Caveolae och caveolin-1 förmedlar endocytos och transcytos av oxiderat lipoprotein med låg densitet i endotelceller | acta Pharmacologica sinica

Caveolae och caveolin-1 förmedlar endocytos och transcytos av oxiderat lipoprotein med låg densitet i endotelceller | acta Pharmacologica sinica

Anonim

Abstrakt

Syfte:

Att undersöka mekanismerna som är involverade i ox-LDL-transcytos över endotelceller och caveolaes roll i denna process.

metoder:

En in vitro- modell upprättades för att undersöka passagen av oxiderat lågdensitetslipoprotein (ox-LDL) genom ett tätt monolag av endotelceller från humana navelsträngsvener (HUVEC) odlade på ett kollagenbelagt filter. Passage av DiI-märkt ox-LDL genom monoskiktet mättes med användning av en fluorescensspektrofotometer. Upptag och utflöde av ox-LDL med HUVEC bestämdes med användning av fluorescensmikroskopi och HPLC.

Resultat:

Caveolae-hämmare - karragenan (250 μg / ml), filipin (5 μg / ml) och nocodazol (33 μmol / L) - minskade transporten av ox-LDL över monoskiktet med 48, 9%, 72, 4% och 79, 8% jämfört till kontrollgruppen. Dessutom minskade de effektivt ox-LDL-upptag och inhiberade utflödet av ox-LDL. Caveolin-1 och LOX-1 reglerades upp med ox-LDL på ett tidsberoende sätt och minskade gradvis efter utarmning av ox-LDL ( P <0, 05). Efter behandling av HUVEC med ox-LDL och tystande kaveolin-1 blockerades NF-KB-omvandling till kärnan och LOX-1-uttrycket minskade ( P <0, 05).

Slutsats:

Caveolae kan vara en bärare för ox-LDL och kan vara involverad i upptag och transcytos av ox-LDL av HUVEC.

Introduktion

Utvecklingen av aterosklerotiska skador är förknippade med ansamlingen av lipidavlagringar i artärintima och beror starkt på nivån av ox-LDL i blodplasma 1 . Aterosklerotisk plack, den vanligaste lesionen, kännetecknas av en förtjockning av arteriell intima och består vanligtvis av en lipidkärna med en överliggande fibrös mössa. Ökande bevis tyder på att ox-LDL är ett mycket giftigt lipoprotein. Koncentrerad ox-LDL i subendotelet bidrar till ansamlingen av kolesterol i aterosklerotiska plack 2, 3 . Emellertid förstås mekanismen som ligger bakom passagen av ox-LDL genom endotelet dåligt. Vaskulärt endotel kontrollerar handeln med lipoproteiner mellan kärlets lumen och artärväggen, och kontrollen kan störas i arteriosklerotiska blodkärl. Att förstå mekanismerna för lipoproteintranslokation, särskilt från artärvägg till kärllumen, kommer att vara fördelaktigt för terapin av hjärt-kärlsjukdomar. Caveolae är distinkta, kolvformade invaginationer av plasmamembranet som genereras i Golgi-komplexet. Dessa organeller har en karakteristisk lipidkomposition och är associerade med ett 22 kDa-protein som kallas caveolin-1. Zhang rapporterade att två ox-LDL-receptorer, CD36 och den relaterade receptorn SR-B1, lokaliseras till caveolae 4, 5 . Flera humana studier har visat transcytos av makromolekyler med hjälp av caveolae i endotelceller 6, 7, 8, 9, 10, 11 . Vi ansåg att ox-LDL kan internalisera och transcytos på detta sätt. Bruneau beskrev en modell för att studera passagen av makromolekyler genom en monolager av INT-407 celler 12 . Vi använde den här modellen för att undersöka egenskaper och mekanism för ox-LDL-passage. LOX-1 är den huvudsakliga receptorn för ox-LDL i endotelceller 13 . Uttrycket av LOX-1 moduleras av ox-LDL 14 . Caveolin-1 är det huvudsakliga strukturella proteinet i caveolae, och det spelar en avgörande roll i bildandet av dessa invaginationer av plasmamembranet. Caveolin-1 är ett kolesterolbindande protein. Hu och Wu demonstrerade sambandet mellan caveolin-1 och cellkolesterolnivå 15, 16 . Våra tidigare studier visade att caveolin-1 är involverat i cellulär kolesterolackumulering, bildning av skum med glatt muskelcellsmassa, intercellulärt kolesterolutflöde och vaskulär ombyggnad 17, 18, 19 . Dessa fynd indikerar att caveolae och caveolin-1 kan spela en viktig roll vid cellulär kolesterolhomeostas. Syftet med denna studie var att undersöka mekanismerna som är involverade i kolesteroltranscytos och rollen som caveolin-1 i ox-LDL-translokation. I denna studie använde vi tre caveolae-hämmare: karragenan, filipin och nocodazol. Studier har visat att karragenan avskaffar ox-LDL-bindning till caveolae 20 ; filipinbehandling stör den strukturella integriteten hos grottor i plasmamembranet och minskar antalet synliga grottor på endotelytan 21 ; och nocodazol blockerar rörelsen av grottor genom mikrotubulär depolymerisation 22 . Vi demonstrerade medling av upptag och transcellulär transport av ox-LDL av caveolae i HUVEC. HUVEC fungerar som ett post-house vid ox-LDL-translokation mellan blodplasma och subendotel. Hela prossess undviker ansamling av ox-LDL i HUVEC.

Material och metoder

Kemikalier och material

Transwell-odlingssystemet som användes för permeabilitetsstudier bestod av polykarbonatinsatser med en diameter av 24 mm med porer på 0, 4 μm (Costar, Cambridge, MA). Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), penicillin, streptomycin och trypsin-EDTA erhölls från GIBCO (Grand Island, NY). Karrageenan, nocodazol, filipin, DiI (1, 1'-dioktadecyl-3, 3, 3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat) och kolesterolstandard köptes från Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA). Ox-LDL erhölls från Institute of Clinical Pharmacology vid Sun Yat-sen University (Guangdong, Kina). Costar Transwell-kulturbrunnar erhölls från Fisher Scientific (Springfield, NJ). Primära antikroppar för caveolin-1 och NF-KB erhölls från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) och för LOX-1 från Chemicon International. Sekundära antikroppar erhölls från Molecular Probes (Eugene, OR). Förbättrad kemiluminescensreagens (ECL) för detektion på Western blots köptes från Amersham Biosciences (Arlington Heights, IL). SiRNA för transfektionsbehandlingar erhölls från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Lipofektaminreagens för transfektion av siRNA erhölls från Invitrogen Life Technologies (Grand Island, NY).

Celler och kultur

HUVEC erhölls från Institutet för farmakologi vid Central South University (Hunan, Kina) som kryokonserverade celler. Efter upptining odlades cellerna i 75 cm2 odlingsflaskor och hölls i DMEM. Cellmediet kompletterades med 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycinlösning och 30 μg endotelcelletillväxttillskott per ml. För permeabilitetsstudier ympades HUVEC i 24-mm Transwell-Clear-skär med en täthet av 4 × 104 celler per insats och tilläts nå sammanflöde under 3 dagar. Den intercellulära övergången integritet av endotel monolager bestämdes genom mikroskopi och genom att mäta permeabilitet för bovint serumalbumin som beskrivs på annat håll 23 .

MTT-analys

HUVECs ympades i plattor med 96 brunnar vid 103 celler / brunn och fick hålla fast under 8 timmar. De subkonfluenta cellerna exponerades sedan för medium innehållande 40 μg / ml ox-LDL under olika tidsperioder. Vid olika tidpunkter beräknades cellöverlevnadsfraktionen från metyltiazolyltetrazolium (MTT) -analysen. I korthet tillsattes 10 mikroliter MTT-lösning i 5 mg / ml fosfatbuffrad saltlösning till varje brunn, och plattorna inkuberades under 4 timmar, 50 mikroliter DMSO tillsattes. Plattor skakades sedan tills kristallerna löstes och därefter analyserades de på en enzymlänkad immunosorbent-analysplattläsare vid 490 nm för att bestämma absorbansen hos proverna.

Lipoprotein-märkning

Oxen-LDL märktes med den fluorescerande sonden DiI genom en modifiering av metoden beskriven av Fisher 24 . I korthet framställdes en stamlösning av DiI genom att lösa 30 mg DiI i 1 ml dimetylsulfoxid och en lämplig volym sattes till ox-LDL-lösningen. Koncentrationen av ox-LDL justerades till 1 mg protein per ml för att ge en slutlig koncentration av 150 ug DiI per mg ox-LDL-protein. Blandningen skyddades från ljus och inkuberades vid 37 ° C under 18 timmar för att ge DiI-märkt ox-LDL (DiI-ox-LDL), som därefter skiktades med en NaBr-lösning (densitet = 1, 1 g / ml) och åter- isolerat genom ultracentrifugering (100 000 × g , 18 timmar, 20 ° C), dialyserat mot fosfatbuffrad saltlösning (18 timmar, 4 ° C) och steriliserat genom filtrering (Nalgene polyeter sulfonfilter, 0, 22 mikrometer; Nalge Nunc International, Naperville IL). Den slutliga proteinkoncentrationen bestämdes med Bradford-metoden 25 . DiI-ox-LDL lagrades vid 4 ° C i mörkret och användes inom 7 dagar. Fluorescensdensiteten och intensiteten hos DiI-märkt ox-LDL inuti cellen observerades genom fluorescerande mikroskopi.

Transendotelial ox-LDL-permeabilitet

Transendotelial permeabilitet för ox-LDL i HUVEC monolager bestämdes med användning av Transwell-filterenheter. HUVEC-monolager tvättades och inkuberades under 1 timme med karragenan, filipin eller nocodazol. DiI-Ox-LDL placerades i den apikala behållaren i en slutkoncentration av 40 μg / ml. Efter 24 timmars inkubation togs prover från de apikala och basolaterala facken och relativa fluorescerande enheter av apikala och basolaterala prover mättes i en fluorescensspektrofotometer vid 399- och 610-nm excitations- och emissionvåglängder. Värdena uttrycktes som procentandelen apikal DiI-Ox-LDL per brunn som passerade Transwell-membranet.

HPLC-analys

HPLC-analys (högpresterande vätskekromatografi) genomfördes såsom beskrivits tidigare 26 . Celler tvättades med PBS 3 gånger. Lämplig volym (vanligtvis 1 ml) av 0, 5% NaCl sattes till 50–200 μg cellulära proteiner per ml. Cellerna sonikerades med hjälp av en ultraljudprocessor under 2 minuter. Proteinkoncentrationen i celllösningen mättes med användning av BCA-kit. En alikvot av celllösningen (0, 1 ml innehållande 5-20 μg protein) användes för att mäta det fria kolesterolet, och en annan alikvot användes för total kolesteroldetektion. Fritt kolesterol upplöstes i isopropanol (1 mg kolesterol / ml) och förvarades vid -20 ° C som stamlösning. Kolesterolstandardskalibreringslösning som sträckte sig från 0 till 40 ug kolesterol per ml erhölls genom utspädning av kolesterolbeståndslösningen i celllysbufferten. Varje prov (0, 1 ml kolesterolstandardskalibreringslösning eller celllösning) kompletterades med 10 mikroliter reaktionsblandning inklusive 500 mmol / L MgCl2, 500 mmol / L Tris-HCl (pH 7, 4), 10 mmol / L ditiotreitol och 5% NaCl . Kolesteroloxidas (0, 4 U) i 10 mikroliter 0, 5% NaCl sattes till varje rör för fri kolesterolbestämning, eller 0, 4 U kolesteroloxidas plus 0, 4 U kolesterolesteras för total kolesterolmätning. Den totala reaktionslösningen i varje rör inkuberades vid 37 ° C under 30 minuter, och 100 ul metanol: etanol (1: 1) tillsattes för att stoppa reaktionen. Varje lösning hölls kall under 30 minuter för att tillåta proteinutfällning och centrifugerades sedan vid 1500 r / min under 10 minuter vid 15 ° C. Supernatant (10 mikroliter) applicerades på en systemkromatograf (PerkinElmer Inc) inklusive en PerkinElmer-serie 200 vakuumavgasare, en pump, en PerkinElmer-serie 600 LINK, en PerkinElmer-serie 200 UV / vis-detektor och en Discovery C-18 HLPC-kolonn (Supelco inc). Kolonnen eluerades med användning av isopropanol: n- heptan: acetonitril (35:13:52) med en flödeshastighet av 1 ml / min under 8 minuter. Absorbans vid 216 nm övervakades. Data analyserades med programvaran TotalChrom från PerkinElmer.

Ox-LDL-bindning och internalisering

HUVEC ympades i glaskammarglas med 100 celler / mm ^ och inkuberades med DMEM innehållande 0, 2% FCS under 24 timmar före experimentet. Bindningsexperiment utfördes såsom tidigare beskrivits 27 . HUVEC inkuberades med 40 μg / ml DiI-Ox-LDL vid 4 ° C under 30 minuter. Efter bindning avlägsnades medium och celler inkuberades vid 37 ° C under 4 timmar i frånvaro eller närvaro av de olika testade föreningarna. Celler tvättades i DMEM-BSA innehållande heparin 100 U / ml under 15 minuter vid 4 ° C med konstant skakning, fixerades vid rumstemperatur under 10 minuter i PBS innehållande 3% paraformaldehyd och 2% sackaros och tvättades två gånger med PBS. Slutligen togs fluorescerande mikrofotografier med ett Olympus Vanox AHBT3-mikroskop med ett exciteringsfilter för rodamin.

siRNA-transfektion

Kortstörande RNA (siRNA) specifikt för humant caveolin-1 (Santa Cruz Biotechnology) och nonsilencing-kontroll siRNA syntetiserades av Biology Engineering Corporation i Shanghai, Kina. HUVEC (2 x 106 celler / brunn) transfekterades med användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Fyrtioåtta timmar efter transfektion utfördes realtids RT-PCR. I jämförelse med kontroll-siRNA undertryckte siRNA för caveolin-1 expressionen av caveolin-1-proteiner med 82% enligt Western blot-analys.

Kärnkraftsutvinning

HUVEC inkuberades med ox-LDL (40 μg / ml) under 24 timmar efter transfektion. Celler skördades för extraktion av kärnproteiner efter inkubering. Celler sköljdes med kall PBS, skrapades, uppsamlades genom centrifugering, återuppslammades i 300 ul lysbuffert (50 mmol / L KCl, 0, 5% IGEPAL CA-630, 25 mmol / L HEPES, 10 | ig / ml leupeptin, 20 | ig / ml ml aprotinin, 125 μmol / L ditiotreitol (DTT) och 1 mmol / L fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)), överfördes till ett 1, 5 ml Eppendorf-rör och hölls på is i 4 minuter. Kärnor uppsamlades genom centrifugering (10 000 r / min, 10 min vid 4 ° C) och tvättades i 300 mikroliter tvättbuffert (50 mmol / L KCl, 25 mmol / L HEPES, 10 ug / ml leupeptin, 20 μg / ml aprotinin, 125 μmol / L DTT och 1 mmol / L PMSF). Kärnor pelleterades (10 000 r / min, 1 min vid 4 ° C) och suspenderades på nytt i 30–100 μL extraktionsbuffert (500 mmol / L KCl, 25 mmol / L HEPES, 10% glycerol, 10 μg / ml leupeptin, 20 μg / ml aprotinin, 125 μmol / L DTT och 1 mmol / L PMSF) under 20 minuter. Suspensionen centrifugerades (14 000 r / min, 2 min vid 4 ° C). Proteinkoncentration mättes med användning av Bradford-analysen 25 .

Western blot-analys

Celler skördades och proteinextrakt framställdes såsom tidigare beskrivits 15 . De utsattes sedan för Western blot-analys [10% SDS-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE); 30 μg protein per spår] med användning av kanin anti-LOX-1, mus anti-NF-κB, mus anti-caveolin-1 och ß-aktinspecifika antikroppar. Proteinerna visualiserades med användning av en kemiluminescensmetod (ECL Plus Western Blotting Detection System; Amersham Biosciences, Foster City, CA, USA).

Statistisk analys

Data uttrycks som medel ± SD. Resultaten analyserades med enkelriktad ANOVA och Student's t- test med användning av SPSS 13.0-programvara. Statistisk signifikans erhölls när P- värden var mindre än 0, 05.

Resultat

Caveolae-hämmare inhiberade transcytos av ox-LDL över endotel

Tidigare studier rapporterade den potentiella rollen som caveolae har i makromolekyltransport över alveolärt endotel. För att bestämma om caveolae är ansvariga för receptormedierad transport av ox-LDL över endotelceller, behandlade vi HUVEC-monolager med caveolae-hämmare före ox-LDL-inkubation, såsom beskrivits ovan. Cellviabiliteten för HUVEC förändrades inte signifikant under våra experiment (figur 1). Tabell 1 visar att carrangeen minskade transporten av ox-LDL över monoskiktet med 48, 9%, filipin minskade transporten av ox-LDL över monoskiktet med 72, 4% och nocodazol minskade transporten av ox-LDL över monolageret med 79, 8%. Dessa resultat tyder på att caveolae och caveolin-1 spelar en avgörande roll vid transcytos.

Image

Effekt av ox-LDL på cellviabilitet i HUVEC. HUVECs ympades i plattor med 96 brunnar vid 103 celler / brunn och fick hålla fast under 8 timmar. De subkonfluenta cellerna exponerades sedan för medium innehållande 40 μg / ml ox-LDL. MTT-analys utfördes vid 0, 6, 12 och 24 timmars tidpunkt. Varje experiment utfördes i tre exemplar och staplar representerar medelvärde ± SD. n = 3.

Bild i full storlek

Full storlek bord

Caveolae är involverade i endocytisk handel med ox-LDL

De fysiologiska konsekvenserna av caveolae-hämmare på upptag av ox-LDL genom en LOX-1 beroende mekanism studerades. HUVEC inkuberades med DiI-ox-LDL under 30 minuter vid 4 ° C. Efter avlägsnande av obundet ox-LDL tillsattes de tre caveolae-hämmarna, och den bundna lipoproteinfraktionen lämnades för att internalisera i 4 timmar vid 37 ° C. Fluorescerande mikrofotografier togs efter internalisering. Såsom visas i figur 2 minskade karragenan, nocodazol och filipin signifikant ox-LDL-upptag och kolesterolbelastning av HUVEC. Dessa observationer antyder att grottor är involverade i ox-LDL-upptag.

Image

Effekter av caveolae-specifika hämmare på DiI-ox-LDL-upptag av HUVEC. HUVEC inkuberades med DiI-ox-LDL (40 μg / ml) under 30 minuter vid 4 ° C. Efter bindning avlägsnades medium och celler inkuberades vid 37 ° C under 4 timmar i frånvaro eller närvaro av de olika caveolae-hämmarna. Därefter tvättades, fixerades och fotograferades HUVEC med ett inverterat fluorescensmikroskop (förstoring × 400). (A) HUVEC inkuberades med ox-LDL, (B) HUVEC inkuberades med DiI-ox-LDL, (C) HUVEC inkuberades med DiI-ox-LDL under 30 minuter vid 4 ° C och inkuberades sedan med karragenan (250 | ig (D) HUVEC inkuberades med DiI-ox-LDL under 30 minuter vid 4 ° C, inkuberades sedan med filipin (5 | ig / ml) under 4 timmar, (E) HUVEC inkuberades med DiI- ox-LDL under 30 minuter vid 4 ° C, inkuberades sedan med nocodazol (33 μmol / L) under 4 timmar.

Bild i full storlek

Caveolae spelar en avgörande roll i utflödet av ox-LDL

Som beskrivs i introduktionen antog vi att grottor är involverade i transcytos av ox-LDL. Om så är fallet förväntas utflöde av ox-LDL också vara långsamt när grottorna hämmas. För att undersöka om hämningen av caveolae minskade ox-LDL-utflöde, bestämdes kolesterolhalten i mediet och det cellulära kolesterolet efter behandling med hämmare. Vi inkuberade HUVEC med ox-LDL i 24 timmar. Efter lipidbelastning tvättades HUVEC två gånger med PBS och inkuberades under ytterligare 6, 12 och 24 timmar i ett ox-LDL-utarmat medium i frånvaro eller närvaro av caveolae-hämmare. Efter inkubation analyserades kolesterolhalten i mediet och cellulärt kolesterol med HPLC. Caveolae-hämmare reverserade signifikant minskningen i cellulärt kolesterol och ökningen i kolesterolhalten i mediet (figur 3). Dessa data antyder att grottor är involverade i utflödet av ox-LDL av HUVEC.

Image

Effekter av caveolae-specifika hämmare på ox-LDL-utflöde av HUVEC. HUVEC inkuberades med ox-LDL (40 μg / ml) under 24 timmar. Efter lipidbelastning tvättades HUVECs två gånger med PBS och inkuberades under ytterligare 6, 12 och 24 timmar i ett ox-LDL-utarmat medium med eller utan caveolae-hämmare. Efter inkubation analyserades kolesterolet i cytoplasma (A) och kolesterol i medium (B) med HPLC. Liknande resultat erhölls i sex oberoende experiment. Data är medelvärde ± SD. b P <0, 05 mot motsvarande grupper vid 0 timmar.

Bild i full storlek

Caveolin-1 deltar i upptag av ox-LDL i HUVEC

Våra experiment visar att kaveolin-1 och LOX-1 uppreglerades av ox-LDL på ett tidsberoende sätt och minskade gradvis efter utarmning av ox-LDL (figur 4). Vi försökte bestämma om caveolin-1 spelar en roll i LOX-1-uttrycket. Vi behandlade HUVEC med ox-LDL och tystnad caveolin-1. NF-kB-translokation till kärnan blockerades och LOX-1-uttrycket minskade (figur 5). Denna studie antyder att caveolin-1 deltar i regleringen av LOX-1.

Image

Effekter av ox-LDL-behandling och ox-LDL-utarmning på expression av kaveolin-1 och LOX-1 i HUVEC. HUVEC i 75 cm 2 kolvar inkuberades med ox-LDL (40 μg / ml) under 0, 6, 12 och 24 timmar, följt av inkubering med ox-LDL-utarmat medium under 0, 6, 12 och 24 timmar. . Totala celllysat framställdes vid de olika angivna tidpunkterna. För varje prov användes 20 ug lysatprotein. Western immunoblotting-analyser med användning av antikropp mot humant p-aktin och caveolin-1 och LOX-1 genomfördes. Resultaten reproducerades i tre oberoende experiment. (A) HUVEC inkuberades med ox-LDL under 0, 6, 12 och 24 timmar. (B) HUVEC inkuberades med ox-LDL-utarmat medium under 6, 12 och 24 efter upptag av lipid av HUVEC.

Bild i full storlek

Image

Effekt av tystnad av caveolin-1 på NF-kB-translokation och LOX-1-uttryck i lipidbelastade HUVEC. HUVECs transfekterade med kontroll siRNA eller caveolin-1 siRNA inkuberades med eller utan ox-LDL. Lysater bereddes efter inkubation under 24 timmar för att bestämma uttrycket av NF-KB och LOX-1. Totala cellulära proteiner från HUVEC transfekterade med kontroll siRNA eller siRNA för caveolin-1 immunblottades med anti-caveolin-1, LOX-1 och p-aktin antikroppar, och kärnproteiner immunblottades med anti-NF-KB. Liknande resultat erhölls i sex oberoende experiment. Data är medelvärde ± SD. b P <0, 05 mot motsvarande grupper transfekterade med kontroll siRNA och behandlades med ox-LDL. e P <0, 05 mot motsvarande grupper transfekterade med siRNA av kontroll men inte behandlas med ox-LDL.

Bild i full storlek

Diskussion

Även om stora framsteg har gjorts när det gäller att förstå vaskulärt lipoprotein-kolesteroltransport, har nyligen uppmärksamheten endast fokuserats på kolesterolrika plasmamembranmikrodomäner och deras interaktion med vägar för intracellulär kolesteroltransport och metabolism. Sedan 1955 har grottor erkänts som morfologiskt distinkta ”små fickor, grottor eller urtagningar” (även benämnda ”kolvformade”) vid cellytas plasmamembran 28 . Majoriteten av kolesterolupptag och utflöde sker via dessa specialiserade plasmamembranmikrodomäner. Caveolin-1 är den huvudsakliga strukturella proteinkomponenten i caveolae: den är lokaliserad vid cytoplasmatisk yta på grottan och korsar inte grottmembranet 9 . Caveolin-1 postuleras för att organisera bildning av caveolae-mikrodomäner och för att reglera caveolae-relaterade signalhändelser, såsom proteinkinas C, Src-liknande kinaser, Ras och endotel NO-syntas. Ox-LDL har implicerats som en kausal faktor i patogenesen för åderförkalkning, inklusive omvandling av makrofager till skumceller.

Fokus för den här artikeln är rollen som caveolae och caveolin-1 och deras medling av ox-LDL-upptag / efflux och transcytotisk handel. Vår studie visade upptag av ox-LDL av HUVEC, och ox-LDL passerade över endotelet. Dessa processer medierades via caveolae, som blockeras av två caveolae-hämmare, filipin och nocodazol. Vi visade också att caveolin-1 spelar en roll för att främja upptag av ox-LDL av HUVEC. En tidigare studie visade lipidansamling inom makrofager som en viktig orsak till bildning av makrofagskumcell. I föreliggande studie ökade ox-LDL upptaget av lipid i HUVEC men ingen bildning av skumcell observerades. Det verkar som om HUVEC fungerar som ett post-house vid ox-LDL-translokation mellan blodplasma och subendotel: denna process kan förhindra att lipid samlas i HUVEC.

Nyligen har man lagt stor vikt vid ox-LDL som ett huvudsakligt toxiskt lipoprotein för aterogenes. Upptag av ox-LDL av målceller i det subendoteliale utrymmet orsakar omvandling av makrofager till skumceller och proliferation av glatta muskelceller 29 . Caveolae spelar en viktig roll i regleringen av endocytos och transcytos i endotelceller. Baserat på data från vår studie kände ox-LDL igen LOX-1 av endotelceller, internaliserade det i cellerna och passerade sedan genom endotelet. Caveolae fungerade således som en bärare för ox-LDL-upptag och transcytos. Detta koncept stöds av två hämmare, filipin och nocodazol, som inhiberade ox-LDL-upptag och transcytos över epitelet.

Caveolin-1 är ett viktigt strukturellt protein i caveolae och dess högsta expressionsnivå är i endotelceller 30 . Vår studie visade att ox-LDL uppreglerade caveolin-1 på ett tidsberoende sätt. Dessutom ökade caveolin-1 LOX-1-uttrycket och främjade translokation av NF-KB, vilket är ett onkogenprotein som reglerar transkription av olika cellulära gener, inklusive LOX-1. Således kan caveolin-1 främja ox-LDL-upptag av HUVEC, och NF-KB kan spela en roll i denna väg.

Sammanfattningsvis inträffade lipidansamling inte under inkubering av HUVEC med ox-LDL. Ox-LDL-bindning i HUVEC internaliserades i celler av caveolae och transciterades över endotelceller med rörelse av caveolae. Caveolae, som arbetade som bärare, spelade en oumbärlig roll under hela processen. Caveolin-1 kan reglera uttrycket av LOX-1 och ox-LDL-upptag.

Författares bidrag

Duan-fang LIAO och Chao-ke TANG designade forskning; Shao-wei SUN och Xu-yu ZU utförde forskning; Xiao-yong LEI och Qin-hui TUO bidrog med nya analysverktyg och reagens; Lin-xi CHEN och Kai LI analyserade data och Shao-wei SUN skrev tidningen.