Karboxypeptidas e: en negativ regulator för den kanoniska wnt-signalvägen | onkogen

Karboxypeptidas e: en negativ regulator för den kanoniska wnt-signalvägen | onkogen

Anonim

ämnen

  • cancer
  • Cell signalering
  • onkogenes

Abstrakt

Avvikande aktivering av den kanoniska Wnt-signaltransduktionsvägen är involverad i många sjukdomar inklusive cancer och är särskilt involverad i utvecklingen och utvecklingen av kolorektal cancer. Det viktiga effektorproteinet i den kanoniska Wnt-vägen är P-catenin, som fungerar med T-cellfaktor / lymfoidförstärkande faktor för att aktivera uttryck av Wnt-målgener. I denna studie använde vi en ny funktionell skärm baserad på cellöverlevnad i närvaro av cDNA: er som kodar proteiner som aktiverar Wnt-vägen och därmed identifierar nya Wnt-signalkomponenter. Här identifierar vi karboxypeptidas E (| CPE) och dess splitsvariant, ΔN-CPE, som nya regulatorer för Wnt-vägen. Vi visar att medan ΔN-CPE aktiverar Wnt-signalen, är CPE-proteinet i full längd en hämmare av Wnt / ß-catenin-signalering. F-CPE bildar ett komplex med Wnt3a-liganden och Frizzled-receptorn. Dessutom stör F-CPE störande inducerade signalosomer som är viktiga för transduktion av Wnt-signalen och minskar ß-catenin-proteinnivåer och -aktivitet. Sammantaget indikerar våra data att F-CPE och ΔN-CPE reglerar den kanoniska Wnt-signalvägen negativt och positivt respektive och visar att denna screeningsmetod kan vara ett snabbt medel för isolering av nya Wnt-signalkomponenter.

Introduktion

Wnt / ß-catenin-vägen är en viktig utvecklingsväg som styr både embryonal utveckling och vävnadsunderhåll hos vuxna. Avvikande konstitutiv aktivering av Wnt-vägen leder emellertid till okontrollerad cellproliferation, tillväxt och överlevnad, vilket främjar utvecklingen av olika typer av humana cancer, särskilt de humana kolorektala cancer (CRC). 1, 2, 3 I frånvaro av en Wnt-signal hålls nivåerna av ß-catenin, nyckeleffektorn för Wnt-signalvägen, låga av "ß-catenin-förstöringskomplexet" som innehåller bland annat tumörsuppressorn proteinadenomatös polypos coli och Axin. Detta komplex främjar fosforylering av p-katenin med kaseinkinas la och glykogensyntas-kinas 3p, vilket markerar det lämpligt för ubikvitet och efterföljande proteasomal nedbrytning. I många cancerformer stör mutationer i adenomatous polyposis coli, Axin eller ß-catenin nedbrytningen av det senare, vilket leder till okontrollerad aktivering av Wnt-målgener. När Wnt-vägen aktiveras binder Wnt-liganden till Frizzled (Fz) transmembranreceptorn och den koreceptor lågdensitetslipoproteinreceptorrelaterade 5 eller LRP6 4 leder LRP6 till caveolininnehållande vesiklar för endocytos. 5 Den cytoplasmatiska svansen hos LRP6 fosforyleras sedan av kaseinkinas la och GSK-3p, som rekryteras tillsammans med Axin från "ß-catenin-förstörelsekomplexet". 6 Dessa händelser utlöser polymerisationen av Disheveled (Dvl), vilket främjar bildningen av punktatproteinkluster som är membranassocierade signalosomer och demonteringen av 'ß-catenin-förstörelsekomplexet. 7, 8, 9, 10, 11 Som ett resultat ackumuleras icke-fosforylerat ß-katenin i cytoplasma och translocates till kärnan där det associeras med TCF-transkriptionsfaktorer och uppreglerar transkriptionen av Wnt-målgener. Onormalt uttryck av Wnt-signalgenen är en av många avvikelser som sannolikt bidrar till neoplastisk transformation. Wnt-kaskaden är extremt komplex, reglerad av olika andra signalvägar och återkopplingsslingor och består av många komponenter, av vilka några ännu inte är okända.

I ett försök att identifiera nya Wnt-signalkomponenter har vi använt en ny screeningteknik. Skärmen är baserad på cellöverlevnad endast i närvaro av cDNA som aktiverar Wnt-vägen. Här identifierade vi karboxypeptidas E (CPE) och dess skarvvariant, ΔN-CPE, som nya Wnt-signalregulatorer. CPE är ett multifunktionellt protein som innehåller både enzymatiska och icke-enzymatiska funktioner (granskas i Cawley et al. 12 ) till stor del uttryckt i endokrina celler och peptidergiska nervceller i nervsystemet. CPE är främst känt som ett prohormonbehandlingsenzym som också fungerar vid prohormonsortering, vesikeltransport och utsöndring. 12, 13, 14 Olika former av CPE uttrycks i olika subcellulära lokaliseringar som uppvisar distinkta funktioner: till exempel, löslig CPE som finns i sekretoriska granuler fungerar som ett exopeptidas som klyver C-terminala basiska aminosyrarester för att producera mogna neuropeptider och hormoner, 14 medan membranbunden CPE i trans- Golgi-nätverket fungerar som en sorteringsreceptor. 13 Nya studier som analyserade CPE-mRNA i mikroarrayer tyder på att det kan vara involverat i utvecklingen eller utvecklingen av cancer. Minskad CPE-aktivitet sågs vid neuroblastom, 15 medan förhöjda nivåer av CPE i neuroendokrina tumörer är en prediktor för god prognos. 16 I gliomcellinjer förknippades höga CPE-nivåer med ökad spridningsgrad, medan CPE-knockdown förbättrade migrationen och invasionen. 17 CPE var också närvarande i icke-endokrina härledda cancerceller där dess uttryck normalt är frånvarande, inklusive epitelia-härledda cancerceller såsom bröstcancer, 18 livmoderhalscancer och njurcancer. 19 Dessa studier tyder på att förhöjda nivåer av CPE-mRNA korrelerar med metastatiska tumörer jämfört med normal vävnad eller godartade tumörer. 19 De uppenbara motstridiga fynden för huruvida CPE främjar eller hämmar metastaser klargjordes av den senaste upptäckten av skarvvarianten, CPE-ΔN (även kallad ΔN-CPE). Undersökning av uttrycket av CPE i epitel-härledda tumörer, såsom hepatocellulärt karcinom och kolorektalt karcinom, avslöjar att endast skarvvarianten och inte full längd CPE (F-CPE) uttrycks. 20 Denna alternativa skarvade variant, ΔN-CPE, saknar signalpeptiden som normalt leder den in i den sekretoriska vägen och uttrycks i mycket metastatiska tumörer. 20 Cytoplasmatisk ΔN-CPE translokerar till kärnan och ökar uttrycket av den metastatiska genen, 'neural prekursor uttryckt utvecklingsmässigt nedreglerad' (NEDD 9), på ett histon deacetylas 1 och 2 aktivitetsberoende sätt. Andra metastatiska och anti-apoptotiska gener uppregleras också vilket leder till ΔN-CPE-inducerad främjande av tumörmetastas. 21

I den aktuella studien visar vi att medan -N-CPE-protein aktiverar den onkogena Wnt-vägen, minskar F-CPE-proteinet både Wnt-signalering och ß-cateninnivåer. Dessutom kolokalerar F-CPE med Wnt3a medan N-CPE kolokaliserar sig i kärnan med ß-catenin. Slutligen interagerar F-CPE med både Wnt3a-liganden och dess receptor Fz, vilket resulterar i störning av de Dvl-inducerade signalosomerna. Dessa fynd indikerar att CPE och ΔN-CPE fungerar som nya regulatorer för den kanoniska Wnt-signalvägen.

Resultat

CPE - en ny Wnt-regulator

En skärm avsedd att identifiera nya Wnt-signalaktivatorer ledde till isolering av 104 gener. En sekundär skärm minskade dessa kandidater till 32 förmodade nya Wnt-signalaktivatorer (kompletterande figur 1 och 2; kompletterande tabell 1). En av de gener som identifierades på vår skärm var CPE. CPE isolerades i tre oberoende screeningsrundor, uppvisande en relativt stark aktivering av p-katenin / TCF-beroende gentranskription (kompletterande figur 2). CPE-cDNA isolerat i vår skärm innehöll endast de C-terminala 140 aminosyrorna (eftersom cDNA-biblioteket är ett oligo dT-bibliotek). För att undersöka effekten av CPE på Wnt-vägen användes F-CPE-cDNA och 365 C-terminus-CPE-rester (ΔN-CPE) till antingen grönt fluorescerande protein (GFP) eller FLAG-tagg. De CPE-kodande plasmiderna testades först med avseende på deras förmåga att specifikt påverka Wnt-vägen genom att mäta den p-catenin / TCF-medierade transkriptionen (med användning av pTOPFLASH / pFOPFLASH-rapportanalysen). Effekten på ß-catenin-proteinnivåer undersöktes också genom SDS – polyakrylamidgelelektrofores och western blotting. HEK293T-celler samtransfekterades med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reporterplasmiderna, GFP-p-catenin och de två CPE-konstruktionerna. I överensstämmelse med våra screenresultat ledde ΔN-CPE-proteinet till ökad ß-catenin / TCF-medierad transkription och β-catenin-proteinnivåer (figur 1a). Överraskande resulterade uttryck av F-CPE i minskad ß-catenin / TCF-medierad transkription och minskade ß-catenin-proteinnivåer (figur la). F-CPE: s förmåga att reducera p-catenin / TCF-medierad transkription och p-catenin-proteinnivåer förstärktes med användning av en dosberoende analys (figur Ib). Liknande resultat erhölls när myc eller FLAG-p-catenin användes (ej visat). Därefter uppreglerade vi Wnt-vägen med användning av ektopiskt uttryck av andra kända Wnt-aktivatorer: Dvl eller liganden Wnt3a och dess receptor Fz1. Återigen reducerade F-CPE-protein halterna av p-catenin / TCF-medierad transkription såväl som endogena p-catenin-proteinnivåer (med användning av en antikropp som detekterar den aktiva formen av p-catenin) 22 (figur 1c). Effektivitetens specificitet bekräftades med användning av RNA-interferens för att reducera CPE-uttryck i PC-12-celler som uttrycker endogen F-CPE (figur 7d), men ingen detekterbar ΔN-CPE. Såsom visas i figur 1d ledde utarmning av CPE till ökade Wnt-signalnivåer och uppreglering av den aktiva formen av p-catenin och Wnt-målgenerna c-myc och SOX-9.

Image

CPE påverkar Wnt-signalvägen. ( a ) HEK293T-celler samtransfekterades med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reportrarna och p-gal-plasmiden, tillsammans med GFP-p-catenin och F-CPE-GFP eller ΔN-CPE-GFP, såsom indikerats (0, 5 μg / ml). Fyrtioåtta timmar senare skördades cellerna och luciferasnivåerna bestämdes (övre paneler). Samma prover underkastades Western blot-analys med användning av en anti-GFP-antikropp. P-galaktosidasaktivitet användes för att normalisera transfektionseffektivitet. Tubulin fungerade som en lastkontroll. ( b ) Som i en, visar dosberoende aktivitet av F-CPE-GFP-konstruktionen på p-katenin och Wnt-signalering. ( c ) HEK293T-celler samtransfekterades med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reportrarna, P-gal-plasmiden och F-CPE-GFP, Fz1 + Wnt3a eller Dvl såsom anges. Fyrtioåtta timmar senare skördades cellerna och luciferasnivåerna bestämdes (övre panelen). Samma prover underkastades Western blot-analys. F-CPE-GFP-protein detekterades med användning av en anti-GFP-antikropp, och endogent aktivt p-catenin detekterades med användning av en anti-aktiv p-catenin-antikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll. ( d ) Med användning av transient transfektion av specifika CPE siRNA-kodande oligos minskades uttrycket av det endogena F-CPE-proteinet i PC-12-celler. 24 timmar efter siRNA-transfektion transfekterades cellerna med pTOPFLASH / pFOPFLASH och P-gal-plasmider för luciferasdetektering. 48 timmar efter transfektion skördades cellerna och underkastades luciferasanalys enligt tillverkarens instruktioner följt av Western blot-analys såsom beskrivits ovan. Den endogena CPE, c-myc och SOX-9 detekterades med användning av specifika antikroppar. Endogent aktivt p-katenin detekterades med användning av en anti-aktiv p-kateninantikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll.

Bild i full storlek

Ett funktionellt p-catenin-förstörelsekomplex krävs för aktiviteten av CPE

För att bättre förstå mekanismen genom vilken CPE reglerar Wnt-vägen testade vi effekten av F-CPE på ett konstitutivt aktivt p-catenin-mutant S33A-p-catenin som inte kan fosforyleras med GSK-3β 23 (figur 2a). Alternativt använde vi LiCl som hämmar funktionen av GSK-3p och aktiverar Wnt-vägen (figur 2b). Resultaten visar att under båda dessa förhållanden hade F-CPE liten effekt på varken ß-catenin / TCF-medierad transkription eller ß-catenin-proteinnivåer. Nästa testade vi CPE: s förmåga att modulera Wnt-signalering oberoende av "ß-catenin-förstöringskomplexet". För detta ändamål använde vi CRC-cellinjen SW480 som innehåller ett icke-funktionellt ß-katenin-nedbrytningskomplex. 24 F-CPE hade ingen effekt på p-catenin / TCF-medierad transkription, på de endogena p-cateninnivåerna eller Wnt-målgenen SOX-9 . Emellertid ökade ΔN-CPE-konstruktionen ß-catenin / TCF-medierad transkription på ett dosberoende sätt och förbättrade nivåerna av ß-catenin och i mindre utsträckning Wnt-signalmålgenen SOX-9 (figur 2c). Sammantaget antyder dessa resultat att ett funktionellt P-catenin-nedbrytningskomplex behövs för att CPE kan påverka Wnt-signalen.

Image

Ett funktionellt p-catenin-nedbrytningskomplex krävs för aktiviteten av CPE. ( a ) HEK293T-celler samtransfekterades med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reportrar, p-gal-plasmiden, en konstitutivt aktiv form av GFP-p-katenin (S33A-p-catenin) och olika mängder F-CPE-GFP. Fyrtioåtta timmar senare skördades cellerna och luciferasnivåerna bestämdes. Proven underkastades Western blot-analys med användning av en anti-GFP-antikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll. ( b ) HEK293T-celler transekterades med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reportrar, p-gal-plasmiden, GFP-p-catenin (0, 3 pg / ml) och olika mängder av F-CPE-GFP såsom indikerats. 24 timmar senare behandlades cellerna med 30 m M LiCl under 24 timmar. Proverna skördades och underkastades luciferasanalys och Western blot-analys med användning av en anti-GFP-antikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll. ( c ) SW480-celler transfekterades med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reportrar, renilla luciferas och F-CPE-GFP (vänster) eller -N-CPE-GFP (höger). Fyrtioåtta timmar senare skördades cellerna och luciferasnivåerna bestämdes. Renilla luciferasnivåer användes för att normalisera transfektionseffektivitet. Proven underkastades Western blot-analys med användning av en anti-GFP-antikropp. Nivåer av endogent P-katenin och SOX-9 bestämdes med användning av specifika antikroppar. Tubulin fungerade som en lastkontroll.

Bild i full storlek

CPE hämmar Wnt-vägen på ett proteasomberoende sätt

Våra resultat indikerar att uttryck av CPE leder till minskade nivåer av ß-cateninproteinet. För att testa om effekten av CPE på p-katenin var proteasomberoende, använde vi proteasominhibitorn MG132. Western blot-analys visar tydligt att effekten av F-CPE på p-catenin-proteinnivåerna vändes när cellerna behandlades med MG132 (figur 3a). Eftersom CPE inte påverkade Wnt3a-nivåerna (figur 3b) tillskrivs inte minskningen i Wnt-signalering till minskade nivåer av Wnt3a-proteinet. Därefter samuttrycktes myc-p-catenin i HEK293T-celler tillsammans med -N-CPE- eller F-CPE-konstruktionerna, och immunofluorescensanalyser (IF) utfördes. Som förväntat avskaffades färgning av myc-p-catenin när den samtransfekterades med F-CPE. Behandlingen av cellerna med proteasominhibitorn MG132 reverserade emellertid denna effekt (figur 3c). Spännande, resulterade överuttryck av F-CPE-GFP i utarmning av myc-p-catenin i både transfekterade och otransfekterade celler, vilket antydde att utsöndrad CPE påverkade p-cateninnivåerna i trasorna (figur 3c). I frånvaro av CPE (GFP-kontroll) detekterades p-catenin i transfekterade celler och stabiliserades något av MG132 som förväntat (figur 3d). Samuttryckning av ΔN-CPE-konstruktionen med myc-p-catenin minskade inte ß-cateninnivåerna oberoende av MG132-behandling (figur 3e). I de samtransfekterade cellerna kolokaliserades de två proteinerna delvis i både cytoplasma och kärnan (figur 3e-utvidgningen). Dessa resultat indikerar att F-CPE inducerar proteasom-medierad nedbrytning av p-katenin.

Image

Effekten av CPE på Wnt-signalen beror på proteasomaktiviteten. ( a ) HEK293T-celler samtransfekterades med GFP-p-katenin och F-CPE-GFP såsom anges. 24 timmar senare tillsattes 25 mikrometer MG132 till cellerna under ytterligare 24 timmar. Celler skördades och utsattes för Western blot-analys med användning av en anti-GFP-antikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll. ( b ) HEK293T-celler samtransfekterades med Wnt3a-HA och ökande mängder F-CPE-GFP såsom indikerats. Western blot-analys utfördes med användning av anti-HA respektive anti-GFP-antikroppar. ( c, d och e ) HEK293T-celler samtransfekterades med F-CPE-GFP, GFP eller ΔN-CPE-GFP-konstruktionerna tillsammans med myc-p-catenin (såsom indikerats). 24 timmar efter transfektion behandlades cellerna över natten med 25 mikrometer MG132. Cellerna fixerades och reagerade med en anti-myc-antikropp och rododkonjugerad antikropp. Bilder togs med hjälp av ett konfokalt mikroskop. Observera ΔN-CPE-immunfärgning i cytoplasma och kärnan i vissa celler. Bar = 10 um.

Bild i full storlek

Sekreterad F-CPE påverkar Wnt-signalering

Eftersom CPE är ett utsöndrat protein, 25 undersökte vi om de olika CPE-konstruktionerna som används i denna studie utsöndras från transfekterade celler. Våra resultat visar att F-CPE, antingen otaggad eller taggad med en GFP- eller FLAG-epitop, effektivt utsöndras i mediet (figur 4a, topppanelen). ΔN-CPE som visade relativt lägre expressionsnivåer utsöndrades inte (figur 4a, bottenpanel) även när större mängder plasmider användes. Detta är inte förvånande eftersom asN-CPE-proteinet saknar en signalpeptid. 20 Figur 4b visar en tydlig korrelation mellan de transfekterade och utsöndrade mängderna F-CPE-protein. För att undersöka om utsöndrad CPE påverkar Wnt-signalbetingade medier (CM) från celler transfekterade med F-CPE-GFP eller från Wnt-utsöndrande celler (L-Wnt3a) 26 användes. HEK293T-celler transfekterade med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reportrar odlades i olika CM under 18 timmar. Som förväntat ökade Wnt CM TCF / ß-kateninberoende transkription och ledde till amplifierade ß-cateninproteinnivåer (figur 4c, spår 4). Att komplettera cellerna med CPE CM resulterade i en minskad TCF / p-catenin-medierad transkription och ß-catenin-proteinnivåer (figur 4c, spår 3). Minskade nivåer av TCF / p-catenin-medierad transkription erhölls också när CPE CM tillsattes till celler transfekterade med olika aktivatorer av Wnt-kaskaden (figur 4d). För att fastställa specificiteten för våra resultat användes renat CPE-rekombinant protein. Wnt-signalering aktiverad genom överuttryck av Wnt3a + Fz1 reducerades i närvaro av renat CPE-protein (figur 4e). Vi visar också att behandling av L-Wnt3a-celler med det renade CPE-proteinet ledde till en minskning av endogena aktiva p-cateninnivåer (figur 4f).

Image

Sekreterad CPE påverkar Wnt-signalering. ( en ; övre panel) HEK293T-celler transfekterades med F-CPE-GFP, F-CPE-FLAG och otaggad-F-CPE. Fyrtioåtta timmar efter transfektion uppsamlades cellmediet och de transfekterade cellerna skördades. Media och lysat underkastades Western blot-analys med användning av en anti-CPE-antikropp. HEK293T-celler transfekterades med FLAG-märkt F-CPE och ΔN-CPE (nedre panel). Fyrtioåtta timmar efter transfektion uppsamlades cellmediet och de transfekterade cellerna skördades. Media och lysat underkastades Western blot-analys med användning av en anti-FALG-antikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll. ( b ) HEK293T-celler transfekterades med olika mängder F-CPE-GFP. Media och lysat underkastades Western blot-analys med användning av en anti-CPE-antikropp. ( c ) HEK293T-celler transfekterades med F-CPE-GFP. 24 timmar senare uppsamlades CM från transfekterade celler. Wnt CM uppsamlades från L-Wnt3a-celler. De olika medierna sattes till HEK293T-celler transfekterade med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reporterplasmiderna. Luciferasnivåer detekterades 24 timmar senare. Den övre panelen visar nivåerna av endogent, aktivt p-katenin som detekteras med användning av en specifik antikropp. ( d ) HEK293T-celler samtransfekterades med p-katenin-GFP, HA-Wnt3a, HA-Dvl och Fzl tillsammans med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reporterplasmiderna. CPE CM (som i c ) tillsattes till transfekterade celler under 24 timmar och luciferasnivåer detekterades sedan. ( e ) HEK293T-celler samtransfekterades med Wnt3a och Fzl tillsammans med pTOPFLASH / pFOPFLASH-reporterplasmiderna. Tolv timmar senare kompletterades cellerna med media innehållande renad CPE såsom indikerats. Tolv timmar senare bestämdes luciferasnivåer. ( f ) L- och L-Wnt3a-celler kompletterades med media innehållande renad CPE såsom anges. Cellerna skördades 12 timmar senare och aktiva p-kateninnivåer detekterades med användning av en specifik antikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll (vänster). Densitometrisk analys av aktivt p-katenin utfördes med användning av TINA-programvara (höger).

Bild i full storlek

CPE interagerar med både Wnt3a och Fz1 men stör inte Wnt – Fz-komplexet

De nästa experimenten syftade till att bestämma om det finns en cellulär interaktion mellan F-CPE och medlemmar av Wnt-vägen. HEK293T-celler samtransfekterades med konstruktioner som kodade för HA-GSK-3p, Dvl eller Wnt3a och F-CPE-GFP. Såsom framgår av figur 5a coimmunoprecipiterades F-CPE specifikt med Wnt3a men inte med GSK-3p eller Dvl. För att kartlägga de interagerande domänerna testade vi en konstruktion som uttrycker de första 113 aminosyraresterna av CPE (N-CPE) utöver ΔN-CPE och F-CPE-konstruktioner. Endast F-CPE och den N-terminala domänen interagerade med Wnt3a (figur 5b). Vi visar också att båda konstruktionerna interagerar med den cysteinrika domänen (CRD), som är den Wnt-bindande domänen för Fz1 (figur 5c). Eftersom aktivering av Wnt-vägen är beroende av bindning av Wnt-liganden till dess receptor Fz, undersökte vi om CPE stör störande förmåga hos Wnt3a att binda Fz1. HEK293T-celler samtransfekterades med HA-Wnt3a, FLAG-HFz1-CRD och antingen F-CPE-GFP eller tom vektor. Data visar att samma mängder Wnt3a coimmunopipititerades med HFz1-CRD i närvaro och frånvaro av F-CPE, vilket indikerar att F-CPE inte stör Wnt – Fz-komplexet (figur 5d).

Image

CPE bildar ett komplex med Wnt3a och Fz1 men avbryter inte Wnt – FZ-komplexet. ( a ) HEK293T-celler samtransfekterades med F-CPE-GFP, HA-Wnt3a, HA-GSK-3p eller HA-Dvl såsom anges. Totalt cellulärt lysat immunutfälldes med användning av en anti-HA-antikropp och analyserades genom western blotting med användning av en anti-HA och en anti-GFP-antikropp. ( b ) HEK293T-celler samtransfekterades med Wnt3a och de olika CPE-konstruktionerna som angivits. IP utfördes enligt beskrivningen i a . ( c ) HEK293T-celler samtransfekterades med FLAG-Hfzl-CRD och CPE-konstruktionerna såsom anges. IP utfördes med användning av en anti-FLAG-antikropp. ( d ) HEK293T-celler samtransfekterades med Wnt3a, FLAG-Hfzl-CRD och F-CPE-GFP såsom anges. IP utfördes såsom beskrivits i c .

Bild i full storlek

Sekreterad CPE bildar ett komplex med utsöndrad Wnt3a och Fz1-CRD

När vi antog att extracellulär F-CPE påverkar Wnt-kaskaden testade vi om F-CPE och Wnt3a kan interagera utanför cellerna. För detta ändamål uttryckte vi ektopiskt CPE och Wnt3a och samlade både CM- och cellextrakt för immunutfällningsanalyser (IP) -analyser. Faktiskt interagerar CPE och Wnt3a i både celllysat och media i de transfekterade cellerna (figur 6a). Celler transfekterades sedan med FLAG-HFz1-CRD och kompletterades med CPE CM för att testa för komplexbildning. Som visas i figur 6b kan utsöndrad CPE interagera med den extracellulära domänen i Fz1-receptorn - CRD. För att studera de endogena interaktionerna använde vi L-Wnt3a-celler, eftersom de är de enda cellerna som uttrycker och utsöndrar både CPE och Wnt3a i ett antal testade cellinjer (figur 6c). Såsom ses i figur 6d fälldes ett proteinkomplex innehållande CPE och Wnt3a från både lysat och media av L-Wnt3a-celler med antingen anti-Wnt3a eller anti-CPE-antikroppar.

Image

CPE och Wnt3a bildar ett extracellulärt komplex. ( a ) HEK293T-celler samtransfekterades med F-CPE-FLAG och HA-Wnt3a såsom anges. 24 timmar senare utsattes media och celllysat för IP-analys med användning av FLAG-konjugerade agarospärlor. Western blot-analys utfördes sedan med användning av anti-FLAG- och anti-HA-antikroppar. ( b ) HEK293T-celler transfekterades med FLAG-Hfzl-CRD. Tolv timmar efter transfektion kompletterades cellerna med CPE CM under ytterligare 12 timmar. Cellerna skördades sedan och utsattes för en IP-analys med användning av FLAG-konjugerade agarospärlor. Western blot-analys utfördes sedan med användning av anti-FLAG- och anti-CPE-antikroppar. ( c ) Uttrycksmönstret för olika Wnt-signalkomponenter i media och lysat bestämdes i olika cellinjer genom Western blot-analys med användning av specifika antikroppar. ( d ) L- och L-Wnt3a-celler användes för att bestämma komplexbildning mellan CPE och Wnt3a genom IP-analyser. Både media och lysater samlades upp och specifika antikroppar användes för IP- och western blot-analys.

Bild i full storlek

CPE kolokaliserar delvis med Wnt3a och stör störningarna i Dvl-proteinerna

För att försöka identifiera den mekanism som F-CPE påverkar Wnt-kaskaden, undersökte vi dess subcellulära lokalisering tillsammans med flera andra Wnt-signalmedlemmar. Enligt våra resultat kolokaliserades transfekterad CPE inte med Axin och GSK-3p, och det förändrade inte heller deras subcellulära lokalisering (data visas inte). I både COS-7 och HEK293T-celler visade F-CPE emellertid viss kolokalisering med Wnt3a (figur 7a). Det är viktigt att ektopiskt uttryckt CPE kolokaliserades med endogent Wnt3A (figur 7b). När CPE- och Wnt-trafik tillsammans till Golgi-komplexet 27, 28 förpackas de troligen i samma vesiklar för utsöndring. 29 Mer intressant, när F-CPE samuttrycks med Dvl, verkar det störa Dvl-proteinaggregaten (figur 7c). Dessa proteinpunkter, benämnda signalosomer, rapporterades vara väsentliga för Dvls aktivitet som en positiv regulator för Wnt-vägen. 7, 8, 30 Effekten av CPE på Dvl sågs endast i celler som överuttrycker båda proteinerna. Kanske var den lokala koncentrationen av CPE runt de transfekterade cellerna högre än angränsande otransfekterade celler, varför inte tillräckligt för att påverka dem. Det har visats att överuttryckt Dvl bildar stora cytoplasmiska punkter medan den endogena Dvl bildar oligomerer med låg molekylvikt. 31 Dessa stora punkter visades också för att aktivera Wnt-vägen (granskad i Reznik och Fricker 32. Det är möjligt att överuttryckt CPE kan starkt påverka överuttryckt Dvl (som bildar stora signalosomer) i celler som ektopiskt uttrycker båda proteinerna. Vi jämförde det ektopiska uttrycksmönstret) av Dvl i två neurala cellinjer. I PC-12-celler som uttrycker och utsöndrar F-CPE är färgningsmönstret för ektopiskt uttryckta Dvl faktiskt i stor utsträckning cytoplasmiskt och diffuserat. Däremot är Dvl-färgning i U-87-celler som inte har detekterbar CPE visar typiska punktata-kluster (figur 7d). Vi testade sedan om utsöndrad F-CPE kan framkalla samma effekt. COS-7-celler transfekterades med HA-Dvl och kompletterades med CPE och Wnt3a CM före IF-analyser (figur 7e). Uttrycksmönstret för exogent Dvl i celler som exponerades för både CPE och Wnt3a CM var mer diffus jämfört med det karakteristiska punktatmönstret som vanligtvis ses när Dvl är överuttryckt. Cellerna uppvisar diffus d Dvl-färgningsmönster räknades. Resultaten visar att exponering av celler för CM innehållande både CPE och Wnt3a resulterade i ett högre antal celler som presenterade ett cytoplasmiskt, diffus Dvl-uttryck (figur 7e, till höger). Ett liknande experiment utfördes i L-Wnt3a-celler kompletterat med renad F-CPE. Ett punktatmönster av endogent Dvl observeras tydligt i de icke-behandlade cellerna, medan behandling med lösligt F-CPE resulterade i ett mer diffust mönster av Dvl (figur 7f). Dessa resultat antyder att CPE stör störning av signalosomerna och förbättrar den proteasomala nedbrytningen av p-catenin.

Image

CPE kolokaliserar delvis med Wnt3a och påverkar Dvl-proteinaggregaten. ( a ) HEK293TorCOS-7-celler samtransfekterades med F-CPE-GFP och HA-Wnt3a. Fyrtioåtta timmar senare fixerades cellerna, färgades med en anti-HA-antikropp som visualiserades med användning av en rodamin-konjugerad antikropp. Bilder togs med hjälp av ett konfokalt mikroskop. ( b ) L-Wnt 3a-celler transfekterades med F-CPE-GFP. Fyrtioåtta timmar senare fixerades cellerna, färgade med en anti-Wnt 3a-antikropp som visualiserades med användning av en rododkonjugerad antikropp. Bilder togs med hjälp av ett konfokalt mikroskop. ( c ) HEK293T- eller COS-7-celler samtransfekterades med F-CPE-GFP och HA-Dvl. Fyrtioåtta timmar senare fixerades cellerna, färgades med en anti-HA-antikropp som visualiserades med användning av en rodamin-konjugerad antikropp. Bilder togs med hjälp av ett konfokalt mikroskop. ( d, vänster panel) Medium från PC-12- eller U-87-celler samlades och celler skördades och utsattes för Western blot-analys. Endogen F-CPE men inte ΔN-CPE detekterades i PC-12-celler och media, och varken detekterades i U-87-celler eller media med användning av en anti-CPE-antikropp. Tubulin fungerade som en lastkontroll. Höger panel: PC-12 och U-87-celler transfekterades med HA-Dvl och utsattes för IF-avbildning som beskrivits. ( e ) COS-7-celler transfekterades med HA-Dvl och inkuberades med CM såsom anges. Representativ färgning visas (vänster). Procentandelen celler innehållande punktat kontra diffust mönster av HA-Dvl-färgning beräknades i ett stort antal celler ( n = 50) (höger panel). ( f ) L-Wnt3a-celler inkuberades med 200 n M renad F-CPE under 12 timmar. Representativ endogen Dvl-färgning (vänsterpaneler) i L-wnt3a-celler med eller utan CPE-behandling (200 nM) visas. Pilarna pekar på punktuttrycksmönstret för Dvl. Stapeldiagram (till höger) som visar procentandelen celler som uttrycker Dvl i ett punktatmönster (kontra diffusmönster) beräknat i ett stort antal celler ( n = 80). Bar = 10 um.

Bild i full storlek

Diskussion

I den aktuella studien har vi utnyttjat vår förmåga att aktivera Wnt-signalering under definierade förhållanden för att upprätta ett funktionellt screeningssystem i däggdjursceller. Denna screeningsmetod tillåter ett snabbt och effektivt sätt att identifiera gener vars uttryck specifikt modulerar Wnt-vägen. En av de gener som isolerats i vår skärm kodar CPE-proteinet. Karboxypeptidasfamiljen av proteiner deltar i många olika funktioner, men endast karboxypeptidas Z (CPZ) har tidigare anslutits till Wnt-kaskaden eftersom det visade sig binda den icke-kanoniska Wnt4-liganden. 33, 34 Till skillnad från CPE innehåller CPZ en CRD som liknar den som finns i Fz-familjen av Wnt-receptorer som förmedlar dess bindning till Wnt4. 35 Även om CPE har ett antal definierade funktioner, finns det inga aktuella indikationer för dess deltagande i några specifika cellulära signalvägar. Här ger vi bevis för att CPE deltar i att reglera den kanoniska Wnt-signalvägen. Denna väg är extremt komplex och regleras på alla nivåer från utsöndringen av Wnt-liganden till mottagningen av signalen i kärnan av TCF / LEF-familjemedlemmar. Våra studier indikerar att medan ΔN-CPE, som är intracellulärt och delvis nukleärt, inducerar ß-cateninansamling och aktiverar Wnt-målgenuttryck, är F-CPE en potent negativ regulator för denna kaskad. Den antagonistiska effekten av CPE på Wnt-vägen beror på ett intakt "p-catenin-förstörelsekomplex" och proteasomal nedbrytning. Våra resultat visar också att CPE bildar ett komplex troligen genom sekvenser belägna vid dess N-terminal domän, med Wnt3a och den extracellulära CRD för Fz1.

Det finns för närvarande två huvudmodeller som beskriver aktiveringen av Wnt-signaleringskaskaden. Enligt den första leder bindning av Wnt till dess receptorer till internalisering av komplexet och bildning av intracellulära tidiga endosomvesiklar. GSK-3p rekryteras till dessa endosomer tillsammans med andra medlemmar av "p-catenin-nedbrytningskomplexet". Detta leder till både sekvestrering av GSK-3p från p-catenin och störning av 'p-catenin-nedbrytningskomplexet. Den senare störs sedan vilket resulterar i p-kateninansamling. 5 En andra modell föreslår att bindning av Wnt-liganden till dess receptorer leder till rekrytering och polymerisation av Dvl vid plasmamembranet. I sin tur interagerar Dvl med Axin som främjar bildningen av "signalosomer" där GSK-3P-medierad fosforylering av p-katenin blockeras (granskas i Reznik och Fricker 32 ). Det har också föreslagits att när den Wnt extracellulära hämmaren Dickkopf homolog 1 (dkk1) binder LRP6, komplexeras det in i endosomer som förhindrar bildningen av de Dvl-inducerade signalosomerna. 36 Även om de fynd som presenterats i denna studie inte helt beskriver den mekanism som CPE fungerar för att hämma Wnt-vägen, antar vi att på liknande sätt som dkk1, utsöndrad F-CPE kan internaliseras tillsammans med Wnt-receptorkomplexet till endosomer och i vridning leder till störning av signalosomerna och reducerar därmed Wnt-signalnivåer (figur 8a och b). Våra resultat visar att F-CPE kolokaliserar med Wnt3a-liganden. Eftersom CPE fungerar som en sorteringsreceptor som hjälper till att dirigera pro-hormoner från trans- Golgi-nätverket i reglerade sekretionsgranulat 27 och Wnt-proteinerna är också kända för att använda trans- Golgi till sekretorisk granuleringsväg, 28 ett antagande kan vara att både CPE och Wnt3a uttrycks i samma Golgi-fack och samma sekretoriska vesiklar som ses i fall av andra proteiner. 29

Image

Hypotetiska modeller för rollen som F-CPE och ΔN-CPE i Wnt-signalering. ( a ) Efter bindning av Wnt-liganden till dess receptor bildas ett komplex innehållande olika Wnt-signalkomponenter i cytoplasmatiska endosomer, vilket resulterar i sekwestrering av GSK-3p och signalosombildning. "P-catenin-nedbrytningskomplexet" demonteras och ß-catenin ackumuleras och translocates till kärnan. ( b ) Bindning av F-CPE till Wnt och Fz påverkar signalosombildning och p-katenin kan effektivt brytas ned. ( c ) ΔN-CPE-splitsvarianten uttryckt i cancerceller translokalerar till kärnan och uppreglerar ß-catenin mRNA-transkription och proteinnivåer för att främja Wnt-signalering.

Bild i full storlek

Wnt / ß-catenin-signalvägen är en viktig bestämmare för genuttrycksmönster längs kolon-kryptaxeln och kontrollerar proliferation kontra differentiering i friska och maligna tarmepitelceller. Det har visats att medan Wnt-vägen är mycket aktiv i kryptbotten, när cellerna rör sig upp krypten och börjar differentiera, stängs Wnt-vägen ned. 37, 38 Intressant visar den senare studien också att uttrycksmönstret för CPE förändras i TCnTCF4-uttryckande CRC-celler. Tidigare studier har beskrivit uttrycket av CPE i olika epitel-härledda cancer. 19 Men nyligen visat arbete indikerar att endast dessa CPE-splitsvarianter i dessa cancertyper -N-CPE, men inte F-CPE, uttrycks. Dessutom uttrycks ΔN-CPE i mycket metastatiska cancerformer jämfört med normal vävnad eller godartade tumörer. 20 I dessa celler kan ΔN-CPE också bidra till cancerutveckling genom att inducera både Wnt-signalaktivitet (kanske genom den hypotetiska mekanismen som visas i figur 8c) och NEDD9-genuttryck, vilket leder till transformation och tumörogenes. 20 Det är således troligt att spekulera att CPE och dess skarvvariant ΔN-CPE är viktiga modulatorer för Wnt-kaskaden som påverkar både normala och avvikande cellprocesser. Enligt detta scenario förloras uttrycket av F-CPE i de första stadierna av CRC-utvecklingen och när sjukdomen fortskrider börjar N-CPE uttryckas. ΔN-CPE kan främja tumörutveckling på både Wnt-beroende och oberoende sätt, medan F-CPE verkar extracellulärt för att motverka Wnt-vägen i normal kolonutveckling, liksom i malign transformation.

Material och metoder

Cellodling, transfektion

HEK293T, HEK293-EBNA (stabilt uttrycker EBNA-1- genen; Invitrogen, Grand Island, NY, USA), L-Wnt3a-celler, L-celler, COS-7, U-87, Jurkat och den humana CRC-cellinjen SW480 i Dulbeccos modifierade Eagle-medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum och 100 U / ml penicillin / streptomycin vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-atmosfär. PC-12 och P-celler upprätthölls såsom beskrivits ovan med ytterligare 10% hästserum. Transfektion av HEK293T-celler utfördes med CaPO4-utfällning. Alla andra celler transfekterades med användning av DNA-transfektionsreagensen jetPEI (Polyplus Transfection, Illkirch, Frankrike) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen), enligt tillverkarens protokoll.

Plasmider och reagens

CPE-konstruktioner: CPE-GFP (pEGFP-N3) och hCPE (pcDNA3.1 (+)) tillhandahölls vänligen av YP Loh (NICHD, NIH, Bethesda, MD, USA). N-CPE-GFP och N-terminal CPE-GFP konstruerades genom att införa cDNA i pEGFP-N3 (Clontech, Oxon, UK) med användning av BamHI och Xho I-restriktionsställen. FLAG-CPE-konstruktioner framställdes genom att införa de olika CPE-cDNA: erna i FLAGX3-pcDNA3.1 (-) med användning av Apa I och Xho I-restriktionsställen. GFP-p-catenin konstruerades genom att införa p-catenin-cDNA i pEGFP-Cl (Clontech) med användning av BamHI och Xba I-restriktionsställen. Denna expressionsvektor användes som en mall för mutagenes av p-catenin av QuikChange-platsriktad mutagenes-kit (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) för att ersätta serin 33 med alanin för att generera GFP-S33A-p-catenin. HA-GSK-3p-expressionsvektorn tillhandahöll vänligen av Dr TC Dale (Developmental Biology, Chester Beatty Laboratories, Institute of Cancer Research, London, UK). FLAG-GSK-3p tillhandahöll vänligen av Dr Hagit Eldar-Finkelman (Tel-Aviv University, Tel Aviv, Israel). FLAG-Dvl, FLAG-Fz1-CRD och HA-p-catenin tillhandahöll vänligen av Dr Arnona Gazit och Dr Abraham Yaniv (Tel-Aviv University). Human Frizzled 1 (Fz1), som beskrivits tidigare, tillhandahölls vänligen av Dr SA Aaronson (Mount Sinai Medical Center, New York, NY, USA). HA-Wnt3a köptes från Upstate Biotechnology (New York, NY, USA). HA-Dvl konstruerades i pcDNA3-vektorn. De Wnt-responsiva TCF-beroende luciferaskonstruktionerna pTOPFLASH (innehållande flera TCF-bindande platser kopplade till en luciferasreporter) och dess muterade version pFOPFLASH tillhandahölls vänligen av Dr H Clevers (Center for Biomedical Genetics, Hubrecht, Nederländerna) och beskrivs tidigare . 39 pCMV-Renilla- och pCMV-p-galaktosidas-expressionsplasmider, som användes för att utvärdera transfektionseffektivitet, köptes från Promega (Madison, WI, USA) respektive Clontech. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA, USA), LiCl (Sigma, Rehovot, Israel), puromycin och hygromycin B (Sigma) användes vid koncentrationer såsom anges. Rekombinant human CPE (10069-H08H; Sino Biological Inc., Peking, Kina) utspädd i Dulbeccos modifierade Eagle-medium och sattes till cellerna som indikerat.

Luciferas reporter analyser

För att analysera TCF-medierad transkription ympades celler vid 1 x 105 celler per brunn i en 24-brunnarsplatta 24 timmar före transfektion. Celler transfekterades med de indikerade vektorerna, tillsammans med pTOPFLASH / pFOPFLASH och P-gal eller pCMV-Renilla-plasmider. Fyrtioåtta timmar efter transfektion skördades cellerna och utsattes för luciferasanalys enligt tillverkarens instruktioner. I alla analyser mättes FOPFLASH-aktivitet genom att ersätta pTOPFLASH med pFOPFLASH under ekvivalenta förhållanden. Data presenteras som medelvärden och s.d för minst tre oberoende experiment utförda i duplikat.

Western blot-analys och IP

Fyrtioåtta timmar efter transfektion tvättades cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och solubiliserades i reporterlysbuffert (luciferasbuffert, Promega), lysbuffert (100 m M NaCl, 50 m M Tris, pH 7, 5, 1% Triton X-100, 2 m M EDTA) eller radioimmunoutfällningsanalysbuffert (50 m M Tris-HCl, pH 7, 4, 1% NP-40, 0, 25% natriumdeoxikolat, 150 m M NaCl, 1 m M EDTA) innehållande proteas hämmare cocktail (Sigma). Extrakt klargjordes genom centrifugering vid 12 000 g under 15 minuter vid 4 ° C. Efter separering av SDS – polyakrylamidgelelektrofores överfördes proteiner till nitrocellulosamembran och blockerades med 5% mjölk med låg fetthalt. Membraner inkuberades med specifika primära antikroppar, tvättades med PBS innehållande 0, 001% Tween-20 (PBST) och inkuberades med den lämpliga pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppen. Efter tvättning i PBST underkastades membran en förbättrad analys av kemiluminescensdetektering. För IP-analys solubiliserades cellerna i lysbuffert (se ovan). Celllysat inkuberades med anti-FLAG M2-agarosaffinitetsgel (Sigma), med rotation under 2-18 timmar vid 4 ° C. Alternativt inkuberades celllysat med den specifika antikroppen under 1-2 timmar vid 4 ° C före 2-18 timmar roterad inkubation med protein A / G-agaros (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) vid 4 ° C. Pärlor uppsamlades genom långsam centrifugering, tvättades fyra gånger med lys eller radioimmunofällningsanalysbuffert och analyserades med SDS – polyakrylamidgelelektrofores följt av detektion med specifik antikropp. IP från medium utfördes på liknande sätt. Celler odlades i medium utan serum under 24 timmar, som sedan uppsamlades och utsattes för IP-analyser. Intensiteten hos proteinbanden kvantifierades med en datorassisterad densitometer (TINA 2.0c; Fuji BAS, Tokyo, Japan).

immunofluorescens

HEK293T, PC-12, U-87, L, L-Wnt3a och COS-7-celler odlades på täckglas och fixerade 48 timmar efter transfektion under 20 minuter i PBS innehållande 4% paraformaldehyd. Efter tre tvättningar med PBS, permeabiliserades de fasta cellerna med 0, 1% Triton X-100 under 10 minuter och blockerades med bovint serumalbumin under 1 timme. Därefter inkuberades cellerna vid rumstemperatur med primära och sekundära antikroppar under 60 respektive 30 min. 4-6 'diamidino-2-fenylindol (Sigma) användes för att färga cellkärnor. GFP detekterades utan färgning. Celler visualiserades genom konfokal mikroskopi.

antikroppar

Följande antikroppar användes: mus-anti-p-katenin (IB: 1: 5000; IF: 1: 300; BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), mus-anti-aktivt p-katenin (Anti-ABC-klon 8E7 ; Merck Millipore, Temecula, CA, USA) (IB: 1: 1000; IF: 1: 150; Millipore), kanin-anti-GFP (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology), rått anti-HA (IB: 1: 2500 ; IF: 1: 300; Roche, Indianapolis, IN, USA), anti-HA-sond (Y-11) antikropp (IB: 1: 1000; Santa Cruz Biotechnology), mus anti-FLAG (1: 5000; Sigma), kanin anti-FLAG (1: 400; Sigma), mus-anti-CPE (IB: 1: 500; IF: 1:50; IHC 1:50; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), kanin anti-Dvl2 ( IB: 1: 1000; Abcam, Cambridge, Storbritannien), kanin anti-Wnt3a (IB: 1: 2500; IF: 1:50; Cell Signaling, Temecula, CA, USA), kanin anti-Fz1 (IB: 1: 500 ; Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-sox-9 (IB: 1: 2000; Millipore), mus-anti-myc (IB: 1: 1000; IF: 1: 100; Santa Cruz Biotechnology) och kanin anti-CPE. 20 Mus-anti-aktin (1:10 000; ImmunO, Aurora, OH, USA) och mus-anti-tubulin (1:10 000; Sigma) användes som belastningskontroller. Anti-råtta pepparrotsperoxidas-konjugerade sekundära antikroppar erhölls från Santa Cruz Biotechnology (1: 5000). Sekundära antikroppar mot mus och anti-kanin erhölls från Jackson Immuno Research (West Grove, PA, USA) (1:10 000). För IF Alexa användes rött och grönt (1: 500; Molecular Probes, Grand Island, NY, USA).

Liten störande analys

CPE små störande RNA (siRNA) oligonukleotider köptes från Thermo Scientific Dharmacon (Chicago, IL, USA; siGENOME SMART pool M-005823-00-0005, Human CPE, NM_001873) såväl som transfektionsreagens Dharmafect-1. Transfektion utfördes enligt tillverkarens protokoll. Alla experiment utfördes i PC-12-celler med användning av 100 n M siRNA-oligonukleotider under 72 timmar. Icke-målriktade RNA-oligonukleotider (Thermo Scientific Dharmacon) användes för sc-kontroll. PC-12-celler transfekterades 24 timmar efter siRNA-transfektion med pTOPFLASH / pFOPFLASH och P-gal-plasmider för luciferasdetektering. Fyrtioåtta timmar efter transfektion skördades cellerna och utsattes för antingen luciferasanalys eller western blot-analys såsom beskrivits ovan.

CM-effekt

Transfektion av HEK293T- eller COS-7-celler med de indikerade plasmiderna utfördes i en 24-brunnarsplatta. Trettio timmar senare ersattes mediet med konditionmedium (CM) från HEK293T-celler transfekterade med F-CPE-GFP eller GFP och medium uppsamlat från L- eller L-Wnt3a-celler. De två typerna av media kombinerades i ett 1: 1-förhållande och sattes till de transfekterade cellerna under 18 timmar. Alternativt tillsattes renad rekombinant CPE (Sino Biological Inc.) utspädd i Dulbeccos modifierade Eagle-medium till den önskade koncentrationen (specificerad i figuren) till celler under 18 timmar. HEK293T-cellerna skördades sedan och utsattes för antingen western-blotting- eller luciferasreporteranalys. COS-7-celler transfekterade med HA-Dvl- och L-Wnt3a-celler kompletterades med CPE CM 12 timmar före IF-analys såsom beskrivits ovan.

Kompletterande information

Powerpoint-filer

  1. 1.

    Kompletterande figur 1

  2. 2.

    Kompletterande figur 2

Word-dokument

  1. 1.

    Kompletterande tabell 1

  2. 2.

    Kompletterande information

    Kompletterande information åtföljer uppsatsen på Oncogene-webbplatsen (//www.nature.com/onc)