. 1 inte synlig på cytogenetik, FISH-procenttal anges istället.

Bild i full storlek

Diskussion

Punktmutationer i kinasdomänen i BCR-ABL är en vanlig och omfattande studerad mekanism för förvärvad resistens mot imatinib. Däremot har deletionsmutationer bara nyligen beskrivits, deras förekomst är okänd och ingen funktionell analys har genomförts. Vi upptäckte BCR-ABL- deletionsmutationer hos 14 av 101 patienter testade genom direkt sekvensering av PCR-produkter. Mutanten Δ248–274 samordnar exklusivt med L248V-mutationen. Detta tros bero på introduktionen av en alternativ skarvplats genom CTG> GTG-substitution vid kodon 248. 2 I vår serie var emellertid den vanligaste raderingsmutationen Δ184–274. Bristen på upptäckt av denna mutation tidigare kan sannolikt bero på användningen av primersekvenseringsprimers lokaliserade 3 ′ av rest 184, vilket skulle detektera vild typ, men inte Δ184–274-transkriptet. Mekanismen för förlust av exon 4 är sannolikt alternativ skarvning, även om det är oklart varför detta inträffar hos vissa patienter till en detekterbar nivå men inte andra. En annan möjlighet är att introniska mutationer påverkar skarvning hos dessa patienter. Tyvärr skulle detta vara svårt att undersöka på grund av storleken på ABL- intronerna och det resulterande avståndet mellan intron / exon-korsningarna från brytpunkten (> 200 Kb). 18

Båda P-loop-deletionsmutanterna är i sig kinas inaktiva och ger inte tillväxtfaktoroberoende. Därför är förutsägelsen att exklusivt uttryck av deletionsmutantprotein i en CML-cell kommer att eliminera BCR-ABL-aktivitet och därmed konkurrensfördelen jämfört med normal hematopoies. Även om vi inte analyserade mutant och nativt BCR-ABL- samuttryck i enstaka celler, är våra data förenliga med detta antagande. Med samuttryck kan man förutsäga att en kinas inaktiv allel kan uppvisa en dominerande-negativ effekt på den aktiva allelen. Vi hittade dock inga bevis för detta när det gäller tillväxtegenskaper och signalaktivitet. Oväntat ökade reproducerbart samuttryck av deletionsmutant BCR-ABL imatinibkänslighet. Detta representerar en dominerande-negativ effekt med avseende på det nativa proteinets känslighet för hämning. Den underliggande mekanismen för denna imatinibsensibilisering förblir svårfångad. En möjlighet är att heterodimerer kan stabilisera en inaktiv BCR-ABL-konformation som kan binda imatinib. 19 När det gäller L248V / Δ248–274 kan punktmutantens höga inneboende imatinib-motstånd övervinna varje handikapp som tas ut av strykningsmutanten. Å andra sidan kan tendensen med denna mutation gynna genereringen av Δ248–274-alleler och de ytterligare effekterna på imatinibs känslighet dämpa den biologiska fenotypen av denna mutant, som är mycket imatinib-resistent in vitro . 1

Upptäckten av Δ184–274-mutationen utvidgar ett framväxande arbete som antyder att alternativ skarvning i BCR-ABL är vanligare än tidigare trott. En ny rapport beskrev alternativt skarvade BCR-ABL- transkript som förenar BCR till antingen ABL exon 4 eller 5, vilket resulterar i ramöversättning av ABL . 4 Dessa händelser visade sig inträffa i 80% av de nyligen diagnostiserade CML-fallen testade med gelekstraktion och sekvensering av de mindre banden. 4 Denna höga frekvens av alternativt skarvade produkter liknar förarbete från en annan grupp. 3 Den lägre frekvensen för detektion av dessa transkript hos våra patienter kan vara relaterad till vår praxis att sekvensbestämma hela PCR-produkten (där små transkript måste tävla med vild typ för att visas på kromatogrammet) och det faktum att vår kohort består av patienter på imatinib, snarare än nyligen diagnostiserade. Således kommer majoriteten av CML-patienter sannolikt att uttrycka BCR-ABL-kinas döda fusioner i olika nivåer tillsammans med vildtypsproteinet. Konsekvenserna av samuttryck Δ184–274 och Δ248–274-mutanter med infödda BCR-ABL i vårt arbete kommer sannolikt att extrapolera till de andra alternativt skarvade produkterna också.

Våra data visar att deletionsmutationer av BCR-ABL är relativt frekventa hos patienter som behandlas med imatinib. Med tanke på att automatiserad sekvensering används för mutationsdetektering i de flesta laboratorier är det troligt att många raderingsmutationer tolkas som spår med hög bakgrundssekvensering och därför undviker diagnos. Påverkar deletionsmutationer prognosen för patienter på imatinib? Åtminstone i vår relativt lilla kohort kunde vi inte upptäcka ett samband mellan förekomsten av raderingmutationer och resultat. Detta kan återspegla det komplexa samspelet mellan radering och punktmutationer. Till exempel utlöses kinasinaktiva Δ248–274-mutanten av närvaron av L248V, vilket ger en hög grad av resistens; samtidigt ökade samuttryck av deletionsmutanten imatinibs känslighet. Vidare är det okänt om benägenheten hos en given CML-patient att generera skarvvarianter är prognostiskt bra, dålig eller neutral. Således kommer större studier att krävas för att definitivt bestämma den prognostiska effekten av deletionsmutationer.

Kompletterande information

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Leukemia-webbplatsen (//www.nature.com/leu)