Hjärnskydd genom kombination av tre föreningar från shengmaipreparat i möss med myokardiell ischemi / reperfusionsskada genom ampk-aktiveringsmedierad mitokondriell klyvning | vetenskapliga rapporter

Hjärnskydd genom kombination av tre föreningar från shengmaipreparat i möss med myokardiell ischemi / reperfusionsskada genom ampk-aktiveringsmedierad mitokondriell klyvning | vetenskapliga rapporter

Anonim

ämnen

  • Klinisk farmakologi
  • Hjärtinfarkt

Abstrakt

GRS är en läkemedelskombination av tre aktiva komponenter inklusive ginsenosid Rb1, ruscogenin och schisandrin. Det härstammar från den välkända TCM-formeln ShengMai-preparat, ett allmänt använt traditionellt kinesiskt läkemedel för behandling av hjärt-kärlsjukdomar i kliniken. Föreliggande studie undersöker de hjärtskyddande effekterna av GRS på myokardiell ischemi / reperfusion (MI / R) skada jämfört med ShengMai-preparat och undersöker de underliggande mekanismerna. GRS-behandling dämpade signifikant MI / R-skada och uppvisade liknande effekt som Shengmai-beredningar, vilket framgår av minskad hjärtinfarktstorlek, förbättrad histologiska egenskaper, minskningen av LDH-produktion och förbättrad hjärtfunktion, och gav också en signifikant minskning av apoptotiskt index. Mekaniskt lindrade GRS myokardial apoptos genom att hämma den mitokondriella medierade apoptosvägen, vilket återspeglas genom hämning av kaspas-3-aktivitet, normalisering av Bcl-2 / Bax-nivåer och förbättrad mitokondriell funktion. Dessutom förhindrade GRS kardiomyocyter mitokondriell klyvning och uppreglerade AMPKa fosforylering. Intressant nog förhindrade AMPK-aktivering hypoxi och reoxygenering inducerad mitokondriell klyvning i kardiomyocyter och GRS-åtgärder dämpades signifikant genom knockdown av AMPKa. Sammantaget visar dessa data att GRS är effektiva för att mildra MI / R-skada genom att undertrycka mitokondriell medierad apoptos och modulera AMPK-aktiveringsmedierad mitokondriell klyvning, och ger därmed en grund för framtida kliniska tillämpningar och potentiell terapeutisk strategi för MI / R-skada.

Introduktion

Myokardiell ischemi / reperfusion (MI / R), en av de ledande orsakerna till mänsklig död över hela världen, beror på blodåterställning efter en kritisk period av kranskärlshinder, vilket är nära förknippat med hjärtfunktioner, särskilt hjärtinfarkt, vänster ventrikulär remolding och hjärtsvikt 1 . Det är allmänt känt att MI / R-skada är en patologisk process som inkluderar förstärkt hjärt-apoptos och ökad infarktstorlek 2 . Terapeutiska strategier syftar till att förebygga kardiomyocyter apoptos är av stort kliniskt och hälsovärde för behandlingen av MI / R-skada 3 .

Som en sensor för cellulär energistatus spelar AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) viktiga roller i cellöverlevnad och apoptos 4 . AMPK är ett serin-treoninkinas som involverar i reglering av energibalans och myokardial signalering i hjärtat 5, och utövar under tiden viktiga fysiologiska funktioner inklusive reglering av inflammation, medling av reaktiva syrearter (ROS) och skydd mot apoptos 6 . Många litteraturer har rapporterat att AMPK är hjärtskyddande under MI / R via främjande av glukosupptag och translokering av glukostransportör, hämmar apoptos och minskade hjärtinfarkt 7, 8, 9 . I vår tidigare studie fann vi att YiQiFuMai-pulverinjektionen, ett traditionellt recept för kinesisk medicin som har utvecklats på nytt baserat på den välkända TCM-formeln Sheng-maisan, skulle kunna ge betydande hjärtskydd mot MI / R-skada och potentiella mekanismer kan förhindra kardiomyocyter apoptos åtminstone delvis genom aktivering av AMPK-signalvägarna 10 . Nyligen framträder reglering av det cytoplasmatiska dynamaminrelaterade proteinet 1 (Drpl) som ett potentiellt molekylärt mål genom vilket AMPK-aktivering hämmar mitokondriell dysfunktion och lindrar endoplasmisk retikulum-stressassocierad endotelial dysfunktion 11 . I stressade celler rekryteras Drpl till mitokondriell membran och påskyndar mitokondriell fission, vilket resulterar i mitokondriell funktionsfel 12 . Tidigare studier har visat att AMPK-aktivering skulle kunna undertrycka hög glukosinducerad mitokondriell klyvning i endotelceller 13, vilket antyder AMPK: s potentiella roll i skyddet av mitokondriell funktion. Därför antar vi att farmakologisk aktivering av AMPK skulle kunna skydda mitokondriell morfologi och fungera genom reglering av Drp1-aktivering och därmed hämma kardiomyocyter apoptos.

Under senare år har positiva bevis från kliniska prövningar främjat acceptans av TCM för behandling av hjärt-kärlsjukdomar 14, 15, 16 . Kombinationsterapi har förespråkats i över 2000 år. Behandling som innehåller flera läkemedel som riktar sig mot flera vägar och flera mål skulle ha starkare terapeutisk effekt för komplexa multifaktoriella sjukdomar 17 . ShengMai San är en välkänd traditionell kinesisk formel och dess botemedel har redan använts i stor utsträckning för att förhindra och bota hjärt-cerebrala ischemiska sjukdomar 18, 19, 20 . Nyligen screenade vi en ny läkemedelskombination (GRS, andelen som 6: 0, 75: 6) innefattande tre föreningar, inklusive ginsenosid Rb1 (Ginsenosides of Red ginseng-G), ruscogenin (Saponins of Radix ophiopogonis-R) och schisandrin (Lignans av Fructus schisandrae-S), som visade en signifikant hjärnskyddande effekt i experimentella studier 21 . Andelen av kombinationen optimerades för att uppnå högsta effektivitet, kvalitetsstabilisering och klinisk säkerhet för forskning 22 . Emellertid förblir dess möjliga mekanism i verkan mot MI / R-skada oklart, och likvärdigheten av hjärtskyddande effekter jämförande med Shengmai-preparat (YiQiFuMai pulverinjektion, YQFM) behöver fortfarande ytterligare bekräftelse.

I den aktuella studien testades därför GRS in vivo i en MI / R-skadad musmodell och in vitro i H9c2-kardiomyocytcellinje och primära odlade kardiomyocyter som utsattes för hypoxi / reoxygenation (H / R) för att undersöka den terapeutiska effekten av GRS jämfört med YQFM och dessutom utforska de möjliga underliggande mekanismerna för GRS mot MI / R-skada, särskilt med fokus på mitokondriell klyvning genom reglering av Drp1-fosforylering (Ser 616) på ett AMPK-beroende sätt.

Resultat

GRS minskade hjärtskada och förbättrade hjärtfunktionen hos MI / R-möss

För att undersöka effekterna av GRS på MI / R-inducerad skada mättes infarktstorlek, histopatologisk undersökning och frisättningen av LDH i serum. Såsom illustreras i fig 1 resulterade 30 minuter av ischemi och 24 timmar reperfusion i myokardskada, vilket framgår av ökad infarktstorlek, LDH-aktiviteter och morfologiska förändringar. GRS vid koncentrationen 6, 4–19, 2 mg / kg och captopril (20 mg / kg) behandlingsgrupper undertryckte dock ökningen av infarktstorleken (fig. 1A, B) signifikant. Samtidigt uppvisade den histopatologiska undersökningen från hjärtvävnader från MI / R-möss utbredd myokardiell strukturell störning, ökad nekros och fusionsområde och ett stort antal inflammatoriska celler som infiltrerade hjärtvävnaden. Däremot blev de histologiska kännetecknen typiska för normal hjärtstruktur eller mild arkitektonisk skada med tydlig förbättring efter GRS och captoprilbehandling (Fig. 1C, D). Efter MI / R reducerade GRS och captopril signifikant LDH-aktiviteten (Fig. 1E). Speciellt utövade GRS vid den högsta koncentrationen av 19, 2 mg / kg de ekvivalenta skyddande effekterna av hjärtinfarkt jämfört med YQFM.

(A) 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning bestämde effekten av GRS på hjärtinfarktområdet. (B) Grafisk representation av hjärtinfarktstorlek. (C) Histopatologiska förändringar av representativa myokardssektioner mättes genom HE-färgning (förstoring av 200 x). (D) Poängmätning av histopatologiska förändringar. (E) Frisättningen av LDH i serum vid slutet av reperfusion bestämdes. Resultaten presenterades som medelvärde ± SEM. ## P <0, 01 vs. skamgrupp utan MI / R, * P <0, 05, ** P <0, 01 vs. grupp behandlad med MI / R enbart. n = 6.

Bild i full storlek

Vidare utfördes ekokardiografi för att bestämma effekterna av GRS på hjärtprestanda. Som observerats i fig. 2, jämfört med skam, försämrade MI / R signifikant LVEF och LVFS, medan de inte påverkade LV-massan och LV-volymerna markant. Däremot uppvisade GRS och captopril markant försvagad MI / R-inducerad försämring av LVEF och LVFS, och GRS vid en koncentration av 19, 2 mg / kg den liknande funktionen jämfört med YQFM, medan det inte heller visade någon signifikant skillnad på LV-massa och LV-volymer. Sammantaget tyder dessa data på att GRS-behandling minskar infarktstorleken och förbättrar hjärtprestanda i modellen för MI / R-skada.

(A) Representativa bilder av ekokardiografi. Hjärtprestationen bestämdes genom ekokardiografi 24 timmar efter reperfusion. (B – E) LVEF-värden ( B ) LVFS ( C ) LV-massa ( D ) LV-volymer ( E ) mättes med ekokardiografi. Resultaten presenterades som medelvärde ± SEM. ## P <0, 01 vs. skamgrupp utan MI / R, * P <0, 05, ** P <0, 01 vs. grupp behandlad med MI / R enbart. n = 6.

Bild i full storlek

GRS inhiberade hjärt-apoptos i MI / R-möss

Myokardial apoptos är en väsentlig bidragare till infarktstorleksutvidgning och hjärtsvikt efter ischemisk reperfusionsskada 23 . Därför utförde vi TUNEL-färgning för att undersöka om GRS förhindrade MI / R-inducerad myokardial apoptos. Efter MI / R uppvisade fordonsbehandlade möss uppenbara TUNEL-positiva (apoptos) celler i iskemiskt myokard jämfört med skambehandlade möss (Fig. 3A, B). Däremot observerades en signifikant lägre andel apoptotiska celler i hjärtskivor från GRS-behandlade möss. Som visas i fig. 3C – E resulterade MI / R dessutom i en märkbar ökning i caspase-3-aktivitet och uttryck, och minskningen av Bcl-2 / Bax-förhållandet. Medan GRS-behandling undertryckte caspase-3-aktivitet och uttryck signifikant, uppreglerade under tiden uttrycket av Bcl-2 / Bax-förhållandet jämfört med det för MI / R-gruppen. Dessa data antyder en potent anti-apoptotisk effekt av GRS vid MI / R-skada och uppvisar liknande effekt jämfört med YQFM.

( A ) Representativa mikrofotografier av TUNEL-färgningsbilder (Bar = 40 mikrometer). Totala kärnor märktes med DAPI (blått), F-aktin märktes med rött och apoptotiska kärnor detekterades med TUNEL-färgning (grön). n = 3. (B) Kvantitativ analys av apoptotiska celler i indikerade grupper. (C) Aktiviteten av caspase-3 mättes genom den specifika klyvningen av substrat i varje grupp. n = 6. (D) Proteinuttrycksnivåer för klyvt caspas-3 bestämdes genom Western blot-analys. n = 3. (E) Proteinuttrycksnivåer för Bcl-2 och Bax bestämdes genom Western blot-analys. n = 3. Resultaten erhölls från tre oberoende experiment och presenterades som medelvärde ± SEM. # P <0, 05, ## P <0, 01 vs. skamgrupp utan MI / R, * P <0, 05, ** P <0, 01 vs. grupp behandlad med MI / R enbart.

Bild i full storlek

GRS dämpade H / R-inducerad skada och apoptos i kardiomyocyter

Vi undersökte först livskraften hos kardiomyocyter efter behandling med GRS och vi fann att GRS vid koncentrationer av 0, 1–60 μg / ml inte påverkade kardiomyocyternas livskraft signifikant (Kompletterande Fig. S1A, B). På grundval av resultaten från föregående steg valdes tre koncentrationer (0, 1, 1 och 10 μg / ml) för vidare undersökning. Exponering av H9c2-kardiomyocyter (H 6 h / R 6 h) och primära kardiomyocyter (H 12 h / R12 h) till H / R ledde till en minskning av cellviabilitet, medan behandling med 0, 1–10 μg / ml GRS bibehöll cellviabilitet (kompletterande Fig. S1C, D). Eftersom LDH-frisättning var en accepterad markör för cellskada undersöktes även kardiomyocytskada genom att bestämma frisättningen av LDH i odlingsmedium. Jämfört med kontrollgruppen ökade LDH-frisättningen markant efter H / R-skada, medan behandling med 0, 1–10 μg / ml GRS signifikant hämmade frisättningen av LDH (kompletterande figur S1E, F). Uppenbarligen indikerade dessa data att GRS med den högsta koncentrationen uppvisade samma effektivitet som YQFM.

Kärnmorfologisk förändring undersöktes med Hoechst 33342-färgning, som observerade att kontrollgruppen verkade jämnt spridd kromatin, normala organeller och intakta cellmembran. Efter H / R uppvisade kärnorna oregelbundet formade och hyperkondenserade (ljust färgade). Medan de morfologiska förändringarna minskades signifikant med GRS-behandling och antalet celler med kärnkondensation och fragmentering minskade signifikant (Fig. 4A). Kvantitativ analys med flödescytometrisk bekräftade vidare att det apoptotiska indexet ökades markant jämfört med kontrollgruppens. Det apoptotiska indexet minskade emellertid signifikant genom behandling med GRS (fig. 4B, C). Den anti-apoptotiska effekten av GRS med koncentrationen vid 10 μg / ml var densamma som YQFM (400 μg / ml).

H9c2-celler behandlades med GRS i en koncentration av 0, 1–10 μg / ml och utsattes sedan för hypoxi på 6 timmar följt av 6 timmars reoxygenering. (A) Cellapoptos detekterades genom Hoechst 33342-färgning (förstoring av 400 x). Pilarna indikerar de representativa apoptotiska kärnorna. (B) H / R-inducerad cellapoptoshastighet kvantifierades med Flowcytometri. (C) Kvantitativ analys av apoptotiska celler i indikerade grupper. Resultaten erhölls från tre oberoende experiment och presenterades som medelvärde ± SEM. ## P <0, 01 vs. kontrollgrupp utan H / R, ** P <0, 01 vs. grupp behandlad med H / R ensam.

Bild i full storlek

GRS återställd H / R-inducerad förlust av mitokondriell membranpotential och reducerad kardiomyocyter apoptos

Som visas i fig. 5A, B, uppvisade kontrollgrupp ljusfärgade mitokondrier som emitterade röd fluorescens. Celler exponerade för H / R orsakade bildning av monomer JC-1, vilket tyder på förlust av membranpotential. Medan GRS-behandling blockerade den H / R-inducerade bildningen av JC-1-monomerer, tyder på att GRS kunde återställa H / R-inducerad förlust av mitokondriell membranpotential. Dessutom var caspase-3 ett viktigt nedströmsenzym i det sista steget av apoptotisk väg, och det kunde orsaka DNA-nedbrytning och apoptos när det aktiverades. Såsom illustreras i fig. 5C ledde D, H / R till en märkbar ökning av caspase-3-uttryck och aktivitet jämfört med kontrollgruppens nivå, medan behandling GRS reducerade nivån av caspase-3 signifikant. Balansen mellan anti- och pro-apoptotiska proteiner i Bcl-2-familjen spelar en viktig roll i kontrollen av cellöverlevnad mot ischemi reperfusionsskador 24 . Såsom presenterades i fig. 5E ökades Bcl-2 / Bax-förhållandet markant i GRS-behandlade celler jämfört med H / R-gruppen. Vi observerade vidare H / R-inducerad primär kardiomyocyter apoptos i närvaro av GRS. Och vi fann att GRS uppreglerade Bcl-2-uttryck och nedreglerade Bax, aktivt caspase-3-uttryck och aktivitet i primära kardiomyocyter skadade av H / R (kompletterande figur S2). Dessa resultat stödde den anti-apoptotiska effekten som framkallades av GRS med samma effekt som YQFM.

H9c2-kardiomyocyter behandlades med GRS i en koncentration av 0, 1–10 μg / ml och utsattes sedan för hypoxi på 6 timmar följt av 6 timmar reoxygenering. (A) Mitokondriell membranpotential utvärderades med den lipofila katjoniska sonden JC-1 (förstoring av 400 x). Röd signal indikerar JC-1-aggregat i mitokondrier. Grön signal visar cytosoliska JC-1-monomerer som indikerar förlusten av mitokondriell membranpotential. (B) Kvantitativ analys av membranpotential i (A). (C) Aktiviteten av caspase-3 mättes genom den specifika klyvningen av substrat i varje grupp. (D) Caspase-3-proteinuttryck detekterades med Western blot. (E) Bcl-2 och Bax-expression detekterades med western blot. Resultaten erhölls från tre oberoende experiment och presenterades som medelvärde ± SEM. # P <0, 05, ## P <0, 01 vs. kontrollgrupp utan H / R, * P <0, 05, ** P <0, 01 vs. grupp behandlad med H / R ensam.

Bild i full storlek

GRS reglerade Drp1-fosforylering, translokation och förhindrade mitokondriell klyvning

Drp1 reglerar mitokondriell morfologi genom att främja mitokondriell klyvning, och fosforylering av Drp1 vid Ser616 stimulerar mitokondriell klyvning. Såsom visas i fig. 6A var det ingen förändring i totalt Drp1-proteinmängd under H / R-skada, medan en immunblot av p-Drpl vid Ser616 visade en anmärkningsvärd ökning under en period av 4 och 6 timmar efter hypoxi och 0, 5, 1 2 timmar efter reoxygenering. Ett statistiskt test avslöjade att uttrycket ökades signifikant på ett tidsberoende sätt efter reoxygenering och vi valde tidpunkten för reoxygenation på 2 timmar för att ytterligare undersöka effektiviteten hos GRS. Vi fann att GRS vid koncentration av 1–10 μg / ml minskade markant Drp1-fosforylering vid Ser616 i H9c2-kardiomyocyter (fig. 6B) och primära kardiomyocyter (kompletterande fig. S3A) utsatta för H / R-skada. GRS hämmade också signifikant myokardiell Drp1-fosforylering vid Ser616 vid MI / R-skada (kompletterande fig. S4A).

(A) Effekter av hypoxi och reoxygenering på expression av Drpl och p-Drpl (Ser616) i H9c2-kardiomyocyter. Proteinnivåerna bestämdes med användning av Western blot-analys. (B) H9c2-kardiomyocyter behandlades med GRS i en koncentration av 0, 1–10 μg / ml och utsattes sedan för hypoxi på 6 timmar följt av 2 timmar reoxygenering. Drp1 och p-Drpl (Ser616) proteinuttryck detekterades med Western blot. (C) Vy över mitokondriell lokalisering av Drp1 med konfokalt skanningsmikroskop i H9c2-kardiomyocyter (Bar = 10 mikrometer). Mitokondriell morfologi och Drp1-translokation analyserades med användning av en 63 × oljedypslins. Resultaten erhölls från tre oberoende experiment och presenterades som medelvärde ± SEM. # P <0, 05, ## P <0, 01 vs. kontrollgrupp utan H / R, * P <0, 05 vs. grupp behandlad med H / R ensam.

Bild i full storlek

Vi undersökte vidare förändringarna i mitokondriell morfologi med MitoTracker Red-färgning. Mitokondrier är organiserade i ett mycket dynamiskt rörformigt nätverk, medan celler som uppvisar fragmenterade eller sfäriska mitokondrier genomgår mitokondriell klyvning som svar på H / R-skada. Omlokalisering av Drp1 från cytosol till mitokondrier är en indikator för Drp1-aktivering. GRS inhiberade H / R-inducerad mitokondriell klyvning och reducerade placeringen av Drpl vid mitokondrier i kardiomyocyter (fig. 6C, kompletterande fig. S3B), vilket indikerade hämningen av Drp1-rekrytering, som visade samma effekt av YQFM och mitokondriell fissionshämmare Mdivi. -1.

GRS hämmade mitokondriell fission med reglering av AMPK

När AMP-aktiverat proteinkinas (AMPK) agonist observeras modulera Drp1-fosforylering i endotel 11, undrade vi om denna reglering var involverad i verkan av GRS och om aktivering av AMPK-reglerad mitokondriell klyvning i kardiomyocyter utsatt för H / R-skada. Först observerade vi effekten av GRS på AMPK-aktivitet i kardiomyocyter. GRS-behandling ökade signifikant AMPKa-fosforylering i kardiomyocyter och MI / R-skadade möss (fig. 7A, kompletterande figurer S4B och S5A). Eftersom det är mer genomförbart att välja H9c2-cellinje för siRNA-transfektion än att använda primära kardiomyocyter, behandlade vi H9c2-celler med specifik AMPKa siRNA. SiRNA-transfektion optimerades och totala celllysat utsattes för SDS-PAGE för immunblottinganalys med P-aktin som referens för att utvärdera effektiviteten hos AMPKa siRNA. Och AMPKα slogs framgångsrikt av en siRNA-metod med hämningseffektiviteten större än 60% (kompletterande fig. S5B – D).

( A ) H9c2-kardiomyocyter behandlades med GRS i en koncentration av 0, 1–10 μg / ml och utsattes sedan för hypoxi på 6 timmar följt av 1 h reoxygenering. AMPKa och p-AMPKa-uttryck detekterades med Western blot. (B) GRS och AICAR inkuberades med H / R-skada i H9c2-kardiomyocyter transfekterade med AMPKa eller kontrollkrypterade siRNA. AMPKa-, Drpl- och p-Drpl-uttryck detekterades med Western blot. (C) Mitokondrial klyvning detekterades av Mito Tracker Red med konfokal mikroskopi (Bar = 10 mikrometer). # P <0, 05 vs. kontrollgrupp utan H / R, * P <0, 05, ** P <0, 01 vs. grupp behandlad med H / R ensam, $ P <0, 05 vs. grupp behandlad med H / R och AMPKa siRNA.

Bild i full storlek

Samtidigt, som visas i fig. 7B, fann vi att AMPK-agonist AICAR med koncentration 500 μM hämmade Drp1-fosforylering vid Ser616 och tystnad av AMPKa dämpade den positiva effekten av AICAR på Ser616-fosforylering, vilket indikerade att AMPK-aktivering var väsentlig i regleringen av Drp1-fosforylering. Dessutom fann vi att tystnad av AMPKa delvis lindrade den hämmande verkan av GRS på Drp1-fosforylering vid Ser616. Dessutom dämpade AMPKa-knockdown den positiva effekten av GRS på H / R-inducerad mitokondriell klyvning i kardiomyocyter (Fig. 7C). Dessa resultat stödde vår hypotes att AMPK-aktivering reglerade mitokondriell klyvning och var väsentlig för den hämmande verkan av GRS vid Drp1-aktivering och mitokondriell klyvning i kardiomyocyter.

Diskussion

Det har gjorts ett antal studier som illustrerar den kliniska användbarheten av Shengmai-preparat vid behandling av hjärt-kärlsjukdomar, såsom YiQiFuMai-pulverinjektion och Shengmai-injektion. Flera huvudtyper av kemiska komponenter, till exempel ginsenosider, lignaner och homoisoflavonoider, har föreslagits vara ansvariga för den farmakologiska verksamheten i Shengmai-preparat 25 . Nuförtiden har säkerheten och effekten av TCM-injektioner varit ett uppmärksamhetsfokus för det medicinska samfundet. Därför är undersökningar av deras bioaktiva komponenter och verkningsmekanismer viktiga för att bestämma kvalitetskontrollen av TCM-injektioner. Det är nödvändigt att utveckla några säkrare och effektivare kompositioner baserade på dessa effektiva komponenter i TCM.

I vår tidigare studie valde vi tre representativa komponenter (GRS-ginsenoside Rb1, ruscogenin och schisandrin) för optimeringsdesignundersökningen, med användning av kvantitativa farmakologiska metoder på grundval av preliminära studier och relevanta litteraturer om Shengmai-beredningar för myokardiell ischemi, och denna kombination hade erhöll ett godkänt patent i Kina 21 . Även om reperfusionsterapier markant har minskat ischemi-inducerad skada och dödlighet, är effektiva interventionsstrategier fortfarande begränsade 26 . I den aktuella studien minskade behandling med GRS signifikant infarktstorlek och bevarad hjärtfunktion hos möss utsatta för MI / R-skada. Dessa positiva effekter av GRS var associerade med undertryckande av mitokondriell medierad apoptos och mitokondriell klyvning. Dessutom uppreglerade GRS uttryck av AMPKa, medan de skyddande effekterna av GRS signifikant blev avstängda av knockdown av AMPKa. Sammantaget indikerar dessa data att farmakologisk aktivering av AMPK hämmar mitokondriell klyvning via defosforylering av Drpl vid Ser616 i kardiomyocyter, och GRS är en potent TCM-läkemedelskombination som reducerar MI / R-skada genom att undertrycka mitokondriell medierad apoptos och fission via uppreglerande AMPKa.

Ackumulering av bevis tyder på att bortfallet av kardiomyocyter till följd av apoptos är avgörande vid olika hjärtsjukdomar och oundvikligen leder till hjärtsvikt 27 . Myokardial apoptos är en viktig determinant för MI / R-inducerad hjärtsvikt. Det är allmänt erkänt att ingripandet av apoptosprocessen kan hämma förlusten av kardiomyocyter, minimera hjärtskador och så småningom bromsa eller till och med förhindra förekomst och utveckling av MI / R-skada 28 .

I överensstämmelse med vår tidigare studie 10 visade den aktuella studien den skyddande effekten av Shengmai-preparat YQFM på MI / R-skada. I likhet med YQFM utövade kombinationen av aktiva ingredienser GRS också hjärtskyddande effekt med samma styrka, vilket visas av förbättrad LV-funktion, minskad infarktstorlek, cellförlustförlust och LDH-aktiviteter. Dessutom validerades den anti-apoptotiska effekten av GRS genom resultaten av TUNEL-färgning, Hoechst 33342-färgning och Annexin-V / PI-färgning. Dessa resultat antydde starkt att GRS skulle kunna utöva en skyddande effekt mot MI / R-skada och hämma kardiomyocyter apoptos som svar på MI / R-skada, vilket lägger grunden för vidareutvecklingen av nytt läkemedel med oberoende intellektuell egendom.

I / R-skada genererade också framträdande variationer i cellsignalering, inklusive störning av mitokondriell membranpotential, caspase-3-aktivering och obalans av anti- och pro-apoptotiska proteiner i Bcl-2-familjeproteiner, vilket indikerar en aktivering av mitokondrial apoptosväg. Mitokondrier ger inte bara energi för kardiomyocyter utan spelar också en väsentlig roll i kardiomyocyter apoptotiska signalvägar. Mitokondriadysfunktion är en dominerande orsak till I / R-inducerad kardiomyocyter apoptos, vilket framgår av minskad mitokondriell membranpotential som en indikator på MPTP-öppning, som tidigare rapporterats 29, 30 . Denna störning kan bero på den förändrade mitokondria transporten av proton i elektrontransportkedjan och manifesteras som de- och hyperpolarisation 31 . Ändå återställde GRS-behandlingar mitokondriell membranpotential. Det är välkänt att mitokondriell permeabilitet och frisättning av apoptosomen kan kontrolleras av Bcl-2-familjen 32 . En ökning av pro-apoptotiska proteiner Bax och en minskning av anti-apoptotiska proteiner Bcl-2 kan leda till en minskning av mitokondriell membranpotential och en öppning av mitokondriell permeabilitetens övergångsporer, vilket kan leda till cytokrom c frisättning från mitokondrier till cytosol 33 . Därför är förhållandet mellan Bcl-2 och Bax en kritisk faktor i celltröskeln för apoptos. Den nuvarande forskningen visade att GRS markant hämmade Bax-uttryck men ökade Bcl-2-uttryck under H / R-tillståndet, vilket så småningom resulterade i ett ökat Bcl-2 / Bax-förhållande och cellöverlevnadshastighet. Dessutom spelar kaspaskaskaden också en viktig roll i apoptos 34 . Våra resultat indikerade att GRS resulterade i aktivt caspase-3-uttryck och aktivitet nedreglerades. Baserat på ovanstående resultat kan det rimligen spekuleras att GRS kan dämpa kardiomyocyter apoptos med samma effekt som Shengmai-beredningar av YQFM.

På grundval av de erhållna resultaten som GRS-skyddade kardiomyocyter apoptos inducerade av I / R genomfördes ytterligare undersökningar med fokus på de potentiella mekanismerna involverade i de anti-apoptotiska effekterna av GRS. Mitokondriella är dynamiska organ som kontinuerligt genomgår fission och fusion, som kontrolleras av kritiska reglerande proteiner. Drp1-aktivering är ansvarig för H / R-inducerad mitokondriell dysfunktion 35 . Den cytoplasmatiska Drp1 är ursprungligen lokaliserad i cytosolen, och när den aktiveras via fosforylering av Drp1 vid Ser616, translokerar den till fokuserna för framtida mitokondriella fissionsställen, vilket leder till klyvning och efterföljande mitokondriell dysfunktion 36 . Medan Drp1-fosforylering vid återstoden av Ser637 har visat sig inaktivera Drp1 37 . I den aktuella studien framkallade H / R-skador Drp1-aktivering, vilket ledde till mitokondriell klyvning. GRS inhiberade Drp1-aktivering genom modulering av fosforylering (Ser616) och skyddade därmed mitokondriell funktionell och strukturell integritet.

AMPK är ett serin / treoninkinas, därför bör dess direkta reglering vara fosforylering vid serin / treoninrest i målsubstratet. Nya studier visade att farmakologisk aktivering av AMPK förhindrar mitokondriell klyvning genom att förbättra Drp1-fosforylering (Ser 637) i kärlendotelceller 11 . Som en specifik hämmare för Drp1-medierad mitokondriell fission skyddade Mdivi-1 hjärtat mot ischemi / reperfusionsskada 35, vilket antydde den möjliga rollen av Drp1 som det mer möjliga direkta målet för AMPK. Som väntat illustrerade våra resultat att AMPK-aktivering hämmade Drp1-fosforylering vid Ser616 och mitokondriell klyvning i H / R-inducerad kardiomyocytskada. Samtidigt ökade knockdown av AMPKa signifikant fosforylering av Drp1 vid Ser616, vilket antyder den kritiska rollen av AMPKa i H / R-inducerad kardiomyocyter mitokondriell klyvning. GRS utövade förmågan att aktivera AMPKa och AMPKa siRNA-knockdown dämpade sin verkan i regleringen av Drp1-fosforylering, vilket indikerade att AMPKa-aktivering var avgörande för dess funktion i förebyggandet av mitokondriell klyvning. Dessutom kan AMPK aktiveras genom flera faktorer, såsom uppströms kinaser CaMKK, LKB1, PKA, eller förhållandet mellan (AMP + ADP) / ATP, och kan också aktiveras genom några andra proteiner som inte har rapporterats hittills. Vidare utredningar kommer att fokuseras på anledningen till hur GRS aktiverar AMPK.

Sammanfattningsvis har vi visat att GRS skyddade myokardium från MI / R-skada och inhiberade MI / R-inducerade kardiomyocyter apoptos med motsvarigheten som ShengMai-preparat. Ännu viktigare fann vi att aktivering av AMPK förbättrar mitokondriell morfologi och funktion genom reglering av Drp1-fosforylering (Ser616) och rekrytering under kardiomyocyter H / R-skada. Och dessa resultat indikerade att GRS utövade hjärtskyddande effekt, åtminstone delvis, genom att aktivera AMPK-fosforylering och förbättra mitokondriell funktion vid I / R-inducerad hjärtskada. Dessa resultat kan ge några farmakologiska bevis för vidareutveckling av nya moderna kinesiska läkemedel mot hjärt-kärlsjukdomar baserat på traditionell kinesisk formel med bekräftande terapeutisk effekt.

Material och metoder

Läkemedel och reagens

GRS var en blandning av ginsenosid Rb1, ruscogenin och schisandrin (6: 0, 75: 6). Ginsenoside Rb1 och schisandrin köptes från Nanjing Zelang Bio-Technology Co., Ltd (Nanjing, Kina). Ruskogenin isolerades i vårt laboratorium och renheten fastställdes vara högre än 99% med HPLC. 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC), Mdivi-1, DNas, Cytosin ß-D-arabinofuranosid (AraC), Poly-D-Lysin (PDL) och AICA-ribosid (AICAR) köptes från Sigma-Aldrich (St St) Louis, MO, USA). Satserna för bestämning av laktatdehydrogenas (LDH), kaspas-3-aktivitet och fluorescerande kit för Hoechst 33342, sond JC-1 erhölls från Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kina). FITC Annexin V apoptos detekteringssats var från Becton Dickinson Co. (San Diego, CA, USA). Mito-Tracker ® Deep Red FM köptes från livsteknologier (Kalifornien, USA). Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) erhölls från GIBCO / BRL (Life Technologies, Kalifornien, USA). Fetalt bovint serum (FBS) var från ScienCell (Carlsbad, CA, USA). RIPA-lysbuffert, proteashämmare och förstärkt kemiluminescen (ECL) -reagens var från Vazyme Biotech (Nanjing, Kina). AMPKa siRNA-kit var från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antikropp mot p-aktin var från Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA), antikropp mot caspase-3, Bcl-2, Bax, Drp1, fosfo-Drp1 (Ser616), AMPKa och fosfo-AMPKa (Thr-172 ) erhölls från Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA).

Djur- och MI / R-skademodell

Manliga ICR-möss (22–25 g) köptes från Model Animal Research Center vid Yangzhou University (Yangzhou, Jiangsu, Kina). The animals were housed in a standard vivarium with free access to food and water. Prior to experiments, animals were randomized into experimental groups. All procedures were approved by the Animal Ethics Committee of China Pharmaceutical University, and the Laboratory Animal Management Committee of Jiangsu Province (Approval No.: 2121961). All methods for in vivo study were carried out in accordance with the approved guidelines. The MI/R model was generated as previously described 38 . Briefly, mice were anesthetized intraperitoneally with chloral hydrate (400 mg/kg). For myocardial ischemia, a slipknot was tied around the left anterior descending coronary artery 3–4 mm from its origin utilizing a 6–0 silk suture. After 30 min of ischemia, the slipknot was released and followed by 24 h of reperfusion. ST-segment elevation on an electrocardiogram monitor represented a success in MI/R model performance. Sham-operated animals were subjected to the same surgical procedures without ligating left anterior descending coronary artery. All drugs were administered via intraperitoneally within 10 min at the beginning of reperfusion. The surgery was performed by a technician blinded to treatment assignment. No difference was observed in surgical mortality among groups investigated and the survival rate of animals was more than 85%.

Measurement of myocardial infarct size

Twenty-four hours after reperfusion, the heart (n = 6) was quickly excised, frozen at −70 °C, and the ventricular tissue was cut into five slices perpendicular to the long axis of the heart. The heart sections were then incubated individually using a 24-well culture plate with 1% TTC solution at 37 °C for 15 min, and photographed digitally. Red parts in the heart stained by TTC indicated ischemic but viable tissue. While staining negative areas represented infarcted myocardium. Areas of infarct size were measured by computerized planimetry. The size of infarction area was expressed as percentage of the total LV area.

Measurement of LDH in serum and histopathologic examination

Myocardial damage was evaluated by measuring plasma concentration of LDH. At the end of the experiment, blood was collected and serum was separated by centrifugation, the LDH was detected as previously described 10 . After collecting the blood samples, the hearts were removed. Heart tissues (n = 6) were fixed in 10% buffered paraformaldehyde solution, embedded in paraffin, sliced into pieces of 5 μm thick, and stained with hematoxylin and eosin (H&E). The histopathological changes were detected by optical microscope.

Echocardiographic measurement

Cardiac function was assessed noninvasively at 24 h after MI/R using an echocardiographic system consisting of a Vevo 2100 Imaging System (Visual Sonics, Toronto, Canada) equipped with a 30 MHz transducer. The mice (n = 6) were anesthetized using 2.5% isoflurane in O 2 gas. When fully anesthetized, each mouse was transferred to dorsal recumbency and placed on a heated imaging platform. The following parameters were measured as indicators of cardiac function: Left ventricular (LV) ejection fraction (EF), LV fractional shortening (FS), LV mass, LV volumes, LV internal dimensions at diastole (LVIDD), LV posterior wall dimensions at diastole (LVPWD) and interventricular septal dimensions at diastole (IVSDD).

TUNEL staining for apoptosis in vivo

At 24 h after MI/R, ischemic/reperfused myocardium (n = 3) was harvested and fixed in 4% paraformaldehyde solution. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling (TUNEL) staining was carried out to assess myocardial apoptosis using the Fluorescein In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) as previously described 28 . Cardiomyocytes, apoptotic nuclei and total cardiomyocyte nuclei were labeled with anti-F-actin antibody, green fluorescein staining and DAPI, respectively. For each slice, 5 fields were randomly obtained under a confocal scanning microscope (LSM700, Zeiss, USA). Extent of cell apoptosis was expressed as ratio of TUNEL positive nuclei over DAPI-stained nuclei.

Determination of caspase-3 activities in vivo

Caspase-3 activity was measured using a colorimetric activity assay kit as previously described 39 . Heart tissues (n = 6) were obtained from the margin of infarct areas, lysed in ice-cold lysis buffer for 30 min, then centrifuged at 4 °C for 10 min at 12, 000 rpm. The supernatant was incubated with the caspase-3 substrate (Ac-DEVD- p NA) after quantification of protein concentration. The caspase-3 activity was determined using a Microplate Reader at 405 nm.

Cellberedning och kultur

Neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) were prepared as previously described 40 . Briefly, ventricular myocytes were enzymatically dissociated and enriched for cardiomyocytes. Using this method, we routinely obtained contractile myocardial cell cultures with 98–99% myocytes, as evidences by microscopic observation of cell beating, and by immunofluorescence with cardiac troponin T. Cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO 2 .

Rat H9c2 cardiomyocyte cell line was obtained from Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). The H9c2 cells were maintained in DMEM supplemented with 10% FBS, 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . The culture medium was replaced every 2 days, and cells were subcultured or subjected to experimental procedures at 80–90% confluence.

H/R injury model in vitro

To mimic the ischemic injury in vitro , the oxygen and glucose deprived (OGD) technique was established based on a previously described protocol 41 . The OGD injury was produced by incubating with none glucose DMEM and exposed to a hypoxic environment of 94% N 2, 5% CO 2 and 1% O 2 at 37 °C in a humidified N 2 /CO 2 incubator and then in a standard incubator with 5% CO 2 in normal atmosphere at 37 °C. All drugs were given at the beginning of hypoxia and retained in the culture medium over the period of H/R.

Cell viability and LDH assays

Cell viability was determined using MTT assay. After different treatments, cells were incubated with MTT at a final concentration of 0.5 mg/mL for 3 h at 37 °C. Then, the medium was discarded and 150 μL DMSO was added to dissolve the formazan crystals. The absorbance was read at 570 nm with a reference wavelength of 650 nm using a microplate reader and cell viability was expressed as percentage of absorbance to control values. To further measure the extent of cell injury, release of LDH was also detected. At the end of the incubation period, the culture supernatants were collected and the activity of LDH was tested at 490 nm as previously described 42 .

Hoechst 33342 staining assay

Briefly, H9c2 cardiomyocytes were washed with ice-cold PBS and exposed to Hoechst 33342 (5 μg/mL) and incubated for 30 min at 37 °C. Then the H9c2 cardiomyocytes were washed three times with PBS and observed under a fluorescence microscope (Zeiss Germany). The nuclei of apoptotic cells exhibited irregularly shaped and hyper-condensed (brightly stained).

Flow-cytometric analysis for apoptosis

Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated Annexin V and propidium iodide (PI) were utilized to detect apoptotic cells. Double staining with FITC-Annexin V and PI was carried out as previously described 43 . In brief, H9c2 cardiomyocytes were harvested, washed with PBS, resuspended with binding buffer, then FITC-Annexin-V and PI were added in a final concentration of 100 ng/mL. The mixture was incubated for 15 min in the dark at room temperature. Cellular fluorescence was analyzed with a flow cytometer (Becton Dickinson, USA). Data were analyzed using FlowJo software.

Determination of caspase-3 activities in vitro

Caspase-3 activity was determined using a colorimetric activity assay kit as previously described 39 . Briefly, cells were lysed in ice-cold lysis buffer, placed on ice for 30 min, then centrifuged at 4 °C for 15 min at 12, 000 rpm. After determining the protein concentration, the supernatant was incubated with the caspase-3 substrate (Ac-DEVD- p NA). The caspase-3 activity was determined using a Microplate Reader at 405 nm.

Mätning av mitokondriell membranpotential

Mitochondrial membrane potential was detected using fluorescent dye JC-1 as previously described 44 . In brief, the cells were incubated with JC-1 staining solution (10 μg/mL) for 20 min at 37 °C after each treatment. The cells were then washed twice with PBS and immediately analyzed using a fluorescence microscope. Data were given as the relative ratio of red to green fluorescence intensity, indicating the level of depolarization of the mitochondrial membrane potential.

Mitochondrial fission analysis

For mitochondrial fission assay, H9c2 cardiomyocytes and primary cultured cardiomyocytes were treated with GRS, YQFM and Mdivi-1 at given concentrations with or without the H/R injury. After incubation, the cells were washed with PBS, and then incubated with 400 nmol/L Mito Tracker® Deep Red FM (Molecular Probes) for 30 min at 37 °C. The cells were then fixed, permeabilised and incubated with anti-Drp1 primary antibody, followed by incubation with an Alexa Fluor 488 conjugated Donkey Anti-Goat IgG (H+L) antibody and DAPI. The structures of mitochondria were viewed by confocal microscopy.

siRNA-transfektion

H9c2 cardiomyocytes were transfected with siRNA directed against AMPK subunits or scrambled siRNA as a control. In brief, the cells were transfected with 80 nmol/L of total siRNA by using Transfection Reagent as previously described 10 . To evaluated the efficiency of the AMPK siRNA, total cell lysates were subjected to SDS-PAGE for immunoblotting analysis with β-actin as a reference.

Western blot-analys

As reported 45, cells were lysed in ice-cold RIPA buffer, supplemented with 1 mM PMSF. For assay in heart tissues obtained from the margin of infarct areas, the tissues were homogenized in RIPA buffer. Proteins were obtained by centrifugation at 12, 000 rpm for 10 min at 4 °C and the concentrations were analyzed by the BCA method. Equal amount of proteins (35 μg) were loaded onto a 12.5% SDS-PAGE and transferred to PVDF membranes (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) by electroblotting. The membranes were blocked with 3% BSA in TBS/T and stained with primary antibodies against caspase-3, Bax, Bcl-2, Drp1, p-Drp1 (Ser 616), AMPK, p-AMPK (Thr 172), β-actin (dilution 1:1000, 1:1000, 1:1000, 1:1000, 1:600, 1:1000, 1:1000, 1:2000, respectively; Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) overnight at 4 °C. Membranes were then probed with peroxidase conjugated secondary antibody at a 1: 8000 dilution (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). The antigen-antibody complexes were then detected with ECL reagent (Vazyme Biotech, Nanjing, China) and visualized by ChemiDoc™ MP System (Bio-Rad) and analyzed using Image Lab™ Software (version 4.1, Bio-Rad).

Statistisk analys

All experiments were performed in triplicate and data were expressed as the mean ± SEM. Statistical analysis was carried out using Student's two-tailed t-test for comparison between two groups and one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Dunnett's test when the data involved three or more groups. P < 0.05 was defined as significant.

ytterligare information

How to cite this article : Li, F. et al . Cardioprotection by combination of three compounds from ShengMai preparations in mice with myocardial ischemia/reperfusion injury through AMPK activation-mediated mitochondrial fission. Sci. Rep. 6, 37114; doi: 10.1038/srep37114 (2016).

Förlagets anmärkning : Springer Nature förblir neutral när det gäller jurisdiktionskrav i publicerade kartor och institutionella anslutningar.

Kompletterande information

PDF-filer

  1. 1.

    Kompletterande figurer

kommentarer

Genom att skicka en kommentar samtycker du till att följa våra villkor och gemenskapsriktlinjer. Om du finner något missbruk eller som inte överensstämmer med våra villkor eller riktlinjer ska du markera det som olämpligt.